JPH06256211A - ウイルス感染・増殖抑制剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 化１または化２で示されるペプチドを有効成
分とするウイルス感染・増殖抑制剤。 【化１】 【化２】 【効果】 ＨＩＶ、インフルエンザウイルスあるいはサ
イトメガウイルスの感染・増殖を抑制することができ、
これらのウイルスに基づく疾病の防御及び治療に有用で
ある。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ペプチド性のウイルス
感染・増殖抑制剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】ウイルス感染による疾患の克服のため
に、これまで多くの努力がなされてきた。しかし近年、
世界的にも猛威をふるっているヒト免疫不全ウイルス
（ＨＩＶ）や毎年流行するインフルエンザウイルスのよ
うにいまだ有効な予防法又は治療法の無いものもある。
ウイルス感染による疾患に対する治療法として抗ウイル
ス剤による化学療法がある。しかし現在のところ、全身
的に投与され明白な効果を示す抗ウイルス剤はほとんど
無い。その理由として、ウイルスは細胞内で増殖し、増
殖のための機能をほとんど細胞に依存している。つまり
ウイルスは感染後、その増殖を治療をすべき人体の構成
細胞自体の増殖機能を利用して行っている。従ってウイ
ルスの増殖を抑える化学物質の多くは細胞にも作用して
毒性を示すからである。抗ウイルス剤の問題点としては
上述のように薬剤の選択毒性が低いこと以外にもウイル
ス感染症の特徴から由来するいくつかの問題点がある。
特に急性・全身性のウイルス感染症では、症状が現れる
時期がウイルスの体内増殖のピークが過ぎてしまった後
なので、むしろウイルスの感染を阻止し増殖を抑制する
物質が求められている。この様にウイルスの感染を防御
する方法としてワクチンの予防接種による方法がある
が、この方法はしばしばアレルギー反応や種々の副作用
を示すことが知られており、しかもウイルスの変異に対
しては対処できないのが現実である。

【０００３】この様な状況において、本発明者らは、ラ
クトフェリン（ＬＦ）、トランスフェリン、オボトラン
スフェリンなど鉄結合能を有するタンパク質が、インフ
ルエンザウイルスやサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の
感染・増殖を抑制することを見出し特許出願を行った
（特開平2-233619) 。ＬＦは乳中に分泌される鉄結合性
のタンパク質で抗菌活性があることが知られている。Ｌ
Ｆは、ヒト、ウシ由来の物質について詳細な研究が行わ
れており、ヒト、ウシＬＦともその全アミノ酸配列がす
でに決定されている（M.W. Rey,et al.,Nucleic acid R
es.,Vol.18,5288,1990および P.E.Mead et al., Nuclei
c acid Res.,Vol.18,7167,1990) 。特開平1-233226公報
にはラクトフェリン等の乳蛋白質を有効成分とする抗ウ
イルス剤が開示されており、この中にＬＦが外被性ウイ
ルスおよび非外被性ウイルスに対し有効であることが記
載されている。また最近、本発明者らは、ＨＩＶに対す
るこれら鉄結合性タンパク質の感染・増殖抑制効果につ
いても確認しＬＦを有効成分とするＨＩＶ感染・増殖抑
制剤について特許出願を行った（特願平4-220635) 。

【０００４】この様に、ＬＦなど鉄結合性タンパク質は
ウイルスの感染・増殖抑制効果をもつことが次第にあき
らかとなり、抗ウイルス剤として、その実用化が期待さ
れてきた。これらタンパク質が実際に感染・増殖抑制剤
として用いられるためには、体内に投与した場合抗原
性の点で問題が無いこと、大量に供給できることが必
要である。これらの鉄結合性タンパク質のうち、ウシＬ
Ｆやウシトランスフェリン、又は鶏卵から得られるオボ
トランスフェリンは大量に供給できるが人体内に投与し
た場合抗原性を示すという問題がある。一方、ヒトＬＦ
は抗原性に関しては問題無いが大量に供給することが困
難である。上述した鉄結合性タンパク質のうちラクトフ
ェリンは、抗菌活性を有することが広く知られており、
最近ＬＦのアミノ酸配列中に存在し、抗菌活性を示すペ
プチドが単離された。ヨーロッパ特許公報ＥＰ-0474506
号にはヒトまたはウシＬＦ由来の抗菌活性を有するペプ
チドとして、化３、化４に示す物質が開示されている。

