ITRM20110606A1 - Peptidi della lattoferrina per lo uso come inibitori ad ampio spettro dellainfezione da virus della influenza. - Google Patents

Description

Peptidi della lattoferrina per uso come inibitori ad ampio spettro dell'infezione da virus dell'Influenza

La presente invenzione riguarda peptidi derivati dalla lattoferrina per uso come inibitori ad ampio spettro dell'infezione da virus dell'Influenza. In particolare, la presente invenzione riguarda peptidi derivati dal lobo C della lattoferrina, preferibilmente peptidi derivati dal lobo C della lattoferrina bovina, per l'uso come inibitori ad ampio spettro dell'infezione da virus dell'Influenza in grado di inibire l'emoagglutinazione e l'infezione di cellule da parte di virus dell'Influenza appartenenti a tutti i maggiori sottotipi compresi H1N1 e H3N2.

Le infezioni da virus influenzale sono un rischio importante per la sicurezza umana e la salute animale in tutto il mondo. Le malattie causate dal virus dell'Influenza rappresentano una grave fonte di morbilità e mortalità in tutto il mondo e una significativa causa di malattia e morte tra le persone con immunodeficienza associata all'invecchiamento o a diverse condizioni cliniche. Il controllo dell'Influenza à ̈ essenzialmente basato sull'utilizzo di vaccini e di pochi farmaci antivirali. Mentre i vaccini sono la strategia principale per il controllo dell'infezione, i programmi di immunizzazione non sono totalmente efficaci a causa della veloce deriva antigenica del virus, tanto che la composizione antigenica del vaccino deve essere aggiornata annualmente sulla base della sorveglianza globale dell'Influenza. Gli sforzi per prevenire l'Influenza con la vaccinazione sono resi difficili dalla capacità del virus di mutare rapidamente e ricombinare in particelle virali antigenicamente nuove, portando a volte alla comparsa di un virus totalmente nuovo (Kasowski et al., 2011).

La chemioterapia antivirale à ̈ basata su due classi di farmaci: l'amantadina e il suo derivato rimantadina (Dolin et al., 1982; Hay et al., 1985) e gli inibitori della neuraminidasi (oseltamivir e zanamivir) (Palese e Shaw, 2007). L'amantadina e i suoi derivati prevengono il denudamento virale bloccando il funzionamento del canale ionico formato dalla proteina M2 del virus dell'Influenza. Questi farmaci riducono la durata dei sintomi clinici dell'Influenza ma sono stati descritti effetti collaterali importanti e la comparsa di varianti del virus farmaco-resistenti (Belshe et al., 1989; Bright et al., 2006; Hayden 2006; Fiore et al., 2008). L'amantadina e derivati, di conseguenza, non rappresentano più la prima scelta per la terapia dell'Influenza. Gli inibitori della neuraminidasi prevengono la gemmazione del virus dalle cellule infettate inibendo il clivaggio dei residui di acido sialico dell'ospite e sono, attualmente, il principale trattamento contro l'Influenza. Tuttavia essi hanno una efficacia limitata se somministrati tardivamente durante l'infezione e il diffuso utilizzo può portare alla comparsa di ceppi virali resistenti(Gubareva et al., 1998; Kiso et al., 2004; Meijer et al., 2009; Dharan et al., 2009; Cheng et al., 2010).

La disponibilità di farmaci antivirali ad ampio spettro à ̈ un importante sussidio nella lotta contro l'Influenza. In particolare, una combinazione di diversi farmaci anti-influenzali, ognuno diretto contro un bersaglio virale diverso o con un differente modo di azione, potrebbe essere più attiva nel trattamento dell'Influenza e potrebbe anche diminuire il fenomeno della farmaco-resistenza. Infatti à ̈ stato dimostrato che la combinazione di amantadina e oseltamivir diminuisce la comparsa di virus dell'influenza A farmaco-resistenti (Ilyushina et al., 2006). Sebbene questo non sia stato osservato in tutti i casi.

Sulla base di quanto detto sopra à ̈ quindi evidente la necessità di trovare nuovi composti contro il virus dell'Influenza in grado di superare gli svantaggi delle terapie conosciute.

Le nuove strategie terapeutiche sono quindi una priorità per la salute pubblica globale. Un'attraente strategia antivirale à ̈ bloccare l'entrata del virus dell'Influenza nella cellula ospite. Questo processo à ̈ mediato dall'emoagglut inina virale (HA), che à ̈ responsabile del legame del virus alla cellula bersaglio e, dopo l'entrata del virus negli endosomi, della fusione del virus con le membrane cellulari (Skehel e Wiley, 2000). L'HA à ̈ il principale componente glicoproteico del rivestimento virale. L'HA à ̈ omotrimerica ed à ̈ composta di due segmenti polipeptidici, designati HA1e HA2, attaccati tra loro attraverso un legame disolfuro (Wilson et al., 1981). I segmenti HA1mediano il legame dell'HA alla superficie della cellula ospite legandosi ai glicani della superficie cellulare contenenti acido sialico. Dopo l'attaccamento, i virioni internalizzati per endocitosi vanno incontro ad un riarrangiamento strutturale acidoindotto irreversibile durante il quale viene esposta la porzione ammino-terminale altamente idrofobica di HA2. Questo peptide di fusione idrofobico viene quindi traslocato attraverso la membrana dell'endosoma mediando la fusione del rivestimento virale con le membrane cellulari e la formazione di un poro di fusione (Wiley e Skehel, 1987).

Questo cambiamento conformazionale à ̈ cruciale per l'attività fusogenica dell 'HA e per l'entrata del virus. Insieme al fatto che il peptide di fusione idrofobico à ̈ il solo epitopo universalmente conservato tra tutti i virus dell'Influenza, esso rappresenta un bersaglio molto interessante per nuovi farmaci anti-Influenza.

E' noto che l'allattamento al seno protegge i neonati dalle infezioni respiratorie e gastrointestinali (May, 1988). Il latte, oltre alle IgA e alle IgM secretorie, contiene anche un numero di differenti componenti non anticorpali con attività antimicrobica nota, compresa la lattoferrina (Laegreid et al., 1986; May, 1988; Levay e Viljoen, 1995; Peterson et al., 1998; Portelli et al., 1998). La lattoferrina (Lf) à ̈ una glicoproteina cationica multifunzionale di 80-kDa appartenente alla famiglia delle transferrine (Levay e Viljoen, 1995). Essa à ̈ presente nelle secrezioni mucosali, come lacrime, saliva, essudato nasale, fluidi gastrointestinali, fluidi seminali e vaginali e nei granuli dei leucociti polimorfonucleati (Levay e Viljoen, 1995) . La Lf possiede diverse funzioni biologiche quali: influenza sull 'omeostasi del ferro, immunomodulazione e attività inibitoria nei confronti di diversi patogeni (Levay e Viljoen, 1995; Palma et al., 1992a, b; Marchetti e Superti, 2001; Valenti e Antonini, 2005) . E' noto che la lattoferrina bovina (bLf) à ̈ un potente inibitore di diversi virus rivestiti come il citomegalovirus umano (Harmsen et al., 1995; Beljaars, et al., 2004), i virus dell' Herpes Simplex di tipo 1 e di tipo 2 (Hasegawa et al. 1994; Fujihara e Hayashi, 1995; Marchetti et al., 1996, 2004, 2009; Andersen et al., 2003; Ammendolia et al., 2007a), il virus dell'immunodeficienza umana (HIV) (Harmsen et al., 1995; Swart et al., 1996; Berkhout et al., 2002, 2004), il virus dell'epatite C umano (Yi et al., 1997; Ikeda et al., 2000), l'hantavirus (Murphy et al., 2000), il virus dell 'epaptite B (Hara et al., 2002), il virus respiratorio sinciziale (Sano et al., 2003) , i virus Sindbis e della foresta del Semliki (Waarts et al., 2005). La bLf, analogamente alla lattoferrina di altre specie di mammiferi, come la lattoferrina umana, à ̈ una glicoproteina ripiegata in due lobi simmetrici (lobo N e lobo C), con un'alta omologia di sequenza, probabilmente derivanti dalla duplicazione di un gene ancestrale (Norris et al., 1986; Anderson et al., 1987). Ogni lobo à ̈ ulteriormente composto di due sotto- lobi o domini chiamati rispettivamente N1, N2, C1 e C2. Nella lattoferrina bovina, N1 comprende le sequenze 1-90 e 251-333, N291-250, C1345-431 e 593-676, e C2 432-592 (Moore et al., 1997; Steijns e van Hooijdonk, 2000). I suddetti domini delimitano un sito legante il Fe<3+>(Norris et al., 1986; Moore et al., 1997). Sebbene sia generalmente accettato che, con qualche eccezione, l'attività inibitoria della lattoferrina abbia luogo nelle prime fasi dell'infezione virale, il suo effetto antivirale sembra essere esercitato in diversi modi nelle diverse specie virali. I meccanismi principali proposti per l'attività antivirale sono un legame diretto della lattoferrina con le particelle virali (Swart et al., 1996; Yi et al., 1997; Superti et al., 1997; Marchetti et al., 1999; Pietrantoni et al., 2003; Weng et al., 2005; Ammendolia et al., 2007b) o alle molecole della cellula ospite che il virus utilizza come recettore o corecettore (Marchetti et al., 1996, 2004; Andersen et al., 2001; Di Biase et al., 2003; Drobni et al., 2004). E' stato descritto un ulteriore effetto della bLf su una fase intracellulare tardiva dell'infezione virale (Superti et al., 1997; Tinari et al., 2005) e, più recentemente, gli inventori della presente invenzione hanno dimostrato che il trattamento con bLf à ̈ in grado di prevenire la morte cellulare programmata indotta dal virus dell'Influenza interferendo con il funzionamento della caspasi-3 (Pietrantoni et al., 2010). Questo causa il blocco dell'esportazione nucleare della ribonucleoproteina virale con la conseguente prevenzione dell'assemblaggio del virus.

Nel tentativo di identificare nuove terapie antivirali efficaci contro il virus dell'Influenza, secondo la presente invenzione, gli inventori hanno tentato di studiare più a fondo il meccanismo dell'effetto anti-virus influenzale della bLf e il ruolo dei suoi frammenti triptici (i lobi N e C) nell'attività antivirale. In particolare, essi hanno valutato l'influenza della bLf sulle funzioni mediate dall'emoagglutinina. L'emoagglutinina à ̈ stata scelta poiché à ̈ la maggiore proteina di superficie del virus dell'Influenza A ed à ̈ essenziale per il processo di entrata così da rappresentare un obiettivo interessante per la terapia antivirale. Per l'infezione virale sono necessari l'attaccamento iniziale della HA a recettori specifici sulla superficie della cellule ospite e la fusione con la membrana dell 'HA maturata dalla digestione proteasica. Infatti, i composti neutralizzanti che hanno come bersaglio l'HA rappresentano un utile strumento per neutralizzare l'infezione virale, eliminare il virus e inibire la diffusione virale. I risultati ottenuti hanno indicato che la lattoferrina à ̈ in grado di legare il frammento HA2di tutti i virus dell'Influenza A presi in esame. In particolare, l'attività del lobo C à ̈ stata comparabile a quella della proteina intera nella capacità di prevenire sia l'emoagglutinazione che l'infezione. Considerevolmente, alcuni peptidi derivati dal lobo C sono stati capaci di prevenire sia l'emoagglutinazione che l'infezione virale con un'efficacia molto più elevata rispetto alla proteina intera.

Interessante à ̈ stata la dimostrazione che la lattoferrina si lega alla subunità HA2dell'HA virale, in particolare al peptide di fusione, il solo epitopo universalmente conservato in tutte le emoagglutinine del virus dell'Influenza.

