JPH06179699A - 新規キチン結合性蛋白ｃｂ１ならびにその製造法と用途 - Google Patents
新規キチン結合性蛋白ｃｂ１ならびにその製造法と用途Info
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- JPH06179699A JPH06179699A JP4276743A JP27674392A JPH06179699A JP H06179699 A JPH06179699 A JP H06179699A JP 4276743 A JP4276743 A JP 4276743A JP 27674392 A JP27674392 A JP 27674392A JP H06179699 A JPH06179699 A JP H06179699A
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
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- A01N63/50—Isolated enzymes; Isolated proteins
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- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【構成】 下記を特徴とする新規キチン結合性蛋白ＣＢ
１、及びバチルス属に属し、該蛋白ＣＢ１の生産能力を
有する細菌を培養した培養物から採取するそれの製造法
並びにそれを有効成分とする抗真菌剤，殺虫剤。 １）融点：約１３７℃の白色粉末、２）構成元素と元素
分析値：Ｃ ６0.９０％、Ｈ 9.６１％、Ｎ １2.１
９％、Ｓ 0.２９％、３）分子量：約４5,０００（ゲ
ル濾過法）、４）等電点ｐＨ：約4.３、５）水，メタノ
ール，エタノール，ブタノールに可溶。酢酸エチル，ク
ロロホルム，エーテル，ベンゼン，ヘキサンなどに不
溶。６）呈色反応：ニンヒドリン反応陽性、10）キトト
リオース，Ｎ−アセチルグルコサン，グルコサミンなど
により阻害されずにキチンとキトサンに結合し、セルロ
ースなどには結合しない。11）キチナーゼとキトサナー
ゼ活性を有しない。12）抗真菌性と殺虫性を有する、1
3）脂肪酸含有比：Ｃ14:0 ４％、
Ｃ15:0 ０％、Ｃ15:0（メチル基分
鎖） １１％、Ｃ16:0 ２１％、Ｃ
16:0（メチル基分鎖） ０％、Ｃ17:0
０％、Ｃ17:0（メチル基分鎖） ９％、Ｃ18:0
３１％、Ｃ18:1
２３％、Ｃ18:2 ０％、Ｃ18:3
０％。 【効果】 本蛋白ＣＢ１は特定微生物を用いた培養によ
り、効率よく製造でき、農薬と木材防腐剤等に有用であ
る。
１、及びバチルス属に属し、該蛋白ＣＢ１の生産能力を
有する細菌を培養した培養物から採取するそれの製造法
並びにそれを有効成分とする抗真菌剤，殺虫剤。 １）融点：約１３７℃の白色粉末、２）構成元素と元素
分析値：Ｃ ６0.９０％、Ｈ 9.６１％、Ｎ １2.１
９％、Ｓ 0.２９％、３）分子量：約４5,０００（ゲ
ル濾過法）、４）等電点ｐＨ：約4.３、５）水，メタノ
ール，エタノール，ブタノールに可溶。酢酸エチル，ク
ロロホルム，エーテル，ベンゼン，ヘキサンなどに不
溶。６）呈色反応：ニンヒドリン反応陽性、10）キトト
リオース，Ｎ−アセチルグルコサン，グルコサミンなど
により阻害されずにキチンとキトサンに結合し、セルロ
ースなどには結合しない。11）キチナーゼとキトサナー
ゼ活性を有しない。12）抗真菌性と殺虫性を有する、1
3）脂肪酸含有比：Ｃ14:0 ４％、
Ｃ15:0 ０％、Ｃ15:0（メチル基分
鎖） １１％、Ｃ16:0 ２１％、Ｃ
16:0（メチル基分鎖） ０％、Ｃ17:0
０％、Ｃ17:0（メチル基分鎖） ９％、Ｃ18:0
３１％、Ｃ18:1
２３％、Ｃ18:2 ０％、Ｃ18:3
０％。 【効果】 本蛋白ＣＢ１は特定微生物を用いた培養によ
り、効率よく製造でき、農薬と木材防腐剤等に有用であ
る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、抗真菌性および殺虫性
を併せ有する新規なキチン結合性蛋白ＣＢ１およびその
製造法に関するものである。
を併せ有する新規なキチン結合性蛋白ＣＢ１およびその
製造法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】キチン質は真菌の細胞壁や昆虫の表皮な
