JPH06113874A - ラミナリオリゴ糖の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 水可溶化β−１，３−グルカンに、リン酸非
存在下、ユーグレナ藻体および／またはその抽出物を作
用させてラミナリアオリゴ糖を得ることよりなるラミナ
リアオリゴ糖の製造法。 【効果】 収率よく多量にラミナリアオリゴ糖を得るこ
とができる。ラミナリアオリゴ糖は、ビフィズス菌増殖
促進作用など種々の生理活性が期待されており、医薬、
機能性食品、飼料などの素材として利用することができ
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ユーグレナ藻体および
／またはユーグレナ藻体抽出物を用い、β−１，３−グ
ルカンからラミナリオリゴ糖を製造する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ラミナリオリゴ糖は、Ｄ−グルコースが
２分子以上β−１，３−結合したオリゴ糖類の総称であ
り、Ｄ−グルコースが２分子β−１，３−結合したラミ
ナリビオース、Ｄ−グルコースが３分子β−１，３−結
合したラミナリトリオース、Ｄ−グルコースが４分子β
−１，３−結合したラミナリテトラオースなどが知られ
ている。従来、β−１，３−グルカンの中には、腫瘍増
殖抑制活性を有するものが知られている。例えば、椎茸
に含まれるβ−１，３−結合を主体とする分子量９５〜
１０５万のグルカンであるレンチナンは、水に難溶であ
るが、アルカリに可溶であって、ザルコーマ１８０に対
する腫瘍増殖抑制効果を示す（Ｎａｔｕｒｅ，２２２，
６８７，１９６９）。また、ユーグレナの生産するβ−
１，３−グルカンであるパラミロンのアルカリ溶解物に
ついてもレンチナンと同様の効果を示すことが知られて
いる（がん，６７，４５５，１９７６）。したがって、
β−１，３−グルカンの構成単位であるラミナリオリゴ
糖についても、腫瘍増殖抑制作用、ビフィズス菌増殖促
進作用などの種々の生理活性が期待されている。

【０００３】ラミナリオリゴ糖の製造法としては、パラ
ミロンやカードランなどのβ−１，３−グルカンを出発
原料として用い、微生物のＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆ
ａｅｃａｌｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｍｙｘｏｇｅｎｅｓ由来
のグルカンエンド−１，３−β−グリコシダーゼ（Ｅ
Ｃ．３．２．１．３９）を作用させて酵素的に分解し、
ラミナリオリゴ糖を取得する方法が考えられている。し
かしながら、現在までに見出されているグルカンエンド
−１，３−β−グリコシダーゼは、高分子のβ−１，３
−グルカンに対して直接作用しないので、上記の方法は
実用化されるに至っていない。このため、高分子のβ−
１，３−グルカンに対して直接作用するグルカンエンド
−１，３−β−グリコシダーゼの探索が盛んに行われて
いる現状にある。また、β−１，３−グルカンに酸を作
用させて分解し、ラミナリオリゴ糖を取得する方法も考
えられているが、分解を制御するに当たり、特異性がな
いため、オリゴ糖類まで分解した段階で反応を停止する
ことは、極めて難しいという問題がある。

