JPH061274B2

JPH061274B2 - 免疫学的自動分析方法

Info

Publication number: JPH061274B2
Application number: JP1201419A
Authority: JP
Inventors: 宏武川; 隆山田
Original assignee: Olympus Optical Co Ltd
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 1989-08-04
Filing date: 1989-08-04
Publication date: 1994-01-05
Anticipated expiration: 2009-01-05
Also published as: JPH0277650A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は免疫学的自動分析方法に関するものである。

近年、医療の進歩に伴い極微量の生体成分の分析が可能
となり、各種疾患の早期診断等に役立っている。例え
ば、α−フェトプロティン、癌胎児性抗原等で代表され
る悪性腫瘍、インシュリン、サイロキシン等で代表され
るホルモンの異常分泌疾患、免疫グロブリン等で代表さ
れる免疫疾患等の難病とされていた各種疾患の診断が早
期にできるだけでなく、それら疾患の治療後のモニタ、
あるいは最近では薬物等の低分子のハプテン（不完全抗
原）も測定可能となり薬物の投与計画作成にも役立って
いる。

これらの生体成分の多くは抗原抗体反応を利用した免疫
化学的な方法で分析され、このような免疫化学的反応を
利用した分析方法として、従来種々の方法が提案されて
いる。例えば、抗原抗体反応の結果生じる抗原抗体複合
物の凝集塊等の有無を、凝集法、沈降法、比濁法等によ
って検出して所望の生体成分を分析する方法がある。し
かし、これらの分析方法は多量の抗原抗体複合物を必要
とし、感度的に劣るため、専ら定性分析あるいは半定量
分析に採用されている。また、このような分析方法の欠
点を補うために、抗体または抗原を炭素粒子や合成樹脂
等の微粒子に結合させて被検物質との抗原抗体反応を行
わせて凝集法あるいは比濁法により被検物質を分析する
方法や、抗体または抗原に放射性同位元素、蛍光性物
質、発光性物質あるいは酵素等の検知感度の高いマーカ
を標識した標識抗体または抗原を用いて抗原抗体複合物
を高感度で検出して被検物質を分析する方法も提案され
ている。しかし、前者の微粒子を用いる方法は後者のマ
ーカを用いる方法に比べ感度的に劣るため、最近では後
者の検知感度の高いマーカを用いる分析方法が主流とな
っている。

このようなマーカを用いる分析方法としては、マーカと
して放射性同位元素を用いる放射性免疫分析法、蛍光性
物質を用いる蛍光免疫分析法、酵素を用いる酵素免疫分
析法等が知られているが、なかでも酵素免疫分析法は特
殊な設備や測定技術を必要とせず、一般に普及している
比色計を用いて容易に行うことができるので、最近特に
注目を集めている。この酵素免疫分析法は、免疫化学的
反応の有無により標識されている酵素の活性の変化量を
直接求めて被検物質を定量するホモジニアス（Homogene
ous）酵素免疫分析法と、不溶性の担体、例えばプラス
チック等の合成樹脂やガラスビーズを用い、抗原または
抗体と反応した酵素標識抗体または酵素標識抗原と未反
応のそれとを洗浄操作によりB・F 分離し、このB・F 分
離後の標識酵素の活性量を求めて被検物質を定量するヘ
テロジニアス（Heterogeneous）酵素免疫分析法との２
つの方法に分類される。しかし、前者のホモジニアス酵
素免疫分析法は、単純な操作で行うことができるが、薬
物等の低分子のハプテンしか分析できず、高分子である
生体成分の分析ができない欠点がある。これに対し、後
者のヘテロジニアス酵素免疫分析法はB・F 分離を行う
ための洗浄操作を必要とするが、被検物質が低分子であ
っても高分子であっても適正に分析でき、その分析対象
が極めて広範囲であるところから一般化されつつある。

かかるヘテロジニアス酵素免疫分析法としては、競合
法、サンドイッチ法等が知られている。競合法は、第１
図に示すように、不溶性の担体１にサンプル中の被検物
質と抗原抗体反応を起こす抗体または抗原を予め固定化
し、この担体１とサンプルおよびその被検物質２と同一
物質に酵素標識した標識試薬３との抗原抗体反応を行わ
せ、その後洗浄を行って抗原抗体反応により担体１に競
合して結合した被検物質２および標識試薬３と、結合し
ていないそれらとをB・F 分離してから、標識試薬３中
の標識酵素と反応する発色試薬を加えて反応させた後そ
の反応液を比色測定して標識酵素の酵素活性を求めて被
検物質２を定量するものである。また、サンドイッチ法
は、第２図に示すように、競合法と同様にサンプル町の
被検物質と抗原抗体反応を起こす抗体または抗原を予め
固定化した不溶性の担体５を用い、先ずこの担体５とサ
ンプルとの抗原抗体反応を行わせてサンプル中の被検物
質６を担体５に結合させ、次に洗浄を行ってＢ・Ｆ分離
した後、その担体５に被検物質６と抗原抗体反応を起こ
す物質を酵素で標識した標識試薬７を作用させて抗原抗
体反応を行わせ、その後再び洗浄を行ってB・F 分離し
てから標識試薬７中の標識酵素と反応する発色試薬を加
えて反応させた後、その反応液を比色測定して標識酵素
の酵素活性を求めて被検物質６を定量するものである。