どに含まれているが、高等動物や植物には通常存在しな
い。そこで、キチンの生合成や代謝を阻害する薬剤の開
発が試みられているが、キチン合成酵素阻害剤のポリオ
キシン（ジャーナル オブ アンティバイオティクス、
１８巻、１３１頁、１９６５年）やキチナーゼ阻害剤の
アロサミジン（ジャーナル オブ アンティバイオティ
クス、４０巻、２９６頁、１９８２年）などが報告され
ているにすぎない。
どに含まれているが、高等動物や植物には通常存在しな
い。そこで、キチンの生合成や代謝を阻害する薬剤の開
発が試みられているが、キチン合成酵素阻害剤のポリオ
キシン（ジャーナル オブ アンティバイオティクス、
１８巻、１３１頁、１９６５年）やキチナーゼ阻害剤の
アロサミジン（ジャーナル オブ アンティバイオティ
クス、４０巻、２９６頁、１９８２年）などが報告され
ているにすぎない。
【０００３】さらに、バチルス属細菌が生産する抗菌性
物質（物質名の記載はない）であって糸状菌に対して抗
菌性を有する物質が報告されている（日本農薬学会誌、
１５巻、１頁、１９９０年）が、この物質はブタノール
ではほとんど抽出されず、水層に大部分が残留すること
（日本農薬学会誌、１５巻、７頁、１９９０年）、分子
量が約５2,０００であること（日本農芸化学大会講演要
旨、３０８頁、１９８９年）から、本発明の蛋白ＣＢ１
とは別物質である。また、「バチルス・スブチリス由来
の抗菌物質」（米特許５０６１４９５）は、ＣＢ１と比
べ、分子量が約１万以上大きく、含まれる脂肪酸組成も
大きく異なる。
物質（物質名の記載はない）であって糸状菌に対して抗
菌性を有する物質が報告されている（日本農薬学会誌、
１５巻、１頁、１９９０年）が、この物質はブタノール
ではほとんど抽出されず、水層に大部分が残留すること
（日本農薬学会誌、１５巻、７頁、１９９０年）、分子
量が約５2,０００であること（日本農芸化学大会講演要
旨、３０８頁、１９８９年）から、本発明の蛋白ＣＢ１
とは別物質である。また、「バチルス・スブチリス由来
の抗菌物質」（米特許５０６１４９５）は、ＣＢ１と比
べ、分子量が約１万以上大きく、含まれる脂肪酸組成も
大きく異なる。
【０００４】バチルス属細菌が生産する抗真菌性のリポ
ペプチドとしては、バシロマイシン（ザ ジャーナル
オブ アンティバイオティクス、３７巻、１６００頁、
１９８４年）などがあるが、いずれも分子量が１万以下
と低く、構成脂肪酸組成の比較からも、本発明の蛋白Ｃ
Ｂ１と異なるものである。
ペプチドとしては、バシロマイシン（ザ ジャーナル
オブ アンティバイオティクス、３７巻、１６００頁、
１９８４年）などがあるが、いずれも分子量が１万以下
と低く、構成脂肪酸組成の比較からも、本発明の蛋白Ｃ
Ｂ１と異なるものである。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】高等動物や植物には作
用せず、真菌や昆虫に特異的に作用する薬剤として、キ
チン関連の抗真菌性および殺虫性を持つ新しい物質が常
に求められている。本発明の目的は、抗真菌性と殺虫性
を併せ持つキチン結合性の新規蛋白ＣＢ１とその製造法
を提供することにある。
用せず、真菌や昆虫に特異的に作用する薬剤として、キ
チン関連の抗真菌性および殺虫性を持つ新しい物質が常
に求められている。本発明の目的は、抗真菌性と殺虫性
を併せ持つキチン結合性の新規蛋白ＣＢ１とその製造法
を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、バチルス属に属す
る菌株の培養液中に、真菌や昆虫の生育を阻害する物質
を見出した。この物質はブタノールにより抽出すること
ができ、単離精製の結果、本物質はキチンに結合する
が、キチン分解活性を持たない蛋白性の物質であり、種
々の理化学的および生物学的諸性質から、新規な蛋白で
あることを確認し、ＣＢ１と称することとした。
を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、バチルス属に属す
る菌株の培養液中に、真菌や昆虫の生育を阻害する物質
を見出した。この物質はブタノールにより抽出すること
ができ、単離精製の結果、本物質はキチンに結合する
が、キチン分解活性を持たない蛋白性の物質であり、種
々の理化学的および生物学的諸性質から、新規な蛋白で
あることを確認し、ＣＢ１と称することとした。
【０００７】本発明は、後述する諸性質を有し、抗真菌
性と殺虫性を併せ持つキチン結合性蛋白ＣＢ１、該蛋白
