JPH06500701A - 核酸分子の増幅 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 核酸分子の増幅 発明の分野 本発明は組み替えＤＮＡ技術の分野に属する。この発明は核酸分子を増幅するた めの方法、及びこの方法によって使用され生成される分子を目的とするものであ る。

発明の背景 試料中の特定の核酸分子の存在を検出できる検定は、法医学、医学、疫学及び公 衆衛生、並びに疾病の予測及び診断において実質的な重要性がある。このような 検定は例えば、感染症の原因物質の同定、個体が遺伝病に罹患する見込みの予測 、飲料水もしくは牛乳の純度の測定、または組織試料の同定に使用することがで きる。このような検定の用途及び適用可能性を拡大しようという願望は、検定感 度によってしばしば挫折する。したがって、より感受性の高い検出用検定の開発 が極めて望まれる。

核酸の検出検定は、核酸分子の任意の特性、例えばその大きさ、配列、及び、Ｄ ＮＡである場合は制限エンドヌクレアーゼによる消化の受け易さに基づくもので あり得る。このような検定の感度は、検出を観察者に対して報告しまたは信号化 する方法を変えることによって高めることができる。即ち、例えば検定の感度は 、検出し得るように標識された試薬の使用によって高めることができる。この目 的のための広範囲の標識が使用されてきた。クリルスキー等（米国特許第４５８ １３３３号）は、検出検定における感度を高めるための酵素標識の使用を記載し ている。放射性同位元素の標識は、ファルコウ等（米国特許第４３．）８３３５ 号）、及びバーニンガー（米国特許第４４４６２３７号）によって開示されてい る。検出を観察する効率を改善する努力の中で、蛍光標識（アルバレラ等、欧州 特許第１４４９１４号）、化学的ｍ識（ジェルトン？ＩＩ等、米国特許第４５８ ２７８９号、アルバレラ等、米国特許第４５６３４１７号）、修飾された塩基（ ミヨン等、欧州特許第１１９４４８号）等もまた使用されてきた。

検出性の高い標識試薬の使用は核酸の検出検定の感度を改善し得るものの、係る 検定の感度は、その検定が検出しようとする核酸の不在下で生成するバックグラ ウンド信号を増強する非特異的反応に生として関係する実際的問題によって依然 制限される。したがって、細菌の純粋培養の同定などのような幾つかの適用に対 しては、所望分子の濃度は典型的に検出に従うものであるが、一方他の、可能性 ある適用に対しては、所望核酸分子の予期される濃度は、上記のいかなる検定に よってもこれを検出するには低すぎるであろう。

これらの障害に対応してＤＮＡ増幅のための高感度の様々な方法が開発された。

核酸濃度の感度の限定を克服する一つの方法は、検定を行なうに先立ち検出を所 望する核酸分子を選択的Ｉこ増幅することである。精製された核酸フラグメント を増幅することのできる組み替えＤＮＡ方法論は長い間認められてきた。典型的 には、このような方法論は、核酸フラグメントのＤＮＡまたはＲＮＡベクター中 への導入、該ベクターのクローニングによる増幅、及び増幅された核酸フラグメ ントの回収を含む。このような方法論の例は、コーエン等（米国特許第４２３７ ２２４号）、Ｔ、マニアティス等、モレキュラー・クローニング（ア・ラボラト リ−・マニュアル）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　（Ａ　Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ））、コールド・スプリング・／ｈ−バー・ラボラト リ−１１９８２、等により供されている。

核酸分子を増幅するもう一つの方法は、鋳型支配伸長によるものである。係る方 法においては、核酸分子を、ポリメラーゼにより触媒される反応における核酸プ ライマーの伸長のための鋳型として使用する。例えばパネット及びコラナ（ジャ ーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）２ ４９巻５２１３−５２２１頁（１９７４）、この記載は引用して本明細書の一部 とする）は、セルロースに結合したデオキシリポポリヌクレオチドの鋳型の複製 を立証した。クレノペ等（ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロン−（Ｊ 。

Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、）５６巻３４１−３６１頁（１９７１，）、この記載は引用 して本明細書の一部とする）は、相補的ＤＮＡの合成のための鋳型としての二本 鎖及び−末鎖ＤＮＡ分子の使用を開示した。

このような方法は、最も広く使用されているＤＮＡ増幅方法である「ポリメラー ゼ連鎖反応Ｊ　（ｒＰｃＲＪ）の基礎を形作っている［Ｋ、ミニリス等、コール ド・スプリング・ハーバ−・ンンボジア・オン・クラオンティタテイブ・バイオ ロジー（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｓｙｍｐ、Ｑｕａｎｔ、Ｂｉ ｏｌ、）５１巻２６３−２７３頁（１９８６）：Ｈ，アーリソヒ等、欧州特許第 ５０４２４号、欧州特許第８４７９６号：欧州特許第２５８０１７号、欧州特許 第２３７３６２号二Ｋ　ミユリス、欧州特許第２０１１８４号、Ｋ　ミニリス等 、ＵＳ４６８３２０２　：Ｈ，アーリッヒ、ＵＳ４．５８２７８８　：及びＲ， サイキ等、ＵＳ４６８３１９４、これらの記載は引用して本明細書の一部とする ］。ＰＣＲは、増幅すべき配列の領域に対し相補的な二つのオリゴヌクレオチド ブライマーを使用して、特異的な核酸配列の増幅を達成する。このプライマーを 組み込んだ伸長産物は、次いでこれに続く複製工程のための鋳型となる。

ポリメラーゼ連鎖反応は、その分子が前もって精製されていな（とも、そして特 定の試料中にただ一個のコピーしか存在しなくとも、特定の配列を有する核酸分 子の濃度を選択的に増加させる方法を提供する。この方法は一本鎖または二本鎖 ＤＮＡのいずれの増幅にも使用することができる。この方法の本質は、所望の核 酸分子の鋳型依存性且つポリメラーゼ介在性復製のためのプライマーとしての役 割を有する二つのオリゴヌクレオチドの使用を含む。

ＰＣＲ法の二つのオリゴヌクレオチドプライマーの正確な性質は、この方法の成 功にとって決定的なことである。良く知られているように、ＤＮＡまたはＲＮＡ の分子は、該分子の糖−燐酸バックボーンの５゛→３゛結合に向かって与えられ る方向性を有する。二つのＤ　Ｎ　ＡまたはＲＮＡ分子は、一方の分子の末端５ ゛燐酸基と第二の分子の末端３゛ヒドロキシ基との間にホスホジエステル結合を 形成することにより結合することができる。核酸分子のポリメラーゼ依存増幅は 、５゛ヌクレオシド三燐酸を核酸分子の３゛ヒドロキシ末端に付加することによ って進行する。このように、ポリメラーゼの作用が核酸分子の３′末端を伸長す る。これら固有の性質を、ＰＣＨの二つのオリゴヌクレオチドブライマーの選択 の際に活用する。ＰＣＲ法の二つのプライマーのオリゴヌクレオチド配列は、こ の配列が、増幅が望まれる特定の核酸分子の配列と隣接する配列と同一のまたは 該配列に対し相補的な配列を含むように選択する。より詳細には、「第一の」プ ライマーのヌクレオチド配列は、これが所望核酸分子の配列に対し３゛に位置す るオリゴヌクレオチド配列とハイブリダイズできるように選択し、一方「第二の 」プライマーのヌクレオチド配列は、これが所望核酸分子の配列に対し５°に存 在する配列と同一のヌクレオチド配列を含むように選択する。どちらのプライマ ーも、酵素の介在する核酸合成に必要な３゛ヒドロキシ基を有する。