【０００５】

【化３】

【０００６】

【化４】

【０００７】このペプチドを配列中に含む抗菌性ペプチ
ドがBellamy らによってラクトフェリシン（Lactoferri
cin)と命名されている（W.Bellamy et al. Biochim. Bi
ophys. Acta, 1121, 130-136 ,1992 )。これらのペプチ
ドはグラム陰性細菌、酵母、カビなどに対して抗菌作用
を有していることが知られているが、抗ウイルス作用に
ついては全く知られていない。

【０００８】

【本発明が解決しようとしている課題】本発明者らは、
特開平2-233619号公報に開示されている鉄結合能を有す
るタンパク質のなかで最も強いウイルス増殖抑制活性を
持つＬＦについて、その活性部位を特定するためＬＦの
プロテアーゼ加水分解物からウイルス感染・増殖抑制効
果をもつペプチドを単離すること、又ＬＦのフラグメン
トペプチドを化学的に合成し、そのウイルス感染・増殖
抑制効果を検討することなどを行った。その結果、ヒト
ＬＦの場合、Ｎ末端側から２０−３７残基に相当するペ
プチドフラグメントが、ウシＬＦの場合同じくＮ末端側
から１９−３６残基に相当するペプチドフラグメント
が、ＬＦのウイルス感染・増殖抑制活性の作用部位であ
ることをつきとめた。また合成ペプチドを用いた研究か
ら、Ｓ−Ｓ結合によるループ構造（ヒトＬＦの場合²⁰
Cys-³⁷Cys 、ウシＬＦの場合¹⁹Cys-³⁶Cys ）が、活性に
は必ずしも必須ではないこと、このペプチドループの
アミノ末端側がアセチル化されていることあるいはアミ
ノ酸残基が延長されていることは、このペプチドループ
のウイルス感染・増殖抑制活性に好ましい影響を与える
こと、このループのカルボキシル末端側がアミド化さ
れていることあるいはアミノ酸残基が延長されているこ
とは、このペプチドのウイルス感染・増殖抑制活性に好
ましい影響を与えること、などを見出した。

【０００９】このペプチドループを含むＬＦフラグメン
トについては、これまで抗菌活性を示すこと(W. Bellam
y et al. Biochim. Biophys. Acta, 1121, 130-136 (19
92))あるいは(D. Legrand et al. Biochemistry, 31, 9
243-9251 (1992))が知られているが、これまでウイルス
の感染・増殖を抑制するという報告はなされていない。
本発明は、ＬＦのアミノ酸配列中に存在するペプチド、
もしくはそのペプチドの配列を含むペプチド誘導体を有
効成分とするウイルス感染・増殖抑制剤を提供すること
を課題とする。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明で提供されるウイ
ルス感染・増殖抑制剤中の有効成分は、化５、化６で表
される化合物からなる。

【００１１】

【化５】 （但しＡは、水素原子、アセチル基または２個のアミノ
酸よりなるペプチドの残基のいずれかであり、Ｂは、水
酸基、アミド、アミノ酸５個よりなるペプチドの残基の
いずれかを示し、-S-S- 結合は、還元状態の-SH であっ
てもよい。）

