JPH06197758A - アミラーゼの精製方法、こうして得られた精製アミラーゼ及び精製アラーゼの使用 - Google Patents

アミラーゼの精製方法、こうして得られた精製アミラーゼ及び精製アラーゼの使用

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JPH06197758A
JPH06197758A JP5262512A JP26251293A JPH06197758A JP H06197758 A JPH06197758 A JP H06197758A JP 5262512 A JP5262512 A JP 5262512A JP 26251293 A JP26251293 A JP 26251293A JP H06197758 A JPH06197758 A JP H06197758A
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    • A61P1/14—Prodigestives, e.g. acids, enzymes, appetite stimulants, antidyspeptics, tonics, antiflatulents
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    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/30—Extraction; Separation; Purification by precipitation

Abstract

(57)【要約】 【目的】 アミラーゼ製剤の曇り、色汚染及び臭気の原
因である色素及びその他の混在物質を除去するようにア
ミラーゼを精製する簡単かつ高回収率の方法、こうして
得られた精製アミラーゼ及びこれらのアミラーゼの使用
を提供することにある。 【構成】 ハロゲン化物の塩、最も好ましくは塩化ナト
リウムまたは塩化カリウムである沈殿剤、また必要によ
り、有機化合物、最も好ましくは４−ヒドロキシ安息香
酸のアルキルエステルである更に別の沈殿の添加を特徴
とする醗酵ブロースから回収された精製アミラーゼの調
製方法。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、醗酵ブロースから回収
されたアミラーゼの精製及びそれから得られる精製アミ
ラーゼ生産物に関する。
【０００２】
【従来の技術】アミラーゼ、即ち、澱粉の加水分解を触
媒作用する酵素の色及び臭気は、それらが混入される治
療組成物及び洗剤配合物の品質に悪影響することがあ
る。こうして、洗剤用途、医薬用途及び食品用途のアミ
ラーゼ製剤は、最終製品中に望ましくない色及び臭気だ
けでなく、望ましくない曇り、不安定性及びアレルギー
作用を生じ得る成分を含まないことが望ましい。これら
の成分は微生物それ自体または残留醗酵原料から誘導さ
れることがある。グラム陽性バチルスの製剤において、
細胞壁アニオン性ポリマー、ペプチドグリカン、ガラク
トシルポリマー、及びその他の多糖混在物質は細胞壁タ
ーンオーバーのために細胞増殖中に可溶化されるように
なる。アミラーゼ製剤中のこれらの細菌の細胞壁ポリマ
ーの存在は、アレルギー反応の増大、カチオン、例え
ば、Ca++を結合することによるアミラーゼ安定性の低下
を含む幾つかの望ましくない効果を生じることがあり、
また洗剤配合物中で曇りの形成を生じることがある。そ
れ故、醗酵ブロースから回収されたアミラーゼを精製す
ることが必須である。
【０００３】米国特許第5,041,377 号明細書は、ハロゲ
ン化物の塩（ハロゲン化物の塩はナトリウム、カリウム
またはカルシウムの塩化物、臭化物、ヨウ化物及びフッ
化物、好ましくは塩化ナトリウム及び塩化カルシウムを
含む）を10℃未満の温度でアルカリ性スブチリシン溶液
に添加することにより結晶性スブチリシン、即ち、バチ
ルス・スブチリス(Bacillus subtilis) 及びバチルス・
アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)
から誘導されたプロテアーゼを生産する方法を開示して
いる。国際特許出願WO91/09943号明細書は、非ハロゲン
化物型の易可溶性塩、例えば、Na、Ｋ、Ca、またはMgの
ギ酸塩、酢酸塩または硝酸塩である結晶化剤が水性酵素
に添加されることによるアミラーゼの如き酵素の結晶化
の方法を開示している。米国特許第4,659,667 号明細書
は、α−アミラーゼ溶液をその酵素の等電点付近の範囲
のpHで過飽和まで濃縮することによる結晶性α−アミラ
ーゼ酵素の生産方法を開示している。しかしながら、過
飽和溶液は不安定であり、しかもその溶液の容器の内壁
に対するショック、微粉粒子またはかき傷を避けるよう
に非常に注意して処理される必要がある。更に、結晶化
が攪拌により一旦誘導されると、アミラーゼの約85％〜
86％を結晶形態にするために、約72時間のインキュベー
ション時間が必要である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、商用
