JPH06502719A - 遊離及び複合体形成した前立腺特異的抗原（ｐｓａ）の分析 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、遊離ＰＳ＾並びにＰＳ＾プロテイナーゼインヒビター複合体の測定が できる特異的な試薬（抗体）が使用される前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）のイムノ アッセイに関する。

本発明は、前立腺癌の患者の診断に於ける有用なマーカーとしての遊離ＰＳ＾及 びＰＳ＾プロテイナーゼインヒビター複合体並びにその割合を使用することに関 する。

１１へ１１ 前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）は前立腺組織から最初に精製されたが（Ｈａｎｇら 、　Ｉｎｖｅｓｔ　０ｒａｌ　１９７９）、この蛋白質は殆ど同時に独立して精 液血漿からも特徴付けられた（Ｉ（ａｒａら、ＪＬａｂ　Ｃ１１ｎ　Ｍｅｄ　１ ９８９　；　Ｇｒａｖｅｓら、Ｎ　Ｅｎｇｌ　Ｊ　Ｍｅｄ　１９８５）、　ＰＳ Ａは、３３−ｋＤａグリコジル化単鎖セリーンプロテアーゼであることは公知で ある［Ｌｉ１ｊａ、　Ｊ　Ｃ１１ｎ　Ｉｎｖｅｓｔ　１９８５　；　１ｌａｔｔ ら。

Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　５ｃｉ（ＰＳＡ）１９８６］、　２３７アミノ 酸ポリペプチド主鎖は、腺カリクレインの主頒と酷似している（Ｌｕｎｄｗａ　 ｌ　ｌら、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ　１９８７；５ｃｈａｌｌｅｒら、Ｅｕｒ　Ｊ　 Ｂｉｏｃｈｅｍ　１９８７）。

Δｒｇ−制限基質特異性を示すトリプシン様腺カリクレインとは異なり（Ｍａｃ Ｄｏｎａｌｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｊ　１９８８）、ＰＳＡはキモトリグシン様 基質特異性を示す（Ａｋｉｙａｍａら、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ　１９８７；Ｃｈｒ ｉｓｔｅｎｓｓｏｎら、Ｍａｎｕｓｃｒｉｐｔ　１９９０；Ｌｉ１ｉａら、Ｊ　 Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｗ１９８９）、　ＰＳ＾は、不活性チモーゲンとして産生され るのだろうと考えられていた（Ｌｕｎｃｌｗａ　ｌ　ｌら、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ 　１９８７）。活性ＰＳ＾は、精液血漿中に分泌され（Ｌｉｌｊａ、Ｊ　Ｃ１１ ｎ　Ｉｎｖｅｓｔ　１９８５）これは前立腺に最も多く含まれる蛋白質の一種で ある（Ｌｉｌｊａら、Ｔｈｅ　Ｐｒｏｓｔａｔｅ　１９８８　；　Ｄｕｂ！ら、 Ｊ　Ａｎｄｒｏｌ　１９８７）、精液中のＰＳ＾の生物学的活性は、精嚢により 分泌された主要蛋白質の限定された蛋白質加水分解分裂に関連する（Ｌｉｌｊａ 。

Ｊ　Ｃ１１ｎ　Ｉｎｖｅｓｔ　１９８５　；　Ｌｉ１ｊａら、Ｊ　Ｃｌ１ｎ　Ｉ ｎｖｅｓｔ　１９８７：ＭｃＧｅｅら、Ｂｉｏｌ　Ｒｅｐｒｏｄ　１９８８）。

前立腺上皮から放出される以外にもＰＳ＾は血液循環からも検出され得る（Ｐａ ｐｓｉｄｅｒｏら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ　１９８０）、　ＰＳ＾の血清中濃度 の測定は、前立腺癌の患者をモニターするのに広く使用し得ることが知見された が、ＰＳ＾の高い血清中濃度は良性の前立腺過形成及び前立腺の外科的創傷時で も報告されていた（Ｄｕｒｆｙ、＾ｎｎ　Ｃｌ１ｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　１９８９ 　；　Ｂｒａｖｅｒら。