【００１２】

【化６】 但しＣは、水素原子、アセチル基または２個のアミノ酸
よりなるペプチドの残基のいずれかであり、Ｄは、水酸
基、アミド、５個のアミノ酸よりなるペプチドの残基の
いずれかを示し、-S-S- 結合は、還元状態の-SH であっ
てもよい。またペプチド残基としては、Ａ及びＣは、Th
r-Lys-あるいはPhe-Lys-などが、またＢ及びＤはIle-Ly
s-Arg-Asp-Ser-あるいはVal-Arg-Arg-Ala-Phe-等が好ま
しい残基として例示することができる。またこれらの薬
理的に許容される塩、例えば、塩酸基、酢酸塩等も用い
ることができる。

【００１３】ヒト、またはウシ由来のＬＦの全アミノ酸
配列は（M.W. Rey,et al.,Nucleicacid Res.,Vol.18,52
88,1990 および P.E.Mead et al., Nucleic acid Re
s.,Vol.18,7167,1990) に記載されており、上記アミノ
酸配列のうち、Cys-Phe-Gln-Trp-Gln-Arg-Asn-Met-Arg-
Lys-Val-Arg-Gly-Pro-Pro-Val-Ser-Cys の配列は、ヒト
ＬＦのアミノ酸配列の一次構造におけるＮ末端から２０
─３７番目の配列、Cys-Arg-Arg-Trp-Gln-Trp-Arg-Met-
Lys-Lys-Leu-Gly-Ala-Pro-Ser-Ile-Thr-Cys の配列はウ
シＬＦのアミノ酸配列の一次構造におけるＮ末端から１
９─３６番目の配列を含んでいる。この構造は上述した
ように、本発明のウイルス感染・増殖抑制剤の活性を発
揮するために必須である。以下、本発明においては、発
明のウイルス感染・増殖抑制剤中の有効成分のＬＦ由来
のアミノ酸配列を含む物質はウシＬＦ(19-36) のように
ラクトフェリン中のアミノ酸配列の番号で記載する。本
発明のペプチドを得るためには、通常の化学合成による
方法、ＬＦのプロテアーゼ分解物から分離する方法、遺
伝子組み換えによる方法などどれでも良い。例えば、化
３、化４の化合物を得るためには、上述のヨーロッパ特
許公報ＥＰ-0474506号に記載されたように、ヒトまたは
ウシＬＦをペプシンなどのプロテアーゼで処理後ＨＰＬ
Ｃ処理により得ることができる。さらに、市販のペプチ
ドシンセサイザー等の合成装置を用いて直鎖状のペプチ
ドを合成した後、Ｎ末端側のアミノ酸残基をアセチル化
等の末端処理を行った後、フェリシアン化カリウム存在
下で酸化処理を行うことによりCys-Cys のS-S 結合によ
る環化操作を行い、目的とするペプチドを得ることがで
きる。

【００１４】これらの、ペプチドまたはペプチド誘導体
は単独もしくは賦型剤、安定剤を添加して製剤化するこ
とができる。本発明のウイルス感染・増殖抑制剤は、経
口、注射、座剤として投与することができる。通常は、
成人１日当たり６〜３０g を投与することにより効果を
示す。特に、本発明によるウイルス感染・増殖抑制剤は
ウイルス感染前２４時間から感染後１時間の間に投与す
ることで効果的に作用させることができる。またこれら
ペプチドは従来から食品素材として用いられているタン
パク質の一部なので安全性の面でも問題無い。特にヒト
ＬＦ由来のペプチドフラグメントは、その抗原性が非常
に低いため実用上好ましい。以下に本発明によるウイル
ス感染・増殖抑制剤について実施例および実験例により
詳細に説明する。