ＣＢ１生産能を有するバチルス属細菌を培養し、その培
養物から蛋白ＣＢ１を採取することを特徴とする蛋白Ｃ
Ｂ１の製造法並びに該蛋白ＣＢ１を有効成分として含有
する抗真菌剤，殺虫剤に関する。
性と殺虫性を併せ持つキチン結合性蛋白ＣＢ１、該蛋白
ＣＢ１生産能を有するバチルス属細菌を培養し、その培
養物から蛋白ＣＢ１を採取することを特徴とする蛋白Ｃ
Ｂ１の製造法並びに該蛋白ＣＢ１を有効成分として含有
する抗真菌剤，殺虫剤に関する。
【０００８】以下に本発明を詳細に説明する。本発明に
用いる微生物は、バチルス属に属し、蛋白ＣＢ１生産能
を有するものであれば特に限定されないが、一例として
本発明者が分離したバチルス・リケニフォルミス ＣＢ
１株が挙げられる。その菌学的性質は以下の通りであ
る。
用いる微生物は、バチルス属に属し、蛋白ＣＢ１生産能
を有するものであれば特に限定されないが、一例として
本発明者が分離したバチルス・リケニフォルミス ＣＢ
１株が挙げられる。その菌学的性質は以下の通りであ
る。
【０００９】（１） 形態学的特徴 肉汁寒天培地において培養した菌体を用いた。細胞の形
は桿菌状で、大きさは0.５〜1.０μｍ×2.０〜7.０μ
ｍ、鎖状に連なる場合がある。運動性が有り、鞭毛は周
毛である。球または楕円形の胞子を形成し、その大きさ
は、0.５〜1.０μｍ×0.５〜1.０μｍである。グラム染
色陽性である。
は桿菌状で、大きさは0.５〜1.０μｍ×2.０〜7.０μ
ｍ、鎖状に連なる場合がある。運動性が有り、鞭毛は周
毛である。球または楕円形の胞子を形成し、その大きさ
は、0.５〜1.０μｍ×0.５〜1.０μｍである。グラム染
色陽性である。
【００１０】（２）各培地における生育状態 肉汁寒天平板培養：生育は良好、白色でラフ形のコロニ
ーを形成する。コロニー表面に光沢はなく、しわができ
る。拡散性色素は認められない。 肉汁液体培地：表面発育し、皮膜を形成。 肉汁ゼラチン穿刺培養：表面発育し、層状液化が認めら
れる。 リトマスミルク培地：ペプトン化およびリトマスの還元
により、培地はほぼ無色透明になる。
ーを形成する。コロニー表面に光沢はなく、しわができ
る。拡散性色素は認められない。 肉汁液体培地：表面発育し、皮膜を形成。 肉汁ゼラチン穿刺培養：表面発育し、層状液化が認めら
れる。 リトマスミルク培地：ペプトン化およびリトマスの還元
により、培地はほぼ無色透明になる。
【００１１】（３）生理生化学的性状 硝酸塩の還元 陽性 脱窒反応 陰性 ＭＲテスト 陽性 ＶＰテスト 陽性 インドールの生成 陰性 硫化水素の生成 陰性 デンプンの加水分解 陽性 クエン酸の利用 コーザーの培地 陽性 クリステンセンの培地 陽性 無機窒素源の利用 硝酸塩（硝酸ナトリウム） 陽性 アンモニウム塩（硫酸アンモニウム） 陽性 色素の生成 陰性 ウレアーゼ 陽性 オキシダーゼ 陰性 カタラーゼ 陽性
【００１２】生育の範囲 ｐＨ ４ 生育しない ｐＨ ５ 生育する ｐＨ ６ 生育する ｐＨ ７ 生育する ｐＨ ８ 生育する ｐＨ ９ 生育する １５℃ 生育しない ２０℃ 生育する ３０℃ 生育する ４０℃ 生育する ５０℃ 生育する ５５℃ 生育する ６０℃ 生育しない
【００１３】酸素に対する反応
通性嫌気性 Ｏ−Ｆテスト 発酵型 糖からの酸生成 Ｌ−アラビノース 陽性 Ｄ−キシロース 陽性 Ｄ−グルコース 陽性 Ｄ−マンノース 陽性 Ｄ−フラクトース 陽性 Ｄ−ガラクトース 陰性 麦芽糖 陽性 ショ糖 陽性 乳糖 陰性 トレハロース 陽性 Ｄ−ソルビット 陽性 Ｄ−マンニット 陽性 イノシット 陽性 グリセリン 陽性 デンプン 陽性 なお、いずれの糖についてもガス生成は認められない。
通性嫌気性 Ｏ−Ｆテスト 発酵型 糖からの酸生成 Ｌ−アラビノース 陽性 Ｄ−キシロース 陽性 Ｄ−グルコース 陽性 Ｄ−マンノース 陽性 Ｄ−フラクトース 陽性 Ｄ−ガラクトース 陰性 麦芽糖 陽性 ショ糖 陽性 乳糖 陰性 トレハロース 陽性 Ｄ−ソルビット 陽性 Ｄ−マンニット 陽性 イノシット 陽性 グリセリン 陽性 デンプン 陽性 なお、いずれの糖についてもガス生成は認められない。
【００１４】本菌株はグラム陽性の桿菌で、周毛を有
し、好気的に生育すること、内生胞子を形成するとい
う、バチルス（Bacillus) 属細菌に特徴的な性状を有す
る。さらに、バージェーズ マニュアル オブ システ
マティク バクテリオロジー、第２巻に記載されている
バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformi
s)の諸性状と上に掲げた本菌株の性状とを比較したとこ
ろ、結果が一致したことから、本菌はバチルス・リケニ
フォルミス（Bacillus licheniformis)に帰属させるの
が適当であると判断された。本菌株は、工業技術院微生
物工業技術研究所にバチルス・リケニフォルミス（Baci
llus licheniformis)ＣＢ１（微工研条寄第４００８
号）として寄託されている。本菌株の自然もしくは人工
的な変異株であっても蛋白ＣＢ１の生産能を有する限り
本発明に用いることができる。
し、好気的に生育すること、内生胞子を形成するとい
う、バチルス（Bacillus) 属細菌に特徴的な性状を有す
る。さらに、バージェーズ マニュアル オブ システ
マティク バクテリオロジー、第２巻に記載されている
バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformi
s)の諸性状と上に掲げた本菌株の性状とを比較したとこ
ろ、結果が一致したことから、本菌はバチルス・リケニ
フォルミス（Bacillus licheniformis)に帰属させるの
が適当であると判断された。本菌株は、工業技術院微生
物工業技術研究所にバチルス・リケニフォルミス（Baci
llus licheniformis)ＣＢ１（微工研条寄第４００８
号）として寄託されている。本菌株の自然もしくは人工
的な変異株であっても蛋白ＣＢ１の生産能を有する限り
本発明に用いることができる。
【００１５】ＣＢ１生産菌の培養に際しては、炭素源と
してグルコース，マルトース，デンプン等の糖類が適宜
用いられる。窒素源としては、酵母エキス，肉エキス，
麦芽エキス，ペプトン，硫酸アンモニウム，塩化アンモ
ニウム，尿素などの有機窒素化合物や無機窒素化合物が
単独または２種以上を組み合わせて用いられる。その他
必要に応じて、鉄やマンガンなどの種々の重金属塩やビ
タミンＢ1 ，ビオチンなどのビタミン類なども添加する
ことができる。
してグルコース，マルトース，デンプン等の糖類が適宜
用いられる。窒素源としては、酵母エキス，肉エキス，
麦芽エキス，ペプトン，硫酸アンモニウム，塩化アンモ
ニウム，尿素などの有機窒素化合物や無機窒素化合物が
単独または２種以上を組み合わせて用いられる。その他
必要に応じて、鉄やマンガンなどの種々の重金属塩やビ
タミンＢ1 ，ビオチンなどのビタミン類なども添加する
ことができる。
【００１６】ＣＢ１生産菌の培養方法としては、振とう
培養，通気攪拌培養などの好気条件下で行うのがよく、
培養温度は２５〜４５℃、培地ｐＨは６〜９が好まし
い。培養時間は１５〜１２０時間、好ましくは７２〜９
６時間である。
培養，通気攪拌培養などの好気条件下で行うのがよく、
培養温度は２５〜４５℃、培地ｐＨは６〜９が好まし
い。培養時間は１５〜１２０時間、好ましくは７２〜９
６時間である。
【００１７】ＣＢ１は培養液の遠心上清に存在し、菌体
表面や菌体内には認められない。したがって、培養液か
らＣＢ１を精製単離するには、微生物の菌体外蛋白を精
製するのに通常用いられる分離方法が適宜利用される。
例えば、遠心分離による菌体除去，硫安塩析，限外濾
過，透析，各種のイオン交換性担体や分子ふるい性担体
によるクロマトグラフィー，ゲル電気泳動などである。
表面や菌体内には認められない。したがって、培養液か
らＣＢ１を精製単離するには、微生物の菌体外蛋白を精
製するのに通常用いられる分離方法が適宜利用される。
例えば、遠心分離による菌体除去，硫安塩析，限外濾
過，透析，各種のイオン交換性担体や分子ふるい性担体
によるクロマトグラフィー，ゲル電気泳動などである。
【００１８】また、培養液にｎ−ブタノールまたはイソ
ブタノールを添加し攪拌すると、培養液のＣＢ１はほぼ
全量がブタノール層に移行する。このブタノール層を採
取し、これにヘキサンなどの有機溶媒をさらに添加して
攪拌すると、ブタノール層に混和していた水が排出され
て、少量の水層が新たに生じ、ＣＢ１もこの水層に移行
するため、高度に濃縮される。この水層中には、ＣＢ１
以外の高分子性物質はほとんど含まれないため、この水
層を採取し、次に分子ふるい性担体たとえばセファクリ
ルＳ−３００ＨＲ（スウェーデン、ファルマシア社製）
などを用い、適当な緩衝液、例えば酢酸アンモニウム緩
衝液を使用するクロマトグラフィーに供することより、
ＣＢ１が十分に精製される。後述の実施例で得られたＣ
Ｂ１の諸性質は以下の通りである。
ブタノールを添加し攪拌すると、培養液のＣＢ１はほぼ