Ｌｌｒｏｌｏｇｙ　５ｕｐｐｌ　１９８９）、　Ｉ、かしながら、現在のところ 、血清中の免疫学的反応性がＰＳ八−チモーゲン、活性ＰＳ＾または細胞外プロ テイナーゼインヒビターにより不活化されたＰＳ＾を表しているかどうかは未知 であり、この免疫学的反応性の分子量に関しては矛盾が報告された。１９８０年 にＰａｐｓｉｄｅｒｏは、ｐｓ＾−免疫学的反応性を単一９０〜１００ｋＤａピ ークとして溶離したが（Ｐａｐｓｉｃｌｅｒｏら、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ　１ ９８０）、＾ｌ　Ｅ　ｔｈａｎ及び５ｔｅｒ＋ｍａｎは、ゲル透過クロマトグラ フィーにかけてこの免疫学的反応性の主要部分を３Ｏ−ｋＤａ蛋白質として溶離 したくＡＩｆｔｈａｎら、　Ｃｌ１ｎ　Ｃｈｅｍ１９８８）。

本発明に於いて、本出願人は、ＰＳ＾は、ヒト細胞外体液中、高濃度でプロテイ ナーゼインヒビターと複合体を形成する能力を有すること及びＰＳ＾は、これら の液体中、遊離及び複合体形の両方を形成し得ることを示した。さらに、本発明 は、前立腺癌患者の診断に非常に有用であることも立証した。

元旦！旧改！一 本発明の方法により、イムノアッセイを遊離ＰＳ＾並びにプロテイナーゼインヒ ビター複合体としてのＰＳ＾を測定するために適用した。遊離ＰＳ＾及びＰＳ＾ 複合体は、本発明により少なくとも２種類の異なったモノクローナル抗体を使用 する非−競合イムノアッセイにより測定した。本発明は、当該ＰＳ＾プロテイナ ーゼインヒビター複合体がαビ抗−キモトリブシン、αビプロテアーゼインヒビ ター（＾ＰＩ）またはＣ２−マクログロブリンのいずれとも形成することにより さらに特徴付けられる。さらに５本発明は、遊ＭＰＳ＾、ＰＳ＾−プロテイナー ゼインヒビター複合体及びその割合を、前立腺癌患者の診断に適用することによ っても特徴付けられる。

１１悲１１ 図１は、アガロースゲル電気泳動後にＰＶＤＦ−膜にプロットした蛋白質をプロ ーブするために使用したポリクローナル抗体及び３種類のモノクローナル抗体を 示している。レーン１は、１　ｕｇＰＳ＾であり、レーン２は６ｕｙａ＋−抗− キモトリプシンと３７℃３０分インキュベートした１μｇＰＳ＾であり、レーン ３は、６１Ｊｇαビ抗−キモトリプシンである。

図２は、５ＤＳ−ＰＡ（：Ｅ後にＰＶＤＦ＝膜にプロットした蛋白質をプローブ するために使用したポリクローナル及び３種類のモノクローナル抗体を示してい る。レーン１は、１ｕｙＰＳ＾であり、レーン２は、６１１ｇαビ抗−キモトリ プシンと３７℃３０分インキュベートしたＬｕｇＰＳ＾であり、レーン３は、６ μｉα、−抗−キモトリプシンである。