上述したヘテロジニアス酵素免疫分析法を実施する装置
として、例えば特開昭56-147067号広報には、複数個の
反応管を反応管ターレットのリング状円板に保持して一
定方向に所定ピッチで回動させて各処理位置に搬送し、
これにより各反応管に対して担体の投入、サンプルの分
注、撹拌、洗浄、酵素標識試薬の分注、撹拌、洗浄、酵
素活性測定用試薬の分注、酵素活性の測定の各処理を順
次に行うようにした酵素免疫自動測定機が開示されてい
る。

しかし、この従来例にあっては、担体を反応管に直接投
入するようにしているため、担体が反応管の底に直接衝
突して、反応管および／または担体が損傷するという問
題があると共に、担体投入後、直ちにサンプルを分注し
て測定を開始するようにしているため、担体や反応管内
に汚れがあると、正確な測定結果が得られないという問
題がある。という問題がある。

本発明は、このような従来の問題点に着目してなされた
もので、反応容器に担体を投入する際の衝撃を軽減し、
反応容器および／または担体の損傷を有効に防止できる
と共に、担体や反応容器内に汚れがあっても、常に正確
な測定結果が得られる免疫学的自動分析方法を提供する
ことを目的とする。

反応容器内に所定の抗体または抗原を固定化した担体を
投入すると共に、所定の抗体または抗原を所定の物質で
標識した標識試薬およびサンプルを分注して反応容器内
で抗原抗体反応を行わせて、サンプル中の被検物質を免
疫学的に自動的に分析するにあたり、前記担体を緩衝液
の存在下で前記反応容器に投入する工程と、前記投入工
程後に前記担体を残したまま前記反応容器から緩衝液の
みを除去する洗浄工程と、前記洗浄工程後に一定量のサ
ンプルを分注して前記担体と反応させる工程とを有する
ことを特徴とするものである。

以下図面を参照して本発明を詳細に説明する。

第３図は本発明を実施する酵素免疫自動分析装置の一例
の構成を示す線図であり、第２図に示したサンドイッチ
法を採用するものである。本例では反応ラインをシング
ルとして単一項目を分析する。反応容器は大口部11aお
よび小口部11bを有するU字管11を24個用い、これらを処
理テーブルである反応管ディスク12の同一円周上に等間
隔に保持する。反応管ディスク12はU字管11を恒温槽10
（第４図）に浸しながら水平面内で矢印で示す方向に所
定のピッチ（例えば15秒）で間欠的に回動させる。この
反応管ディスク12の間欠的回動によるU字管11の停止位
置を符号S₁〜S₂₄で示す。本例では停止位置S₁にあるU字
管11に、サンプル分注装置13によりサンプラ14の所定の
サンプル吸引位置にあるサンプルカップ15からサンプル
を選択的に分注する。なお、サンプラ14は反応管ディス
ク12に保持する。U字管数と同数の24個のサンプルカッ
プを同一円周上に等間隔に保持し、反応管ディスク12の
回動と同期して矢印方向に間欠的に回動する。また、停
止位置S₃にあるU字管11には試薬分柱装置16によりサン
プル中の被検物質に応じた酵素標識試薬17を選択的に分
注し、停止位置S₄にあるU字管11には試薬分注装置18に
より発色試薬19を選択的に分注する。更に、停止位置S
₁₆にあるU字管11には緩衝液分注装置31により緩衝液32
を所定量選択的に分注し、停止位置S₁₇にあるU字管11に
はその大口部11aから担体投入器20に多数収容されてい
るプラスチック等の合成樹脂やガラスビーズ等の不溶性
の担体21を１個選択的に投入する。なお、担体21はＵ字
管11の大口部11aから容易に出し入れでき、かつ小口部1
1bには入らない大きさとし、その表面には上述したよう
にサンプル中の被検物質と抗原抗体反応を起こす抗体ま
たは抗原を予め固定化しておくと共に、担体投入器20内
においては緩衝液で湿潤させておく。また、停止位置S
₁₉にあるU字管11からは、これに収容されている反応液
を比色計22に選択的に吸引し、停止位置S₂₀にあるU字管
11からは、これに収容されている担体21を担体取出器23
により選択的に取り出して排出する。更にまた、停止位
置S₂₂にあるU字管11には洗浄ポンプ24により、イオン交
換水、免疫分析用緩衝液、生理食塩水等の洗浄液を選択
的に分注し、また停止位置S₂₄にあるU字管11には緩衝液
分注装置25により緩衝液26を選択的に分注する。更に、
停止位置S₂〜S₅にある各々のＵ字管11は、その小口部11
bをそれぞれ共通の撹拌用エアーポンプ27に着脱自在に
連結し、同様に停止位置S₂₂およびS₂₃にある各々のU字
管11は、その小口部11bをそれぞれ共通の排液ポンプ28
に着脱自在に連結する。