ポリメラーゼ連鎖反応においては、反応条件は、ハイブリダイゼーション及び核 酸重合が行なわれる条件と、二本鎖の分子の変性をもたらす条件とを循環させる 。この反応の第一段階においては、存在するかも知れない二本鎖分子を変性させ るために、試料の核酸を一時的に加熱し、次いで冷却する。次に「第一の」及び 「第二の」プライマーを、所望の核酸分子の濃度をはるかに超える濃度で試料に 加える。この試料をハイブリダイゼーション及び重合の行なわれる条件下でイン キユベートすると、［第一の」プライマーは、増幅されるべき所望分子の配列に 対し３゛位で試料の核酸分子とハイブリダイズするであろう。試料の核酸分子が 最初二本鎖であるならば、「第二の」プライマーが、増幅の望まれる配列の相補 物である所望分子の配列に対し３゛位で、核酸分子の相補鎖にハイブリダイズす るであろう。ポリメラーゼの添加時において、「第一の」及び（核酸分子が二本 鎖であるならば）「第二の」プライマーの３′末端が伸長するであろう。「第一 の」プライマーの伸長は、所望の核酸の相補物の正確な配列を有するＤＮＡ分子 の合成をもたらすであろう。「第二の」プライマーの伸長は、所望核酸の正確な 配列を有するＤＮＡ分子の合成をもたらすであろう。

「第一の」プライマーの伸長産物は「第二の」プライマーの配列に対し相補的な 配列を含み、故に「第二の」プライマーの伸長産物の生成のための鋳型とじて働 くため、このＰＣＲ反応は特定の核酸配列の指数関数的な増幅が可能である。

同様に、「第二の」プライマーの伸長産物は必然的に「第一の」プライマーの配 列に対し相補的な配列を含み、故に「第一の」プライマーの伸長産物の生成のた めの鋳型として働くであろう。即ち、ハイブリダイゼーション、重合、及び変性 の循環をさせることにより、所望核酸分子の濃度の幾何級数的な増加が達成でき る。ポリメラーゼ連鎖反応の論評は、Ｋ、Ｂ、ミニリス［コールド・スプリング ・ハーバ−・ンンポジア・オン・クラオンティタテイブ・バイオロジー（Ｃｏｌ ｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｓｙｍｐ、Ｑｕａｎｔ、Ｂｉｏｌ、）５１巻２ ６３−２７３頁（１９８６）］　：Ｒ，に、サイキ等［バイオ／子クツロン−（ Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）３巻１００ｇ−１０１２頁（１９８５）コ　： 及びＫＢ、ミニリス等［メソッズ・イン・エンザイモロ）−（Ｍｅ　ｔ、Ｅ　ｎ 　ｚ　ｙｍｏｌ、）１５５巻３３５−３５０頁（１９８７）、これらの記載は引 用して本明細書の一部とする〕により提供されている。。

ＰＣＲ技術は、これが迅速な且つ大量のポリヌクレオチド分子の増幅を達成でき るという点で有用である。しかしながらこの方法は、標的配列に隣接する二つの オリゴヌクレオチド配列とハイブリダイズする二つの異なったプライマーの調製 を必要とする。この二つのプライマーの濃度は該反応にとって律速であり得る。

二つのプライマーの濃度が等しいことは必須ではないが、二つのプライマーの濃 度間の格差は反応の通算収率を著しく低下させ得る。

ＰＣＲ反応のさらなる不利な点は、二つの異なったプライマーが使用された場合 、選ばれる反応条件は、どちらのプライマーも同じような効率でロプライミング する」ような条件でなければならないということである。二つのプライマーは必 然的に異なった配列を持っているため、この必要条件はプライマーの選択を束縛 し、かなりの実験を要求する。さらに、二つの異なる配列をＰＣＲを用いて同時 に増幅しようとする場合（即ち、二つのプローブを２組使用する）、反応条件は 四つのプライマーに対して最適とせねばならない。

その他の既知の核酸増幅法には、転写に基づく増幅系「Ｄ、クウォウ等、プロシ ーディングズ・オン・ザ・ナショナル・アカデミ−・オン・サイエンシズ（Ｐｒ ｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）（Ｕ、Ｓ、Ａ、）８６巻１１７３頁（１ ９８９）：ＴＲ，ジンンエラス等、ＰＣＴ出願ＷＯ３８／１０３１５　（優先権 米国特許出願第０６４１４１及び２０２９７８号）］が包含される。得られる「 ンーオリゴヌクレオチド」の配列を有する核酸の存在下での二つ（またはそれ以 上）のオリゴヌクレオチドの連結に基づく、故に該ジ−オリゴヌクレオチドを増 幅させる方法もまた知られている［Ｄ、Ｙ、ウー等、シーノミクス（Ｇｅｎｏｍ ｉｃｓ）４巻５６０頁（１９８９）コ。

Ｈ，１，ミラー等、ＰＣＴ出願ＷＯ３９１０６７００（優先権：１９８８年１月 ２１日出願の米国特許出願第１４６４６２号）は、プロモーター／プライマー配 列を標的の一本鎖ＤＮＡ　（ｒｓ　５ＤＮＡＪ　）にハイブリダイゼーションし 、続いてこの配列のＲＮＡコピーを多数転写することに基づく核酸配列増幅方法 を開示している。この方法は着層的でなかった。即ち新しい鋳型は、得られたＲ ＮＡ転写物からは生産されなかった。

Ｃ，ディビー等（欧州特許出願公開第３２９８２２号）は、−末鎖ＲＮＡ（ｒｓ ｓＲＮＡＪ）　、５ｓＤＮＡ、及び二本鎖ＤＮＡ　（ｄｓＤＮＡ）の循環的合成 を含む核酸増幅法を開示している。５ｓＲＮＡは第一のブライマーオリゴヌクレ オチドのための第一の鋳型であり、これが逆転写酵素（ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメ ラーゼ）によって伸長される。次いで、得られたＤＮＡ　：ＲＮＡ二本鎖からこ のＲＮＡが、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮＮアーゼ０ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれ かと二本鎖の状態にあるＲＮＡに特異的なＲＮアーゼ。）の作用によって除去さ れる。