図３は、３種項のアッセイ型の特異性を示している。

図４は、アッセイ型ＡとＣで分析した時の６５人の患者からの血清サンプルに於 けるＰＳ＾免疫学的反応性の相関関係を示している。

図５は、ア・ソセイ型ＡとＢで分析した時の６５人の患者からの血清サンプルに 於けるＰＳ＾免疫学的反応性の相関関係を示している。

図６は、ＴＳＫ　２５０　ＨＰＬＣカラムに於ける患者サンプルＢのゲル透過を 示している。溶層した両分のＰＳ＾免疫学的反応性をアッセイ型Ａ、Ｂ及びＣで 分析した。

図７は、ＴＳＫ　２５０　ＨＰＬＣカラムに於ける患者サンプルＣの透過を示し ている。溶離した画分のＰＳ＾免疫学的反応性をアッセイ型Ａ、Ｂ及びＣで分析 した。

図８は、ＴＳＫ　２５０　ＨＰＬＣカラムに於ける患者サンプルＤのゲル透過を 示している。溶離した画分のＰＳ＾免疫学的反応性をアッセイ型Ａ、Ｂ及びＣで 分析した。

図９は、ゲル透過による１００００μｇ／ｌのＰＳＳリレベル血清サンプル中の ＰＳ＾免疫学的反応性の特徴を示している。ＰＳ＾及びＰＳ＾−＾ＣＴ複合体は 、ＩＦＭ＾により測定した。

図１０は、ＰＳ＾濃度の関数としての前立腺癌の患者の血清に於ける全ＰＳ＾免 疫学的反応性のＰＳ＾−＾ＣＴ複合体の割合を示している。ＰＳ＾のレベルは、 ＩＲＩ４＾により測定し、ＰＳ＾−＾ＣＴのレベルは、ＩＦＭ＾により測定した 。

図１１は、前立腺癌の患者由来の血清中のＩＲＭ八により測定したＰＳ＾濃度の 関数としての［ＦＭ＾により測定したＰＳＡ−ＡＰＩ複合体濃度を示している。

　− Ｈの＝　ｆ＝日 １、モノ　ローナル　の　び、　・番 抗−ＰＳ＾特異的モノクローナル抗体Ｂａ１ｂ／ｃマウスの産生を、フロイント の完全アジュバントと等容量で乳化させたＰＳＡ７０μｇで腹腔的注入により免 疫した。３．６及び９週間後、フロイントの不完全アジ豆バントで乳化させたＰ ＳＡ５０．ｇで免疫感作を繰り返した。３週間後、マウスにＰＳＡ４０．Ｈの最 終ブースターを与え、４日後にマウスを殺した。牌臓のリンパ球様細胞を取り出 し、形質細胞（ＮＳ−１）と１：１で混合した。細胞を溶解し、２００ｇ／Ｌ牛 脂児血清及びＨＡＴ−サブルメントＨ−０２６２（１：５０．Ｓｉｇｍａ）を含 むＫＣ−２０００（Ｈａｚｌｅｔｏｎ　ＢｉｏｌｏｇｉｃｓＩｎｃ、、　Ｌｅ　 ｎｅｘａ、　ＵＳ＾）中ミクロ滴定ウェル中で収穫した（Ｍａｔｉｋａｉｎｅｎ ら、Ｊ　Ｇｅｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　１９８３）。

マスタークローンによる抗−ＰＳＡ特異的性抗体の産生を、ウサギ抗一マウスＩ ｇＧでコートしたウェルストリッププレートで分析した（Ｌａｖｇｒｅｎら、　 Ｔａ１ａｎｔａ　１９８４）。ストリップをハイブリドーマ上清または標準（Ｐ ＳＡに特異的なモノクローナル抗体；　０８１２　Ｈｙｂｒｉｔｅｃｈ）のいず れかとインキュベートし、洗浄し、Ｅｕ−標識ＰＳ＾（５０ｎｇ／ウェル）とイ ンキュベートし、次いで結合したＥｕ−標識ＰＳＡ量を測定した。

限定希釈液によるマスタークローンのクローニングを記載の如〈実施した（Ｓｔ ａｓｚｅｗｓｋｉ及びＹａｌｅ、Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｍｅｄ　１９８４）。

所望のクローンをＢａ１ｂ／ｃマウス中、腹腔内で増殖させ、腹水液を１０日目 で集めた。腹水液のＩｇＧ−画分を、製造業者により推奨のプロトコルに従って 蛋白質＾−セファロース上クロマトグラフィーにより精製した。