【００１５】

【実施例１】ヒトＬＦ(20-37) 化７および〔²⁰CysSH, ³⁷CysSH〕ヒト
LF(20-37) の合成

【００１６】

【化７】

【００１７】ペプチドシンセサイザー431A (ABI 社）に
より、パラヒドロキシメチル フェノキシメチルポリス
チレン（ＨＭＰ）樹脂を用い、９−フルオレニルメチル
オキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基をアミノ末端の保護基
として0.25ｍＭスケールで直鎖保護ペプチドを合成し
た。得られたＨＭＰ樹脂結合保護ペプチド1250mgをフェ
ノール、１，２−エタンジチオール、チオアニソール存
在下、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）によりペプチドのＨ
ＭＰ樹脂からの切り離しと保護基の除去を同時に行っ
た。減圧濃縮によりＴＦＡを除去した後、エチルエーテ
ルで粗ペプチドを結晶化させ、これを５％酢酸に溶解し
凍結乾燥を行った。得られた直鎖粗ペプチド５００mg
は、ＨＰＬＣ〔カラム：オクタデシル４ＰＷ（21.5×15
0mm)（東ソー社),溶出： 0.1％ＴＦＡを含む水−アセト
ニトリルにてグラジエント溶出〕により精製し直鎖精製
ペプチド〔²⁰CysSH, ³⁷CysSH〕ヒトＬＦ(20-37)340mgを
得た。Ｓ−Ｓ結合による環化反応は、フェリシアン化カ
リウム存在下空気酸化により行い、前述と同様の方法で
ＨＰＬＣによる精製を行った。得られた環状精製ペプチ
ド３５mgの純度は、ＨＰＬＣによる分析の結果９３％で
あった。エルマン法により遊離のＳＨ基が無いこと、お
よび質量分析により単量体であることを確認した。

【００１８】

【実施例２】ヒトＬＦ(18-48) 化８および〔²⁰CysSH, ³⁷CysSH〕ヒト
ＬＦ( 18-42)の合成

【００１９】

【化８】

【００２０】実施例１と同様の方法でペプチドシンセサ
イザー 431A (ABI社）により合成し、純度９４％の直鎖
ペプチド４２０mg、純度９６％の環状ペプチド３８mgを
得た。

【００２１】

【実施例３】Ｎ−アセチル−ヒトＬＦ(20-37) −アミド(Ac-ヒトＬＦ
(20-37)-NH₂)化９の合成

【００２２】

【化９】

【００２３】ペプチドシンセサイザー431A(ABI社) より
ベンズヒドリルアミン樹脂を用いて３ブチルオキシカル
ボニル(t-Boc) 基をアミノ末端の保護基として0.25ｍＭ
スケールで合成を行った。縮合反応をすべて終えた後、
アミノ末端のt-Boc 基を除去し、無水酢酸でこれをアセ
チル化した。ＨＦ処理によりペプチドの樹脂からの切り
離しと保護基の除去を同時に行った。減圧濃縮によりＨ
Ｆを除去し目的の粗Ａｃ−ヒトＬＦ(20-37)-NH₂ を得
た。この粗ペプチドを実施例１と同様にしてＨＰＬＣで
精製し、フェリシアン化カリウム存在下空気酸化により
Ｓ−Ｓ結合による環化反応を行い、さらにＨＰＬＣで精
製した。純度９１％の環状ペプチド１８mgを得た。

【００２４】

【実施例４】ウシＬＦ(19-36) 化１０の合成

【００２５】

【化１０】

【００２６】実施例１と同様の方法で合成し、純度９４
％の環状ペプチド４０mgを得た。

【００２７】

【実施例５】ウシＬＦ(17-41) 化１１および〔¹⁹CysSH, ³⁶CysSH〕ウ
シＬＦ(17-41) の合成

【００２８】

【化１１】

【００２９】実施例１と同様の方法で合成し、純度９１
％の精製直鎖状ペプチド〔¹⁹CysSH,³⁶CysSH〕ウシＬＦ
(17-41) を３８０mgおよび純度９５％の環状ペプチド２
８mgを得た。