【０００４】一方、グルコース−１−リン酸とグルコー
スを出発原料として用い、ラミナリビオースホスホリラ
ーゼ（ＥＣ．２．４．１．３１）および／または１，３
−β−グルカンホスホリダーゼ（ＥＣ．２．４．１．９
７）を作用させてラミナリオリゴ糖を酵素的に合成する
方法が提案されている（特開平４−６６０９２号公
報）。この方法は、ラミナリビオースホスホリラーゼの
作用によって等モル量のグルコース−１−リン酸とグル
コースから等モル量のラミナリビオースとリン酸を生成
する酵素反応を利用したものである。しかしながら、現
状ではグルコース−１−リン酸を安価に供給する方法が
無いので、得られるラミナリオリゴ糖は大変高価なもの
となることが明らかである。さらに、このグルコース−
１−リン酸は非常に不安定な物質であるため、酵素反応
を行う際の条件設定が非常に複雑になるという問題もあ
る。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明者等は、上述の
問題を鑑み、β−１，３−グルカンを出発原料として用
いてラミナリオリゴ糖を安価に製造する方法を鋭意検討
したところ、β−１，３−グルカンを弱酸部分分解処理
して水可溶化したものを出発原料として用い、ユーグレ
ナ藻体および／またはユーグレナ藻体抽出物を作用させ
ることにより、ラミナリオリゴ糖を容易かつ安価に製造
することを見出し、本発明を完成するに至った。 した
がって、本発明は、弱酸で部分分解処理して水可溶化し
たβ−１，３−グルカンを出発原料として用い、ユーグ
レナ藻体および／またはユーグレナ藻体抽出物を作用さ
せることにより、ラミナリオリゴ糖を容易かつ安価に製
造する方法を提供することを課題とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明で用いるβ−１，
３−グルカンとしては、ユーグレナの貯蔵多糖として知
られているパラミロンが好ましい。パラミロンは、平均
重合度がグルコース単位で約７００の直鎖状β−１，３
−グルカンである。このパラミロンは、以下のような処
理を行うことにより得ることができる。ユーグレナ属の
ＥｕｇｌｅｎａｇｒａｃｉｌｉｓやＥｕｇｌｅｎａ ｖ
ｉｒｉｄｉｓなどの藻体をハトナー培地やコーレン・ハ
トナー培地などの適当な培養液を用いて、２０〜３０
℃、３〜１０日間、５０〜２００ｒｐｍで振盪培養した
後、遠心分離によって培養液から藻体を回収する。次
に、回収した藻体にエタノールやクロロホルム−メタノ
ールなどの有機溶剤を加えて脱脂処理した後、ドデシル
硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）水溶液中で加熱抽出処理し、
沈殿を遠心分離により回収する。そして、この沈殿にＳ
ＤＳと尿素を加えて蛋白質を変性させた後、ＤＭＳＯに
溶解し、遠心分離によりパラミロンを回収する。このよ
うにして回収したパラミロンを水で洗浄し、メタノー
ル、アセトン、エーテルなどの有機溶剤で脱水し、さら
に、真空下で乾燥させたものが精製パラミロンとなる。

【０００７】上記のようにして得られたパラミロンを酸
部分分解して水溶性パラミロンを調製する。酸部分分解
は、例えば、ギ酸、トリフルオロ酢酸などの有機酸を用
いる公知の手段により行うことができる。パラミロンを
７０〜１００℃に加温した低濃度の有機酸溶液中に５〜
３０分間保持することで水溶性パラミロンを調製するこ
とができる。この水溶性パラミロンは、水に可溶化でき
る程度に加水分解されておれば十分であり、その分解度
の指標として一例を挙げれば、ＨＰＴＬＣを用い、１−
ブタノール：アセトン：水＝４：５：１で２回展開して
も原点から移動しない程度の重合度を持つものが好まし
い。

【０００８】通常、リン酸存在下で、水可溶化β−１，
３−グルカンにユーグレナ藻体および／またはユーグレ
ナ藻体抽出物を作用させると、完全分解されて、グルコ
ース−１−リン酸とグルコースが生成する。しかしなが
ら、リン酸非存在下で、水可溶化β−１，３−グルカン
にユーグレナ藻体および／またはユーグレナ藻体抽出物
を作用させると、グルコース−１−リン酸、グルコース
と共に、ラミナリビオース、ラミナリトリオース、ラミ
ナリテトラオースなどのラミナリオリゴ糖類が生成す
る。この場合、グルコース−１−リン酸とグルコースの
生成量は極めて少量であり、ラミナリビオース、ラミナ
リトリオース、ラミナリテトラオースなどのラミナリオ
リゴ糖類が大量に得られる。