固相に結合したＰＳＡを使用して、未標識モノクローナル抗体が固相に結合した ＰＳＡに対するもう一つのＥｕ−標識キーＰＳＡ　Ｍ＾ｂの結合をブロックでき たかどうかを試験した。固相に結合したＰＳＡは、２Ｅ９または５＾１０抗−Ｐ ＳＡ　Ｍ＾ｂでコートしたウェルストリッププレート中２時開、精製ＰＳ＾（２ ５μ！Ｆ／Ｌ）の２５μ！アリコート及び２００１ＩＬアツセイ緩衝液ＤＥＬＦ Ｉ＾（商標）（５０Ｉｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ、ｐｉ（７，７５，０，１５ｍｏｌ／ Ｌ　ＮａＣ１，０，５ｇ／Ｌ　ＢＳ＾。

及び０．５ｇ／Ｌ　ＮａＮｚ）のインキュベーシゴンにより得られた。

ストリップを洗浄し、次いで未標識抗−ＰＳＡ　Ｍ＾ｂ（０，００５−５０ｕＦ Ｉ／Ｌ）の一つＺＯＯμＬと１時間インキュベートした。再び、ストリップを洗 浄し、もう一つのＥｕ−標識抗−ＰＳＡ　Ｍ＾ｂと１時間インキュベートし、結 合したＥｕ−標識抗−Ｐｓ＾量と測定した。

ＰＳＡに　自ｆ３　のモノクローナル　のエピトープ捧　０．−４＋− 幾つかのクローンは、蛍光定量分析により示されるようにＰＳＡ特異的モノクロ ーナル抗体を産生した。これらのうち３種ｆｆ　（２Ｅ９．２Ｈ１１及び５Δ１ ０）と増殖させ、腹水液から抗体を単離した。３種頭のＰＳ＾特異的モノクロー ナル抗体を使用して、１μｇＰＳ屓レーン１　）　；　６ｕｌ？αビ抗−キモト リプシンと３７°Ｃ３０分インキュベートした１μｙ　ｐｓ＾（レーン２）；及 び６μｇα１−抗−キモトリプシン（レーン３）のアガロースゲル；気泳動（図 １）または５ＤＳ−ＰＡＧＥ（図２）後、ＰＶＤＦ−膜上にプロ７トした蛋白質 をプローブした。アガロースゲル由来のＰＶＤＦ−膜にプロットしたＰＳＡを全 ３種頭のモノクローナル抗体により認識した。αビ抗−キモトリズシンと複合体 形成したＰＳＡは２Ｅ９及び２Ｈ１１抗体により認識できたが、５＾１゜抗体で は認識できながった。２Ｅ９抗体は、これらの蛋白質を５Ｏ５−ＰＡＧＥ後Ｇ、 ：　ＰＶＤＦ−膜上にプロットスルトき、ＰＳＡト、ａ。

−キーキモトリプシンと複合体形成したＰＳＡとをすぐに認識できた唯一の抗− ＰＳＡ　Ｍ＾ｂであった。しかしながら、２Ｈ１１及び５＾１０抗体を５ＤＳ− ＰＡ（：Ｅ後のＰＶＤＦ−腹にプロットしたこれらの蛋白質をプローブするのに 使用するとき、ＰＳＡとほんの少し反応した（α、−抗−キーキモトリプシン合 体形成したＰＳＡでは得られない）。

３種頭のモノクローナル抗体のエピトープ特異性は、固相サンドイッチアッセイ の３種類の異なるセットを使用しても特徴つけられた。従って、２Ｅ９抗体を固 相キャッチャ−として使用し、Ｅｕ−標識２Ｈ１１を検出抗体として使用するア ッセイ（Ａ）は、Ｃ１−抗一キモトリプシンと複合体形成したＰＳＡと比較して 、ＰＳＡと殆ど同一の濃度−反応を示した（表１；図３）。これは、５＾１０抗 体をキャッチャ−として使用し、ＰＳＡを認識するがαじ抗−キモトリプシンと 複合体形成したＰＳＡは殆ど認識しない検出抗体としてＥｕ−標識２Ｈ１１を使 用したアッセイ（Ｂ）及び、２Ｅ９抗体をキャッチャ−として使用し、Ｃ１−抗 −キモトリプシンに特異的なＥｕ−標識抗体をαじ抗−キモトリプシンと複合体 形成したＰＳＡのみを認識する検出抗体として使用したアッセイ（Ｃ）と対照的 である（表１；図３）。