次に、第３図に示す酵素免疫自動分析装置の動作を第４
図Ａ〜Ｄをも参照しながら説明する。

反応管ディスク12の１回転目においては、先ず停止位置
S₁₆において緩衝液分注装置31により一定量の緩衝液32
をU字管11に分注する。次に、停止位置S₁₇において第４
図Aに示すように担体投入器20から緩衝液で湿潤されて
いる担体21を順次にU字管11に、その大口部11aから１個
ずつ投入して、担体21をU字管11内の緩衝液に湿潤させ
る。このように、担体21をU字管11に投入するのに先立
って、U字管11に所定量の緩衝液を分注することによ
り、U字管11に担体21を投入する際の緩衝を軽減でき、U
字管11および／または担体21の損傷を有効に防止するこ
とができる。

担体21が投入されたU字管11には、停止位置S₂₂において
洗浄ポンプ24の作動によりその大口部11aから洗浄液を
シャワー状に間欠的に注入すると共に、この洗浄液およ
び担体21の投入に先立って分注した緩衝液を排液ポンプ
28の作動により小口部11bを経て吸引排出してU字管11を
洗浄し、次の停止位置S₂₃において更に小口部11bを経て
排液ポンプ28により吸引することにより洗浄液をほぼ完
全に排出する。このようにU字管11を洗浄することによ
り、予め分注した緩衝液および担体21に湿潤した緩衝液
を洗い流し、後段の緩衝液分注後のU字管11内の緩衝液
量を一定に保つ。

次に、第４図Ｂに示すように停止位置S₂₄において緩衝
液分注装置25により緩衝液26を大口部11aから一定量分
注した後、停止位置S₁においてサンプル分注装置13によ
り、サンプラ14の所定のサンプル吸引位置にあるサンプ
ルカップ15から一定量のサンプルを大口部11aから分注
する。停止位置S₁においてサンプルが分注されたU字管1
1は、次の停止位置S₂においてその小口部11bを撹拌用エ
アーポンプ27に連結し、該エアーポンプ27により小口部
11bを経てエアーを噴出させることによりU字管11内に収
容された担体21、緩衝液26およびサンプルを撹拌して１
回目の抗原抗体反応を開始させる。この撹拌は停止位置
S₃,S₄およびS₅においても順次行う。なお、緩衝液分注
装置31、担体投入器20、緩衝液分注装置25、サンプル分
注装置13およびサンプラ14は各U字管11に対して１回作
動させた後は不作動にしておく。

U字管11が停止位置S₁₇において担体21を受けてから１回
転して再び停止位置S₁₇に移動した後の２回転目におい
ては、先ず停止位置S₂₂において第４図Ｂに示すようにU
字管11内の反応液を小口部11bを経て排液ポンプ28によ
り吸引して排出すると共に、大口部11aから洗浄ポンプ2
4により洗浄液をシャワー状に間欠的に分注し、この分
注された洗浄液を、該停止位置S₂₂および次の停止位置S
₂₃において同様に小口部11bを経て排液ポンプ28により
吸引して排出することによりU字管11および担体21を洗
浄して第１回目のB・F 分離を行う。その後停止位置S₃
において第４図Ｃに示すように大口部11aから試薬分注
装置16により酵素標識試薬17を一定量分注すると共に、
該停止位置S₃および次の順次の停止位置S₄,S₅において
小口部11bから撹拌用エアーポンプ27によりエアーを噴
出させて担体21と酵素標識試薬17とを撹拌し、２回目の
抗原抗体反応を開始させる。