【００３０】

【実施例６】Ｎ−アセチル−ウシＬＦ(19-36) −アミド（Ａｃ−ウシ
ＬＦ(19-36)-NH₂)の化１２の合成

【００３１】

【化１２】

【００３２】実施例３と同様の方法で合成し、純度９２
％の直鎖ペプチド４０５mgおよび純度９５％の環状ペプ
チド１９mgを得た。

【００３３】

【実施例７】ウイルス感染、増殖抑制剤の製造 本実施例においては、上記実施例１〜６の方法により得
ることのできたペプチドの注射製剤の生産例を示した。
これらの注射製剤は、静注に用いられる。 （１） ヒトＬＦ(20-37) 100mg ヒト血清アルブミン 100mg 上記組成をｐＨ7.0 の0.01ＭのＰＢＳで溶解し、全量を
２０mlに調整し滅菌後、バイアル瓶に２mlずつ分注し、
凍結乾燥密封した。 （２） ヒトＬＦ(18-42) 100mg ツイーン80 1mg ヒト血清アルブミン 100mg 上記組成を注射用生理食塩水に溶解し、全量を２０mlに
調整し、滅菌後、バイアル瓶に２mlずつ分注し、凍結乾
燥密封した。

【００３４】 （３） Ａｃ−ＬＦ(20-37)-NH₂ 100 mg ツイーン80 2 mg ソルビトール 4 g 上記組成をｐＨ7.0 の0.01ＭのＰＢＳで溶解し、全量を
２０mlに調整し、滅菌後、バイアル瓶に２mlずつ分注
し、凍結乾燥密封した。 （４） ウシＬＦ(19-36) 4 g ツイーン80 2 mg グリシン 2 g 上記組成を注射用生理食塩水に溶解し、全量を２０mlに
調整し、滅菌後、バイアル瓶に２mlずつ分注し、凍結乾
燥密封した。 （５） ウシＬＦ(17-41) 2 g ツイーン80 1 mg ソルビトール 2 g グリシン 1 g 上記組成を注射用生理食塩水に溶解し、全量を２０mlに
調整し、滅菌後、バイアル瓶に２mlずつ分注し、凍結乾
燥密封した。 （６） Ａｃ−ウシＬＦ(19-36)-NH₂ 4 g ソルビトール 4 g ヒト血清アルブミン 50 mg 上記組成をｐＨ7.0 の0.01ＭのＰＢＳで溶解し、全量を
２０mlに調整し、滅菌後、バイアル瓶に２mlずつ分注
し、凍結乾燥密封した。

【００３５】

【発明の効果】本発明の実施により、ウイルス感染・増
殖抑制剤が提供される。本発明によるウイルス感染・増
殖阻止作用のある組成物の作用効果を要約すると次のと
おりである． （１）ウイルスの感染を防ぐことができ，また，既感染
者に対しては，体内でさらにウイルスが増殖して感染細
胞が増加することを防ぐことができる． （２）すでに通常食品として摂取している成分を有効成
分とする組成であるため，投与することによる副作用の
心配が少ない． （３）低分子であるため、ＬＦなど鉄結合性タンパク質
に比べ化学合成方法などで比較的容易にしかも大量に調
製できる。ゆえに特定の患者の治療に使用が限定される
ことがなく，広くウイルスの感染・増殖を予防すること
もできる．本発明のウイルス感染・増殖抑制剤は、イン
フルエンザあるいはエイズの予防または治療や臓器移植
の際のサイトメガロウイルスの感染防御に有用である。