のアミラーゼ製剤中に曇り、色汚染及び臭気を生じる色
素及びその他の混在物質を除去するようにアミラーゼを
精製する新規な方法を提供することである。本発明の別
の目的は、アレルギー作用と関連する問題の原因である
多糖及びオリゴ糖並びにその他のガラクトシルポリマー
を除去するアミラーゼの簡単かつ新規な精製方法を提供
することである。本発明の別の目的は、簡単かつ、速度
及びコスト有効性の両方であり、しかも純粋アミラーゼ
の高度の回収をもたらす新規な方法により前記の目的を
達成することである。本発明の一実施態様の利点は、最
初に、アミラーゼがアミラーゼを保存し、また安定化す
る化合物により沈殿されるアミラーゼ精製方法が開示さ
れることである。本発明の方法は、典型的な工業用のア
ミラーゼを含む液体製品と関連する多くの問題、例え
ば、製品安定性、微生物汚染、大容積及び高い輸送コス
トを排除する。本発明は、更に別の目的及び付随の利点
と一緒に、本明細書中の説明、実施例及び表を参考にし
て最も良く理解されるであろう。しかしながら、本発明
はこれらに限定されない。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明は、(i) 醗酵ブロ
ースの細胞及び懸濁固体からアミラーゼを分離すること
によりアミラーゼ溶液を生成する工程、(ii)濃縮アミラ
ーゼ溶液の酵素活性が少なくとも約250,000MWU/ml にな
るまで前記のアミラーゼ溶液を濃縮アミラーゼ溶液に濃
縮する工程、(iii) アミラーゼを沈殿させるのに有効な
量の沈殿剤を前記の濃縮アミラーゼ溶液に添加する工程
（前記の沈殿剤はアルカリ金属塩化物、アルカリ金属臭
化物及びこれらの金属ハロゲン化物の二種以上のブレン
ドからなる群から選ばれた金属ハロゲン化物である）、
(iv)アミラーゼを沈殿させるのに有効な時間中に沈殿剤
を含む前記の濃縮アミラーゼ溶液をインキュベートする
工程、及び(v) 精製アミラーゼ沈殿を回収する工程を含
むことを特徴とする醗酵ブロースからの精製アミラーゼ
の調製方法に関する。
【０００６】アミラーゼは、澱粉の加水分解を触媒作用
する酵素だけでなく、アミラーゼのタンパク質操作され
た(protein engineered)変異体と理解される。本発明の
方法は、α−アミラーゼ、α−１，４−グルカノヒドロ
ラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、イソアミ
ラーゼ、アミログリコシダーゼ、トランスグリコシダー
ゼ、プルラナーゼ、α−１，６−グルカノヒドロラーゼ
またはアミログリコシダーゼの如きアミラーゼに適用す
る。通常、アミラーゼは細菌アミラーゼである。本発明
の好ましい実施態様において、アミラーゼはα−アミラ
ーゼまたはそのタンパク質操作された変異体、更に好ま
しくは細菌α−アミラーゼまたはこのアミラーゼのタン
パク質操作された変異体である。更に好ましい実施態様
において、アミラーゼはバチルス種から誘導された細菌
α−アミラーゼ、例えば、バチルス・リチェニホルミス
(Bacillus licheniformis)、バチルス・アルカロフィル
ス(Bacillus alcalophilus) 、バチルス・レンタス(Bac
illus lentus) 、バチルス・アミロリケファシエンス、
バチルス・スブチリス、バチルス・ステアロテルモフィ
ルス(Bacillus stearothermophilus) から誘導されたア
ミラーゼ、それらの誘導体またはこれらのアミラーゼの
タンパク質操作された変異体である。バチルス・リチェ
ニホルミスから誘導されたα−アミラーゼで良好な結果
が得られた。
【０００７】精製アミラーゼは、実質的に減少された着
色を有するだけでなく、ガラコトシルポリマーの如き炭
水化物ポリマーの実質的に減少された含量を有するアミ
ラーゼ酵素と理解される。減少された着色に関して、そ
れにより、酵素活性が100,000MWU/ml に調節される場合
に470nm で0.5 未満の吸光度、好ましくは0.1 未満の吸
光度、更に好ましくは0.09未満の吸光度を有するアミラ
ーゼと理解される。炭水化物ポリマーの実質的に減少さ
れた含量に関して、それにより、酵素活性が100,000MWU
/ml に調節される場合に酵素タンパク質１kg当たり1.00
mg未満の炭水化物ポリマー含量、好ましくは酵素タンパ
ク質１kg当たり0.65mg未満、更に好ましくは１kg当たり
0.5mg 未満の炭水化物ポリマー含量を有するアミラーゼ
と理解される。
【０００８】醗酵技術、分離技術、及び濃縮技術は当業
界で公知であり、そして濃縮アミラーゼ溶液を調製する
ために通常の方法が工程(i) 及び工程(ii)を行うのに使
用し得る。醗酵後に、醗酵ブロースが得られ、アミラー
ゼ溶液を得るために微生物細胞及び種々の懸濁固体（残
留醗酵原料を含む）が通常の分離技術により除去され
る。濾過、遠心分離、精密濾過、回転式真空濾過、限外
濾過、遠心分離続いて限外濾過等が一般に使用される。
本発明の好ましい実施態様において、遠心分離または限