得られた５ｓＤＮＡは第二のプライマーのための第二の鋳型であり、これはさら にＲＮＡポリメラーゼプロモーター（例えばＴ７ＲＮＡポリメラーゼ）５゛から その鋳型に対する相同までの配列を含む。次いでこのプライマーをＤＮＡポリメ ラーゼ（例えば大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩの大きな「フレノウ」フラグメント ）によって伸長し、プライマー間の元のＲＮ、Ａと同一の配列を持ち、さらに一 方の端にプロモーター配列を有する二本鎖ＤＮＡ　（ｄｓＤＮＡ）分子を得る。

このブロモーター配列は、適当なＲＮＡポリメラーゼにより該ＤＮＡのＲＮＡコ ピーを数多く作るために使用することができる。次いでこれらのコピーは、極め て迅速な増幅を導く循環に再び入る。、酵素の適正な選択により、二の増幅は、 各循環の時点で酵素を添加せずに等温で実施することができる。この方法の循環 的性格のため、出発配列はＤＮＡまたはＲＮＡのいずれの形で選択することもで きる。

上の増幅法は全て、一つの循環の最終生成物は出発物質と機能的に同一であると いう原理に依存している。したがって、循環を繰り返すことにより核酸は指数関 数的に増幅される。

温度循環を用いる方法、例えばＰＣＲまたはり、　Ｙ、　ウー等、ジーノミクス （Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）４巻５６０頁（１９８９）は、各々の循環において各鋳型 から一つの生成物が作られるため、生成物の理論的最大増加は−サイクルにつき ２倍である。実際には増加は常に２倍より低い。さらに増幅を遅らせるのは温度 の変更に要する時間である。さらに遅延を付は加えるのは、−サイクルにおいて 全分子に工程を終了させるために充分な時間をかける必要性である。一つの工程 を速やかに終えた分子は、循還の次工程に進む前に、より遅い分子が工程を終え るのを「待機」せねばならず、循環時間を短縮すればそれは「より遅い」分子が 一つの工程を飛び越す二とになり、増幅の指数がより低くなる。

転写工程を含む方法、例えば本発明方法またはＣ，ディビー等（欧州特許出願公 開第３２９８２２号）の方法は、各サイクルにおいて生成物を２より大きな係数 で増加させることができる。事実１００またはこれ以上の転写物が一つの鋳型か ら作られるというように、増加係数１００またはそわ以上が理論的には容易に達 成てきる。さらに、もし全工程が同一条件下で実施されれば、ある工程を終了し た分子が次の工程に進む前に「待機」する必要が無い。このように、転写に基づ き温度循環を必要としない増幅は、ＰＣＨのような１實循環性増幅よりはるかに 迅速である可能性があるわ 本発明はＤ　Ｎ　Ａ増幅を仲介するための別途な方法を提供するものである。特 にこれは、ディビー等（欧州特許出願公開第３２９８２２号）の方法に対する改 良を含んでいる。

発明の要約 本発明は核酸分子の増幅を達成する方法に関するものである。本発明はこの目標 を、増幅されるべき標的配列（即ち「所望」配列）に対して操作可能に結合した プロト−プロモーターを有する核酸分子を作り出すことによって達成する。

詳細には、本発明は、３゛ヒドロキシ末端を有する所望核酸分子を増幅する方法 であって、循環的な以下の工程からなる方法を提供する：（Ａ）該所望核酸分子 をプロト−プロモーター含有核酸分子の存在下でインキュベートしにこで該プロ ト−プロモーター含有核酸分子は、該所望分子の３°末端領域に存在する配列に 対し相補的な第一領域、及び５゛から該第−領域までに位置し、該プロト−プロ モーターを含む第二領域を含み、：該プロト−プロモーター含有核酸分子はさら に、ポリメラーゼによって伸長され得ない３°末端を有し：該インキュベーショ ンは、核酸のハイブリダイゼーションを起こして、該プロト−プロモーター含有 核酸分子の該第一領域及び該所望分子の３′末端領域からなるハイブリダイズさ れた二本鎖分子を生成させるに充分な条件下にある］　：（Ｂ）ハイブリダイズ した分子を、所望分子の３°末端を鋳型依存的方式によって伸長することのでき る酵素の存在下でインキュベートし、それにより該プロト−プロモーターを、所 望分子を転写できるプロモーターに変換し：（Ｃ）このプロモーターを、所望分 子のプロモーター依存性転写のできるＲＮＡポリメラーゼの存在下でインキュベ ーション、それにより所望核酸分子に対し相補的なＲＮＡ分子を生成させ； （Ｄ）このＲＮ、Ａ分子をプライマーの存在下でインキュベートシ［ここで、プ ライマー（謡、このＲＮＡ分子の３°末端領域に存在する配列に対し相補的な領 域を有し；インキュベーションは、核酸のハイブリダイゼーションを起こさせ、 且つ、該プライマー及びこのＲＮ　Ａ分子の３“末端領域を含むハイブリダイズ された二本鎖分子を生成するに充分な条件下にある］　：そして、（Ｅ）鋳型依 存性ポリメラーゼを使用してプライマーを伸長し、それにより所望核酸分子の増 幅を達成する。

さらに本発明は、プロモーターがＴ７プロモーターであり、ＲＮＡポリメラーゼ が鋳型依存性逆転写酵素、またはＴ７ＲＮＡポリメラーゼである、上の方法の態 様を提供する。

さらに本発明は、所望の核酸分子が一本＠　Ｄ　Ｎ　Ａであり、この方法が工程 （、へ）で開始する循環である、上の方法の態様を提供する。

さらに本発明は、所望の核酸分子が二本鎖Ｄ　Ｎ　Ａであり、この方法が工程（ Ａ　）で開始する循環である、上の方法の態様を提供する。

さらに本発明は、所望の核酸分子が一本鎖ＲＮＡであり、この方法が工程（Ｄ） で開始する循環である、上の方法の態様を提供する。

さらに本発明は、所望の核酸分子が二本鎖ＲＮＡであり、この方法が工程（Ｄ） で開始する循環である、上の方法の態様を提供する。

さらに本発明は、所望の核酸分子を増幅するためのキットを提供し、このキット は、プロト−プロモーターを含む核酸分子を入れた第一の容器〔二〇で該プロト −プロモーター含有核酸分子はポリメラーゼにより伸長され得ない３゛末端をさ らに有している］、及び所望配列に対する相補物の３°末端領域に存在する配列 に対し相補的な配列領域を有する少なくとも一つのプライマー分子を入れた第二 の容器を、近接した区分化の下で含むよう特に適合させである。