Questo à ̈ stato dimostrato attraverso un sequenziamento proteico N-terminale di campioni di subunità e da saggi ELISA nei quali il peptide di fusione à ̈ stato sufficientemente esposto per permettere l'accesso della bLf. A nostra conoscenza, questa à ̈ la prima dimostrazione che 1'emoagglutinazione virale può essere inibita per mezzo di un'interazione specifica con la subunità HA2. Infatti, à ̈ stato osservato che gli anticorpi neutralizzanti verso il virus dell'Influenza agiscono attraverso due meccanismi diversi, riflettendo le due funzioni dell'emoagglutinina: (i) prevenzione dell'attaccamento alle cellule bersaglio, (ii) inibizione dell'entrata (fusione della membrana) . Il meccanismo di neutralizzazione dipende dal sito dell'HA riconosciuto dalle molecole HA-specifiche . Generalmente, gli anticorpi contro l'HA agiscono inibendo l'attaccamento. Questo avviene quando legano l'HA1e fisicamente ostacolano l'interazione con i recettori di acido sialico sulle cellule bersaglio (Edwards e Dimmock, 2001). E' stato osservato che alcuni anticorpi prevengono la fusione della membrana; la maggior parte di loro riconosce dei siti nella regione HA2, lontani dal sito di riconoscimento del recettore (Ekiert et al., 2009; Sui et al., 2009).

I virus dell'influenza di tipo A sono sierologicamente divisi in 16 sottotipi HA che sono ulteriormente separati in due gruppi filogenetici principali: gruppo 1 (suttotipi H1, H2, H5, H6, H8, H9, H11 , H12, H13 e H16) e gruppo 2 (sottotipi H3, H4, H7, H10 , H14 e H15). Questa separazione dei 16 sottotipi correla con due distinte strutture di base presenti nel gambo dell'HA (Ekiert et al., 2009). La bLf mostra attività verso virus che esprimono proteine dell 'emoagglutinina sia di gruppo 1 che di gruppo 2 poiché à ̈ capace di neutralizzare isolati di 4 dei 16 sottotipi di Influenza A: H1, H3, H5 e H7. L'ipotesi di lavoro degli inventori à ̈ che l'interazione della bLf con la regione altamente conservata dell'HA (peptide di fusione) possa portare a un "cambiamento conformazionale'' dell' emoagglutinina tale da prevenire sia l'emoagglutinazione che l'infezione.

I calcoli di docking proteina-proteina, condotti per trovare un possibile modo di legame del lobo C della bLf all'HA, hanno dimostrato la possibilità che la bLf leghi una regione conservata dell'HA, vicina al peptide di fusione. Questa regione mostra caratteristiche comuni alle HA di altri ceppi virali, suggerendo la possibilità di prendere come bersaglio questa parte del gambo dell'HA per il disegno di farmaci anti-influenzali . Inoltre questi calcoli hanno suggerito il ruolo di tre loop del lobo C della bLf nell'interazione con l'HA, corrispondenti alle sequenze 506-522, 418-429 e 553-563. Le due ultime sequenze non sono presenti nel lobo N della bLf, che à ̈ risultato inattivo. Quindi sono stati identificati tre peptidi: SKHSSLDCVLRP (418-429) (SEQ ID NO: 1), AGDDQGLDKCVPNSKEK (506-522) (SEQ ID NO: 2) e NGESTADWAKN (553-563) (SEQ ID No: 3). A causa della scarsa stabilità del peptide SEQ ID NO:3, à ̈ stata progettata una sequenza modificata nella quale il residuo di treonina à ̈ stato sostituito con una serina omologa ottenendo un peptide con la sequenza NGESSADWAKN (SEQ ID NO: 4). I suddetti peptidi sono stati sintetizzati e analizzati per la loro capacità di inibire l'emoagglutinazione e l'infezione.

I risultati hanno mostrato che i peptidi derivati dalla lattoferrina si legano all'HA e neutralizzano l'emoagglutinazione e l'infezione in vitro di ceppi diversi di virus dell'Influenza con una efficienza molto elevata, suggerendo che queste regioni della bLf sono di fatto coinvolte nell'inibizione del virus dell'Influenza da parte della bLf. Significativamente, i peptidi sono attivi su sottotipi virali appartenenti ai due maggiori gruppi filogenetici del virus dell'Influenza. Questi peptidi possono rappresentare uno strumento prezioso per lo studio dei virus dell'Influenza e delle loro interazioni di legame al recettore, così come per le possibilità terapeutiche che saranno esaminate con esperimenti in vivo. La corta sequenza à ̈ un valore aggiunto al fine della commercializzazione poiché può notevolmente ridurre il costo di produzione.

Costituisce, pertanto, oggetto specifico della presente invenzione un peptide derivato dal lobo-C della lattoferrina scelto dal gruppo che consiste in SKHSSLDCVLRP (SEQ ID NO: 1), AGDDQGLDKCVPNSKEK (SEQ ID NO: 2), NGESSADWAKN (SEQ ID NO: 4), o frammenti della SEQ ID No:2 o 4 o una miscela di almeno due di detti peptidi o di detti frammenti, in cui la SEQ ID NO:1 à ̈ un peptide del lobo C della lattoferrina bovina o di bufalo, la SEQ ID NO:2 à ̈ un peptide del lobo C della lattoferrina bovina, di bufalo o di capra, la SEQ ID NO: 4 à ̈ un peptide del lobo C della lattoferrina di capra o di pecora o una sequenza modificata del peptide NGESTADWAKN (SEQ ID No: 3) del lobo C della lattoferrina bovina in cui il residuo di treonina à ̈ stato sostituito con una aerina omologa. In accordo con la presente invenzione, la definizione dei peptidi di cui sopra descrive in quali specie detti peptidi possono essere naturalmente trovati nel lobo C della lattoferrina, comunque, le rivendicazioni devono essere intese per coprire detti peptidi (SEQ ID No: 1, 2 e 4) o frammenti di questi preparati per sintesi o estratti da sorgente naturale.

Preferibilmente, il lobo C della lattoferrina à ̈ il lobo C della lattoferrina bovina consistente nella seguente sequenza SEQ ID No:5:

YTRW WCAVGPEEQKKCQQWSQQSGQNVTCATASTTDDCIVLVLKGEADA LNLDGGYIYTAGKCGLVPVLAENRKSSKHSSLDCVLRPTEGYLAVAW KKANEGL TWNSLKDKKSCHTAVDRTAGWNIPMGLIVNQTGSCAFDEFFSQSCAPGADPKSRL CALCAGDDQGLDKCVPNSKEKYYGYTGAFRCLAEDVGDVAFVKNDTVWENTNGES TADWAKNLNREDFRLLCLDGTRKPVTEAQSCHLAVAPNHAW SRSDRAAHVKQVL LHQQALFGKNGKNCPDKFCLFKSETKNLLFNDNTECLAKLGGRPTYEEYLGTEYV TAIANLKKCSTSPLLEACAFLTR . Anche in questo caso, in accordo con la presente invenzione, la definizione di cui sopra della sequenza del lobo C della lattoferrina descrive in quali specie detta sequenza può essere naturalmente trovata, comunque le rivendicazioni devono essere intese per coprire la sequenza del lobo C della lattoferrina o frammenti di questo preparati per sintesi o estratti da sorgente naturale.

In accordo con quanto sopra, detti frammenti del lobo C della lattoferrina possono essere scelti dal gruppo consistente in SKHSSLDCVLRP (SEQ ID NO: 1), AGDDQGLDKCVPNSKEK (SEQ ID NO: 2), NGESSADWAKN (SEQ ID NO: 4), in cui la SEQ ID NO:1 à ̈ un peptide del lobo C della lattoferrina bovina o di bufalo, la SEQ ID NO:2 à ̈ un peptide del lobo C della lattoferrina bovina, di bufalo o di capra, la SEQ ID NO: 4 à ̈ un peptide del lobo C della lattoferrina di capra o di pecora o una sequenza modificata del peptide NGESTADWAKN (SEQ ID No: 3) del lobo C della lattoferrina bovina in cui il residuo di treonina à ̈ stato sostituito con una serina omologa .

I lobi C della lattoferrina dì bufalo, capra e pecora hanno una percentuale di identità con il lobo C della lattoferrina bovina rispettivamente di 97,4%, 95,7% e 94,5%. Le SEQ ID N0:1, 2, 3 e 4 sono state trovate nelle lattoferrine sopra specificate con identità del 100%, mentre non sono state trovate in altre specie.

Inoltre, la presente invenzione riguarda una composizione farmaceutica comprendente o consistente in un peptide del lobo C della lattoferrina come definito nella rivendicazione 1 o frammenti della SEQ ID NO: 2 o 4 o una miscela di almeno due di detti peptidi o di detti frammenti, come principio attivo, insieme ad uno o più eccipienti e/o coadiuvanti farmaceuticamente accettabili, in cui detto lobo C della lattoferrina à ̈ un lobo C di lattoferrina bovina, di bufalo, di capra o di pecora. Preferibilmente, il lobo C della lattoferrina à ̈ il lobo C di lattoferrina bovina consistente nella seguente sequenza SEQ ID No:5:

YTRW WCAVGPEEQKKCQQWSQQSGQNVTCATASTTDDCIVLVLKGEADA LNLDGGYIYTAGKCGLVPVLAENRKSSKHSSLDCVLRPTEGYLAVAW KKANEGL TWNSLKDKKSCHTAVDRTAGWNIPMGLIVNQTGSCAFDEFFSQSCAPGADPKSRL CALCAGDDQGLDKCVPNSKEKYYGYTGAFRCLAEDVGDVAFVKNDTVWENTNGES TADWAKNLNRED FRLLCLDGTRKPVTE AQSCHLAVAPNHAW SRSDRAAHVKQVL LHQQALFGKNGKNCPDKFCLFKSETKNLLFNDNTECLAKLGGRPTYEEYLGTEYV TAIANLKKCSTSPLLEACAFLTR .

Costituisce ulteriore oggetto della presente invenzione il lobo C della lattoferrina o peptide del lobo C della lattoferrina come definito nella rivendicazione 1 o frammenti della SEQ ID NO: 1, 2 o 4 o frammenti del lobo C della lattoferrina comprendenti la SEQ ID NO: 1, 2 o 4, o una miscela di almeno due di detti peptidi o di detti frammenti o composizione farmaceutica come definita sopra, per l'uso nel trattamento dell'infezione da virus dell'Influenza, come l'infezione da virus dell'Influenza A, per esempio l'infezione da virus dell'Influenza di tipo A e tutti i principali sottotipi di questo come i sottotipi H1, H2, H5 , H6, ΗΠ̧, H9, H11, H12, H13, H16, H3, H4, H7, H10, H14 e H15. Preferibilmente, il lobo C della lattoferrina à ̈ il lobo C di lattoferrina bovina consistente nella seguente sequenza SEQ ID No:5:

YTRW WCAVGPEEQKKCQQWSQQSGQNVTCATASTTDDCIVLVLKGEADA LNLDGGYI YTAGKCGLVPVLAENRKS SKHSSLDCVLRPTEGYLAVAW KKANEGL TWN SLKDKKSCHTAVDRTAGWN IPMGLI VNQTGS CAFDEFFSQS CAPGADPKSRL CALCAGDDQGLDKCVPNSKEKYYGYTGAFRCLAEDVGDVAFVKNDTVWENTNGES TADWAKNLNREDFRLLCLDGTRKPVTEAQSCHLAVAPNHAW SRSDRAAHVKQVL LHQQALFGKNGKNCPDKFCLFKSETKNLLFNDNTECLAKLGGRPTYEEYLGTEYV TAIANLKKCSTSPLLEACAFLTR. Mentre, i frammenti di detto lobo C della lattoferrina possono essere scelti dal gruppo consistente in SKHSSLDCVLRP (SEQ ID NO: 1), AGDDQGLDKCVPNSKEK (SEQ ID NO: 2), NGESSADWAKN (SEQ ID NO: 4), in cui SEQ ID NO :1 à ̈ un peptide del lobo C della lattoferrina bovina o di bufalo, la SEQ ID NO:2 à ̈ un peptide del lobo C della lattoferrina bovina, di bufalo o di capra, la SEQ ID NO: 4 à ̈ un peptide del lobo C della lattoferrina di capra o di pecora o una sequenza modificata del peptide NGESTADWAKN (SEQ ID No: 3) del lobo C della lattoferrina bovina in cui il residuo di treonina à ̈ stato sostituito con una serina omologa .