外濾過が使用される。回収を最適にするためにアミラー
ゼ溶液を濃縮することが望ましい。未濃縮の溶液の使用
は、精製アミラーゼ沈殿を回収するために増大されたイ
ンキュベーション時間を必要とする。
【０００９】所望の酵素活性が得られるまで、通常の濃
縮技術を使用して、アミラーゼ溶液が濃縮アミラーゼ溶
液に濃縮される。アミラーゼ溶液の濃縮は、濾過、遠心
分離、回転式真空蒸発、限外濾過、抽出またはクロマト
グラフィーを含む種々の通常の技術のいずれかにより行
われてもよい。本発明の好ましい実施態様において、回
転式真空濾蒸発び／または限外濾過が使用される。本発
明の最も好ましい実施態様において、限外濾過が使用さ
れる。アミラーゼ溶液は、前記の濃縮アミラーゼ溶液の
酵素活性が少なくとも約250,000MWU/ml 、好ましくは少
なくとも約300,000MWU/ml 、更に好ましくは少なくとも
約350,000MWU/ml になるまで濃縮アミラーゼ溶液に濃縮
される。少なくとも約450,000MWU/ml の酵素活性で最良
の結果が得られた。
【００１０】沈殿剤は、アミラーゼを濃縮アミラーゼ溶
液から固体形態（その性質が、例えば、結晶性、無定形
またはその両方のブレンドであってもよい）で沈殿させ
るのに有効な化合物と理解される。金属ハロゲン化物沈
殿剤は、アルカリ金属塩化物、アルカリ金属臭化物及び
これらの金属ハロゲン化物の二種以上のブレンドからな
る群から選ばれる。金属ハロゲン化物は、塩化ナトリウ
ム、塩化カリウム、臭化ナトリウム、臭化カリウム及び
これらの金属ハロゲン化物の二種以上のブレンドからな
る群から選ばれることが好ましい。金属ハロゲン化物
は、塩化ナトリウム及び塩化カリウムの中から選ばれる
ことが更に好ましく、最も好ましい金属ハロゲン化物沈
殿剤は塩化ナトリウムであり、これは更にアミラーゼの
防腐剤である。金属ハロゲン化物沈殿剤はアミラーゼを
沈殿させるのに有効な量で使用される。本発明のアミラ
ーゼの沈殿を生じるのに有効な金属ハロゲン化物の少な
くとも有効な量及び最適量、並びにインキュベーション
時間、pH、温度及びアミラーゼの濃度を含む最大の回収
のための沈殿の条件の選択は、本明細書の開示に鑑み
て、簡単なルーチン試験後に、当業者に容易に明らかに
なるであろう。
【００１１】一般に、少なくとも５％w/v(重量／容積）
の金属ハロゲン化物が濃縮アミラーゼ溶液に添加され、
少なくとも８％w/v が通常である。一般に、25％w/v(重
量／容積）以下の金属ハロゲン化物が濃縮アミラーゼ溶
液に添加され、20％w/v 以下が通常である。金属ハロゲ
ン化物沈殿剤の最適濃度は、とりわけ、特別なアミラー
ゼの性質及び濃縮アミラーゼ溶液中のその濃度に依存す
るであろう。本発明の別の最も好ましい実施態様によれ
ば、更に別の沈殿剤（これは有機化合物である）が工程
(iii) で濃縮アミラーゼ溶液に添加される。こうして、
工程(iii) は、濃縮アミラーゼ溶液に、４−ヒドロキシ
安息香酸、４−ヒドロキシ安息香酸のアルカリ金属塩、
４−ヒドロキシ安息香酸のアルキルエステル及びこれら
の有機化合物の二種以上のブレンドからなる群から選ば
れた有機化合物である更に別の沈殿剤を添加することを
更に含むことが好ましい。前記の有機化合物沈殿剤の添
加は、金属ハロゲン化物沈殿剤の添加の前、それと同時
またはその後に行うことができ、両方の沈殿剤、即ち、
有機化合物と金属ハロゲン化物の添加は連続的または同
時に行われてもよい。前記の有機化合物沈殿剤の添加
は、pH、温度、アミラーゼ濃度、沈殿剤濃度及びインキ
ュベーションの時間に関して沈殿条件の高度の融通性の
予期しない利点を与える。
【００１２】沈殿剤として使用可能な好適な有機化合物
は、４−ヒドロキシ安息香酸、４−ヒドロキシ安息香酸
のアルカリ金属塩、４−ヒドロキシ安息香酸のアルキル
エステル及びこれらの有機化合物の二種以上のブレンド
からなる群から選ばれる。一般に、有機化合物沈殿剤
は、４−ヒドロキシ安息香酸のアルカリ金属塩、例え
ば、ナトリウム塩またはカリウム塩、及び４−ヒドロキ
シ安息香酸の線状または分枝アルキルエステル（そのア
ルキル基は１〜12個の炭素原子を含む）並びにこれらの
有機化合物の二種以上のブレンドからなる群から選ばれ
る。それらは、４−ヒドロキシ安息香酸の線状または分
枝アルキルエステル（そのアルキル基は１〜10個の炭素
原子を含む）、及びこれらの有機化合物の二種以上のブ
レンドからなる群から選ばれることが好ましい。有機化
合物は、４−ヒドロキシ安息香酸の線状アルキルエステ
ル（そのアルキル基は１〜６個の炭素原子を含む）、及
びこれらの有機化合物の二種以上のブレンドからなる群
から選ばれることが更に好ましい。更に好ましい有機化
合物の例は、４−ヒドロキシ安息香酸のメチルエステ
ル、４−ヒドロキシ安息香酸のプロピルエステル、４−
ヒドロキシ安息香酸のブチルエステル、４−ヒドロキシ
安息香酸のエチルエステル及びこれらの有機化合物の二
種以上のブレンドである。それらの中で、最も好ましい
ものは、４−ヒドロキシ安息香酸メチルエステル（メチ
ルパラベンと称される）及び４−ヒドロキシ安息香酸プ