さらに本発明は、ＤＮＡポリメラーゼ及び／またはＲＮＡポリメラーゼ（特にＴ ７ＲＮＡポリメラーゼ）をさらに含む上のキットので様を提供する。

図面の簡単な説明 図１は、Ｃディビー等によって使用された５ｓＤＮＡ分子を増幅する方法を示す 。

図２は、Ｃ，ディビー等によって使用されたＲＮＡ分子を増幅する方法を示す。

図３は、いかにして本発明がＲＮＡ分子の増幅を達成するかを例示している（記 号「■」は、分子の３゛末端がブロックされていることを意味する）。

図４は、いかにして本発明がＲＮＡ分子の増幅を達成するかを例示している（記 号「■」は、分子の３°末端がブロックされていることを意味する）。

発明の詳細な説明 本発明は、試料中の所望の核酸分子を増幅するための方法を提供するものである 。このような試料は、細菌またはウィルス調製物から誘導される試料を含む人間 または他の動物から誘導される生物学的試料（例えば、血液、糞便、痰、粘液、 血清、尿、唾液、涙液、生検試料、組織学的組織試料、Ｐ　、Ａ　Ｐ塗抹標本、 奇胎、いぼ、農産物、排水、飲料水、牛乳、加工食品、空気等）、並びにその他 の試料（例えば、農産物、排水または飲料水、牛乳または他の加工食品、空気等 ）を含み得る。

本発明を単純化且つ例示する目的のために、表象的な図解を提供する。係る例示 において、一本！ＲＮＡはｒ＝＝＝＝＝Ｊでニー末鎖ｄＴ含有ＤＮＡは「−□」 て表わす。二本鎖の核酸分子は接近させた水平の線で表わす。幾つかの図におい ては、標的分子またはプライマーの配列領域を強調するためにｒＡＪ、「Ｂ゛」 または他の記号を使用する。このような配列領域は、配列「Ａ′」または「Ｂ゛ 」に対してそれぞれ実質的に相補的である。Ｂ゛配列ｍＲＮ、Ａのポリ（Ａ）尾 であり得る。好ましい態様において、Ｂはオリゴ（ｄＵ）である。デオキシウリ ジン含有配ダ１の使用は、所望ならば、該分子をＵＤＧのような酵素の存在下で 処理することにより、配列を破壊させる。

大発明は、所望の核酸分子の増幅を達成するために様々な異なった酵素を使用す る。「ポリメラーゼ」は、核酸分子が適当な鋳型核酸分子とハイブリダイズして いる場合、核酸分子の３゛ヒドロキシ基を伸長させるためにヌクレオシド三燐酸 を取り込むことのできる酵素である。ポリメラーゼ酵素は、Ｊ、Ｄ、ワトソン、 モレキュラー・バイオロンー・オブ・ザ・ジーン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉ。

１ｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｇｅｎｅ）第３版、Ｗ、Ａ、ベンジャミン、Ｉｎｃ、 、メンロパーク、ＣＡ（１９７７）（この記載は引用して本明細書の一部とする ）及び類似の教科書に議論されている。好ましいＤＮＡポリメラーゼはＴａｑポ リメラーゼ（シータス）である。一般に「フレノウ」ポリメラーゼとして知られ る細菌大腸菌のＤＮＡポリメラーゼＩの大きな蛋白分解性フラグメント、大腸菌 ＤＮＡポリメラーゼ■、及びバクテリオファージＴ７ＤＮＡポリメラーゼのよう な他のポリメラーゼもまた本明細書に記載の方法の実施に使用することができる 。

酵素Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼはＲＮＡの転写的増幅のための好ましい酵素である 。この酵素はプロモーターサイトに結合して転写を仲介する［ディビー等（欧州 特許公開第３２９８２２号。その全体を引用して本明細書の一部とする。）参照 コ。本発明は、部分的には、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼが二本鎖Ｔ７プロモーター に結合することができるという発見から誘導されたものである。重要なことに、 Ｔ７プロモーターが二本鎖である限り、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは所望の核酸分 子に結合してこれを転写しＲＮＡを形成させることができる。所望の核酸分子は 全体が二本鎖ＤＮＡである必要はなく、Ｔ７プロモーターが二本鎖ＤＮＡとして 存在する限り、ＲＮＡ転写（Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いてＴ７プロモーター から）は部分的二本鎖のＤＮＡ分子を用いて起こるであろう［Ｊ、　Ｆ、ミリガ ン等、ヌクレイツク・アシズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ 、）１５巻８７８３−８７９８頁（１９８７）。その全体を引用して本明細書の 一部とする。］。

「鋳型に依存する方式」という語は、新たに合成される核酸の鎖の配列が相補的 な塩基の対形成に従う、ＲＮＡまたはＤＮＡの核酸合成を意味する。

酵素的反応、例えば重合反応が行なわれる場合、このような反応に必要な成分は 、反応容器中に「過剰に」供給するのが好ましい。増幅反応の成分に関する「過 剰に」とは、所望の増幅を達成する能力が、その成分の濃度により実質上限定さ れないような各成分の量を意味する。

プライミング、プライマーの伸長、もしくは鎖の置換の程度もしくは速度を増加 させる条件または試薬は、本発明に係る方法によって得られる増幅の程度を増加 させ得る。例えば、ヘリカーゼまたは一本鎖核酸結合蛋白の添加はＤＮＡポリメ ラーゼの鎖置換速度を増加させ得、または、通常実質的な増幅を与えることので きないＤＮＡポリメラーゼの使用を可能にすることができる。

検定混合物には、Ｍｇ”のような必要な補助因子、及びｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ。

ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ％ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰＳＵＴＰまたは他のヌクレオシド 三燐酸を、所望の増幅の程度を支持するに充分な量で供給するのが望ましい。塩 基の対形成、ポリメラーゼ及び鎖の置換機能が、増幅が所望の程度まで進行しな いという点で悪影響を受けないならば、ヌクレオシド三燐酸類似体等（Ｊ、　Ａ 。

ピチリーリ等、ネイチャー３４３巻３３−３７頁（１９９０）を、上に特記した ものに置換または添加することができる。

プライマーの伸長は、ｃＤＮＡの生成に使用されるのと同じ逆転写酵素を用いて 実施することができる。別法として、ｃＤＮＡの伸長のために新たなりＮＡポリ メラーゼを添加することもできる。ＲＮＡのｃＤＮＡからの除去は、好ましくは ＲＮＮアーゼ処理またはヘリカーゼの作用によって行なうが、物理的変性、例え ば熱、ホルムアミド、もしくはアルカリ（高いｐＨ）によって行なうこともでき る。後者の場合、もし再生の速度が充分高いならば、この工程に続いてｃＤＮＡ 及びＲＮＡの物理的な分離または例えばＲＮアーゼもしくはアルカリによるＲＮ Ａの減成を行なわねばならない。充分苛酷なアルカリ処理はｄＣを脱アミノして ｄＵを形成させ、突然変異を起こし得ることに留意されたい。

ＲＮＮアーゼ活性を有する逆転写酵素によって逆転写を行なうことができる；こ のような酵素の使用は、ＲＮＮアーゼの不十分なポリメラーゼ（例えばスーパー スクリプト”　（ＢＲＬ））のような逆転写酵素より好ましい。ＲＮＮアーゼ活 性を有する酵素を使用するならば、反応条件を注意深く選択することによって、 別個のＲＮＮアーゼ消化工程を省略することが可能である。