【００３６】以下に実験例により本発明の効果を詳細に
説明する。

【実験例１】ＬＦ由来ペプチドのＨＩＶ感染・増殖抑制活性の測定 （方法) ＨＩＶの一株であるＨＴＬＶ−III _B 持続感染
株であるＭＯＬＴ−４／ＨＴＬＶ−III _B 細胞の培養上
清をウイルス液として用いた。上清は−８０℃に保存し
た。検定に用いる細胞はヒトＴ細胞系のＭＴ−４を用い
た。ＭＴ−４は１０％牛胎児血清（ＦＣＳ）を含むＲＰ
ＭＩ 1640 培地を用いて継代した。試料（ＬＦ由来ペプ
チド）は、培地（ＲＰＭＩ 1640)に溶解し目的の濃度と
して細胞に１ml添加した。６０分間インキュベートした
後、ＨＩＶをmoi(細胞／感染ウイルス比）＝0.01となる
ようにＭＴ−４細胞に感染させ、３×１０⁵ 細胞／mlに
調製した細胞液の１mlを加えた。細胞を３日間培養後、
ＨＩＶ感染細胞を間接蛍光抗体法を用いて測定した。Ｈ
ＩＶ感染細胞は、ＨＩＶ感染患者血清を一次抗体とした
間接蛍光抗体法で測定した。蛍光顕微鏡下で細胞５００
個以上を観察し、蛍光染色された細胞の割合を算出し
た。なお、陽性コントロールとして試料を加えずに培養
したＨＩＶ感染ＭＴ−４細胞、陰性コントロールとして
ウイルス液を添加しない細胞培養を同時に行った。 （結果）実験結果を表１に示した。結果は染色された細
胞の割合を示している。いずれのペプチドもＬＦと同レ
ベルの活性を有していた。なお、陽性コントロールのＨ
ＩＶ感染ＭＴ−４細胞の染色率は26.0％，ＨＩＶを添加
していないＭＴ−４細胞の染色率は０％であった。

【００３７】

【表１】 ラクトフェリンおよびラクトフェリン由来ペプチドのＨＩＶ感染・増殖抑制効果 ──────────────────────────────────── 添加濃度（μg ／ml） 試 料 ────────────────────────── 1000 500 250 125 63 ──────────────────────────────────── ヒトＬＦ 3.1 5.8 7.3 8.6 17 ヒトＬＦ(20-37) 4.4 6.0 8.9 10.9 19 ヒトＬＦ(18-42) 1.1 2.9 6.7 8.8 17 〔²⁰CysSH, ³⁷CysSH〕ヒトＬＦ(18-42) 1.4 3.1 6.2 8.5 17 Ａｃ−ヒトＬＦ(20-37)NH₂ 3.9 4.5 7.7 9.8 18 ウシＬＦ 3.6 4.8 6.2 8.0 18 ウシＬＦ(19-36) 4.8 5.9 8.9 9.9 20 ウシＬＦ(17-41) 1.0 2.7 5.9 7.9 17 〔¹⁹CysSH, ³⁶CysSH〕ウシＬＦ(17-41) 1.2 2.9 6.4 8.3 19 Ａｃ−ウシＬＦ(19-36)NH₂ 3.6 5.0 6.1 8.8 17 ──────────────────────────────────── 単位％

【００３８】

【実験例２】ＬＦ由来ペプチドのインフルエンザウイルスに対する感
染・増殖抑制効果 （方法）インフルエンザウイルスに対するＬＦ由来ペプ
チドの感染・増殖抑制効果は、ウイルス実験学総論、国
立予防衛生研究所学友会編、P.113-129 丸善（1973) に
従い、ふ化鶏卵内培養法によって行った。ヒトＬＦ、ウ
シＬＦおよび実施例１−６で調製したペプチドを１mg／
mlの濃度となるように生理食塩水に溶解し、濾過滅菌し
た。卵令１０日のふ化鶏卵５０個を５個ずつ１０群にわ
け、コントロール群には生理食塩水のみを、他の群には
試料溶液１００μｌを尿液腔内に接種した。３時間後、
各ふ化鶏卵にインフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３
４のウイルス液１００μｌを尿液腔内に接種した。なお
ここで用いたウイルス量は、尿液腔内に接種した後採取
した尿液を６４倍希釈した溶液で赤血球凝集（ＨＡ）反
応を示すことのできるウイルス量である。２日後それぞ
れの卵を氷室中で一夜静置しその後尿液を採取した。得
られた尿液を生理食塩水で段階的に希釈しこれにヒヨコ
安定化赤血球（武田薬品）を加え、ＨＡ反応を行うこと
でウイルスを定量した。 （結果）実験結果を表２に示す。インフルエンザウイル
スの感染・増殖抑制率は、ウイルスのみを接種した群の
ウイルス量を１００とした時の各群のウイルス量から算
出している。値は各群ごとの平均値で示している。いず
れのペプチドもＬＦと同レベルの活性を有していた。