La presente invenzione sarà ora descritta, in modo illustrativo e non limitativo, secondo forme preferite di realizzazione con particolare riferimento alle figure allegate in cui:

La Figura 1 mostra un saggio ligand-blot del legame della bLf con le sub-unità del virus dell'Influenza A H1N1 . Linea 1: SDS-PAGE (Poli-Acrilamide Gel Elettroforesi in presenza di Sodio Dodecil Solfato) di subunità ridotte di virus A/Solomon 3/2006 H1N1. Linea 2: blot overlay con la lattoferrina. Linea 3: controllo di specificità (anticorpi di coniglio anti-Lf anticorpi anti-coniglio coniugati con perossidasi di rafano (HRP).

La Figura 2 mostra un saggio ligand-blot del legame della bLf con le subunità del virus dell'Influenza A H3N2. Linea 1: SDS-PAGE di subunità ridotte di virus A/Wisconsin (67/05) H3N2. Linea 2: blot overlay con la lattoferrina. Linea 3: controllo di specificità (anticorpi di coniglio anti-Lf anticorpi anti-coniglio coniugati con HRP.

La Figura 3 mostra (a): l'influenza del pH sul legame della bLf al virus dell'Influenza con saggio immunoenzimatico (ELISA). Il virus dell'Influenza A/RomaISS/2/08 à ̈ stato trattato con tamponi a diversa acidità (pH 4,0, 5,0, 6,0 e 7,4) e lasciato legare alla bLf precedentemente assorbita alla plastica. Il legame del virus à ̈ stato rivelato attraverso un saggio ELISA tramite colorazione con un anticorpo anti-influenza A e i risultati sono stati espressi come percentuale di virus legato alla bLf. I dati rappresentano la media di almeno tre esperimenti indipendenti, (b): Microscopia elettronica a trasmissione del virus dell'Influenza A/RomaISS/2/08 H1N1. (A): Virus dell'Influenza incubato a pH neutro. Notare che le proiezioni sono ben ordinate. (B): Virus incubato a pH 6,0. Le proiezioni sul virione sono ancora ben definite e distinte.(C): Virus incubato a pH 5,0. Notare che le proiezioni sul virione hanno cominciato a diventare disorganizzate e non sono più ben definite o distinte. (D): Virus incubato at pH 4,0. Le proiezioni appaiono molto disordinate e discontinue.

La Figura 4 mostra le possibili interazioni del lobo C della bLf (nastro bianco) con il gambo dell'HA (superficie solida grigio chiaro): (A) nella cavità tra i due monomeri; (B) vicino al peptide di fusione (grigio scuro) . Le sequenze della bLf selezionate corrispondono ai loop di colore nero.

La Figura 5 mostra l'allineamento delle sequenze del lobo N e del lobo C della bLf. Le sequenze in grassetto corrispondono ai loop che si suppone siano coinvolti nel legame.

La Figura 6 mostra un saggio ligand-blot del legame della bLf con le sub-unità del virus dell'Influenza suina SW X-179A (H1N1). Linea 1: SDS-PAGE delle subunità ridotte di SW X-179A suino pandemico. Linea 2: blot overlay con la lattoferrina. Linea 3 : controllo di specificità (anticorpi di coniglio anti-Lf anticorpi anti-coniglio coniugati con HRP.

La Figura 7 mostra le sequenze amminoacidiche N-terminali determinate attraverso il metodo di degradazione di Edman.

Esempio 1: Studio sull'efficacia dei peptidi della presente invenzione contro l 'infezione da virus dell 'Influenza .

Materiali e Metodi

Ceppi virali

Sono stati usati i seguenti ceppi di virus dell'Influenza A: A/Solomon 3/2006 H1N1 , A/Wisconsin/67/2005 H3N2 e SW X-179A suino pandemico H1N1 (vaccini inattivati e corrispondenti preparazioni a subunità) ; A/Puerto Rico/8/34 H1N1 (virus PR8), A/RomaISS/2/08 virus H1N1 sensibile all'oseltamivir, A/Parma/24/09 virus H1N1 resistente all'oseltamivir, A/Parma/05/06 H3N2, Avian 29/05/06 H5N1 (vaccino inattivato a subunità) e A/Turkey/Italy/2676/99 H7N1 (gentilmente forniti dalla Dr.ssa Isabella Donatelli, ISS, Italia). Il virus PR8 à ̈ stato coltivato nella cavità allantoica di uova di pollo embrionate di 10 giorni. Dopo 48 h a 37°C, il fluido allantoico à ̈ stato raccolto e centrifugato a 5000 rpm per 30 min per rimuovere i detriti cellulari e i titoli virali sono stati determinati tramite titolazione dell'emoagglutinazione e saggio delle placche in accordo con le procedure standard (Gaush and Smith, 1968; Kurokawa et al. 1990). I virus A/RomaISS/2/08 H1N1, A/Parma/24/09 H1N1 e A/Parma/05/06 H3N2 sono stati coltivati in cellule renali di cane (Madin-Darby canine kidney, MDCK). Le cellule MDCK sono state coltivate a 37°C in atmosfera umidificata contenente il 5% di C02in terreno MEM (Minimal Essential Medium, Gibco; Paisley, UK) contenente 1,2 g/L di NaHC03e supplementato con il 10% di siero di vitello fetale inattivato (FCS, Flow Laboratories, Irvine, UK.), glutammina 2 mM, il 2% di amminoacidi non essenziali (Gibco; Paisley, UK), penicillina (100 UI/ml) e streptomicina (100 pg/ml). I virus sono stati inoculati in monostrati confluenti di cellule cresciute in bottiglie rotanti alla molteplicità di infezione (multiplicity of infection, m.o.i.) di 1 unità formante placca (p.f.u.)/cellula. Dopo 90 min a 35°C, l'inoculo à ̈ stato rimosso e i monostrati sono stati lavati tre volte con tampone fosfato salino (Phosphate Buffered Saline, PBS, pH 7,4) e quindi incubati a 35°C in terreno di coltura contenente il 2% di amminoacidi non essenziali (Gibco; Paisley, UK), il 4% di siero albumina bovina (BSA frazione V, Gibco; Paisley, UK) e 0,5pg di tripsina trattata con N-tosil-L-fenilalanina clorometilchetone (Tripsina TPCK; Sigma Chemical Co.; St. Louis, MO, USA). Quando veniva osservato un effetto citopatico (cytopathic effect, c.p.e.) esteso, le colture infettate venivano congelate e scongelate tre volte, centrifugate (3000 rpm, 10 min) e i sopranatanti venivano conservati a -80°C. Il titolo infettante veniva determinato tramite titolazione dell'emoagglutinazione e saggio delle placche in accordo con le procedure standard (Gaush and Smith, 1968; Kurokawa et al., 1990).

Purificazione del virus

Per la purificazione virale il fluido allantoico infetto o i sopranatanti delle colture infette sono stati raccolti e centrifugati a 1000g per 30 min per rimuovere i detriti cellulari. Il virus à ̈ stato centrifigato a 25000g per 20 h. Il pellet à ̈ stato risospeso in tampone salino HEPES 10 mM (HBS) per 1 h a 4°C, omogeneizzato, incubato a 20°C per 45 min e centrifugato a 2000g per 15 min per rimuovere il virus aggregato .

Il sopranatante à ̈ stato posto su un gradiente discontinuo di saccarosio 0/20/40/60% e centrifugato a 85000g per 2 h. Il virus purificato à ̈ stato raccolto all'interfaccia del saccarosio 20/40%, saggiato per il contenuto proteico, congelato rapidamente e conservato a -80°C.

Lattoferrina

La lattoferrina da latte bovino (bLf), acquistata dalla Morinaga Milk Industries (Zama City, Giappone), à ̈ stata deprivata dell 'endotossina come descritto precedentemente (Pietrantoni et al., 2006). La bLf detossificata à ̈ stata disciolta come soluzione stock (400 mM) in PBS apirogeno. La purezza della bLf à ̈ stata controllata tramite SDS-PAGE (Poli-Acrilamide Gel Elettroforesi in presenza di Sodio Dodecil Solfato) colorata con nitrato di argento ed à ̈ stata giudicata essere maggiore del 95%. La concentrazione proteica à ̈ stata determinata tramite spettroscopia UV sulla base del coefficiente di estinzione di 15,1 (280 nm, soluzione 1%) (Groves, 1960). Il tasso di saturazione in ferro della bLf, determinato tramite spettrometria ad assorbimento atomico, era circa 19,4%.

Idrolisi enzimatica della bLf, separazione purificazione tramite HPLC e caratterizzazione dei lobi N e C

La bLf (4 mg/ml) à ̈ stata dissolta in ammonio bicarbonato 50 mM, pH 8,5 e la digestione con tripsina (da pancreas bovino, trattata con TPCK, Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, USA) à ̈ stata condotta tutta la notte a 37°C usando un rapporto enzima/ substrato di 1:50 peso/peso. I lobi N e C ottenuti dall'idrolisi enzimatica sono stati purificati tramite HPLC a fase inversa su una colonna Vydac C18 (250x10 mm, 5 Î1⁄4πι) usando un sistema Waters HPLC (Datasystem Millenium, HPLC pumps Waters 510, Detector Waters 486). Come eluenti sono stati utilizzati acido trifluoroacetico allo 0,1% (solvente A) e acido trifluoroacetico allo 0,07% in 95% acetonitrile (solvente B). L'eluzione à ̈ stata condotta attraverso un corto gradiente lineare da 35% a 55% di solvente B per 20 min. con un flusso di 3,5 ml/min. e monitorata a 220 nm. La frazione contenente tripsina à ̈ stata scartata poiché non coeluiva con le frazioni contenenti i lobi della bLf. Inoltre esperimenti di controllo non hanno mostrato attività triptica residua nelle frazioni digerite di bLf poiché l'enzima andava incontro ad autoidrolisi e inattivazione a causa delle condizioni denaturanti dell'HPLC. L'analisi elettroforetica (SDS-PAGE) delle frazioni ottenute con l'HPLC à ̈ stata condotta utilizzando gel al 12,5% colorato con Blu di Comassie R250. La purificazione e la caratterizzazione dei lobi N e C della bLf sono state condotte come precedentemente descritto (Superti et al., 2001). Le frazioni contenenti i lobi della bLf sono stati raccolti, essiccati in una centrifuga Speed-Vac (Savant), liofilizzati due volte e conservati a -20°C.

Sintesi dei peptidi

La sintesi dei peptidi à ̈ stata condotta in fase solida (Solid Phase Peptide Synthesis, SPPS) con chimica Fmoc dalla Ditta Primm Biotech, Inc., Milano, Italia. Le catene peptidiche sono state assemblate su un supporto solido partendo dal C-terminale e procedendo verso l'N-terminale ripetendo tre fasi di base: deprotezione dello Fmoc (9-fluorenilmetilossicarbonile) ammino gruppo in alfa dell'amminoacido, attivazione del successivo amminoacido protetto, come estere attivo, e coupling. Dopo aver ottenuto la sequenza di amminoacidi desiderata, il peptide à ̈ stato rimosso dal supporto polimerico tramite clivaggio con TFA (acido trifluoroacetico) con la concomitante rimozione dei gruppi di protezione sulle catene laterali degli amminoacidi .