この増幅反応に使用される全ての酵素、逆転写酵素、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、 ＲＮアーゼＨ１及びＴ４ＤＮＡリガーゼは、同じ反応条件下で活性であることが できる。事実、全酵素がそれらの最適な反応条件に近い緩衝液が存在する。故に 本発明に係る増幅法は、反応体の添加または温度循環のようないかなる条件の変 更もすることなく単一の反応容量において行なうことができる。したがって、こ の方法は分子レベルにおいて幾つかの工程を有してはいるが、操作上は単一の工 程である。いったん反応体を混合してしまえば、この増幅反応が１またはそれ以 上の成分を涸渇するまでいかなるものの添加も、また、条件、例えば温度の変更 も必要ではない。この間、増幅される核酸配列は何倍にも増加するであろう。増 加のレベルは多くの目的について充分であるが、幾つかの目的のためには、所望 の増幅のレベルを達成するために、反応を新しい成分を用いて反復しなければな らない。

本発明の特定の態様に使用される条件を規定する際、幾っがの、プライマーの介 在する、標的と独立した反応があり、これらが増幅効率を低下させるため、検定 を最適化する間に調べなければならない。第一に、それ自身またはプロト−プロ モーターの一本鎖部分に反応開始させ得ないプライマーを選択せねばならない。

第二に、幾つかの場合プライマーはＴ７ＲＮＡポリメラーゼのための鋳型として 働き［Ｌ、シャーミン等、ヌクレイツク・アシズ・リサーチ（ＮｕｃｌｅｉｃＡ ｃ　ｉｄｓ　Ｒｅｓ、）１５巻６７０５−６７１１頁（１９８７）］、そのブプ ライマに対し相補的な転写物を生成し、それにより以後のＲＮＡのプライミング を損なう。第三に、異常な、プロモーターに独立した転写反応において、プライ マーはＤＮＡ鋳型としても働き得る［Ｇ、タラップ、ヌクレイツク・アシズ・リ サーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）１７巻３０２３−３０３６ 頁（１９８９）］。この反応の、プライマーからＤＮＡ／ＲＮＡキメラ生成物へ の転換は、以後のＲＮＡのプライミングを著しく損なうであろう。プライマーの 配列分析によってのみ判断されるプライマー相互作用の予測は、しばしば不充分 である。可能性ある妨害反応の見込みを最小限にするためには、候補となるプラ イマーを、増幅法に使用する前に、それらの問題の各々を指向する反応において 試験すべきである。このような例の一つは、他の酵素またはＤＮＡの不在下で、 Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによる候補プライマーの３゛末端へのヌクレオチドの添 加を測定することである。最後に、このＤＮＡ増幅法において、標的からのみ由 来する配列が、増幅されるものの全てであって、プライマー及びプロト−プライ マー中の配列もまた増幅産物中に存在する。増幅配列が実際に標的配列を含んで おり、プロトプライマーまたはプライマー配列だけでないことを確認せねばなら ない。

この発明は、分子生物学の分野における他の多くの方法と組み合わせて特定の目 的を達成することができる。特に興味深いのは、核酸試料中の他の配列から標的 配列を精製することである。これは、標的に対し相補的であって固体支持体に固 定したオリゴヌクレオチドに、核酸試料をアニーリングすることによって最も有 利に達成することができる。使いやすい支持体はマイクロビーズ、特に磁性マイ クロビーズである。このように結合させた後、非標的配列は洗い流すことができ 、その結果完全なまたは部分的な精製ができる。

増幅を行なった後に、生成された増幅産物を検出したいことがあるかも知れない 。当分野で知られる数多くの技術を、過度の実験をすることなくこの目的に適合 させることができる。幾つかの状況において特に有利なのは、標的配列によって 決定されたＲＮＡ配列に対し相補的なりＮＡオリゴヌクレオチドによるＲＮＡ増 幅産物の捕捉である［ここでこのオリゴヌクレオチドは、磁性マイクロビーズの ような固体支持体に結合している〕。好ましくはこのオリゴヌクレオチドの配列 は、増幅前の標的の精製に用いられるいかなるオリゴヌクレオチドの配列とも重 複していない。このようにして形成されたＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドは、次に 、ＲＮＡ：　ＤＮＡへテロ二本鎖と結合する抗体によって検出することができる 。

係る抗体の結合の検出は、当分野で知られる多（の方法によって実施することが できる。

別法として、増幅された核酸は、当分野でよく理解されるように、ゲル電気泳動 、ハイブリダイゼーション、またはこの二つの組合せによって検出することがで きる。当業者は、本発明を適合させて多くの検出法に取り入れ得ることがわかる であろう。

本発明方法にしたがって増幅された配列は、精製して（例えばゲル電気泳動、カ ラムクロマトグラフィー、親和クロマトグラフィー、ハイブリダイゼーション等 により）、精製された生成物を含む画分を、本発明方法によるさらなる増幅に付 すことができる。本発明により提供される、試料中の所望の核酸分子を増幅する 方法は、任意の所望核酸分子の増幅に使用することができる。係る分子はＤＮＡ またはＲＮＡのいずれであってもよい。この分子は試料中に存在する他の核酸分 子とホモローガスであってよい（例えばこれは人間の細胞生検から分離されたヒ ト染色体のフラグメント等であってよい）。これに対して、この分子は試料中に 存在する他の核酸分子とへテロローガスであってもよい（例えばこれは、人間の 血液、糞便等の試料から分離されたウィルス、細菌、または真菌の核酸分子であ ってよい）。本発明方法は、ヘテロローガスな分子とホモローガスな分子の両者 を同時に増幅することができる。例えば、ウィルスに感染した人間の組織試料の 増幅の結果、ウィルス及び人間の配列の両者を増幅することができる。

本明細書中使用される「増幅」とは、試料中に存在する所望の核酸分子の量の増 加を意味する。「実質的な増幅」とは、約３倍以上の増幅を意味する。

「配列領域」は、本発明方法の例示のための概念上の助けである。「配列領域」 とは、単に、本発明に従って所望分子の増幅を達成するために使用される特徴ま たは属性を示す、所望分子の全ヌクレオチド配列中に含まれるヌクレオチドの配 列であるに過ぎない。特記しない限り、「配列領域」の特定のヌクレオチド配列 が、所望の核酸分子を増幅するために既知である必要はない。配列領域の例は、 プロト−プロモーターを含む領域、係る領域に結合することのできる配列領域等 を包含する。