ＰＳＡと結合させた固相を使用して、ＰＳＡに特異的な３種票のモノクローナル 抗体のエピトープ特異性をさらに特徴つけた、ＰＳＡの固相との結合は、２Ｅ９ または５＾１０抗体でコートしたウェルストリッププレートを使用して実施した 。これにより、ＰＳＡと結合させた固相に対するもう一つのＥｕ−標識キーＰＳ Ａ　ＨＡｂの結合をブロックする抗〜ＰＳＡ　ＨＡｂの能力を試験したとき、抗 −ＰＳＡ　ＨＡｂの２ε９．２Ｈ１１または５＾１０はいずれも互いに結合と全 くブロックしないことが知見された。

２、ヒト　゛に・ｃＰＳ＾−プローイナーゼインヒビター鉦飢悲ｉ【 ヒト　゛　でのｐｓ＾ 個々の患者サンプル（ｎ＝６５）からの血清を、３種票の異なるアッセイ（Ａ− Ｂ及びＣ）で分析した。アッセイＡ及びアッセイＣで得られた結果の回帰分析か ら、ｙ　＝　０．８９ｘ　＋６．５５、ｒ＝０．９７（図４）が得られた。アッ セイＡ及びアッセイＢの間の回帰分析から、　ｙ　−０，１０ｘ　＋９．５６、 ｒ＝０．８２（図５）が得られた。

ＴＳＫ　２５０　ＨＰＬＣカラム上の患者サンプルのゲル透過実験からの免疫学 的反応性の全回収率は、使用した全３種票のアッセイ（Ａ、Ｂ及びＣ）に関して 等しく高かった（８２〜１０７％）。

ＴＳＫ　２５０　ＨＰＬＣカラム上の患者サンプルのゲル透過実験から、アッセ イＡで分析するとき、ＰＳＡ−免疫学的反応性の主要ピークは、分子量８０〜９ ０ｋＤａに対応する位置の溶離画分中に認識され、この免疫学的反応性の弱いピ ークは、分子量２５〜４０ｋＤａに対応する位置の溶離画分中に認識された（図 ６〜８）。同様にして、アッセイＣで溶離した画分の分析（αビ抗−キモトリプ シンと複合体形成したＰＳＡに特異的）から、８０〜９０ｋＤａの範囲の主要な 免疫学的反応性ピークを認識したく図６〜８）。しかしながら、アッセイＢを使 用してゲル透過実験から溶離した両分を分析すると、主要な免疫学的反応性ピー クは２５〜４０ｋＤａの分子量に対応する位置に溶離した。このピークの溶離位 置は、アッセイＡにより認識された弱い免疫学的反応性ピークに対応する（図６ 〜８）。

ｐｓ＾の種々のレベル（１０〜１０．０ＯＯｕｙ／Ｌ）を含む男性由来の血清サ ンプルを、ゲル透過により分画すると、ＰＳＡ及びＰＳＡ−＾ＣＴに対応する２ 成分も知見された。ＰＳＡ−レベルが高いサンプルでは、ＰＳＡ−＾ＣＴ複合体 が優位であった（図９）。女性の血清中では、これらの成分は見られなかった（ 示されていない）、全ＰＳ＾免疫学的反応性のＰＳＡ−八ＣＴの割合は、ＰＳ＾ レベルが高くなるにつれて増加したく図１０）、　２．ａｕｇ／Ｌ以下のＰＳＳ リレベル健康な男性由来の血清中では、ＰＳＡ−八ＣＴの割合ハ２３〜４７１テ あり、ＰＳ＾レベル２．８〜１１０１Ｊ／Ｌノサンプルに於いては、割合は２６ 人８６＄であり、高いレベル（１０００ｕｇ／Ｌ以トのＰＳ＾レベル）のサンプ ル中では割合はさらに増加して７０〜１０ｏｚであった（図１０）。