このように、停止位置S₃において酵素標識試薬17の分注
を受けて第２回目の抗原抗体反応を開始したU字管11
が、停止位置S₁₇に移動して３回転目に入ったら、停止
位置S₂₂およびS₂₃において上述したと同様に洗浄ポンプ
24による洗浄液の分注および排液ポンプ28によるU字管1
1内の反応液および分注された洗浄液の吸引排出を行っ
てU字管11および担体21を洗浄して第２回目のB・F 分離
を行う。次に、停止位置S₄において第４図Ｄに示すよう
に大口部11aから試薬分注装置18により発色試薬19を一
定量分注すると共に、該停止位置S₄および次の停止位置
S₅において撹拌用エアーポンプ27によりエアーを噴出さ
せて担体21と発色試薬19とを撹拌して、担体21に結合し
た酵素標識試薬17中の標識酵素と発色試薬19との反応を
開始させる。

発色試薬19の分注を受けたU字管11が、停止位置S₁₇に移
動して４回転目に入ったら、先ず停止位置S₁₉においてU
字管11の反応液を比色計22に吸引して比色測定する。比
色計22は、例えば第４図Ｄに示すように反応液を通すフ
ローセル22aを介して光源22bおよび検知器22cを配置
し、光源22bからの光を干渉フィルタ22dを介してフロー
セル22aに投射し、該フローセル22aからの透過光をライ
トガイド22eを経て検知器22cで受光するように構成する
ことができる。次に、停止位置S₂₀においてU字管11内に
残存する担体₂₁を大口部11aから担体取出器23により取
り出す。その後、停止位置S₂₂において洗浄ポンプ24に
より洗浄液をシャワー状に間欠的に分注すると共に、こ
の分注された洗浄液を該停止位置S₂₂および次の停止位
置S₂₃において排液ポンプ28により吸引排出してU字管11
を洗浄し、次のサンプル分析に備える。

上述した実施例においては、緩衝液32の分注の後に、停
止位置S₂₂において一度担体21とU字管11とを洗浄してか
ら、停止位置S₂₄で再度緩衝液26を分注するようにした
ので、担体表面およびU字管内部の汚れを有効に除去で
き、したがって正確な測定を行うことができる。また、
緩衝液32の分注量は高精度に制御する必要がないので、
その分注装置31を比較的安価に構成することができる。

なお、本発明は上述した実施例にのみ限定されるもので
はなく、幾多の変更または変形が可能である。例えば、
上述した実施例では、緩衝液分注装置31を設け、これに
より担体21の投入に先立って緩衝液32をU字管11に分注
するようにしたが、この緩衝液の分注は緩衝液分注装置
25を用いて行うようにして、緩衝液分注装置31を省くこ
ともできる。また、以上のように、この発明によれば、
担体を緩衝液の存在下で反応容器内に投入するようにし
たので、投入したときの緩衝を有効に軽減でき、したが
って反応容器および／または担体をの損傷を有効に防止
することができる。また、担体投入後に緩衝液のみを除
去し、その後に、一定量のサンプルを分注して反応を開
始させる構成としたので、担体および反応容器内の汚れ
を有効に洗浄できるばかりでなく、緩衝液の液量のばら
つきに影響されずに常に一定の反応条件下で正確な測定
結果を得ることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は競合法による酵素酸分析法を説明するための
図、第２図はサンドイッチ法による酵素免疫分析法を説明す
るための図、第３図は本発明を実施する酵素免疫自動分析装置の一例
の構成を示す図、第４図A〜Dはその動作を説明するための図である。 10…恒温槽 11…U字管 12…反応管ディスク 13…サンプル分注装置 14…サンプラ 15…サンプルカップ 16,18…試薬分注装置 17…酵素標識試薬 19…発色試薬 20…担体投入器 21…担体 22…比色計 23…担体取出器 24…洗浄ポンプ 25…緩衝液分注装置 26…緩衝液 27…撹拌用エアーポンプ28…排液ポンプ 31…緩衝液分注装置 32…緩衝液

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】反応容器内に所定の抗体または抗原を固定
化した担体を投入すると共に、所定の抗体または抗原を
所定の物質で標識した標識試薬およびサンプルを分注し
て反応容器内で抗原抗体反応を行わせて、サンプル中の
被検物質を免疫学的に自動的に分析するにあたり、前記
担体を緩衝液の存在下で前記反応容器に投入する工程
と、前記投入工程後に前記担体を残したまま前記反応容
器から緩衝液のみを除去する洗浄工程と、前記洗浄工程
後に一定量のサンプルを分注して前記担体と反応させる
工程とを有することを特徴とする免疫学的自動分析方
法。