本明細書中、二つの配列は、これらが逆平行の二本鎖核酸の構造を形成できるな らば、互いにハイブリダイズ可籠であると言う。係る二本鎖構造の形成に好適な 核酸ハイブリダイゼーションの条件は、Ｔ、マニアティス等［モレキュラー・ク ローニング、ア・ラボラトリ−・マニュアル（Ｍ０１６（ｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉ ｎｇ、Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）、コールド・スプリング・ハ ーバ−・ラボラトリーズ、コールド・スプリング・ハーバ−１ＮＹ（１９８２） コ、及びＢ、　Ｄ、ヘイムス等［ヌクレイツク・アシド・ハイブリダイゼーショ ン、ア・プラクティカル・アプローチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｈｙｂｒｉ ｄｉｚａｔｉｏｎ、　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ）、ＩＲＬプ レス、ワシントンＤＣ（１９８５）］により記載されている。二つの配列は、そ れらが違いにハイブリダイズして安定な逆平行二本鎖核酸構造を形成し得るなら ば、互いに「相補的」であると言う。即ちそれらの配列は正確な相補性を示す必 要はなく、単に、配列が充分相補的であって安定な二本鎖構造を形成できればよ いのである。したがって、完！な相補性からの逸脱は、係る逸脱が二本鎖構造を 形成するためのハイブリダイゼーションを完全に妨げるに充分でない限り、許容 できる。

本方法は、増幅されるべき分子が特定の配列または長さを有していることを必要 としない。特に、増幅され得る分子は、任意の天然に存在する原核生物（例えば 病原菌または非病原菌、ニジエリチア、サルモネラ、クロストリジウム、アブロ バフタ−、スタフィロコッカス及びストレプトマイセス、ストレプトコッカス、 リケッチア、クラミジア、マイコプラズマ等）、真核生物（例えば原生動物及び 寄生虫、真菌、酵母、高等植物、哺乳類及び人間を含む下等及び高等動物）また はウィルス（例えばヘルペスウィルス、ＨＩＶ、インフルエンザウィルス、エプ スタイン−バーウィルス、肝炎ウィルス、ポリオウィルス等）またはウィロイド の核酸を包含する。さらにこの核酸分子は、化学合成されたまたはされ得る任意 の核酸分子であってよい。即ち、この核酸配列は天然に見いだされても見いださ れなくともよい。

増幅されるべき所望の核酸分子は二本鎖または一本鎖の形のいずれであってもよ い。しかしながら、もしその核酸が増幅反応の開始時に二本鎖であるならば、好 ましくはその二本の鎮をまず一本鎖、または部分的に一本鎖の形にするよう処理 する。例えば加熱、またはアルカリ処理、または酵素的方法（例えばヘリカーゼ の作用等）、または蛋白の結合などといった、二本鎖の核酸を一本鎖または部分 的−末鎖の形にする方法が知られている。この処理を達成する一般的方法は、７ 、７ニアテイス等［モレキュラー・クローニング、ア・ラボラトリ−・マニュア ル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａ ｎｕａ　Ｉ）、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリーズ、コールド・ スプリング・ハーバ−１ＮＹ　（１９８２）］　、及びＢ、　Ｄ、ヘイムス等［ ヌクレイツク・アシド・ハイブリダイゼーション、ア・プラクティカル・アプロ ーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、Ａ　Ｐｒａｃ ｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ）、ＩＲＬプレス、ワシントンＤＣ（１９８５） コにより提供されており、これらの記載は引用して本明細書の一部とする。

二本鎖ＤＮＡ、または−末鎖ＤＮＡ以外の核酸、例えば一本ＭＲＮＡ、二本鎖Ｒ ＮＡまたはｍＲＮＡを含む高分子を、本発明方法によって増幅することができる 。例えば、あるウィルスのＲＮ、Ａゲノムは逆転写酵素のような酵素との反応に よってＤＮＡに変換することができる［Ｔ、マニアティス等、モレキュラー・ク ローニング（ア・ラボラトリ−・マニュアル）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｏｏｎ ｉｎｇ（Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ））、コールド・スプリング ・ハーバ−・ラボラトリ−１１９８２；に、Ｆ、　ノーマン等、ヌクレイツク・ アシズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）第１６巻１０３６ ６頁（１９８８）］。次いで逆転写酵素反応の生成物を本発明に従って増幅する ことができる。

本発明はＣ，ディビー等（欧州特許出願公開第３２９８２２号）により記載され たものの改良である。本発明方法を説明するために、係る方法を、Ｃ，ディビー 等により用いられた５ｓＤＮＡまたはＲＮＡの「所望核酸分子」を増幅する方法 と比較する。

Ｃ，ディビー等により使用された５ｓＤＮＡ分子を増幅する方法を図１に示す。

Ｃ，ディビー等により使用されたＲＮＡ分子を増幅する方法をｖ！Ｊ２に示す。

理解できるように、Ｃ，ディビー等によって記載された５ｓＤＮＡ分子を増幅す る方法の重要な特性は、ハイブリダイズされたプライマーを二本鎖分子が作り出 されるまで伸長するＤＮＡポリメラーゼ、例えば逆転写酵素の使用である。次い でこの方法は、この二本鎖分子を増幅する。

同様に、Ｃ，ディビー等により記載されたＲＮＡ分子を増幅する方法においては 、該ＲＮＡ分子に対し相補的なｃＤＮＡ分子を生成させるために逆転写酵素を使 用する。この分子はｃＤＮＡ：　：ＲＮＡ二本鏑末鎖を形成し、次にこれが該方 法によって増幅されて二本鎖ＤＮＡ分子を形成する。次いで該方法がこの二本鎖 分子を増幅する。

上に論じたようにＴ７ＲＮＡポリメラーゼは一本鎖の鋳型を転写することができ る（但しＴ７プロモーター領域が二本鎖であれば）。本発明は、ハイブリダイズ する核酸分子を使用することによりこの性質を利用するものである。この分子は 、増幅されるべき所望のＤＮＡまたはＲＮＡ分子中に存在する配列領域と特異的 にハイブリダイズすることのできる配列領域を有する。該分子はさらにＴ７プロ トープロモーター領域である配列領域を有している。プロト−プロモーターは、 二本鎖型においてＲＮＡ転写を仲介することのできる一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ 配列領域である。最も好ましいプロト−プロモーターは、Ｔ７プロモーターを含 む一本鎖配列である［Ｊ、Ｆ、ミリガン等、ヌクレイツク・アンス・リサーチ（ Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）１５巻８７８３−８７９８頁（１９８ ７）］。この］プロトープロモータは、最初に二本鎖にされ（それによりプロモ ーターを形成する）なければ実質上転写を仲介することができない。／％４ブリ ダイズする配列領域は、好ましくはプロト−プロモーター配列領域に対し３゛に 位置するであろう。重要なことに、この分子の３゛末端はブロックされ、したが ってプライマー伸長反応の基質として働くことができない。この３゛末端は、例 えば３゛ヒドロキシ基を欠く３′末端ヌクレオチド（例えば３′デオキシアデノ シン等）の使用によってブロックすることができる。

このような核酸分子が、３゛ヒドロキシ末端を有する線状または線状化された所 望分子とハイブリダイズする時、３゛末端は伸長して、それにより該核酸分子の プロト−プロモーター領域に対し相補的な配列を含む伸長した所望分子を生成す ることができる。これらの相補的配列は互いにハイブリダイズし、それによりプ ロモーターを形成する。このプロモーターは所望分子の鋳型依存性転写を指令す る。本方法のこの工程が、所望核酸分子の大量の相補物を生み出す。