任意のユニット中に発現した複合体の濃度をベースとして血清中の主複合体はＰ ＳＡ−へＣＴ複合体であった。ＰＳ＾レベルが低いサンプルでは、ＰＳＡ−＾Ｐ Ｉ及びＰＳＡ−＾ＣＴの両方の１度は、検出限界に近かった。従って、通常のサ ンプル中でこれらの複合体の割合を計算するのは困難であった。４０μｇ／Ｌ以 上のＰＳ＾レベルのサンプルではＰＳＡ−ＡＰＩ複合体のレベルが明らかに増加 し、ＰＳＳリレベル高くなるにつれて増加した（図１１）。

３．１　の１、　の診　でのＰＳＡ　びＰＳＡ−αビ　−　モトＬ乙辷乙１１肘 「３種票のＰＳ＾特異的モノクローナル抗体のエピトープ特異性の特徴つけ」の 段落で参照した３種類のアッセイ型を使用して、良性の前立腺過形成（ＢＰ旧の 患者１４４人及び前立腺癌（ＣＡＰ）の種々の段階の患者１２２人を試験した。

Ａ：α１−抗−キモトリプシンと複合体形成したＰＳ＾／全ＰＳ＾と、Ｂ：遊離 の、複合体形成していないＰＳΔ／全ＰＳ＾との割合並びに、全ＰＳ＾及びＰＳ ＾αビ抗−キモトリプシン単独の測定の臨床的感受性及び特異性を計算した。示 されたデータから、高い臨床特異性は、ＰＳ＾αビ抗−キモトリプシン複合体を 測定することにより達成され、遊離ＰＳ＾／全ＰＳ＾及び遊離ＰＳ＾／α。

−キーキモトリプシンと複合体形成したＰＳＡの割合は、ＢＰＨ及びＣＡＰ患者 の間で大きく異なっていることは明らかである。

Ｌ 表１は、３種票の異なるアッセイのセットで分析した時の精製ＰＳ＾及びα１− 抗−キモトリプシンと複合体形成したＰＳＡの容量一応答を示している。

−アッセイＡでは、固相キャッチャ−は２Ｅ９抗〜ＰＳＡ　ＨＡｂであり、検出 抗体はＥｕ−標識２Ｈ１１抗−ＰＳＡ　ＨＡｂである。

−アッセイＢでは、固相キャッチャ−は５＾１０抗−ＰＳＡ　ＭＡｂであり、検 出抗体はＥｕ−標識２Ｈ１１抗−ＰＳＡ　ＨＡｂである。

−アッセイＣでは、固相キャッチャ−は２Ｅ９抗〜ＰＳＡ　ＨＡｂであり、検出 抗体はαビ抗−キモトリプシンに特異的なＥｕ−標識ウサギ抗体である。

ｆｉｌは、精製ＰＳ＾を表し、ｆ［２は、αビ抗−キモトリプシンと複合体形成 したＰＳＡを表す。

轟Ｗ区２６− 表２ａ及び２ｂは、遊離、複合体形成及び合ＰＳ＾に関する３種票のアッセイ型 による患者サンプルの試験結果を示している。表中、ＢＰＨは良性の前立腺過形 成を示し、ＣＡＰは前立腺癌を示し、Ｇは分化のｎ段階を示し、Ｔは段階分示す 。表２ｂは、感受性及び特異性を示している。