【０００９】ユ−グレナ藻体および／またはユーグレナ
藻体抽出物を水溶性パラミロン等の水可溶化β−１，３
−グルカンに作用させ、ラミナリビオース、ラミナリト
リオース、ラミナリテトラオースなどのラミナリオリゴ
糖類を得るには、以下のような処理を行うとよい。ま
ず、本発明に用いるユ−グレナ藻体の調製法は、次の通
りである。ユ−グレナ藻体を４℃前後の低温に保持した
有機溶剤−緩衝液中に１０分間〜４時間浸漬処理し、細
胞膜複合体（ペリクル）を固定化する。ここで用いるこ
とのできる有機溶剤としては、１〜３％濃度に調製した
ホルムアルデヒド、グルタールアルデヒド、パラホルム
アルデヒドなどを例示することができる。また、緩衝液
としては、リン酸を含まないものであれば特に限定はさ
れないが、中性域のｐＨのものが好ましく、例えば、ク
エン酸−クエン酸ナトリウム、カコジル酸ナトリウム−
塩酸、マレイン酸ナトリウム−水酸化ナトリウム、Ｇｏ
ｏｄの緩衝液（Ｂｉｓｔｒｉｓ，ＡＤＡ，ＰＩＰＥＳ，
Ｂｉｓｔｒｉｓｐｒｏｐａｎｅ，ＡＣＥＳ，ＭＯＰＳ，
ＢＥＳ，ＴＥＳ，ＨＥＰＥＳ）などを用いることができ
る。なお、いずれの緩衝液を用いる場合でも、その濃度
は５０〜２００ｍＭ当量が好ましい。次に、固定化した
ユ−グレナ藻体を４℃前後の低温に保持した有機溶剤中
に５分間〜１時間浸漬処理し、脱脂する。ここで用いる
ことのできる有機溶剤としては、エタノール、アセトン
などを例示することができる。そして、脱脂した固定化
ユ−グレナ藻体を、そのまま、あるいは凍結乾燥して、
本発明に用いる。

【００１０】また、本発明に用いるユーグレナ藻体抽出
物の調製は、次の通りである。ユーグレナ藻体の湿重量
に対して５倍量の緩衝液を加え、４℃の低温に保持しな
がら超音波処理を行い、遠心分離処理を行って上澄液を
得る。そして、この上澄液を３０％以上の飽和硫安分画
し、生成する沈殿を回収してユーグレナ藻体抽出物とす
る。なお、回収したユーグレナ藻体抽出物は、透析など
の操作によって濃縮しておくことが好ましい。ここで用
いることのできる緩衝液としては、リン酸を含まないも
のであれば特に限定はされないが、中性域のｐＨのもの
が好ましく、クエン酸−クエン酸ナトリウム、カコジル
酸ナトリウム−塩酸、マレイン酸ナトリウム−水酸化ナ
トリウム、Ｇｏｏｄの緩衝液（Ｂｉｓｔｒｉｓ，ＡＤ
Ａ，ＰＩＰＥＳ，Ｂｉｓｔｒｉｓｐｒｏｐａｎｅ，ＡＣ
ＥＳ，ＭＯＰＳ，ＢＥＳ，ＴＥＳ，ＨＥＰＥＳ）などを
例示することができる。いずれの緩衝液を用いる場合で
も、その濃度は５０〜２００ｍＭ当量が好ましい。さら
に、用いる緩衝液には０．５〜２ｍＭのＥＤＴＡと１０
〜３５％濃度のグリセロールを添加しておくとよい。

【００１１】このようにして調製したユーグレナ藻体お
よび／またはユーグレナ藻体抽出物を、水可溶化β−
１，３−グルカン、例えば水溶性パラミロン１ｇに対
し、藻体の湿重量換算で０．５〜５ｇ添加する。ユーグ
レナ藻体および／またはユーグレナ藻体抽出物を水溶性
パラミロンに作用させるに当たっては、１０〜７０℃、
好ましくは２０〜５０℃の温度条件下、８時間〜４日
間、好ましくは１〜２日間の処理を行う。なお、反応液
に加える緩衝液はリン酸を含まないものであれば特に制
限されないが、中性域のｐＨのものが好ましい。また、
いずれの緩衝液を用いる場合においても５０〜２００ｍ
Ｍ当量が好ましい。