所望分子を増幅するために、転写されたＲＮＡの３°末端領域にｌｓ、４ブリダ イズすることのできるプライマー分子が添加される。このプライマー分子の３′ 末端はブロックされておらず、したがってｃＤＮＡの鋳型依存的形成のための基 質として働くことができる。本方法のこの工程は、前工程で生成された相補分子 のコピーそれぞれに対して１コピーの所望核酸分子を生成させる。

このように本発明は、図３に例示されるようにＤＮＡ分子の増幅を達成する。

同様に、本発明は図４に例示されるようにＲＮ　４分子の増幅を達成する。これ らの図において、記号「■」は、分子の３゛末端がブロックされていることを意 味する。

理解されるように、未知の配列の核酸分子は、その配列がＤＮＡポリメラーゼま たは逆転写酵素の作用を妨げ得るまたはブロックし得る二次構造を形成すること のできる領域を持っていることがある。同様に、係る核酸分子は内部的プロト− プロモーターを有することがある。二本鎖ＤＮＡ分子の形成が、このようなプロ モーターに転写を仲介させるよう働き、したがって増幅過程を損なうことがある 。認められるように、ディビー等の方法のこれらの欠点は本発明方法の使用によ って回避される。

本発明は「キット」のような製造品を包含する。一つの態様において、このよう なキットは、典型的には、プロト−プロモーターを含む核酸分子を入れた箪−の 容器、及び所望配列の相補物の３°末端領域に存在する配列に対し相補的な配列 領域を有する少なくとも一つのプライマー分子を入れた第二の容器を近接した区 分化のもとに含むよう特に適合させである。さらにこのキットは所望により、１ またはそれ以上のＤＮＡ及び／またはＲＮＡボリメラーセ、緩衝剤等を、所望の 核酸分子を増幅させるに充分な量で含むことができる。加えてこのキットは使用 説明書等を含むことができる。

ここに本発明を一般的に説明してきたが、本発明は以下の実施例を参照すること によってより容易に理解される。この実施例は例示のために供されるものであっ て、特記されない限り本発明の限定を意図するものではない。

実施例］、ＲＮ、４分子の核酸配列の増幅材料及び方法： 試薬・ オリゴヌクレオチドはアプライド・バイオシステムズ３８０Ａ　ＤＮ、Ａ合成機 を用いてシアノエチルホスホアミダイト化学により合成した。合成に使用される 試薬はクルアチェムから購入した。オリゴヌクレオチドは変性ポリアクリルアミ ドケル電気泳動によって精製した。ＤＮＡを、２０ｍＭトリスＨＣＩ　（ｐＨ８ ゜０）、０．５Ｍ酢酸アンモニウム、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．０１％ドデンル硫 酸ナトリウムで３７℃で１６時間ケルマトリックスから溶出し、次いでファルマ ／ア由来のＰＤ−１０カラムを用いる分子排除クロマトグラフィーによって脱塩 した。プロト−プロモーターオリゴヌクレオチドを、ブロックされた３′末端に よって、オリゴヌクレオチド合成用にコルジセピンで修飾したＣＰＧカラムを用 いて組み立てた。

この増幅法のためｌこ使用される酵素（Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、大腸菌ＲＮア ーゼＨ１スーパースクリプト（商標）ＲＮＮアーゼ−逆転写酵素）はライフ・チ クノロシーズ、Ｉｎｃ、／ＢＲＬから入手した。ＲＮａｓｉｎリボヌクレアーゼ インヒビターはプロメガからのものであった。デオキシリボヌクレオシド三燐酸 （ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ）及びリボヌクレオノド三燐酸（ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ及びＵＴＰ）はファルマシアから１００ｍＭの溶液とし て購入した。緩衝剤の構成成分のために用いられた生化学物質はシグマからのも のであった。

ＲＮＡ被検体の調製。

ヒト乳頭腫ウィルス（ＨＰＶ）１６型のＬ１領域からのＤＮＡセグメントを、プ ラスミドベクターｐＴ７１　（ＵＳＢ）中Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター の後ろにクローニングした。インビトロの転写を、１．ｍ＋の反応中無機ピロホ スファターゼ（ＩＣＮ、２５Ｕ）及びヒト胎盤ＲＮアーゼインヒビター（プロメ ガ、２００Ｕ）の存在下でＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（ＢＲＬ、１２０００Ｕ）及 び１０Ｕｇのプラスミド鋳型を用いて実施した。反応物を３７℃で６０分間イン キユベートシ、次いでフェノール、クロロホルムの５０　：　５０混合物を用い て１回抽出した。ＤＮＡ鋳型をＲＮアーゼ不含ＤＮアーゼ（ＢＲＬ）を用いて減 成した。

ＲＮＡ転写物をＧ−５０（ファルマンア）サイズ排除カラムクロマトグラフィー により精製したつ平衡及び溶出緩衝液は、１００ｍＭ　ＮａＣ１及び０１％ＳＤ Ｓを含有するＴＥであった。

増幅 増幅反応は、２５μｍ容のＤ　ＯｍＭ　トリスＨＣＩ　（ｐＨ８，３）　、１７ ５ｍＭグルタミン酸カリウム、６％ポリエチレングリコール８０００．６ｍＭ　 ＭｇＣｌ２．１０ｍＭ　ＤＴＴ、１ｍＭ　ＡＴＰ、１ｍＭ　ＣＴＰ、１ｍＭ　Ｇ ＴＰ、１ｍＭ　ＵＴＰ、２５０μＭ　ｄ、ＡＴＰ、２５０μＭ　ｄＣＴＰ、２５ ０μＭｄＧＴＰ、２５０μＭ　ｄＴＴＰ、０．５μＭ　ｃＤＮ、Ａブライマーオ リゴヌクレオチド、Ｏ１２μＭのＴ７プロモーター含有鋳型オリゴヌクレオチド 、４００単位のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ、１５０単位のスーパースクリプト（商 標）ＲＮＮアーゼ−Ｃ−）Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素、０，０５単位の大腸菌リボヌ クレアーゼＨ１及び２０単位のＲＮａｓｉｎリボヌクレアーゼインヒビター中で 実施した。

反応混合物を氷上で調製し、ＲＮＡ被検体配列を加え、次いで３７℃で３時間イ ンキュベートした。反応は、ＨＴＢ３１細胞から調製された総ＲＲＮＡ１００ｎ のバックグラウンドにおいて、０．１０．１００．１０００．１００００、また は１０００００分子のＲＮＡ被検体配列をもって実施した。各反応物に同容量の ５０ｍＭ　ＥＤＴＡを加えることにより増幅を終了させた。

分析： 増幅産物は、この方法により生成されたＲＮＡに特異的な３２′Ｐ−標識オリゴ ヌクレオチドプローブを用いるドツト−プロットハイブリダイゼーションによっ て検定した。増幅産物（各反応物の１／１０容）及びＲＮＡ被検体の連続希釈物 （ハイブリダイゼーション標準として使用）を、本質的にはカーミカニル及びマ クマスターによる記載［メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔ、Ｅｎｚｙ ｍ。