【００３９】

【表２】 ラクトフェリンおよびラクトフェリン由来ペプチドのインフルエンザ ウイルスに対する感染・増殖抑制効果 ──────────────────────────────── 試 料 抑制率（％） ──────────────────────────────── ヒトＬＦ 87.5 ヒトＬＦ(20-37) 75.0 ヒトＬＦ(18-42) 96.9 〔²⁰CysSH, ³⁷CysSH〕ヒトＬＦ(18-42) 96.0 Ａｃ−ヒトＬＦ(20-37)-NH₂ 93.7 ウシＬＦ 87.5 ウシＬＦ (19-36) 50.0 ウシＬＦ(17-41) 93.7 〔¹⁹CysSH, ³⁶CysSH〕ウシＬＦ(17-41) 92.0 Ａｃ−ウシＬＦ(19-36)-NH₂ 87.5 ────────────────────────────────

【００４０】

【実験例３】ＬＦ由来ペプチドのＣＭＶに対する感染・増殖抑制効果 （方法）ＬＦ由来ペプチドを２％血清添加ＭＥＭ培地に
５mg／mlとなるように溶解し、濾過滅菌しストック溶液
とした。このストック溶液を必要に応じて２％血清添加
ＭＥＭ培地により希釈して用いた。ヒト胎児繊維芽細胞
（ＨＥＬ細胞）を試料を含む２％血清添加ＭＥＭ培地に
懸濁させ１０分間インキュベートした。遠心分離により
細胞を取り出しさらに２％血清添加ＭＥＭ培地で細胞を
２回洗浄した後、細胞を２％血清添加ＭＥＭ培地に懸濁
させた。これにヒトサイトメガロウイルス〔ヒトＣＭＶ
（Ｔａｎａｋａ株）〕を添加し、２４時間培養後、ヒト
ＣＭＶ陽性血清で蛍光染色し細胞へのヒトＣＭＶの吸着
能力を測定した。 （結果）表３、４に結果を示す。結果は１カバースリッ
プあたりの蛍光染色細胞の数から判定した。いずれのペ
プチドもＬＦと同様の感染・増殖抑制効果を示した。

【００４１】

【表３】 ＬＦ由来ペプチドのヒトＣＭＶに対する感染・増殖抑制効果 ─────────────────────────────── 試 料 ヒトＣＭＶ感染抑制率（％） ─────────────────────────────── ヒトＬＦ 94.8 ヒトＬＦ(20-37) 94.0 ヒトＬＦ(18-42) 95.7 〔²⁰CysSH, ³⁷CysSH〕ヒトＬＦ(18-42) 100.0 Ａｃ−ヒトＬＦ(20-37)-NH₂ 96.1 ウシＬＦ 95.7 ウシＬＦ(19-36) 93.9 ウシＬＦ(17-41) 95.7 〔¹⁹CysSH, ³⁶CysSH〕ウシＬＦ(17-41) 100.0 Ａｃ−ウシＬＦ(19-36)-NH₂ 96.5 ───────────────────────────────

【００４２】

【表４】 ヒトＬＦ（１８−４２）のヒトＣＭＶに対する 濃度依存的感染・増殖抑制効果 ──────────────────────── 濃度（mg／ml) 抑制率（％） ──────────────────────── 0.04 14.7 0.1 34.9 0.2 45.0 0.4 51.9 1.0 86.0 2.0 96.1 ────────────────────────