円＾　Ａ　Ｂ　Ｃ 口ｇル　１２１２１２ ｓ　２６８９７　２３５３５　３１４８７　３１７９　４８７１５６６２５００ 　２２３１６４０　１８２６７９０　２６３１８４０　１５６７１２　１２０７ ３　７２６５％１精製阿＾： ２、α、−抗一キートリブシンと複合体形成した円＾宍−２１ ＣＡＰ、Ｇ３（ｎ＝４３）　＾、　０．９９６　１０１４Ｂ、　０．７７０　０ ．１８４ ＰＳＡ　ｃ　：複合体形成した円＾ 阿＾ｒ：’ｉｔｗ＾ 円＾ｔｏｔ　：全円＾ Ｒ−ユ旦 を力υ虹庁唱牲 ＰＳＡ　Ｌｏｔ　感受性　ＰＳＡＬｏｔ　＞５　９５／１２１・０．７６＞１０ 　８０／１２１＝０．６６１ 特異性　ＰＳ八へｏｔ　＜５　８４／１４４二０．５８３＜１０　１１６／１４ ４・０．８０６ ＰＳＡ　ｃ　感受性　ＰＳＡ　Ｃ２５９３／１２１＝０．７６９＞１０　８１／ １２１・０．６６９ 特異性　兇＾ｃ　＜５　９２／１４４＝０．６３９＜１０　１２４／１４４＝０ ．８６１ Ｉ６　１ ＦＩＧ、　２ 口＝直添１ｎａ名１紅ににしてｔいＩ’ＳＡ　娑ゑ１ｉ＝ＰｓＡ−Ｃ（１７九午 モ、ト”ｊプシン財停Ｆ１６３ ＦＩＧ、　Ｓ サンフーレ　〔 ＦＩＧ。７ ２５　３５　４ｓ　５５ 五　うゴー ＦＩｏ、８ ＦＩＧ、　９ ＦＩＧ、　１０ Ｆ＋６１１ 補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の７第１項）平成５年１月２ ２日４し

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）のイムノアッセイに於いて、−プロテイナーゼ インヒビターと複合体形成した前立腺特異的抗原の量及び／または −遊離の、複合体形成していない前立腺特異的抗原の量及び／または −前立腺特異的抗原の全量 を測定することを特徴とする前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）のイムノアッセイ。
2. ２．−ＰＳＡ−プロテイナーゼインヒビター複合体（複合体形成したＰＳＡ）及 び／または −遊離の、複合体形成していない前立腺特異的抗原（遊艇ＰＳＡ）及び／または −全前立腺特異的抗原（全ＰＳＡ） を非−競合イムノアッセイにより測定することを特徴とする請求項１に記載のイ ムノアッセイ。
3. ３．−ＰＳＡ−プロテイナーゼインヒビター複合体（複合体形成したＰＳＡ）及 び／または −遊離の、複合体形成していない前立腺特異的抗原（遊艇ＰＳＡ）及び／または −全前立腺特異的抗原（全ＰＳＡ） を少なくとも２種類の異なったモノクローナル抗体を使用する非−競合イムノア ッセイにより測定することを特徴とする請求項２に記載のイムノアッセイ。
4. ４．ＰＳＡ−プロテイナーゼインヒビター複合体（複合体形成したＰＳＡ）を認 識するために使用したモノクローナル抗体が−前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ま たは−ＰＳＡ−プロテイナーゼインヒビター複合体（複合体形成したＰＳＡ）ま たは −プロテイナーゼインヒビター のいずれかと結合することを特徴とする請求項３に記載のイムノアッセイ。
5. ５．プロテイナーゼインヒビターがα１−抗−キモトリプシンであることを特徴 とする請求項４に記載のイムノアッセイ。
6. ６．プロテイナーゼインヒビターがα１−プロテイナーゼインヒビターであるこ とを特徴とする請求項４に記載のイムノアッセイ。
7. ７．プロテイナーゼインヒビターがα２−マクログロブリンであることを特徴と する請求項４に記載のイムノアッセイ。
8. ８．遊離の、複合体形成していない前立腺特異的抗原（遊離ＰＳＡ）とＰＳＡ− プロテイナーゼインヒビター複合体（複合体形成したＰＳＡ）との割合を測定す ることを特徴とする請求項２に記載のイムノアッセイ。
9. ９．遊離の、複合体形成していない前立腺特異的抗原（遊離ＰＳＡ）と全前立腺 特異的抗原（全ＰＳＡ）との割合を測定することを特徴とする請求項２に記載の イムノアッセイ。
10. １０．ＰＳＡ−プロテイナーゼインヒビター複合体（複合体形成したＰＳＡ）と 全前立腺特異的抗原（全ＰＳＡ）との割合を測定することを特徴とする請求項２ に記載のイムノアッセイ。