全量がブタノール層に移行する。このブタノール層を採
取し、これにヘキサンなどの有機溶媒をさらに添加して
攪拌すると、ブタノール層に混和していた水が排出され
て、少量の水層が新たに生じ、ＣＢ１もこの水層に移行
するため、高度に濃縮される。この水層中には、ＣＢ１
以外の高分子性物質はほとんど含まれないため、この水
層を採取し、次に分子ふるい性担体たとえばセファクリ
ルＳ−３００ＨＲ（スウェーデン、ファルマシア社製）
などを用い、適当な緩衝液、例えば酢酸アンモニウム緩
衝液を使用するクロマトグラフィーに供することより、
ＣＢ１が十分に精製される。後述の実施例で得られたＣ
Ｂ１の諸性質は以下の通りである。
【００１９】１）外観：白色粉末 ２）融点：約１３７℃ ３）構成元素：Ｃ，Ｈ，Ｎ，Ｏ，Ｓ ４）元素分析値： Ｃ ６0.９０％ Ｈ 9.６１％ Ｎ １2.１９％ Ｓ 0.２９％ ５）分子量：約４5,０００（ゲル濾過法による） ６）等電点ｐＨ：約4.３ ７）紫外線吸収スペクトル：λmax １９６，２７５ｎ
ｍ ８）赤外線吸収スペクトル（ｃｍ-1）： ３３１０，２９５０，１７３０，１６６０，１５４０，
１４７０，１３９０，１２００，６５０ ９）溶解性：水，メタノール，エタノール，ブタノール
に可溶。 酢酸エチル，クロロホルム，エーテル，ベンゼン，ヘキ
サンなどに不溶。 10）溶媒抽出：ｎ−ブタノール，イソブタノールによっ
てほぼ完全に抽出される。 酢酸エチル，クロロホルム，エーテル，ベンゼンによっ
て抽出されない。 11）呈色反応：ニンヒドリン反応陽性 フェノール硫酸反応陰性 12）多糖類への結合性：キチンおよびキトサンに結合
し、この結合はキトトリオース，Ｎ−アセチルグルコサ
ン，グルコサミンなどによって阻害されない。また、セ
ルロースなどには結合しない。 13）キチナーゼおよびキトサナーゼ活性を有しない。 14）抗真菌性を有する 15）殺虫性を有する 16) 脂肪酸を以下の比率で含有する。 Ｃ14:0 ４％ Ｃ15:0 ０％ Ｃ15:0（メチル基分鎖） １１％ Ｃ16:0 ２１％ Ｃ16:0（メチル基分鎖） ０％ Ｃ17:0 ０％ Ｃ17:0（メチル基分鎖） ９％ Ｃ18:0 ３１％ Ｃ18:1 ２３％ Ｃ18:2 ０％ Ｃ18:3 ０％
ｍ ８）赤外線吸収スペクトル（ｃｍ-1）： ３３１０，２９５０，１７３０，１６６０，１５４０，
１４７０，１３９０，１２００，６５０ ９）溶解性：水，メタノール，エタノール，ブタノール
に可溶。 酢酸エチル，クロロホルム，エーテル，ベンゼン，ヘキ
サンなどに不溶。 10）溶媒抽出：ｎ−ブタノール，イソブタノールによっ
てほぼ完全に抽出される。 酢酸エチル，クロロホルム，エーテル，ベンゼンによっ
て抽出されない。 11）呈色反応：ニンヒドリン反応陽性 フェノール硫酸反応陰性 12）多糖類への結合性：キチンおよびキトサンに結合
し、この結合はキトトリオース，Ｎ−アセチルグルコサ
ン，グルコサミンなどによって阻害されない。また、セ
ルロースなどには結合しない。 13）キチナーゼおよびキトサナーゼ活性を有しない。 14）抗真菌性を有する 15）殺虫性を有する 16) 脂肪酸を以下の比率で含有する。 Ｃ14:0 ４％ Ｃ15:0 ０％ Ｃ15:0（メチル基分鎖） １１％ Ｃ16:0 ２１％ Ｃ16:0（メチル基分鎖） ０％ Ｃ17:0 ０％ Ｃ17:0（メチル基分鎖） ９％ Ｃ18:0 ３１％ Ｃ18:1 ２３％ Ｃ18:2 ０％ Ｃ18:3 ０％
【００２０】上記のＣＢ１の諸性質のうち、多糖類への
結合性，キチナーゼおよびキトサナーゼ活性の有無，抗
真菌性，殺虫性についてはさらに詳しく以下に示す。1.
５ml容遠心管に、キチンパウダー，キトサンパウダーお
よびセルロースパウダーをそれぞれ２０mgずつ取り、Ｃ
Ｂ１の0.１mg／ml溶液１００μｌを添加し、十分浸潤さ
せた後、１0,０００rpm で５分間遠心し、上清をポリア
クリルアミドゲル電気泳動に供した。蛋白の確認は銀染
色キット（和光純薬工業社製）によって行った。その結
果、キチンパウダーおよびキトサンパウダーで処理した
ものはＣＢ１のバンドがほとんど認められないのに対
し、セルロースパウダー処理では原液と同程度の濃さの
バンドが検出された。また、Ｎ−アセチルグルコサミン
およびそのトリマーであるキトトリオースをＣＢ１溶液
に添加して、同様にキチンへの吸着を調べたが、ＣＢ１
とキチンの結合は全く阻害されなかった。
結合性，キチナーゼおよびキトサナーゼ活性の有無，抗
真菌性，殺虫性についてはさらに詳しく以下に示す。1.