ロピルエステル（プロピルパラベンと称される）であ
り、これらは共にアミラーゼの優れた防腐剤である。
【００１３】有機化合物沈殿剤は、金属ハロゲン化物沈
殿剤によるアミラーゼの沈殿を改良するのに有効な量で
使用される。有機化合物沈殿剤の少なくとも有効な量及
び最適量、並びにインキュベーション時間、pH、温度及
びアミラーゼの濃度を含む最大の回収のための沈殿の条
件の選択は、本明細書の開示に鑑みて、簡単なルーチン
試験後に、当業者に容易に明らかになるであろう。一般
に、少なくとも0.01％w/v(重量／容積）の有機化合物沈
殿剤が濃縮アミラーゼ溶液に添加され、少なくとも0.02
％w/v が通常である。一般に、0.3 ％w/v(重量／容積）
以下の有機化合物沈殿剤が濃縮アミラーゼ溶液に添加さ
れ、0.2 ％w/v 以下が通常である。金属ハロゲン化物沈
殿剤を含み、そして本発明の最も好ましい実施態様にお
いて、有機化合物沈殿剤を含む濃縮アミラーゼ溶液は、
精製すべきアミラーゼに当然に依存するpHに調節され
る。一般に、pHはアミラーゼの等電点付近のレベルに調
節される。pHは、等電点より約2.5 のpH単位下から等電
点より約2.5 のpH単位上までの範囲のpHに調節される。
説明の目的で、アミラーゼがバチルス・リチェニホルミ
スから誘導されたα−アミラーゼである場合、その濃縮
アミラーゼ溶液は通常約5.5 〜9.7 のpH、好ましくは約
6.5 〜9.0 のpHに調節される。
【００１４】本発明の精製アミラーゼ沈殿を得るのに必
要なインキュベーションの時間は、特別なアミラーゼの
性質及びその濃度に依存するだけでなく、特別な一種以
上の沈殿剤の性質及びその（それらの）濃度に依存す
る。一般に、工程(iv)中でアミラーゼを沈殿させるのに
有効な時間は約１〜30時間の範囲である。通常、それは
25時間を越えない。有機化合物沈殿剤の存在下で、イン
キュベーションの時間は更に短縮でき、それは10時間を
越えず、殆どの場合には６時間でさえも越えない。一般
に、インキュベーション中の温度は約４℃〜約50℃であ
る。通常、その方法は約10℃〜約45℃、好ましくは約20
℃〜約40℃の温度で行われる。沈殿を誘発するのに最適
の温度は、溶液の状態及び使用されるアミラーゼまたは
一種以上の沈殿剤により変化するであろう。
【００１５】精製アミラーゼ沈殿の全回収及びその方法
が行われる効率は、金属ハロゲン化物及び有機化合物の
添加中、並びにその後のインキュベーション期間中の両
方で、アミラーゼ、添加された金属ハロゲン化物及び添
加された有機化合物を含む溶液を攪拌することにより改
良されるであろう。好適な攪拌方法として、機械攪拌ま
たは振とう、激しい通気またはあらゆる同様な当業界で
認められている技術が挙げられる。インキュベーション
期間後に、精製アミラーゼは、その後、解離色素及びそ
の他の不純物から分離され、そして通常の分離技術、例
えば、濾過、遠心分離、精密濾過、回転式真空濾過、限
外濾過、圧搾濾過、交差膜精密濾過、交差流膜精密濾過
等により回収される。本発明の好ましい実施態様におい
て、濾過が使用される。この目的で、交差膜精密濾過が
使用されて優れた結果が得られた。精製アミラーゼ沈殿
の更なる精製が、沈殿を水洗することにより得ることが
できる。こうして、本発明の方法は、工程(v) の後に、
精製アミラーゼ沈殿を水洗することからなる工程(vi)を
含むことが好ましい。精製アミラーゼ沈殿は、金属ハロ
ゲン化物沈殿剤を含む水で洗浄されることが好ましく、
金属ハロゲン化物と有機化合物沈殿剤を含む水で洗浄さ
れることが更に好ましい。
【００１６】本発明の方法により調製された精製アミラ
ーゼは、アミラーゼが一般に使用される全ての用途に有
益である。例えば、それらはランドリー洗剤及びスポッ
ト除去剤、食品工業、澱粉の加工及びベーキング並びに
消化助剤として医薬組成物中に使用し得る。それらは、
液体（溶液、スラリー）または固体（グラニュール、粉
末）である最終製品にし得る。洗剤用途では、本発明に
より調製されたアミラーゼはプロピレングリコールを含
む液体組成物中で通常使用される。アミラーゼは、10％
の塩化カルシウムを含む25％（容積／容積）のプロピレ
ングリコール溶液中で循環することによりプロピレング
リコールに可溶化されることが好ましい。医薬用途で
は、本発明により調製されたアミラーゼは通常乾燥され
る。それらは凍結乾燥により乾燥されることが好まし
い。以下の実施例は本発明を更に説明することを目的と
する。しかしながら、本発明はこれらの特別な実施例ま
たはその中に表された実施態様に限定されないことが理
解されるであろう。
【００１７】
【実施例】実施例１ この実施例は、α−アミラーゼ沈殿に関する塩化ナトリ
ウム濃度の効果を説明する。醗酵ブロースを、米国特許
第4,659,667 号明細書に記載されたような適当な培地中
でバチルス・リチェニホルミスの深部培養で生産する。
醗酵後に、遠心分離及び真空ドラム濾過を使用して、α
−アミラーゼ酵素を微生物細胞、懸濁固体、及びその他
の残留醗酵原料から分離することによりα−アミラーゼ
酵素溶液を生成する。次いで、得られたα−アミラーゼ