Saggio di citotossicità

Al fine di stabilire la massima dose non citotossica della bLf e dei suoi derivati, diluizioni seriali in base due di ogni sostanza in terreno di coltura sono state incubate a 37°C con cellule MDCK confluenti cresciute in micropiastre per culture cellulari da 96 pozzetti (Nalge Europe Ltd, Neerijse, Belgio) . Dopo 24 h sono stati valutati i seguenti parametri: la morfologia e la vitalità cellulare (determinata tramite colorazione con rosso neutro) sono state esaminate al microscopio ottico mentre la proliferazione cellulare à ̈ stata quantificata contando al microscopio le cellule separate tramite tripsina. Le diluizioni delle sostanze che non alteravano nessuno di questi parametri sono state considerate come non citotossiche e utilizzate per i saggi di attività antivirale .

Inibizione dell'emoagglutinazione

I saggi di emoagglutinazione sono stati condotti in piastre da microtitolo con fondo a U utilizzando 50 Î1⁄4l di una sospensione di emazie di tacchino allo 0,5% in PBS aggiunte a 50 Î1⁄4l di virus diluito serialmente in PBS . Per saggiare la bLf o i frammenti peptidici nell'inibizione dell'emoagglutinazione, il virus in PBS à ̈ stato incubato con volumi uguali di diluizioni seriali con fattore due di bLf o dei suoi frammenti peptidici in PBS, partendo da 12,5 Î1⁄4Îœ, per 60 min. a 4<0>C . E' stato quindi aggiunto un volume uguale di emazie di tacchino allo 0,5% in PBS ed à ̈ stata condotta l'agglutinazione. I titoli sono stati espressi come il reciproco della diluizione di bLf o dei suoi frammenti peptidici che inibivano del 50% l'emoagglutinazione ottenuta da 4 unità emagglutinanti di virus.

Saggio di neutralizzazione

La neutralizzazione del legame del virus alle cellule MDCK à ̈ stata condotta incubando diluizioni seriali con fattore due di bLf o dei suoi frammenti peptidici, partendo da 12,5 Î1⁄4Îœ, in terreno di coltura con volumi uguali di sospensioni virali (0,25 mi} contenenti 1.10<6>p.f.u./Q,25 mi. Per i controlli negativi in sostituzione della bLf o dei suoi frammenti peptidici à ̈ stato utilizzato uno stesso volume di terreno di coltura. Le miscele sono state incubate per 60 min. a 4°C. Monostrati di cellule MDCK, cresciuti in micropiastre per culture cellulari da 96 pozzetti (Nalge Europe Ltd, Neerijse, Belgium) per 24 h a 37°C in aria contenente il 5% di C02, sono stati infettati (in quadruplicato) con 100 Î1⁄4l/pozzetto della miscela virus -proteine . E' stato osservato che in questo tipo di saggio di neutralizzazione il rapporto virus/cellula era molto importante e che il rapporto ottimale in piastrine da 96 pozzetti si aveva infettando 20.000 cellule con 2.10<s>p.f.u. di virus (m.o.i. 10). Dopo un'ora di assorbimento a 37°C, le cellule erano lavate estesamente e incubate a 37°C per 24 ore. L'effetto citopatico (c.p.e.) virale à ̈ stato misurato tramite colorazione con rosso neutro. Dopo essere state colorate e lavate, le cellule MDCK sane ritenevano il colorante rosso neutro a differenza delle cellule danneggiate in seguito a infezione con il virus dell'Influenza. La quantità di cellule sane à ̈ stata determinata leggendo l'assorbanza del rosso neutro di ciascun pozzetto a A540. La frazione di cellule vitali in presenza delle sostanze neutralizzanti à ̈ stata quantificata attraverso la colorazione delle cellule in quanto l'intensità di colorazione era direttamente proporzionale al numero delle cellule vitali.

La percentuale di neutralizzazione à ̈ stata determinata per mezzo della seguente formula:

% di neutralizzazione:

A540dei pozzetti infettati contenenti la sostanza da testare - A540dei pozzetti di controllo infettati

A54Odei pozzetti del controllo cellula - A540dei pozzetti di controllo infettati

x 100%

Il titolo delle sostanze neutralizzanti nel saggio del rosso neutro à ̈ stato riportato come IC50, che indica il reciproco della diluizione della sostanza alla quale il 50&% delle cellule MDCK era protetto dalla morte indotta dal virus.

Saggio dell'assorbimento del rosso neutro

Per il saggio dell'assorbimento del rosso neutro, le cellule infette trattate e non trattate sono state colorate per 3 h con rosso neutro (50 pg/ml, 200 Î1⁄4l/pozzetto, 37°C, 5% C02) ; le cellule sono state quindi lavate con una soluzione di sali di Hank e fissate per lo min. a temperatura ambiente con 4% formaldeide e 10% CaCl2(200 Î1⁄4l/pozzetto) . Il colorante assorbito à ̈ stato estratto per 15 min. a temperatura ambiente con acido acetico all'1% in etanolo al 50% (200 Î1⁄4l/pozzetto) e il danneggiamento delle cellule da parte del virus o la possibile protezione da parte dei composti à ̈ stata misurata a 540 nm in un lettore ELISA.

Far-western-blot

Preparazioni purificate di subunità virali dei ceppi Solomon (H1N1) e Wisconsin (H3N2) sono state separate tramite SDS-PAGE, come descritto da Laemmli (1970) in condizioni denaturanti e/o non denaturanti su un gel di acrilammide al 15%. Le proteine sono state quindi trasferite dal gel su membrane di nitrocellulosa (Bio-Rad, Hercules, California, USA), utilizzando una cella per trasferimento semisecco (Trans-blot, Bio-Rad, Hercules, California, USA) secondo il protocollo del produttore. Dopo il trasferimento, le membrane sono state bloccate per 1 h con una soluzione al 5% di latte scremato e lavate con Tween-20 allo 0,05% in PBS (soluzione di lavaggio). Le membrane sono state quindi incubate per 90 min. con una soluzione di lavaggio contenente 1 mg/ml (12,5 Î1⁄4Îœ) di bLf. Dopo estensivo lavaggio le membrane sono state incubate con anticorpi di coniglio anti-lattoferrina (Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri, USA) in una soluzione di lavaggio per 1 h, lavati ancora e quindi incubati per 1 h con anticorpi IgG di capra anti-coniglio marcati con perossidasi di rafano (Bio-Rad, Hercules, California, USA). Dopo lavaggio estensivo la colorazione à ̈ stata ottenuta usando il kit per la perossidasi con substrato 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) (Vector Laboratories, Inc., Buriingame, California, USA) secondo il protocollo del produttore. Tutte le incubazioni sono state condotte a temperatura ambiente. Il legame aspecifico dell'anticorpo anti-Lf alle proteine virali à ̈ stato verificato incubando le strisce di nitrocellulosa con anticorpi di coniglio anti-Lf e con anticorpi anti-coniglio coniugati con HRP.

Sequenziamento

Per identificare la regione dell'HA riconosciuta dalla bLf in far-western blot, le subunità di A/Solomon 3/2006 H1N1 sono state separate su gel di acrilammide al 15% in condizioni denaturanti. Le proteine separate sono state quindi trasferite dal gel su membrana di difluoruro di polivinilidene(PVDF) (Bio-Rad, Hercules, California, USA), utilizzando una cella per trasferimento semisecco (Trans-blot, Bio-Rad, Hercules, California, USA) secondo il protocollo del produttore. Il trasferimento à ̈ stato condotto usando un tampone CAPS [acido 3-cicloesilammino-l-propansulfonico] 10 mM (pH 11,0) contenente metanolo al 10%. La membrana à ̈ stata quindi colorata con una soluzione di Blu di Comassie R-250 (0,25% peso/volume) in metanolo 50% per circa 5 min., lavata con acqua e decolorata in metanolo al 50% con agitazione costante. La banda proteica di interesse à ̈ stata rimossa, lavata estesamente con acqua sterile di Milli-Q e le sequenze amminoacidiche N-terminali sono state determinate con il metodo di degradazione di Edman dalla Primm Biotech, Ine., Milano, Italia.

Saggio Immunoenzimatico (Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)

E' stato condotto un ELISA per determinare il legame della lattoferrina alle particelle virali trattate a pH appropriati. I virus A/RomaISS/2/08 e A/Parma/24/09 sono stati trattati con tampone TNE (0,1 M Tris, 1 M NaC1, 0,05 M Na EDTA) a differenti pH (pH 7,4, 6,0, 5,0 e 4,0). Dopo incubazione a 37°C per 15 min. , la reazione à ̈ stata neutralizzata con NaOH e i virus sono stati usati per il saggio di legame. Piastre a 96 pozzetti a fondo piatto (Nalge Europe Ltd. , Neerijse, Belgio) sono state ricoperte con 0,1 mg/pozzetto di lattoferrina in tampone carbonato 0,05 M (pH 9,6) a 4° C per tutta la notte. Le piastre sono state bloccate con siero albumina bovina (BSA) al 10% in PBS per 2 h a 37 ° C. Dopo lavaggio con PBS contenente Tween-20 0,01% (PBS-T), le piastre sono state incubate a 37°C per 1 h con 50 Î1⁄4l di particelle virali purificate pretrattate per 15 min a 37°C con PBS a differenti pH (pH 7,4, 6,0, 5,0 e 4,0). Le piastre sono state lavate e incubate a 37 C per 1 h con anticorpi di pollo anti- influenza A (Abcam pie, Cambridge, UK) in PBS contenente 1% di BSA, lavate nuovamente e incubate a 37 C per 1 h con IgG policlonali di coniglio anti-polio coniugati con HRP (Sigma Chemical Co.; St. Louis, Missouri, USA). Dopo lavaggio con PBS-T, à ̈ stato aggiunto il substrato per la perossidasi dicloridrato di ortofenilendìammina (OPD). La reazione di sviluppo del colore à ̈ stata bloccata aggiungendo 50Î1⁄4L of HC1 3,0 N. La densità ottica à ̈ stata letta su un lettore di piastre multipozzetto (PerkinElmer Italia, Monza) a 490 nm.

Microscopia. elettronica a trasmissione (Transmission Electron Microscopy, TEM)

Per la visualizzazione in TEM le particelle virali purificate sono state trattate per 15 min a 37°C con PBS a differenti pH (pH 7,4, 6,0, 5,0 e 4,0). Dopo la neutralizzazione del pH, 20Î1⁄41 di ciascun campione sono stati assorbiti su griglie di rame a 400 maglie ricoperte da formvar-carbone, colorati con acido fosf otungstico (PTA) al 2% (pH 7,0) per 30 s e osservati con un microscopio elettronico Philips 208S a 80 kV.

Metodi computazionali

Le sequenze peptidiche dell 'HA sono state ottenute per i ceppi virali A/Solomon 3/2006 H1N1, A/Wisconsin/67/2005 H3N2, A/Puerto Rico/8/34 H1N1 (PR8 virus), A/RomaISS/2/08 H1N1 e A/Parma/24/09 H1N1. Le sequenze ottenute sono state allineate a quelle delle HA la cui struttura a raggi X à ̈ disponibile nel Protein Data Bank. Il programma BlastX à ̈ stato usato per tradurre la sequenza nucleotidica in sequenza amminoacidica . L'allineamento delle sequenze con FASTA à ̈ stato effettuato applicando i parametri seguenti: algoritmo: EMBOSS, metodo: needle, matrice: Blosum62, penalty apertura gap: -10, penalty ampiezza dei gap: -0,5. La stessa procedura à ̈ stata applicata per allineare i lobi N e C della bLf, ottenuti tagliando la sequenza completa al residuo numero 342.