５ml容遠心管に、キチンパウダー，キトサンパウダーお
よびセルロースパウダーをそれぞれ２０mgずつ取り、Ｃ
Ｂ１の0.１mg／ml溶液１００μｌを添加し、十分浸潤さ
せた後、１0,０００rpm で５分間遠心し、上清をポリア
クリルアミドゲル電気泳動に供した。蛋白の確認は銀染
色キット（和光純薬工業社製）によって行った。その結
果、キチンパウダーおよびキトサンパウダーで処理した
ものはＣＢ１のバンドがほとんど認められないのに対
し、セルロースパウダー処理では原液と同程度の濃さの
バンドが検出された。また、Ｎ−アセチルグルコサミン
およびそのトリマーであるキトトリオースをＣＢ１溶液
に添加して、同様にキチンへの吸着を調べたが、ＣＢ１
とキチンの結合は全く阻害されなかった。
【００２１】次に、ＣＢ１とコロイダルキチン（キチン
パウダーから調製），エチレングリコールキチン（生化
学工業社製），グリコールキトサン（和光純薬工業社
製）をそれぞれ混合し、ｐＨ５（酢酸緩衝液），ｐＨ７
（リン酸緩衝液），ｐＨ９（トリス塩酸緩衝液）の条件
で２５℃で１２時間反応させた。反応液にフェリシアン
化カリウムのアルカリ性溶液を添加して煮沸したが、４
００ｎｍの波長の吸収は対照と差がなかった。つまり、
還元糖の生成が認められなかったことから、本ＣＢ１に
はキチナーゼおよびキトサナーゼ活性が存在しないと判
断された。
パウダーから調製），エチレングリコールキチン（生化
学工業社製），グリコールキトサン（和光純薬工業社
製）をそれぞれ混合し、ｐＨ５（酢酸緩衝液），ｐＨ７
（リン酸緩衝液），ｐＨ９（トリス塩酸緩衝液）の条件
で２５℃で１２時間反応させた。反応液にフェリシアン
化カリウムのアルカリ性溶液を添加して煮沸したが、４
００ｎｍの波長の吸収は対照と差がなかった。つまり、
還元糖の生成が認められなかったことから、本ＣＢ１に
はキチナーゼおよびキトサナーゼ活性が存在しないと判
断された。
【００２２】ＣＢ１の各種微生物に対する抗菌性は下表
に示す通りである。糸状菌の場合は、多段階の濃度のＣ
Ｂ１を含む、ＭＹＧ（麦芽エキス１％，酵母エキス0.４
％，グルコース0.４％、ｐＨ6.３）寒天（1.５％）平板
培地に、スラントから切り取った約１mm3 角の菌糸片を
接種して、２５℃または３０℃で３〜７日間培養したと
きのコロニーの直径が半分になる濃度をＩＣ50として表
示した。細菌には肉汁液体培地、酵母にはＭＹＧ液体培
地を用い、それぞれＣＢ１を数段階の濃度で添加した後
に菌を接種し、３０℃または３７℃で１〜２日間培養
し、５９０ｎｍの濁度が半分になるＣＢ１の濃度をＩＣ
50として表１に示した。ＣＢ１の抗菌力の安定性に関し
ては、種々のｐＨに調整した緩衝液にＣＢ１を溶解し
て、２５℃で２４時間保温した後、上記の通り培地に添
加したが、コルティシウム・ロルフシー ＭＡＦＦ ０
７−１２０４３株に対する抗菌力は、ｐＨ４〜９の間で
差は認められなかった。また、ｐＨ７でオートクレーブ
を用いて１５分間加熱したところ、少なくとも１２０℃
までは抗菌力が低下しなかった。
に示す通りである。糸状菌の場合は、多段階の濃度のＣ
Ｂ１を含む、ＭＹＧ（麦芽エキス１％，酵母エキス0.４
％，グルコース0.４％、ｐＨ6.３）寒天（1.５％）平板
培地に、スラントから切り取った約１mm3 角の菌糸片を
接種して、２５℃または３０℃で３〜７日間培養したと
きのコロニーの直径が半分になる濃度をＩＣ50として表
示した。細菌には肉汁液体培地、酵母にはＭＹＧ液体培
地を用い、それぞれＣＢ１を数段階の濃度で添加した後
に菌を接種し、３０℃または３７℃で１〜２日間培養
し、５９０ｎｍの濁度が半分になるＣＢ１の濃度をＩＣ
50として表１に示した。ＣＢ１の抗菌力の安定性に関し
ては、種々のｐＨに調整した緩衝液にＣＢ１を溶解し
て、２５℃で２４時間保温した後、上記の通り培地に添
加したが、コルティシウム・ロルフシー ＭＡＦＦ ０
７−１２０４３株に対する抗菌力は、ｐＨ４〜９の間で
差は認められなかった。また、ｐＨ７でオートクレーブ
を用いて１５分間加熱したところ、少なくとも１２０℃
までは抗菌力が低下しなかった。
【００２３】
【表１】
【００２４】次に、コクゾウムシ（シトフィルス・ツィ
アマイズ、Sitophilus zeamais) の生育に対するＣＢ１
の効果を表２に示す。玄米粉にＣＢ１を１〜０％の濃度
になるように添加し、水で練り合わせ、錠剤状にして乾
燥したものに、コクゾウムシを産卵させてその後の生育
を見た。