溶液を1,000,000MWU/ml の酵素活性まで限外濾過(UF)す
ることにより濃縮アミラーゼ溶液を生成する。塩化ナト
リウムを、表１に従って濃度を変えて濃縮アミラーゼ溶
液に添加する。塩化ナトリウムの完全な可溶化の後、10
％の水酸化ナトリウムを使用して濃縮アミラーゼ溶液の
pHを7.6 に調節する。次いで処理試料をマグネチックス
ターラーで攪拌することにより一定の攪拌下で25℃でイ
ンキュベートする。24時間のインキュベーション後に、
アミラーゼ沈殿を15,000rpm で30分間遠心分離すること
により分離する。次いで沈殿を70％のプロピレングリコ
ールに可溶化する。
【００１８】精製α−アミラーゼ沈殿の回収率（％）
を、こうして得られた組成物の酵素活性の測定により測
定する。酵素活性を１ミリリットル当たりの改良ウォル
ゲムース(Wohlgemuth)単位(MWU/ml)に基いて測定する。
ウォルゲムース法に従って澱粉−ヨウ素錯体の青色の値
の低下を使用して可溶性澱粉の加水分解を使用してアミ
ラーゼ活性を測定する。典型的な実験において、pH5.4
で緩衝された２％の可溶性澱粉５ml及び水４mlを、40℃
に保たれた水浴中で適当に希釈したアミラーゼ１mlと共
にインキュベートする。所定の時間間隔（アミラーゼの
添加から５〜30分）で、アリコート（１ml）を抜取り、
希薄なヨウ素溶液５mlを含む管に注入し、反転により混
合する。次いで発色をコンパレーターで比較して反応終
点のアプローチを監視する。酵素活性を１ミリリットル
当たりの改良ウォルゲムース単位(MWU/ml)として計算す
る。１改良ウォルゲムース単位は、可溶性澱粉１mlをそ
のアッセイの条件下で30分で特定の青色の値にデキスト
リン化する活性である。計算に関して、密度は水の密度
であると仮定し、こうして、１ミリリットル当たりの活
性は１ｇ当たりの活性に等しいと仮定される。その計算
は下記のとおりである。
【００１９】 MWU/ml＝MWU/g ＝(100x30)/(TxW)＝3000/(TxW) ［式中、 100 ＝夫々のインキュベーション混合物中の澱粉のmg数 30 ＝特定のデキストリン化時間（単位：分） Ｔ ＝終点に達するのに要した時間（単位：分） Ｗ ＝酵素希釈のアリコート１ml中でインキュベーショ
ン混合物に添加された酵素の重量（単位：ｇ）］ 上澄み液の全アミラーゼ活性値を沈殿されなかった対照
の活性と比較して沈殿の回収率（％）を求める。アミラ
ーゼ沈殿の量に関する塩化ナトリウム濃度の効果を表１
に示す。
【００２０】
【表１】 塩化ナトリウムを使用する精製α−アミラーゼ沈殿の回収 塩化ナトリウム濃度 精製沈殿の回収率 ％（重量／容積） ％ 0 4.1 5 85.4 10 89.4 12 92.0 15 93.0
【００２１】こうして得られた精製α−アミラーゼは色
素の除去のために実質的に減少された着色を有し、酵素
活性が100,000MWU/ml に調節される場合にそれは470nm
で約0.08の吸光度を有する。比較のために、精製されな
かったα−アミラーゼは同条件下で約0.72の吸光度を有
する。こうして得られた精製α−アミラーゼはガラクト
シルポリマーの実質的に減少された含量を有し、酵素活
性が100,000MWU/ml に調節される場合にそれは酵素タン
パク質溶液１kg当たり約0.3mg のガラクトシルポリマー
含量を有する。比較のために、精製されなかったα−ア
ミラーゼは同条件下で約1985mg/kg のガラクトシルポリ
マー含量を有する。
【００２２】実施例２ この実施例は塩化ナトリウムによるα−アミラーゼ沈殿
に関するpHの効果を説明する。実施例１の条件に従って
得られた1,000,000MWU/ml の活性を有するバチルス・リ
チェニホルミスからのα−アミラーゼの濃縮酵素溶液を
調製する。12％の塩化ナトリウムを、この濃縮アミラー
ゼ溶液に添加する。溶液の別個のアリコートのpHを水酸
化ナトリウムでpH6.0 、7.0 、7.6 及び8.0 に調節す
る。pHを安定化した後、処理試料を攪拌により一定に攪
拌して25℃で24時間インキュベートする。アミラーゼ沈
殿を遠心分離(15,000rpmで30分) により分離し、酵素活
性を測定して回収率（％）を求める。結果を表２に示
す。
【００２３】
【表２】 α−アミラーゼの精製に関するpHの効果 インキュベーション中のpH 沈殿の回収率（％） 6.0 2.2 7.0 88.0 7.6 91.5 8.0 90.9
【００２４】表２に示されたように、α−アミラーゼの
最大の沈殿が中性及び塩基性のpH範囲で起こる。実施例３ この実施例は、α−アミラーゼを沈殿させるための塩化
ナトリウム及び４−ヒドロキシ安息香酸メチルエステル
の使用を説明する。実施例１の条件に従って得られた48
0,000MWU/ml の活性を有するバチルス・リチェニホルミ
スからのα−アミラーゼの濃縮酵素溶液を調製する。そ
の濃縮アミラーゼ溶液のpHをpH7.0 に調節する。18％
（重量／容積）の固体塩化ナトリウムを濃縮アミラーゼ
溶液に添加する。次いで0.12％（重量／容積）の４−ヒ
ドロキシ安息香酸メチルエステル（通称メチルパラベ