I calcoli di docking proteina-proteina sono stati effettuati utilizzando la struttura a raggi X dell'HA con codice PDB 2WRG e del lobo C della bLf con codice PDB 3IB0. Le due strutture cristallografiche sono state sottoposte alla procedura di Protein Preparation in Maestro (Schrodinger, New York, USA) che permette di correggere la struttura del recettore, eliminando le molecole d'acqua e di zucchero, correggendo gli ordini di legame, aggiungendo gli atomi di idrogeno, ionizzando i residui di lisina, arginina, glutammato e aspartato. Per ottimizzare la rete di legami idrogeno, sono stati predetti i tautomeri e lo stato di ionizzazione delle istidine, sono state assegnate le rotazioni di 180° degli angoli χ terminali dei residui di Asn, Gln e His, e sono stati campionati gli atomi di idrogeno dei gruppi ossidrilici e tiolici. Per ciascuna struttura un breve rilassamento à ̈ stato effettuato usando una minimizzazione all-atom vincolata eseguita con il modulo Impact Refinement (Impact, Schrodinger, New York, USA) usando il force-field OPLS-2005, per ridurre i conflitti sterici che posso esserci nella struttura PDB originale. La minimizzazione à ̈ stata terminata quando l'energia à ̈ arrivata a convergenza o l'RMSD ha raggiunto un cutoff massimo di 0,30 A. La proteina 3IB0 à ̈ stata preliminarmente passata attraverso la procedura di homology modelling Prime (Prime, Schrodinger, New York, USA) per completare la struttura con i residui mancanti.

Le strutture così preparate sono state sottoposte a differenti procedure di docking utilizzando quattro software (Autodock-MacroModel, ZDock-RDock, PatchDock-FireDock e ClusPro). Tutti comprendono un calcolo di docking preliminare seguito da una fase di rifinitura.

1. Un calcolo di docking rigido à ̈ stato effettuato con Autodock, impostando la griglia sulla regione del gambo di un solo monomero dell'HA. I calcoli di docking sono stati eseguiti utilizzando l'Algoritmo Genetico Lamarckiano (Morris et al., 1998) come algoritmo di ricerca implementato in Autodock. Sono state usate le impostazioni seguenti: numero dì punti della griglia in xyz, 126 126 126, spacing 1,0 À, numero di individui nella popolazione 300, numero massimo di valutazioni di energia 2500000, numero massimo di generazioni 30000, GA-LS ibrido, 250 corse. Dopo aver ordinato tutte le conformazioni per energia, le pose di docking sono state raggruppate per mezzo di ADTools, applicando un cutoff di RMSD di 0,5 Ã…. I complessi più rappresentativi di ciascun gruppo sono stati successivamente minimizzati interamente (senza vincoli) con MacroModel (MacroModel, Schrodinger, New York, USA) applicando le impostazioni seguenti: forcefield OPLS-2005, solvente Acqua, numero massimo di iterazioni 10000, metodo di minimizzazione PRCG, convergenza sul gradiente con una soglia di 0,05.

2. ZDock e RDock sono implementati in Discovery Studio (Discovery Studio, Accelrys, San Diego, USA). I calcoli di docking sono stati effettuati impostando i parametri seguenti: i residui della parte superiore dell 'HA e i residui del lobo C della bLf a stretto contatto con il lobo N sono stati bloccati (non esplorati) , sono state generate 54000 pose iniziali di docking, le migliori 2000 pose sono state classificate con ZRank (Chen et al., 2002) e quindi raggruppate a ottenere 100 gruppi (RMSD > 10 Å). I complessi più rappresentativi di ciascun gruppo sono stati sottoposti a una successiva rifinitura con RDock (Li et al., 2003) applicando i parametri di default.

3. PatchDock (Duhovny et al., 2002; Schneidman-Duhovny et al., 2005) à ̈ un server web (http: //bioinfo3d. cs.tau. ac.il/PatchDock) che compie calcoli di docking usando un algoritmo basato su principi di complementarietà della forma (rigid-body) . Sono stati applicati i parametri di default e 100 complessi (raggruppati con un cutoff di RMSD di 4,0 À) sono stati passati alla successiva rifinitura con FireDock (Andrusier et al., 2007; Mashiach et al., 2008) . Quest'ultimo à ̈ un server web che effettua un raffinamento flessibile su larga scala, attraverso un riarrangiamento ristretto delle catene laterali all'interfaccia e attraverso un'ottimizzazione soft rigid-body .

4. ClusPro à ̈ un server web (http://cluspro.bu.edu/home.php) che sfrutta PIPER (Kozakov et al., 2006), un algoritmo di docking basato su FFT, per generare 1000 complessi che sono stati successivamente raggruppati. I migliori rappresentanti dei raggruppamenti sono stati sottoposti a rifinitura attraverso una simulazione Monte Carlo e applicando il Semi-Defined programming based Underestimation (SDU) per classificare i complessi (Kozakov et al., 2010).

Tutti i complessi risultanti dai quattro calcoli di docking sono stati raccolti e analizzati per rimuovere le pose non adatte.

I complessi selezionati sono stati raggruppati per trovare un consenso tra le pose generate con approcci differenti. Il clustering à ̈ stato effettuato usando R (R, The R foundation for statistical computing) e applicando la metrica di clustering Ward.

I 161 complessi risultanti sono stati allineati tra loro e analizzati visivamente usando PyMOL v 1,2 (PyMOL, DeLano Scientific, San Francisco, USA).

Risultati

Interazione della bLf con l'emoagglutinina virale Il primo stadio dell'entrata del virus dell'Influenza nelle cellule suscettibili dipende dall'interazione tra la HA virale e uno specifico recettore cellulare contenente acido sialico. Poiché il legame al recettore dell 'HA funzionale può essere misurato mediante emoagglutinazione di eritrociti dì tacchino, à ̈ stata saggiata l'interazione diretta tra il virus e la bLf, analizzando l'inibizione dell'attività emoagglutinante del virus. Come mostrato in Tabella 1 (interazione della bLf con l'HA virale), concentrazioni di bLf comprese tra 0,05 pM e 6nM sono state capaci di prevenire l'attività emoagglutinante di tutti i ceppi virali saggiati. Non à ̈ stata osservata, nei saggi descritti sopra, né agglutinazione indotta da bLf né alcuna evidenza visiva di lisi degli eritrociti, quindi l'inibizione dell'emoagglutinazione virale à ̈ stata considerata attendibile.

Tabella 1

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Ceppo Virale sottotipo Titolo HI

A/Roma~ISS/2/08 (Brisbane-simile) H1N1 6 nM (oseltamivir-sensibile)

A/Parma/24/09 (Brisbane-simile) H1N1 6 nM (oseltamivir-resistente)

A/PR/8/34 H1N1 3 nM

A/Solomon (3/06) subunità H1N1 5 pM inattivate, vaccino

A/Parma/5/06 (Wisconsin-simile) H3N2 3 nM A/Wisconsin (67/05) subunità H3N2 0,3 pM inattivate, vaccino

SW X-179A 1089/09 subunità H1N1 46,5 fM inattivate, vaccino _

Avian 29/05/06 vaccino inattivato H5N1 2,9 pM

A/Turkey/Italy/2676/ 99 H7N1 93,1 fM

Neutralizzazione dell'infezione del virus dell'Influenza da parte della lattoferrina

E' stato valutato se, e fino a che punto, la bLf potesse influenzare la replicazione virale. Per fare questo, à ̈ stato utilizzato il test di colorazione delle cellule MDCK mediante rosso neutro, come misura della vitalità cellulare. In questi esperimenti sono stati utilizzati due ceppi di virus influenzale sottotipo A/H1N1 (A/Roma-ISS/2/08 e A/Parma/24/09) e un ceppo di virus sottotipo A/H3N2 (A/Parma/05/06) . La replicazione virale à ̈ risultata fortemente inibita dalla bLf, a concentrazioni più basse di diversi logaritmi rispetto a quelle che causavano citotossicità aspecifica sulle cellule MDCK. Per determinare l'indice di selettività (SI) della lattoferrina, à ̈ stato calcolato il rapporto tra la concentrazione di bLf che dava il 50% di citotossicità (CC50) e la concentrazione richiesta per inibire l'effetto citopatico virale del 50% (EC50). 1 valori di SI sono stati circa tra 10<6>e 10<5>rispettivamente per i sottotipi A/H1N1 and A/H3N2 (dati non mostrati)

Far-western-blot e identificazione proteica

In base ai dati riportati sopra, abbiamo provato ad identificare i reali componenti del legame bLfvirus, cominciando con l'esaminare l'interazione della bLf con le proteine dell'involucro virale. A tale scopo, gli antigeni di superficie HA e NA presenti nei vaccini a subunità Solomon (H1N1) e Wisconsin (H3N2) sono stati separati per elettroforesi e fatti reagire con la bLf, mediante saggio di far-western-blot. Le Figure 1 e 2 dimostrano che in entrambi i ceppi virali la bLf si lega più consistentemente a una proteina virale di apparente peso molecolare di 28KDa, corrispondente probabilmente alla subunità HA2dell'HA.

Risultati simili sono stati ottenuti con il vaccino a subunità del ceppo suino pandemico SW X-179A (H1N1) (Figura 6).

Il sequenziamento dell'estremità N-terminale del campione a subunità H1N1 Solomon ha confermato che la componente virale legata dalla bLf à ̈ effettivamente la subunità HA2dell'HA. In particolare, i primi 18 amminoacidi della sequenza N-terminale sono GLFGAIAGFIEGGWTGMV (SEQ ID No: 6), corrispondenti al peptide di fusione altamente conservato della subunità HA2 (Ekiert et al., 2009)(Figura 7).

Saggio del pH

Dato che la bLf riconosce la subunità HA2, che à ̈ coinvolta nei cambiamenti conformazionali indotti dal pH durante l'entrata del virus dell'Influenza nelle cellule dell'ospite suscettibile, sono stati eseguiti degli esperimenti per determinare il legame della lattoferrina a particelle virali esposte a differenti valori di pH. Questi esperimenti sono stati eseguiti, con risultati simili, con due ceppi virali, ma i dati in Figura 3 si riferiscono al ceppo virale A/RomaISS/2/08 . E' stato riscontrato che la bLf si lega al virus con maggiore affinità a pH acido (52,9 /-9,7% e 34,1 /-4,1% rispettivamente a pH 5,0 e 6,0). Il legame della bLf era ancora alto a pH 4,0 (47,2 /-1,4%) (Figura 3a) . Quando il virus dell'Influenza à ̈ stato osservato in microscopia elettronica a trasmissione dopo contrasto negativo con acido fosfotungstico , le particelle virali trattate e non trattate sono apparse molto differenti nella morfologia (Figura 3b).

Come mostrato in Figura 3b, a pH neutro, le proiezioni dell' HA apparivano come strutture rettangolari, ben ordinate, emergenti dalla membrana virale (A). Le particelle virali trattate a pH 6,0 mostravano sui virioni proiezioni ancora distinte e ben definite (B). Dopo incubazione a pH 5,0, l'aspetto ben ordinato veniva perso ed era difficile distinguere le singole proiezioni (C). Questo quadro era più evidente dopo trattamento a pH 4,0, in cui le proiezioni apparivano molto disordinate e a mala pena distinguibili (D).

La perdita della struttura ben definita delle proiezioni, osservata a basso pH, riflette le variazioni conformazionali irreversibili dell 'HA (Ruigrok et al., 1986).