アマイズ、Sitophilus zeamais) の生育に対するＣＢ１
の効果を表２に示す。玄米粉にＣＢ１を１〜０％の濃度
になるように添加し、水で練り合わせ、錠剤状にして乾
燥したものに、コクゾウムシを産卵させてその後の生育
を見た。
【００２５】
【表２】
【００２６】前述したように、本発明のＣＢ１は、バチ
ルス属細菌が生産する抗菌性物質とは別異のものであ
る。また、キチン結合性レクチン蛋白がこれまでに植物
などで多数見出されているが、これらのレクチンのキチ
ンへの結合は、キチンを構成する単糖やオリゴ糖たとえ
ばＮ−アセチルグルコサミンやキトトリオースなどによ
って阻害される。それ故、本発明のＣＢ１と異なる。さ
らに、抗真菌活性を有するキチン結合性レクチンとして
報告されたＵＤＡ（サイエンス、２４５巻、１１００
頁、１９８９年），ヘベイン（プランタ、１８３巻、２
５８頁、１９９１年）およびキチン結合性ペプチドのＡ
ｃ−ＡＭＰ１，Ａｃ−ＡＭＰ２（バイオケミストリー、
３１巻、４３０８頁、１９９２年）が報告されている
が、これらは分子量がいずれも１万以下で、ＣＢ１とは
大きく異なる。したがって、本キチン結合性蛋白ＣＢ１
は新規物質であることが確認された。
ルス属細菌が生産する抗菌性物質とは別異のものであ
る。また、キチン結合性レクチン蛋白がこれまでに植物
などで多数見出されているが、これらのレクチンのキチ
ンへの結合は、キチンを構成する単糖やオリゴ糖たとえ
ばＮ−アセチルグルコサミンやキトトリオースなどによ
って阻害される。それ故、本発明のＣＢ１と異なる。さ
らに、抗真菌活性を有するキチン結合性レクチンとして
報告されたＵＤＡ（サイエンス、２４５巻、１１００
頁、１９８９年），ヘベイン（プランタ、１８３巻、２
５８頁、１９９１年）およびキチン結合性ペプチドのＡ
ｃ−ＡＭＰ１，Ａｃ−ＡＭＰ２（バイオケミストリー、
３１巻、４３０８頁、１９９２年）が報告されている
が、これらは分子量がいずれも１万以下で、ＣＢ１とは
大きく異なる。したがって、本キチン結合性蛋白ＣＢ１
は新規物質であることが確認された。
【００２７】以下に実施例により本発明を詳述するが、
これらは本発明を何ら限定するものではない。
これらは本発明を何ら限定するものではない。
実施例１ ペプトン１％，酵母エキス0.５％，食塩１％からなる液
体培地（ｐＨ7.２）１０mlを含む１００ml容三角フラス
コに、バチルス・リケニフォルミスＣＢ１（微工研条寄
第４００８号、ＦＥＲＭ ＢＰ−４００８号）の培養ス
ラントの菌体を接種し、３７℃で２４時間培養した。次
に、ペプトン１％，酵母エキス0.５％，Na2HPO4 ・12H2
O 1.５％, KH2PO4 0. ２％, グルコース１％からなる液
体培地（ｐＨ7.２）0.1 リットルを含む0.５リットル容
坂口フラスコ１０本に、上記の前培養液約１mlずつを接
種し、３７℃で７２時間振とう培養した。振とう幅は７
cmで、回転数は１４０rpm である。
体培地（ｐＨ7.２）１０mlを含む１００ml容三角フラス
コに、バチルス・リケニフォルミスＣＢ１（微工研条寄
第４００８号、ＦＥＲＭ ＢＰ−４００８号）の培養ス
ラントの菌体を接種し、３７℃で２４時間培養した。次
に、ペプトン１％，酵母エキス0.５％，Na2HPO4 ・12H2
O 1.５％, KH2PO4 0. ２％, グルコース１％からなる液
体培地（ｐＨ7.２）0.1 リットルを含む0.５リットル容
坂口フラスコ１０本に、上記の前培養液約１mlずつを接
種し、３７℃で７２時間振とう培養した。振とう幅は７
cmで、回転数は１４０rpm である。
【００２８】上記の培養液約１リットルにｎ−ブタノー
ル0.２リットルを加えて攪拌した後、遠心分離する。上
層のブタノール層約0.１５リットルを採取し、これに0.
２リットルのヘキサンを加えて攪拌する。遠心分離で上
層のブタノール：ヘキサン層を除去し、下層の水層約１
６mlを得る。次に、これをセファクリルＳ−３００ＨＲ
（ファルマシア社製）分子ふるいカラムクロマトグラフ
ィーに付した。緩衝液には、５０ｍＭ酢酸アンモニウム
緩衝液ｐＨ6.５を用いた。溶出液の２８０ｎｍの吸収を
モニターし、最初に溶出する画分、すなわち最も高分子
の画分を採取した。この画分を純水に対して透析した
後、凍結乾燥したところ、４８mgの結晶が得られた。こ
のようにして得られたＣＢ１は上記した理化学的および
生物学的性質を有していた。
ル0.２リットルを加えて攪拌した後、遠心分離する。上
層のブタノール層約0.１５リットルを採取し、これに0.