１、）６５巻３８０−３９１頁（１９８０）］のようにしてグリオキサールとの 反応により変性させ、次いで製造者の指示に従い９６ウエルの多岐管（バイオラ ド・ラボラトリーズ、リッチモンド、ＣＡ）を用いて２ＯＸ　ＳＳＣ中バイオダ インＢナイロンメンブレン（ポール）に固定した。フィルターを８０℃で領　５ 時間焼き、続いて３０２ｎｍの透視機により２分間ＵＶ固定した。

オリゴヌクレオチドプローブを、製造者の指示に従って５　’　Ｄ　Ｎ　、Ａ末 端標識系（ライフ・チクノロシーズ、ｉｎｃ、／ＢＲＬ）を使用し１−２ｘｌＯ ’ｄｐｍ／μｇの比活性までキナーゼ反応により３２ｐで標識した。プローブは セファデックスＧ−５０（ファルマシアＬＫＢバイオテクノロジー・Ｉｎｃ、） を用いたゲル濾過によって精製した。

トントープロットメンブレンを、ＬＭ　ＮａＣ］、３０％ホルムアミド、５０ｍ Ｍ燐酸ナトリウム（ｐＨ７，４）　、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．１％ゼラチン、５ ０ｐｇ／ｍｌ酵母ｔＲＮＡ、及び５％ＳＤＳ中４２℃で３０分間プレハイブリダ イゼーションした。ハイブリダイゼーションを、１ｘ１０’ｄｐｍ／ｍｌのプロ ーブを含有する新鮮なハイブリダイゼーション溶液により４２℃で１６時間実施 した。ハイブリダイゼーションの後、フィルターを０．１ｘＳＳＣ，０，１％Ｓ ＤＳにより４２℃で５分間５回洗浄し、次いでコダックＸ　Ａ　Ｒ−ＲＰフィル ム及びクウォンタＩＩＩ増感スクリーン（デュポン）を用いて一７０℃のオート ラジオグラフィーに付した。

ＲＮＡ被検体配列の連続希釈に対するハイブリダイゼーション（ハイブリダイゼ ーション標準）と予め定められた濃度の標的投入から得られたＲ　Ｎ　Ａ増幅産 物との間の相対的信号強度の比較を用いて、本方法で達成される増幅の有効性を 決定した。

結果・ 標的の増幅は１ｘ１０７倍を超え、用量反応曲線は１０２ないし１０’の投入分 子においてほぼ直線であった。１００の標的分子を含む増幅反応から得られたハ イブリダイゼーション信号は、標的を欠（対照により生成された信号のほぼ５倍 強＜、１０”分子のハイブリダイゼーション標準の信号より僅かに強かった。

本発明を特定の態様に関連付けて記載してきたが、さらなる修飾が可能であるこ と、そしてこの出願が、一般に本発明の原則に従い且つ本発明の属する分野の中 の既知のまたは慣習による実施の範囲内にある、そしてこれまでに開示された及 び以下に付記された請求項の範囲における本質的特徴に対して適用することので きる、本開示からの逸脱を含む、いかなる改変、用途、または適合をも包含する ことを意図していることが理解できるであろう。

Ｂ　３’ ”　Ａｓ５ＤＮＡ被検体

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. １．３′ヒドロキシ末端を有する所望核酸分子を増幅する方法であって、循環的 な以下の工程： （Ａ）該所望核酸分子をプロトープロモーター含有核酸分子の存在下でインキュ ベートし［ここで該プロトープロモーター含有核酸分子は、該所望分子の３′末 端領域に存在する配列に対し相補的な第一領域、及び５′から該第一領域までに 位置し、該プロトープロモーターを含む第二領域を含み、；該プロトープロモー ター含有核酸分子はさらに、ポリメラーゼによって伸長され得ない３′末端を有 し；該インキュベーションは、核酸のハイブリダイゼーションを起こして、該プ ロトープロモーター含有核酸分子の該第一領域及び該所望分子の３′末端領域か らなるハイブリダイズされた二本鎖分子を生成させるに充分な条件下にある］（ Ｂ）ハイブダイズした分子を、所望分子の３′末端を鋳型依存的方式によって伸 長することのできる酵素の存在下でインキュベートし、それにより該プロトープ ロモーターを、所望分子を転写できるプロモーターに変換し；（Ｃ）該プロモー ターを、所望分子のプロモーター依存性転写のできるＲＮＡポリメラーゼの存在 下でインキュベートし、それにより所望核酸分子に対し棺桶的なＲＮＡ分子を生 成させ： （Ｄ）該ＲＮＡ分子をプライマーの存在下でインキュベートし［ここで該プライ マーは、該ＲＮＡ分子の３′末端領域に存在する配列に対し相補的な領域を有し ；インキュベーションは、核酸のハイブリダイゼーションを起こさせ、且つ、該 プライマー及びこのＲＮＡ分子の３′末端領域を含むハイブリダイズされた二本 鎖分子を生成するに充分な条件下にある］：そして、（Ｅ）鋳型依存性ポリメラ ーゼを使用してプライマーを伸長し、それにより所望核酸分子の増幅を逹成する 、 からなる方法。
2. ２．該ブロモ−ターがＴ７プロモーターである請求項１の方法。
3. ３．該ＲＮＡポリメラーゼがＴ７ＲＮＡポリメラーゼである請求項２の方法。
4. ４．核ポリメラーゼが鋳型支配逆転写酵素である請求項１の方法。
5. ５．該所望核酸分子が一本鎖ＤＮＡであり、該方法の全体が工程（Ａ）で開始す る循環である、請求項１の方法。
6. ６．該所望核酸分子が二本鎖ＤＮＡであり、該方法の全体が工程（Ａ）で開始す る循環である、請求項１の方法。
7. ７．該所望核酸分子が一本鎖ＲＮＡであり、該方法の全体が工程（Ｄ）で開始す る循環である、請求項１の方法。
8. ８．該所望核酸分子が二本鎖ＲＮＡであり、該方法の全体が工程（Ｄ）で開始す る循環である、請求項１の方法。
9. ９．所望の核酸分子を増幅するためのキットであって、プロトープロモーターを 含む核酸分子を入れた第一の容器［ここで咳プロトープロモーター含有核酸分子 はポリメラーゼにより伸長され得ない３′末端をさらに有している］、及び所望 配列の相補物の３′末端領域に存在する配列に対し相補的な配列領域を有する少 なくとも一つのプライマー分子を入れた第二の容器を、近接した区分化の下で含 むよう特に適合させてあるキット。
10. １０．ＤＮＡポリメラーゼをさらに含む、請求項９のキット。
11. １１．ＲＮＡポリメラーゼをさらに含む、請求項９のキット。
12. １２．該ＲＮＡポリメラーゼがＴ７ポリメラーゼである、請求項１１のキット。
13. １３．該ＤＮＡポリメラーゼが逆転写酸素である、請求項１１のキット。