【００４３】

【実験例４】in vivo におけるサイトメガロウイルス感染防御試験 （方法）４週齢雄のBalbc/AJclマウス（１群１０匹）を
用いた。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に試料を溶か
し、マウス腹腔内に投与した。２４時間後、１×１０⁶
ＰＦＵのマウスサイトメガロウイルス（マウスＣＭＶ）
を腹腔内に投与し、１０日後のマウスの生存率で感染防
御効率を評価した。 （結果）表５に結果を示した。本発明によるペプチドは
0.1 g／体重kg以上の投与でマウスＣＭＶに対して感染
防御効果をもつことが明らかとなった。

【００４４】

【表５】 in vivoにおけるマウスＣＭＶ感染防御試験 ──────────────────────────────── 試 料 投与量（g ／体重kg） 生存率（％） ──────────────────────────────── ポジティブコントロール ── 100 ネガティブコントロール ── 0 ヒトＬＦ(18-42) 0.02 20 0.05 50 0.10 100 0.50 100 ウシＬＦ(17-41) 0.02 30 0.05 60 0.10 100 0.50 100 ────────────────────────────────

【００４５】

【実験例５】サイトメガロウイルス感染防御試験、投与時期の検討 （方法）４週齢雄のBalbc/AJclマウス（１群１０匹）を
用いた。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に試料を溶か
し、マウス腹腔内に投与した。２４時間後、１×１０⁶
ＰＦＵのマウスサイトメガ ウイルス（マウスＣＭＶ）
を腹腔内に投与し、１０日後のマウスの生存率で感染防
御効率を評価した。試料の投与時期はウイルスの投与時
間を基準として、４８時間前、２４時間前、６時間前、
１時間前、投与直後、１時間後、６時間後とした。 （結果）表６に結果を示した。本発明によるペプチドの
投与時期は、感染前２４時間から感染１時間後に投与す
ることが最も効果的であった。

【００４６】

【表６】 投与時期によるマウスＣＭＶ感染防御試験 ────────────────────────────────── 試 料 投与量 投与時期 生存率（％） （g ／体重kg） （時間）^* ────────────────────────────────── ポジティブコントロール ── ─── 100 ネガティブコントロール ── ─── 0 ヒトＬＦ(18-42) 0.10 −48 60 0.10 −24 100 0.10 − 6 100 0.10 − 1 100 0.10 0 100 0.10 ＋ 1 100 0.10 ＋ 6 60 ────────────────────────────────── ＊投与時点を基準にした時間

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 田中 重明 神奈川県綾瀬市小園1431−６ (72)発明者 堂迫 俊一 埼玉県浦和市北浦和５−15−39−616 (72)発明者 川崎 功博 埼玉県川越市笠幡4881−21 (72)発明者 内田 俊昭 埼玉県川越市新宿町５−11−３ 雪印乳業 独身寮

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 化１で表されるペプチド及びその薬理的
   に許容される塩を有効成分とするウイルス感染・増殖抑
   制剤。 【化１】 但しＡは、水素原子、アセチル基または２個のアミノ酸
   よりなるペプチドの残基のいずれかであり、Ｂは、水酸
   基、アミド、５個のアミノ酸よりなるペプチドの残基の
   いずれかを示し、-S-S- 結合は、還元状態の-SH であっ
   てもよい。
2. 【請求項２】 化２で表されるペプチド及びその薬理的
   に許容される塩を有効成分とするウイルス感染・増殖抑
   制剤。 【化２】 但しＣは、水素原子、アセチル基または２個のアミノ酸
   よりなるペプチドの残基のいずれかであり、Ｄは、水酸
   基、アミド、５個のアミノ酸よりなるペプチドの残基の
   いずれかを示し、-S-S- 結合は、還元状態の-SH であっ
   てもよい。