２リットルのヘキサンを加えて攪拌する。遠心分離で上
層のブタノール：ヘキサン層を除去し、下層の水層約１
６mlを得る。次に、これをセファクリルＳ−３００ＨＲ
（ファルマシア社製）分子ふるいカラムクロマトグラフ
ィーに付した。緩衝液には、５０ｍＭ酢酸アンモニウム
緩衝液ｐＨ6.５を用いた。溶出液の２８０ｎｍの吸収を
モニターし、最初に溶出する画分、すなわち最も高分子
の画分を採取した。この画分を純水に対して透析した
後、凍結乾燥したところ、４８mgの結晶が得られた。こ
のようにして得られたＣＢ１は上記した理化学的および
生物学的性質を有していた。
【００２９】
【発明の効果】本発明のキチン結合性蛋白ＣＢ１は、特
定の微生物を用いて培養することにより、効率よく製造
することができる。この蛋白ＣＢ１は、抗真菌性と殺虫
性を併せ持ち、農薬および木材防腐剤等として有用であ
る。
定の微生物を用いて培養することにより、効率よく製造
することができる。この蛋白ＣＢ１は、抗真菌性と殺虫
性を併せ持ち、農薬および木材防腐剤等として有用であ
る。
【図１】 水に溶解したＣＢ１の紫外部吸収スペクトル
を示す。
を示す。
【図２】 ＣＢ１の臭化カリウム錠での赤外部吸収スペ
クトルを示す。
クトルを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:10）
Claims (4)
- 【請求項１】 下記の性質を有することを特徴とする新
規キチン結合性蛋白ＣＢ１。 １）外観：白色粉末 ２）融点：約１３７℃ ３）構成元素：Ｃ，Ｈ，Ｎ，Ｏ，Ｓ ４）元素分析値： Ｃ ６0.９０％ Ｈ 9.６１％ Ｎ １2.１９％ Ｓ 0.２９％ ５）分子量：約４5,０００（ゲル濾過法による） ６）等電点ｐＨ：約4.３ ７）紫外線吸収スペクトル：λmax １９６，２７５ｎｍ ８）赤外線吸収スペクトル（ｃｍ-1）： ３３１０，２９５０，１７３０，１６６０，１５４０，
１４７０，１３９０，１２００，６５０ ９）溶解性：水，メタノール，エタノール，ブタノール
に可溶。 酢酸エチル，クロロホルム，エーテル，ベンゼン，ヘキ
サンなどに不溶。 10）溶媒抽出：ｎ−ブタノール，イソブタノールによっ
てほぼ完全に抽出される。 酢酸エチル，クロロホルム，エーテル，ベンゼンによっ
て抽出されない。 11）呈色反応：ニンヒドリン反応陽性 フェノール硫酸反応陰性 12）多糖類への結合性：キチンおよびキトサンに結合
し、この結合はキトトリオース，Ｎ−アセチルグルコサ
ン，グルコサミンなどによって阻害されない。また、セ
ルロースなどには結合しない。 13）キチナーゼおよびキトサナーゼ活性を有しない。 14）抗真菌性を有する 15）殺虫性を有する 16) 脂肪酸を以下の比率で含有する。 Ｃ14:0 ４％ Ｃ15:0 ０％ Ｃ15:0（メチル基分鎖） １１％ Ｃ16:0 ２１％ Ｃ16:0（メチル基分鎖） ０％ Ｃ17:0 ０％ Ｃ17:0（メチル基分鎖） ９％ Ｃ18:0 ３１％ Ｃ18:1 ２３％ Ｃ18:2 ０％ Ｃ18:3 ０％ - 【請求項２】 バチルス属に属し、請求項１記載のキチ
ン結合性蛋白ＣＢ１を生産する能力を有する細菌を培養
し、その培養物から該蛋白ＣＢ１を採取することを特徴
とする新規キチン結合性蛋白ＣＢ１の製造法。 - 【請求項３】 請求項１記載のキチン結合性蛋白ＣＢ１
を有効成分として含有する抗真菌剤。 - 【請求項４】 請求項１記載のキチン結合性蛋白ＣＢ１
を有効成分として含有する殺虫剤。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4276743A JPH0694478B2 (ja) | 1992-09-22 | 1992-09-22 | 新規キチン結合性蛋白ｃｂ１ならびにその製造法と用途 |
| AU33728/93A AU646195B2 (en) | 1992-09-22 | 1993-02-24 | Novel chitin-binding protein CB1, method of producing the same and use of the same |
| CA002090562A CA2090562C (en) | 1992-09-22 | 1993-02-26 | Chitin-binding protein cb1, method of producing the same and use of the same |
| FR9302460A FR2695932B1 (fr) | 1992-09-22 | 1993-03-03 | Proteine liant la chitine, procede pour sa production, et insecticide et fongicide la contenant. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4276743A JPH0694478B2 (ja) | 1992-09-22 | 1992-09-22 | 新規キチン結合性蛋白ｃｂ１ならびにその製造法と用途 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06179699A true JPH06179699A (ja) | 1994-06-28 |
| JPH0694478B2 JPH0694478B2 (ja) | 1994-11-24 |
Family
ID=17573724
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4276743A Expired - Lifetime JPH0694478B2 (ja) | 1992-09-22 | 1992-09-22 | 新規キチン結合性蛋白ｃｂ１ならびにその製造法と用途 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0694478B2 (ja) |
| AU (1) | AU646195B2 (ja) |
| CA (1) | CA2090562C (ja) |
| FR (1) | FR2695932B1 (ja) |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8805394D0 (en) * | 1988-03-07 | 1988-04-07 | Agricultural Genetics Co | Antibiotic |
| US5187262A (en) * | 1990-09-24 | 1993-02-16 | Board Of Trustees, Operating Michigan State University | cDNA encoding a polypeptide including a hevein sequence |
| GB9112300D0 (en) * | 1991-06-07 | 1991-07-24 | Ici Plc | Biocidal proteins |
-
1992
- 1992-09-22 JP JP4276743A patent/JPH0694478B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1993
- 1993-02-24 AU AU33728/93A patent/AU646195B2/en not_active Ceased
- 1993-02-26 CA CA002090562A patent/CA2090562C/en not_active Expired - Fee Related
- 1993-03-03 FR FR9302460A patent/FR2695932B1/fr not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2090562C (en) | 1997-08-12 |
| JPH0694478B2 (ja) | 1994-11-24 |
| FR2695932A1 (fr) | 1994-03-25 |
| AU646195B2 (en) | 1994-02-10 |
| CA2090562A1 (en) | 1994-03-23 |
| FR2695932B1 (fr) | 1996-12-06 |
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Legal Events
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|---|---|---|---|
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