Effetto del lobo N e del lobo C sull 'emoagglutinazione virale

La bLf à ̈ costituita da due lobi, denominati lobo N e lobo C, appartenenti rispettivamente alle unità N-termìnale e C-terminale della molecola. Ci siamo quindi chiesti quale dei due lobi interagisse effettivamente con la componente HA2 del virus influenzale per inibire l'emoagglutinazione virale. I risultati ottenuti sono riportati nella Tabella 2 che mostra l'attività dei lobi N e C sull'emoagglutinazione virale.

Tabella 2

Ceppo virale Sottotipo Lobo Lobo C Lobo C N (aa 285- (aa 345-(aa 689) 689) 1-280)

A/Roma-ISS/2/08 H1N1 10 nM 10 nM

A/Parma/24/09 H1N1 - 24 nM 10 nM

A/PR/8/34 H1N1 24 nM 12 nM

A/Solomon (3/06) H1N1 5 pM 5 pM Vaccino SU inattivato

A/Parma/5/06 (Wisconsin- H3N2 6 nM 6 nM simile)

A/Wisconsin (67/05) Vaccino H3N2 1,6 pM 1,2 pM SU inattivato

SW X-179A 1089/09 H1N1 46,5 fM 46,5 fM Vaccino SU inattivato

Avian 29/05/06 vaccino H5N1 2,9 pM 2,4 pM inattivato

A/Turkey/Italy/2676/99 H7N1 “ 93,1 fM 93,1 fM

Una marcata inibizione dell 'emoagglutinazione virale à ̈ stata ottenuta con il lobo C mentre il lobo N non ha mostrato alcuna attività inibitoria.

Neutralizzazione dell'infezione virale da parte dei lobi N e C

Successivamente abbiamo esaminato se, e fino a che punto, i lobi N e C della bLf potessero influenzare la replicazione virale. In questi esperimenti sono stati utilizzati due ceppi di virus sottotipo A/H1N1 (A/Roma-ISS/2/08 e A/Parma/24/09), e un ceppo di virus sottotipo A/H3N2 (A/Parma/05/06). Come ci si aspettava, l'infezione virale non à ̈ stata influenzata dal trattamento con il lobo N mentre à ̈ stata fortemente inibita dal lobo C. I valori del SI sono stati 2,5 - 5 volte maggiori di quello della bLf intera (dati non mostrati) .

Docking proteina-proteina

I dati riportati sopra dimostrano che la bLf interagisce con l'HA e suggeriscono una possibile interazione tra il lobo C della bLf e il peptide di fusione (subunità HA2) dell'HA. A causa della mancanza di dati strutturali (Raggi-X o NMR) sull'interazione tra le due proteine, per ottenere maggiori informazioni sulle modalità di legame tra la bLf e l'HA à ̈ stato necessario sviluppare un protocollo di docking proteina-proteina.

Per i calcoli di docking à ̈ stata usata la struttura a raggi X del lobo C della bLf con il codice PDB 3IB0, poiché questa porzione à ̈ responsabile dell'attività della bLf (vedi sopra). La struttura cristallografica dell'HA con codice PDB 2WRG à ̈ stata selezionata poiché mostrava la più alta similarità di sequenza con le HA isolate dai ceppi virali H1N1 usati nei saggi.

La Tabella 3 mostra le percentuali di identità e similarità di sequenza delle emoagglutinine dei ceppi indicati con la struttura cristallografica 2WRG.

Tabella 3

Ceppo virale sottotipo % Identità<а>% Similarità<а>

A/Solomon (3/06) H1N1 82 88 subunità

inattivate, vaccino

A/Roma-ISS/2/08 H1N1 84 90

A/Parma/24/09 H1N1 84 89

A/PR/8/34 H1N1 86 90

<a>valori calcolati con il Multiple Sequence Viewer di Maestro.

Quello che à ̈ degno di nota à ̈ che le maggiori differenze sono state riscontrate nei residui della subunità HAi, mentre la sequenza HA2à ̈ risultata perfettamente conservata tra tutte le HA considerate appartenenti ai ceppi H1N1, dimostrando che questa regione à ̈ un interessante target per le terapie anti-Influenza.

I calcoli di docking sono stati eseguiti usando quattro differenti software (ZDOCK, PatchDock, AutoDock, ClusPro) , selezionati per il fatto che utilizzano approcci diversi. I risultati ottenuti da tutte le procedure sono stati analizzati allo scopo di trovare un consenso: trovare modi di legame comuni applicando protocolli diversi di docking può migliorare l'affidabilità dei risultati osservati; é ben noto infatti che il docking proteina-proteina à ̈ un metodo di calcolo impegnativo che fornisce molti risultati, a causa delle grandi dimensioni delle superfici proteiche interagenti .

Tutte le simulazioni sono state eseguite usando il lobo C della bLf per velocizzare il calcolo, dal momento che i dati sperimentali hanno dimostrato che il lobo N à ̈ inattivo. Inoltre, poiché le analisi di farwestern-blot hanno dimostrato il legame alla subunità HA2, per le analisi successive sono state selezionate le pose di legame che coinvolgevano questa regione.

I risultati sono stati analizzati per eliminare tutte le pose di legame inappropriate, che coinvolgevano regioni non accessibili della bLf o dell'HA.

Come mostrato in Figura 4, la maggior parte delle pose di legame erano concentrate in due regioni del gambo dell'HA: la prima nella tasca tra i due monomeri (Figura 4A) e la seconda molto prossima al peptide di fusione (Figura 4B). Questo ultimo sito di legame sembra essere particolarmente interessante perchà ̈ corrisponde alla regione bersaglio degli anticorpi universali.

Quindi il legame a questa regione potrebbe spiegare perchà ̈ l'inibizione della bLf si esercita su tutti i ceppi virali analizzati.

Il lobo C della bLf si può legare in diversi modi, ma il legame più frequente all'HA à ̈ mediato da tre loop: SKHSSLDCVLRP (aa 418-429) (SEQ ID NO:1), NGESTADWAKN, (aa 553-563) (SEQ ID NO: 3) e AGDDQGLDKCVPNSKEK (aa 506-522) (SEQ ID NO:2).

Le sequenze 418-429 e 553-563 corrispondono ai loop che non sono presenti nel lobo N, come dimostrato dall'allineamento delle sequenze del lobo N e del lobo C (Figura 5) . A causa della scarsa stabilità del peptide NGESTADWAKN, à ̈ stata disegnata una sequenza modificata in cui il residuo di treonina à ̈ stato sostituito con una serina omologa, i.e. NGESSADWAKN (SEQ ID NO: 4). I peptidi sono stati testati nei saggi di HI e Nt.

Interazione dei peptidi derivati dalla bLf con l 'emoagglutinina virale

L'interazione diretta tra il virus e i peptidi derivati dalla bLf à ̈ stata testata analizzando l'inibizione dell'emoagglut inazione virale. Come mostrato in Tabella 4, SKHSSLDCVLRP (residui amminoacidici 418-429) (SEQ ID NO:l), AGDDQGLDKCVPNSKEK (residui amminoacidici 506-522) (SEQ ID NO: 2) e NGESSADWAKN (SEQ ID NO: 4) sono stati capaci di prevenire l'attività emoagglut inante di tutti i ceppi virali testati in maggior misura rispetto alla proteina intera.

Tabella 4

SEQ ID SEQ ID NO:2 SEQ ID No:4 Ceppo virale sottotipo No:1 Titolo IH Titolo IH Titolo

IH

A/Roma-ISS/2/08 H1N1 1,4 pM 1,4 pM 0,7 fM

A/Parma/24/09 H1N1 1,4 pM 1,4 pM 0,3 fM

A/PR/8/34 H1N1 0,7 nM 0,35 nM 0,7 fM

A/Solomon (3/06) Η1ΠΊ 46,5 fM 46,5 fM 93 fM subunità inattivate,

vaccino

A/Parma/5/06 H3N2 0,7 pM 0,7 pM 0,3 pM (Wisconsin-simile)

A/Wisconsin (67/05) H3N2 23,2 fM 11,6 fM 5,8 fM subunità inattivate,

vaccino

SW X-179A 1089/09 SU H1N1

inattivate vaccino 5,8 fM 46 fM 0,3 fM

Avian 29/05/06 vaccino H5N1

inattivato 18 fM 70 fM 93,1 fM

A/Turkey/Italy/2676/99 H7N1

18 fM 46,5 fM 5,8 fM

Come osservato per la bLf, in questi saggi non à ̈ stata rilevata né agglutinazione indotta dai peptidi né alcuna evidenza visiva di lisi degli eritrociti, quindi anche l'inibizione dell 'emoagglutinazione virale da parte dei peptidi à ̈ stata considerata attendibile.

Neutralizzazione dell'infezione virale in cellule MDCK da parte dei peptidi derivati dalla bLf Abbiamo esaminato se, e fino a che punto, i peptidi derivati dalla bLf fossero in grado di influenzare la replicazione virale. In questi esperimenti sono stati utilizzati due ceppi di virus influenzale sottotipo H1N1 (A/Roma-ISS/2/08 e A/Parma/24/ 09) e un ceppo di virus sottotipo A/H3N2 (A/Parma/05/ 06). Come mostrato nelle Tabelle 5, 6 e 7, i peptidi derivati dalla bLf sono stati migliori inibitori della proteina intera, poiché i loro indici di selettività sono stati, a seconda del ceppo virale, più elevati di uno o due ordini di grandezza. Per quanto riguarda NGESSADWAKN (SEQ ID NO:4), il'SI nelle cellule infettate con H1N1 (ceppo resistente all oseltamivir) raggiunge valori 500 volte maggiori rispetto alla bLf.

Tabella 5

Attività antivirale in vitro di SKHSSLDCVLRP (SEQ ID NO :1) verso l'infezione da virus dell'Influenza

Ceppo virale sottotipo CC5D* ECso ° SI<A>

A/ Roma- H1N1 > 25 Î1⁄4Îœ 4 pM

ISS/2/08 V

A/Parma/ 24/09 H1N1 oM > 25 Î1⁄4Îœ 3,1 pM >8 .IO<6>

A/Parma/ 05/06 H3N2 > 25 Î1⁄4Îœ 5,8 pM > 4,3 -10<6>

Tabella 6

Attività antivirale in vitro di AGDDQGLDKCVPNSKEK (SEQ ID NO:2) verso l'infezione da virus dell'Influenza

Ceppo virale sottotipo cc50* EC50° SI<A>A/ Roma- H1N1 > 25 Î1⁄4Îœ 3,7 pM >6,75 ISS/2/08 .IO<6>

A/Parma/24 /09 H1N1 > 25 Î1⁄4Îœ 3,4 pM >7,35 .IO<6>A/Parma/ 05/06 H3N2 > 25 Î1⁄4Îœ 7,3 pM >3,42 .IO<6>

Tabella 7

Attività antivirale in vitro di NGESSADWAKN (SEQ ID NO :4) verso l'infezione da virus dell'Influenza

Ceppo virale sottotipo cc50* EC5Q° SI<*>

A/ Roma- H1N1 > 25 Î1⁄4Îœ 225 fM >1.11 . ISS/2/08 IO<8>

A/Parma/ 24/09 H1N1 > 25 Î1⁄4Îœ 50 fM >5 . IO<8>

A/Parma/ 05/06 H3N2 > 25 Î1⁄4Îœ 22,5 pM >1.11 .

IO<6>

*CC50concentrazione citotossica 50%, °EC5o concentrazione efficace 50%,<A>SI (indice di selettività) =CC5O/EC50

Bibliografia

Ammendolia MG, Marchetti M, Superti F. (2007a) Bovine lactoferrin prevents thà ̈ entry and intercellular spread of herpes simplex virus type 1 in Green Monkey Kidney cells. Antiviral Res. 76:252-262.

Ammendolia MG, Pietrantoni A, Tinari A, Valenti P, Superti F. 2007b. Bovine lactoferrin inhibits echovirus endocytic pathway by interacting with virai structural polypeptides . Antiviral Res. 73:151-60.