ン）を、NaClを含む濃縮アミラーゼ溶液に添加する。次
いでマグネチックスターラーを使用して試料を37℃で連
続的に攪拌する。次いで試料を異なる時間間隔で抜取
り、15,000rpm で30分間遠心分離して沈殿アミラーゼを
分離する。沈殿アミラーゼをプロピレングリコールに溶
解する。酵素活性を測定して回収率（％）を求める。結
果を表３に示す。
【００２５】
【表３】
【００２６】塩化ナトリウム及び４−ヒドロキシ安息香
酸メチルエステルの存在下では、１時間のインキュベー
ションがα−アミラーゼの沈殿を可能にし、酵素の約93
％を回収するのに充分である。実施例４ この実施例は、塩化ナトリウム及び４−ヒドロキシ安息
香酸メチルエステルによるα−アミラーゼの沈殿に関す
る温度の効果を説明する。473,000MWU/ml の活性を有す
るバチルス・リチェニホルミスからのα−アミラーゼの
濃縮酵素溶液を調製する。塩化ナトリウム（18％（重量
／容積))及び４−ヒドロキシ安息香酸メチルエステル
（0.12％（重量／容積))を添加する。溶液のpHを7.0 の
pHに調節し、その溶液を一定に攪拌して種々の温度で４
時間インキュベートする。沈殿アミラーゼを15,000rpm
で30分間遠心分離することにより分離する。沈殿アミラ
ーゼをプロピレングリコールに溶解する。酵素活性を測
定して回収率（％）を求める。結果を表４に示す。
【００２７】
【表４】
【００２８】表４に示されるように、かなりの沈殿がこ
れらの条件下で５℃〜40℃で起こり、最適の沈殿が約20
℃〜40℃で起こる。実施例５ この実施例は、塩化ナトリウムによるα−アミラーゼの
沈殿に関する４−ヒドロキシ安息香酸メチルエステルの
異なる濃度の効果を説明する。480,000MWU/ml の活性を
有するバチルス・リチェニホルミスからのα−アミラー
ゼの濃縮酵素溶液を調製する。18％（w/v)の塩化ナトリ
ウムを濃縮α−アミラーゼ溶液に添加する。水酸化ナト
リウムを使用してpHをpH7.0 に調節する。４−ヒドロキ
シ安息香酸メチルエステルを異なる濃度で濃縮アミラー
ゼ溶液に添加する。これらの溶液を攪拌による一定の攪
拌下で37℃で４時間インキュベートする。アミラーゼ沈
殿を遠心分離により分離し、沈殿をプロピレングリコー
ルに溶解する。酵素活性を測定して回収率（％）を求め
る。結果を表５に示す。
【００２９】
【表５】 アミラーゼ沈殿に関する４−ヒドロキシ安息香酸メチルエステル濃度の効果 ４−ヒドロキシ安息香酸メチルエステル濃度 沈殿の回収率 w/v ％ ％ 0 75 0.03 88.2 0.06 91.7 0.09 93.3 0.12 93.8
【００３０】表５に示されるように、沈殿はこのアッセ
イの条件下で0.03％(w/v) 程度に少ない量の４−ヒドロ
キシ安息香酸メチルエステルの存在下で更に非常に有効
である。実施例６、７及び８ この実施例は、塩化ナトリウムによるα−アミラーゼの
沈殿に関する４−ヒドロキシ安息香酸メチルエステル及
び４−ヒドロキシ安息香酸プロピルエステルの効果を説
明する。480,000MWU/ml の活性を有するバチルス・リチ
ェニホルミスからのα−アミラーゼの濃縮酵素溶液を調
製する。18％（w/v)の塩化ナトリウムを濃縮α−アミラ
ーゼ溶液に添加する（実施例６）。次いで４−ヒドロキ
シ安息香酸メチルエステル（0.12％（w/v)) を、NaClを
含む濃縮アミラーゼ溶液に添加する（実施例７）。次い
で４−ヒドロキシ安息香酸プロピルエステル（0.06％
（w/v)) を、NaCl及び４−ヒドロキシ安息香酸メチルエ
ステルを含む濃縮アミラーゼ溶液に添加する（実施例
８）。水酸化ナトリウムを使用してpHをpH7.0 に調節す
る。これらの溶液を攪拌による一定の攪拌下で37℃で４
時間インキュベートする。アミラーゼ沈殿を遠心分離に
より分離し、酵素活性を測定して回収率（％）を求め
る。結果を表６に示す。
【００３１】
【表６】
【００３２】表６に示されるように、４−ヒドロキシ安
息香酸メチルエステル及び４−ヒドロキシ安息香酸プロ
ピルエステルの添加はα−アミラーゼの回収率（％）を
増大する。実施例９ この実施例は、塩化ナトリウム、４−ヒドロキシ安息香
酸メチルエステル及び４−ヒドロキシ安息香酸プロピル
エステルによるα−アミラーゼの沈殿に関するpHの効果
を説明する。480,000MWU/ml の活性を有するバチルス・
リチェニホルミスからのα−アミラーゼの濃縮酵素溶液
を調製する。塩化ナトリウム（18％）、４−ヒドロキシ
安息香酸メチルエステル（0.12％）及び４−ヒドロキシ
安息香酸プロピルエステル（0.06％）を濃縮α−アミラ
ーゼ溶液に添加する。水酸化ナトリウムを使用して別個
のアリコートのpHをpH6.5 、7.0 、7.5 、8.0 及び8.5
に調節する。これらの溶液を攪拌による一定の攪拌下で
37℃の温度で４時間インキュベートする。アミラーゼ沈
殿を15,000rpm で30分間遠心分離することにより上澄み
から分離する。酵素活性を測定して回収率（％）を求め
る。結果を表７に示す。
【００３３】
【表７】
【００３４】表７に示されるように、最大の沈殿は約6.
5 〜約8.5 の範囲のpHで起こる。表２及び表７の結果の
比較は、酸性pHにおける塩化ナトリウムによるα−アミ
ラーゼの沈殿中の４−ヒドロキシ安息香酸アルキルエス
テルの添加が収率の著しい増加をもたらすことを示す。実施例10及び11 これらの実施例は、塩化ナトリウムによる、また４−ヒ
ドロキシ安息香酸メチルエステルを含む塩化ナトリウム
によるα−アミラーゼの沈殿に関する濃縮アミラーゼ溶
液の酵素濃縮割合の効果を説明する。異なる酵素活性を
有するバチルス・リチェニホルミスからのα−アミラー
ゼの異なる濃縮酵素溶液を調製する：200,000 〜1,000,
000MWU/ml 。濃縮アミラーゼ溶液の一つの組（実施例1
0）に、塩化ナトリウムを12％(w/v)の濃度で添加する。
別の組（実施例11）に、塩化ナトリウム（12％(w/v))及
び４−ヒドロキシ安息香酸メチルエステル（0.12％(w/
v))を添加する。水酸化ナトリウムを使用して別個のア
リコートのpHをpH7.6 に調節する。これらの溶液を攪拌
による一定の攪拌下で25℃の温度で24時間インキュベー
トする。アミラーゼ沈殿を15,000rpm で30分間遠心分離
することにより上澄みから分離する。次いでアミラーゼ
沈殿をプロピレングリコールに溶解する。酵素活性を測
定して回収率（％）を求める。結果を表８に示す。
【００３５】
【表８】 濃縮アミラーゼ溶液の酵素活性 沈殿の回収率 MWU/ml ％ NaCl NaCl+4-ヒドロキシ安息香酸 メチルエステル 実施例10 実施例11 200,000 0 0 350,000 0 82.3 500,000 67.4 90.8 750,000 83.9 93.3 1,000,000 91.4 98.5
【００３６】表８に示されるように、４−ヒドロキシ安
息香酸メチルエステルはアミラーゼ酵素の低濃度で塩化
ナトリウムによるα−アミラーゼの沈殿を促進するのに
有効である。実施例12及び13 これらの実施例は、塩化カリウムによるα−アミラーゼ
の沈殿を説明する。実施例１の条件に従って得られた1,
000,000MWU/ml の活性を有するバチルス・リチェニホル
ミスからのα−アミラーゼの濃縮酵素溶液を調製する。
濃縮アミラーゼ溶液のpHをpH7.6 に調節する。実施例12
では、塩化カリウムを2Mの濃度まで添加し、また実施例
13では、４−ヒドロキシ安息香酸メチルエステルを0.12
％(w/v) の濃度まで添加する。次いでマグネチックスタ
ーラーを使用して試料を25℃で24時間にわたって連続的
に攪拌する。試料を15,000rpm で30分間遠心分離して沈
殿アミラーゼを分離する。沈殿アミラーゼをプロピレン
グリコールに溶解する。酵素活性を測定して回収率
（％）を求める。結果を表９に示す。
【００３７】
【表９】 金属ハロゲン化物 沈殿の回収率 ％ 金属ハロゲン化物 金属ハロゲン化物＋４−ヒドロキシ 安息香酸メチルエステル 実施例12 実施例13 KCl 91.2 98.0
【００３８】表９に示されるように、塩化カリウムはま
たアミラーゼを沈殿させ、精製するのに有効である。実施例14及び15 これらの実施例は、臭化カリウムまたは臭化ナトリウム
と４−ヒドロキシ安息香酸メチルエステルによるα−ア
ミラーゼの沈殿を説明する。実施例１の条件に従って得
られた1,000,000MWU/ml の活性を有するバチルス・リチ
ェニホルミスからのα−アミラーゼの濃縮酵素溶液を調
製する。濃縮アミラーゼ溶液のpHをpH7.6 に調節する。
濃縮アミラーゼ溶液の一つの組（実施例14）に、臭化ナ
トリウムを2Mの濃度まで添加し、４−ヒドロキシ安息香
酸メチルエステルを0.12％(w/v) の濃度まで添加する。
別の組（実施例15）に、臭化カリウムを2Mの濃度まで添
加し、４−ヒドロキシ安息香酸メチルエステルを0.12％
(w/v) の濃度まで添加する。次いでマグネチックスター
ラーを使用して試料を25℃で24時間連続的に攪拌する。
試料を15,000rpm で30分間遠心分離して沈殿アミラーゼ
を分離する。沈殿アミラーゼをプロピレングリコールに
溶解する。酵素活性を測定して回収率（％）を求める。
結果を表10に示す。
【００３９】
【表１０】
【００４０】表10に示されるように、臭化ナトリウム及
び臭化カリウムはまたアミラーゼを沈殿させ、精製する
のに有効である。例16R 及び17R(比較のため） これらの例は、ヨウ化ナトリウム及びヨウ化カリウムに
よるα−アミラーゼの沈殿に関する。実施例１の条件に
従って得られた1,000,000MWU/ml の活性を有するバチル
ス・リチェニホルミスからのα−アミラーゼの濃縮酵素
溶液を調製する。濃縮アミラーゼ溶液のpHをpH7.6 に調
節する。濃縮アミラーゼ溶液の一つの組（例16R ）に、
ヨウ化ナトリウムまたはヨウ化カリウムを2Mの濃度まで
添加する。別の組（例17R ）に、ヨウ化ナトリウムまた
はヨウ化カリウムを2Mの濃度まで添加し、４−ヒドロキ
シ安息香酸メチルエステルを0.12％(w/v) の濃度まで添
加する。次いでマグネチックスターラーを使用して試料
を25℃で24時間連続的に攪拌する。試料を15,000rpm で
30分間遠心分離して沈殿アミラーゼを分離する。沈殿ア
ミラーゼをプロピレングリコールに溶解する。酵素活性
を測定して回収率（％）を求める。結果を表11に示す。
【００４１】
【表１１】
【００４２】表11に示されるように、４−ヒドロキシ安
息香酸メチルエステルを使用して、またはそれを使用し
ないで、ヨウ化ナトリウム及びヨウ化カリウムはアミラ
ーゼを沈殿させ、精製するのに全く有効ではない。例18R 及び19R(比較のため） これらの例は、塩化カルシウム及び塩化マグネシウムに
よるα−アミラーゼの沈殿に関する。実施例１の条件に
従って得られた1,000,000MWU/ml の活性を有するバチル
ス・リチェニホルミスからのα−アミラーゼの濃縮酵素
溶液を調製する。濃縮アミラーゼ溶液のpHをpH7.6 に調
節する。濃縮アミラーゼ溶液の一つの組（例18R ）に、
塩化カルシウムまたは塩化マグネシウムを2Mの濃度まで
添加する。別の組（例19R ）に、塩化カルシウムまたは
塩化マグネシウムを2Mの濃度まで添加し、４−ヒドロキ
シ安息香酸メチルエステルを0.12％(w/v) の濃度まで添
加する。次いでマグネチックスターラーを使用して試料
を25℃で24時間連続的に攪拌する。試料を15,000rpm で
30分間遠心分離して沈殿アミラーゼを分離する。沈殿ア
ミラーゼをプロピレングリコールに溶解する。酵素活性