Andersen JH, Osbakk SA, Vorland LH, Traavik T, and Gutteberg TJ. 2001. Lactoferrin and cyclic lactof erricin inhibit thà ̈ entry of human cytomegalovirus ùnto human fibroblasts. Antiviral Res.

51:141-149.

Andersen JH, Jenssen H, Gutteberg TJ. 2003. Lactoferrin and lactoferrìcin inhibit Herpes simplex 1 and 2 infection and exhibit synergy when combined with acyclovir. Antiviral Res. 58:209-215.

Anderson BF, Baker HM, Dodson EJ, Norris GE, Rumball SV, Waters JM, Baker EN. 1987. Structure of human lactoferrin at 3.2-A resolution. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84:1769-1773.

Andrusier N, Nussinov R, Wolfson HJ. 2007. FireDock: fast interaction refinement in molecular docking. Proteina 69: 139-159.

Beljaars L, van der Strate BW, Bakker HI, Reker-Smit C, van Loenen-Weemaes AM, Wiegmans FC, Harmsen MC, Molema G, Meijer DK. 2004. Inhibition of cytomegalovirus infection by lactoferrin in vitro and in vivo. Antiviral Res. 63:197-208.

Belshe RB, Burk B, Newman F, Cerruti RL, Sim IS.

1989. Resistance of influenza A virus to amantadine and rimantadine : results of one decade of surveillance. J. Infect. Dis. 159:430-435.

Berkhout B, van Wamel JL, Beljaars L, Meijer DK, Visser S, Floris R. 2002. Characterization of thà ̈ antiHIV effects of native lactoferrin and other milk proteins and protein-derived peptides. Antiviral Res.

55:341-355 .

Berkhout B, Floris R, Recio I, Visser S. 2004. The antiviral activity of thà ̈ milk protein lactoferrin against thà ̈ human immunodefi ciency virus type 1. Biometals 17:291-294.

Bright RA, Shay DK, Shu B, Cox NJ, Klimov AI, 2006. Adamantane resistance among influenza A viruses isolated early during thà ̈ 2005-2006 influenza season in thà ̈ United States. JAMA 29:891-894.

Chen R, Weng Z. 2002. Docking unbound proteins using shape complementarity, desolvation, and electrostatics . Proteins 47: 281-294.

Cheng PK, To AP, Leung TW, Leung PC, Lee CW, Lim WW. 2010. Oseltamivir- and amantadine-resistant influenza virus A (H1N1), Emerg. Infect. Dis. 16:155-156.

Dharan NJ, Gubareva LV, Meyer JJ, Okomo-Adhiambo M, McClinton RC, Marshall SA, St George K, Epperson S, Brammer L, Klimov AI, Bresee JS, Fry AM, Oseltamivir-Resistance Working Group. 2009. Infections with oseltamivir-resistant influenza A(H1N1) virus in thà ̈ United States. JAMA 30:1034-1041.

Di Biase AM, Pietrantoni A, Tinari A, Siciliano R, Valenti P, Antonimi G, Seganti L, Superti F. 2003. Heparin-interacting sites of bovine lactoferrin are involved in anti-adenovirus activity. J. Med. Virol.

69:495-502 .

Dolin R, Reichman RC, Madore HP,Maynard R, Linton PN, Webber-Jones J. 1982. A controlled trial of amantadine and rimantadine in thà ̈ prophylaxis of influenza A infection. N. Engl. J. Med. 307:580-584.

Drobni P, Naslund J, Evander M. 2004. Lactoferrin inhibits human papillomavirus binding and uptake in vitro. Antiviral Res. 64:63-68.

Duhovny D, Nussinov R, Wolfson HJ. 2002. Efficient Unbound Docking of Rigid Molecules. In Gusfield et al., Ed. Proceedings of thà ̈ 2'nd Workshop on Algorithms in Bioinformatics (WABI) Rome, Italy, Lecture Notes in Computer Science 2452: 185-200, Springer Verlag .

Edwards M, Dimmock NJ. 2001. Hemagglutinin 1-specific immunoglobulin G and Fab molecules mediate postattachment neutralization of influenza A virus by inhìbition of an early fusion event J. Virol. 75:10208-10218 .

Ekiert DC, Bhabha G, Elsliger MA, Friesen RH, Jongeneelen M, Throsby M, Goudsmit J, Wilson IA. 2009. Antibody recognition of a highly conserved influenza virus epitope. Science 324:246-251

Fiore AE, Shay DK, Broder K, Iskander JK, Uyeki TM, Mootrey G, Bresee JS, Cox NS. Centers for Disease Control and Prevention (CDC) . Advisory Committee on Immunization Practices (ACIP) 2008. Prevention and control of influenza: recommendations of thà ̈ Advisory Committee on Immunization Practices (ACIP) . MMWR Recomm. Rep . 57(RR-7):1-60.

Fujihara T, Hayashi K. 1995. Lactoferrin inhibits herpes simplex virus type-1 (HSV-1) infection in mouse cornea. Arch. Virol. 140:1469-1472.

Gaush CR, Smith TF. 1968. Replication and plaque assay of influenza virus in an established line of canine kidney cells. Appi. Microbiol. 16:588-594.

Groves ML 1960. The isolation of a red protein from milk. J. Am. Chem. Soc. 82:3345-3350.

Gubareva LV, Matrosovich MN, Brenner MK, Bethell RC , Webster RG . 1998. Evidence for zanamivir resistance in an immunocompromised child infected with influenza B virus. J. Infect. Dis. 178:1257-1262.

Hara K, Ikeda M, Saito S, Matsumoto S, Numata K, Rato N, Tanaka K, Sekihara H. 2002. Lactoferrin inhibits hepatitis B virus infection in cultured human hepatocytes. Hepatol . Res. 24:228-235.

Harmsen MC, Swart PJ, de B'ethune MP, Pawels R, De Clercq E, Th'e TH, Meijer DKF. 1995. Antiviral effects of plasma and milk proteina: lactoferrin shows a potent activity against both human immunodef iciencyvirus and human cytomegalovirus replication in vitro. J. Infect. Dis. 172:380-388

Hasegawa K, Motsuchi W, Tanaka S, Dosako S. 1994. Inhibition with lactoferrin of in vitro infection with human herpes virus. Jpn. J. Med. Sci. Biol. 47:73-85.

Hay AJ, Wolstenholme AJ, Skehel JJ, Smith MH.

1985. The molecular basis of thà ̈ specific antiinfluenza action of amantadine. EMBO J. 4:3021-3024. Hayden FG 2006. Antiviral resistance in influenza viruses - implications for management and pandemie response. N. Engl. J. Med. 354:785-788.

Kasowski EJ, Garten RJ, Bridges CB. 2011. Influenza pandemie epidemiologie and virologie diversity: reminding ourselves of thà ̈ possibilities . Clin. Infect. Dis. 52 Suppl 1:S44-S49.

Riso M, Mitamura K, Sakai-Tagawa Y, Shiraishi K, Kawakami C, Kimura K, Hayden FG, Sugaya N, Kawaoka Y.

2004. Resistant influenza A viruses in children treated with oseltamivir: descriptive study. Lancet 364:759-765 .

Kozakov D, Brenke R, Comeau SR, Vajda S. 2006. PIPER: an FFT-based protein docking program with pairwise potentials. Proteine 65:392-406.

Kozakov D, Hall DR, Beglov D, Brenke R, Comeau SR, Shen Y, Li K, Zheng J, Vakili P, Paschalidis ICh, Vajda S. 2010. Achieving reliability and high accuracy in automated protein docking: ClusPro, PIPER, SDU, and stability analysis in CAPRI rounds 13-19. Proteins 78: 3124-3130 .

Kurokawa M, Ochiai H, Nakaj ima K, Niwayama S.

1990. Inhibitory effect of protein kinase C inhibitor on thà ̈ replication of influenza type A virus. J. Gen. Virol . 71:2149-2155.

Ikeda M, Nozaki A, Sugiyama K, Tanaka T, Naganuma A, Tanaka K, Sekihara H, Shimotohno K, Saito M, Rato N.

2000. Characterization of antiviral activity of lactoferrin against hepatitis C virus infection in human cultured cells. Virus Res. 66:51-63.

Ilyushina NA, Bovin NV, Webster RG, Govorkova, EA.

2006. Combination chemotherapy, a potential strategy for reducing thà ̈ emergence of drug-resistant influenza A variants. Antiviral Res. 70: 121-131.

Laemmli UK 1970. Cleavage of structural prroteins during thà ̈ assembly of thà ̈ head of bacteriophage T4. Nature 227:680-685.

Laegreid A, Kolsto Otnaess AB, Orsavik I, Carlsen KH. 1986. Neutralizing activity in human milk fractions against respiratory syncytial virus, Acta Paediatr. Scand. 75: 696-701.

Levay PF, Viljoen M. 1995. Lactoferrin: a generai review. Haematologica 80:252-267.

Li L, Chen R, Weng Z. 2003. RDOCK: refinement of rigid-body protein docking predictions. Proteins 53:693-707 .

Marchetti, Longhi C, Conte MP, Pisani S, Valenti P, Seganti L. 1996. Lactoferrin inhibits herpes simplex virus type 1 adsorption to Vero cells, Antiviral Res.

29:221-231 .

Marchetti M, Superti F, Ammendolia MG, Rossi P, Valenti P, Seganti L. 1999. Inhibition of poliovirus type 1 infection by iron-, manganeseand zinc-saturated lactoferrin. Med. Microbiol. Immunol. 187:199-204.

Marchetti M, Superti F. 2001. Antiviral activity of lactoferrin. In: Pandalai SG, ed. Recent developments in antiviral research. Trivandrum: Transworld Research Network: 1, 193-203.

Marchetti M, Trybala E, Superti F, Johansson M, Bergstròm T. 2004. Inhibition of herpes simplex virus infection by lactoferrin is dependent on interference with thà ̈ virus binding to glycosaminoglycans . Virology 18 :405-413 .

Marchetti M, Ammendolia MG, Superti F 2009. Glycosaminoglycans are not indispensable for thà ̈ antiherpes simplex virus type 2 activity of lactoferrin. Biochimie 91:155-159.

Mashiach E, Schneidman-Duhovny D, Andrusier N, Nussinov R, Wolfson HJ. 2008. FireDock: a web server for fast interaction refinement in molecular docking. Nucleic Acids Res. Jul 1;36 (Web Server issue) :W229-232.

May JT. 1988. Microbial contaminants and antimicrobial properties of human milk. Microbiol. Sci.

5:42-46.

Meijer A, Lackenby A, Hungnes 0, Lina B, van-der-Werf S, Schweiger B, Opp M, Paget J, van-de-Kassteele J, Hay A, Zambon M. 2009. European Influenza Surveillance Scheme Oseltamivir-resistant influenza virus A (H1N1), Europe, 2007-08 season. Emerg. Infect. Dis . 15:552-560.

Moor, SA, Anderson BF, Groom CR, Haridas M, Baker, EN. 1997. Three-dimensionai structure of diferric bovine lactoferrin at 2.8 °A resolution. J. Mol. Biol.

274 :222-236.

Morris GM, Goodsell DS, Halliday RS, Hue, R, Hart, WE, Belew RK, Olson AJ. 1998. Automated Docking Using a Lamarckian Genetic Algorithm and and Empirical Binding Free Energy Function J. Computational Chemistry 19: 1639-1662.

Murphy ME, Kariwa H, Mizutani T, Yoshimatsu K, Arikawa J, Takashima I. 2000. In vitro antiviral activity of lactoferrin and ribavirin upon hantavirus. Arch. Virol. 145:1571-1582.

Norris GE, Gartner AL, Anderson BF, Ward J, Baker EN, Rumbai1 SV, Baker HM. 1986. Preliminary crystallographic studies on bovine lactoferrin. J. Mol. Biol. 191:143-145.

Palese P, Shaw ML. 2007. Orthomyxoviridae: thà ̈ viruses and their replication. In: D.M. Knipe and P.M. Howley, Editors, Fields Virology voi. 2, Wolters Kluwer/Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, pp.

1647-1690.

Palma C, Serbousek D, Torosantucci A, Cassone A, Djeu JY. 1992a. Identification of a mannoprotein fraction from Candida albicans that enhances human polymorphonuclear leukocyte (PMNL) functions and stimulates lactoferrin in PMNL inhibition of candidai growth. J. Infect. Dis. 166:1103-1112.

Palma C, Cassone A, Serbousek D, Pearson CA, Djeu JY. 1992b. Lactoferrin release and interleukin-1, interleukin- 6, and tumor necrosis factor production by human polymorphonuclear cells stimulated by various lipopolysaccharides : relationship to growth inhibition of Candida albicans . Infect. Immun. 60:4604-4611.

Peterson JA, Patton S, Hamosh M. 1998. Glycoproteins of thà ̈ human milk fat globule in thà ̈ protection of thà ̈ breast-fed infant against infections. Biol. Neonate 74:143-162.

Pietrantoni A, Di Biase AM, Tinari A, Marchetti M, Valenti P, Seganti L, Superti F. 2003. Bovine lactoferrin inhibits adenovirus infection by interacting with virai structural polypeptides . Antimicrob. Agents Chemother . 47:2688-91.

Pietrantoni A, Ammendolia MG, Tinari A, Siciliano R, Valenti P, Superti F. 2006. Bovine lactoferrin peptidic fragments involved in inhibition of Echovirus 6 in vitro infection. Antiviral Res 69:98-106.

Pietrantoni A, Dofrelli E, Tinari A, Ammendolia MG, Puzelli S, Fabiani C, Donatelli I, Superti F. 2010. Bovine lactoferrin inhibits influenza A virus induced programmed celi death in vitro. Biometals 23:465-475.

Portelli J, Gordon A, May JT . 1998. Effect of compounds with antibacterial activities in human milk on respiratory syncytial virus and cytomegalovirus in vitro, J. Med. Microbiol. 47:1015-1018.

Ruigrok RW, Wrigley NG, Calder LJ, Cusack S, Wharton SA, Brown EB, Skehel JJ. 1986. Electron microscopy of thà ̈ low pH structure of influenza virus haemagglutinin. EMBO J. 5:41-49.

Sano H, Nagai K, Tsutsumi H, Kuroki K. 2003. Lactoferrin and surfactant protein A exhibit distinct binding specificity to F protein and differently modulate respiratory syncytial virus infection. Eur. J. Immunol. 33:2894-2902.

Schneidman-Duhovny D, Inbar Y, Nussinov R, Wolfson HJ. 2005. PatchDock and SymmDock: servers for rigid and symmetric docking. Nucl. Acids Res. 33:W363-367.

Skehel JJ, Wiley DC. 2000. Receptor binding and membrane fusion in virus entry: thà ̈ influenza hemagglutinin. Annu. Rev. Biochem. 69:531-569.

Steijns JM, van Hooijdonk AC. 2000. Occurrence, structure, biochemical properties and technological characteristics of lactoferrin. Br. J. Nutr.84 Suppl

1:Sll-17.

Sui J, Hwang WC, Perez S, Wei G, Aird D, Chen LM, Santelli E, Stec B, Cadwell G, Ali M, Wan H, Murakami A, Yammanuru A, Han T, Cox NJ, Bankston LA, Donis RO, Liddington RC, Marasco WA. 2009. Structural and functional bases for broad-spectrum neutralization of avian and human influenza A viruses. Nat. Struct. Mol. Biol. 16:265-273.

Superti F, Ammendolia MG, Valenti P, Seganti L.

1997. Antirotaviral activity of milk proteins: lactoferrin prevents rotavirus infection in thà ̈ enterocyte-like celi line HT-29. Med. Microbiol. Immunol. 186:83-91.

Superti F, Siciliano R, Rega B, Giansanti F, Valenti P, Antonini G, 2001. Involvement of bovine lactoferrin metal saturation, sialic acid and protein fragments in thà ̈ inhibition of rotavirus infection. Biochim. Biophys . Acta 1528:107-115.

Swart PJ, Kuipers ME, Smit C, Pauwels R, de B'ethune MP, DeClercq E, Meijer DKF, Huisman JG. 1996. Antiviral effects of milk proteins: acylation results in polyanionic compounds with potent activity against human immunodef iciency virus types 1 and 2 in vitro. AIDS Res. Hum. Retroviruses 12:769-775.

Tinari A, Pietrantoni A, Ammendolia MG, Valenti, P, Superti F. 2005. Inhibitory activity of bovine lactoferrin against echovirus induced programmed celi death in vitro. Int. J. Antimicrob. Agents 25:433-438.

Valenti P, Antonini G. 2005. Lactoferrin: an important host defence against microbial and virai attack. Celi. Mol. Life Sci. 62:2576-2587.

Waarts BL, Aneke OJ, Smit JM, Rimata K, Bittman R, Meijer DK, Wilschut J. 2005. Antiviral activity of human lactoferrin: inhibition of alphavirus interaction with heparan sulfate. Virology 333:284-292.

Weng TY, Chen LC, Shyu HW, Chen SH, Wang JR, Yu CK, Lei HY, Yeh TM. 2005. Lactoferrin inhibits enterovirus 71 infection by binding to VP1 protein and host cells. Antiviral Res. 67:31-37.

Wiley DC, Skehel JJ. 1987 The structure and function of thà ̈ hemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus. Annu. Rev. Biochem. 56:365-394.

Wilson IA, Skehel JJ, Wiley DC. 1981. Structure of thà ̈ hemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus at 3À resolution. Nature 289:366-373

Yi M, Kaneko S, Yu DY, Murakami S. 1997. Hepatitis C virus envelope proteins bind lactoferrin. J. Virol.

71:5997-6002.

Claims (4)

1. RIVENDICAZIONI 1) Peptide del lobo C della lattoferrina scelto dal gruppo consistente in SKHSSLDCVLRP (SEQ ID NO: 1), AGDDQGLDKCVPNSKEK {SEQ ID NO: 2), NGESSADWAKN (SEQ ID NO: 4), o frammenti della SEQ ID NO: 2 o 4 o una miscela di almeno due di detti peptidi o di detti frammenti, in cui la SEQ ID N0:1 à ̈ un peptide del lobo C della lattoferrina bovina o di bufalo, la SEQ ID NO:2 à ̈ un peptide del lobo C della lattoferrina bovina, di bufalo o di capra, la SEQ ID NO: 4 à ̈ un peptide del lobo C della lattoferrina di capra o di pecora o una sequenza modificata del peptide NGESTADWAKN (SEQ ID No: 3) del lobo C della lattoferrina bovina in cui il residuo di treonina à ̈ stato sostituito con una serina omologa .
2. 2) Peptide del lobo C della lattoferrina come definito nella rivendicazione 1 o frammenti della SEQ ID NO: 2 o 4 o una miscela di almeno due di detti peptidi o di detti frammenti, per l'uso come medicamento .
3. 3) Composizione farmaceutica comprendente o consistente in un peptide del lobo C della lattoferrina come definito nella rivendicazione 1 o frammenti della SEQ ID NO: 2 o 4 o una miscela di almeno due di detti peptidi o di detti frammenti, come principio attivo, insieme ad uno o più eccipienti e/o coadiuvanti farmaceuticamente accettabili, in cui detto lobo C della lattoferrina à ̈ un lobo C di lattoferrina bovina, di bufalo, di capra o di pecora.
4. 4) Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 3, in cui detto lobo C della lattoferrina bovina consiste nella seguente sequenza SEQ ID No:5: YTRW WCAVGPEEQKKCQQWSQQSGQNVTCATASTTDDCIVLVLKGEADA LNLDGGYIYTAGKCGLVPVIiAENRKSSKHSSLDCVLRPTEGYLAVAW KKANEGL TWNSLKDKKSCHTAVDRTAGWNIPMGLIVNQTGSCAFDEFFSQSCAPGADPKSRL CALCAGDDQGLDKCVPNSKEKYYGYTGAFRCLAEDVGDVAFVKNDTVWENTNGES TADWAKNLNRED FRLLCLDGTRKPVTEAQS CHLAVAPNHAW SRSDRAAHVKQVL LHQQALFGKNGKNCPDKFCLFKSETKNLLFNDNTECLAKLGGRPTYEEYLGTEYV TAIANLKKCSTSPLLEACAFLTR 5) Lobo C della lattoferrina o peptide del lobo C della lattoferrina come definito nella rivendicazione 1 o frammenti della SEQ ID NO: 1, 2 o 4 o frammenti del lobo C della lattoferrina comprendenti la SEQ ID NO: 1, 2 o 4, o una miscela di almeno due di detti peptidi o di detti frammenti, o composizione farmaceutica come definita in ognuna delle rivendicazioni 3-4, per l'uso nel trattamento dell'infezione da virus dell'Influenza. 6) Lobo C della lattoferrina o peptide del lobo C della lattoferrina come definito nella rivendicazione 1 o frammenti della SEQ ID NO : 1, 2 o 4 o frammenti del lobo C della lattoferrina comprendenti la SEQ ID NO: 1, 2 o 4, o una miscela di almeno due di detti peptidi o di detti frammenti o composizione farmaceutica come definita in ognuna delle rivendicazioni 3-4, per l'uso secondo la rivendicazione 5, in cui detto lobo C della lattoferrina bovina consiste nella seguente sequenza SEQ ID No :5: YTRW WCAVGPEEQKKCQQWSQQSGQNVTCATASTTDDCIVLVLKGEADA LNLDGG YIYTAGKCGLVP VLAENRKS SKHSSLDCVLRPTEG YLAVAW KKANEGL TWNSLKDKKSCHTAVDRTAGWNIPMGLIVNQTGSCAFDEFFSQSCAPGADPKSRL CALCAGDDQGLDKCVPNSKEKYYGYTGAFRCLAEDVGDVAFVKNDTVWENTNGES TADWAKNLNREDFRLLCLDGTRKPVTEAQSCHLAVAPNHAW SRSDRAAHVKQVL LHQQALFGKNGKNCPDKFCLFKSETKNLLFNDNTECLAKLGGRPTYEEYLGTEYV TAIANLKKCSTSPLLEACAFLTR 7) Lobo C della lattoferrina o peptide del lobo C della lattoferrina come definito nella rivendicazione 1 o frammenti della SEQ ID NO: 1, 2 o 4 o frammenti del lobo C della lattoferrina comprendenti la SEQ ID NO: 1, 2 o 4, o una miscela di almeno due di detti peptidi o di detti frammenti, o composizione farmaceutica come definita in ognuna delle rivendicazioni 3-4, per l'uso secondo ognuna delle rivendicazioni 5-6, in cui l'infezione da virus dell'Influenza à ̈ un'infezione da virus dell'Influenza di tipo A. 8) Lobo C della lattoferrina o peptide del lobo C della lattoferrina come definito nella rivendicazione 1 o frammenti della SEQ ID NO: 1, 2 o 4 o frammenti del lobo C della lattoferrina comprendenti la SEQ ID NO: 1, 2 o 4, o una miscela di almeno due di detti peptidi o di detti frammenti o composizione farmaceutica come definita in ognuna delle rivendicazioni 3-4, per l'uso secondo la rivendicazione 7, in cui l'infezione da virus dell'Influenza di tipo A à ̈ scelta dal gruppo consistente nei sottotipi HI, H2, H5, H6, H8, H9, Hll, H12, H13, H16, H3, H4, H7, H10, H14 e H15.