を測定して回収率（％）を求める。結果を表12に示す。
【００４３】
【表１２】
【００４４】表12に示されるように、４−ヒドロキシ安
息香酸メチルエステルを使用して、またはそれを使用し
ないで、塩化カルシウム及び塩化マグネシウムはアミラ
ーゼを沈殿させ、精製するのに全く有効ではない。勿
論、広範囲の変化及び改良が上記の好ましい実施態様に
なし得ることが理解されるべきである。それ故、以上の
詳細な説明が理解され、本発明の範囲を特定すると意図
されるものは全ての均等物を含む特許請求の範囲である
ことが意図される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 9/26 Ｃ１２Ｒ 1:10） (72)発明者 チョン ワイ キム アメリカ合衆国 インディアナ州 46514 エルクハート カリフォルニア ロード 2623 (72)発明者 ジャヤラマ ケイ シェッティー アメリカ合衆国 インディアナ州 46514 エルクハート ブルックトゥリー コー ト 2912 (72)発明者 ケント エム スプロート アメリカ合衆国 インディアナ州 46530 グレンジャー クウェイル ヴァリー ドライヴ 51930

Claims (19)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】(i) 醗酵ブロースの細胞及び懸濁固体から
    アミラーゼを分離することによりアミラーゼ溶液を生成
    する工程、 (ii)濃縮アミラーゼ溶液の酵素活性が少なくとも約250,
    000MWU/ml になるまで前記のアミラーゼ溶液を濃縮アミ
    ラーゼ溶液に濃縮する工程、 (iii) アミラーゼを沈殿させるのに有効な量の沈殿剤を
    前記の濃縮アミラーゼ溶液に添加する工程（前記の沈殿
    剤はアルカリ金属塩化物、アルカリ金属臭化物及びこれ
    らの金属ハロゲン化物の二種以上のブレンドからなる群
    から選ばれた金属ハロゲン化物である）、 (iv)アミラーゼを沈殿させるのに有効な時間中に沈殿剤
    を含む前記の濃縮アミラーゼ溶液をインキュベートする
    工程、及び (v) 精製アミラーゼ沈殿を回収する工程を含むことを特
    徴とする醗酵ブロースからの精製アミラーゼの調製方
    法。
  2. 【請求項２】 金属ハロゲン化物が塩化ナトリウムまた
    は塩化カリウムから選ばれる請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 工程(iii) が、４−ヒドロキシ安息香
    酸、４−ヒドロキシ安息香酸のアルカリ金属塩、４−ヒ
    ドロキシ安息香酸のアルキルエステル及びこれらの有機
    化合物の二種以上のブレンドからなる群から選ばれた有
    機化合物である更に別の沈殿剤を添加することを更に含
    む請求項１に記載の方法。
  4. 【請求項４】 有機化合物が、４−ヒドロキシ安息香酸
    のアルカリ金属塩、例えば、ナトリウム塩またはカリウ
    ム塩及び４−ヒドロキシ安息香酸の線状または分枝アル
    キルエステル（そのアルキル基は１〜12個の炭素原子を
    含む）並びにこれらの有機化合物の二種以上のブレンド
    からなる群から選ばれる請求項３に記載の方法。
  5. 【請求項５】 有機化合物が、４−ヒドロキシ安息香酸
    の線状アルキルエステル（そのアルキル基は１〜６個の
    炭素原子を含む）、及びこれらの有機化合物の二種以上
    のブレンドからなる群から選ばれる請求項４に記載の方
    法。
  6. 【請求項６】 有機化合物が、４−ヒドロキシ安息香酸
    のメチルエステル、４−ヒドロキシ安息香酸のプロピル
    エステル及びこれらの２種の有機化合物のブレンドから
    なる群から選ばれる請求項５に記載の方法。
  7. 【請求項７】 工程(iii) 中に、少なくとも５％（重量
    ／容積）の金属ハロゲン化物が濃縮アミラーゼ溶液に添
    加される請求項１に記載の方法。
  8. 【請求項８】 工程(iii) 中に、25％（重量／容積）以
    下の金属ハロゲン化物が濃縮アミラーゼ溶液に添加され
    る請求項１に記載の方法。
  9. 【請求項９】 工程(iii) 中に、少なくとも0.01％（重
    量／容積）の有機化合物が濃縮アミラーゼ溶液に添加さ
    れる請求項３に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 工程(iii) 中に、0.3 ％（重量／容
    積）以下の有機化合物が濃縮アミラーゼ溶液に添加され
    る請求項３に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 工程(iv)が、アミラーゼの等電点より
    約2.5 のpH単位下から等電点より約2.5 のpH単位上まで
    の範囲のpHで行われる請求項１に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 アミラーゼが細菌アミラーゼである請
    求項１に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 アミラーゼがバチルス(Bacillus)種か
    ら誘導されたα−アミラーゼである請求項12に記載の方
    法。
  14. 【請求項１４】 アミラーゼがバチルス・リチェニホル
    ミス(Bacillus licheniformis)から誘導されたα−アミ
    ラーゼである請求項13に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 工程(iv)が約5.5 〜9.7 のpHで行われ
    る請求項14に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 請求項１に記載の方法により生産され
    た精製アミラーゼ。
  17. 【請求項１７】 請求項16に記載の精製アミラーゼを含
    む洗剤組成物。
  18. 【請求項１８】 請求項16に記載の精製アミラーゼを含
    む医薬組成物。
  19. 【請求項１９】 プロピレングリコールと請求項16に記
    載の精製アミラーゼを含む液体組成物。
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