【００１２】このようにして得られたラミナリビオー
ス、ラミナリトリオース、ラミナリテトラオースなどの
ラミナリオリゴ糖類は、公知の分離・精製手段、例え
ば、十分量の水で平衡化した活性炭などの担体に吸着さ
せた後、５、１０、１５、２０、２５、５０％（ｖ／
ｖ）の各濃度に調整したエタノール水溶液で段階的に溶
出するラカムクロマトグラフィーによって分別すること
ができる。なお、ユーグレナ由来のパラミロンとはグル
コースの重合度が異なるものの同様の糖鎖構造を有する
微生物由来のカードランなど、いずれのβ−１，３−グ
ルカンについても、水可溶化すれば同様にラミナリオリ
ゴ糖類の生産原料として用いることができる。

【００１３】次に実施例を示し、本発明を具体的に説明
する。

【実施例１】改変ハトナー培地を用い、ユーグレナ・グ
ラチリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）ＳＭ−
ＺＫ株を２５℃、７日間振盪培養した後、培養液を遠心
分離処理（３，０００×ｇ、１０分間）し、ユーグレナ
藻体を得た。このようにして得られたユーグレナ藻体を
エタノールで洗浄し、さらにクロロホルム−メタノール
で洗浄した後、１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）
に浸漬し、１００℃、５分間の加熱抽出を２度行った。
加熱抽出後、遠心分離処理（１５，０００×ｇ、１０分
間）によって回収した沈澱を０．１％ＳＤＳで洗浄し、
次いで、６Ｍ尿素で処理を行った後、ＤＭＳＯに溶解さ
せた。そして、この溶液を遠心分離し、回収した上澄液
に水を加え一夜放置した後、再び遠心分離を行って回収
した沈澱を水で洗浄し、次いで５０％メタノールで洗浄
した後、アセトンおよびエーテルで予備脱水し、真空下
で乾燥させ、精製パラミロンを調製した。

【００１４】このようにして調製した精製パラミロン１
ｇを９０％ギ酸２００ｍｌに溶解し、９０℃、１５分間
加熱処理した後、減圧下でギ酸を除去し、さらに水を加
えた後、ホルミル化したグルカンよりホルミル基を外す
ため、１００℃、３時間加熱処理した。そして加熱処理
した後、減圧下で水を除去することにより、酸部分分解
した水溶性パラミロン０．７ｇを得た。

【００１５】一方、ユーグレナ・グラチリス（Ｅｕｇｌ
ｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）ＳＭ−ＺＫ株（大阪府立大
学より分譲）を改変ハトナー培地で２５℃、３日間、暗
黒下に振盪培養した後、遠心分離処理（３，０００×
ｇ、１０分間）して得られたユーグレナ藻体３ｇ (湿重
量) を２ｍＭのＥＤＴＡおよび２５％濃度のグリセロー
ルを含む０．１ＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）１
５ｍｌに懸濁し、超音波破砕装置（トミー精工（株）
製、ＵＲ−１００Ｐ型）を用い、出力３の強さで３０秒
間づつ５回超音波破砕処理を行った。得られた破砕液を
遠心分離処理（２０，０００×ｇ、２０分間）し、その
上澄液１７ｍｌをユ−グレナ藻体抽出物とした。

【００１６】上述のようにして調製した水溶性パラミロ
ン０．５ｇとユ−グレナ藻体抽出物２．５ｍｌに、２ｍ
ＭのＥＤＴＡおよび２５％濃度のグリセロールを含む
０．１ＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）２．５ｍｌ
に懸濁させた後、蒸留水２ｍｌを添加し、３７℃、８時
間反応させた。１００℃、４分間加熱処理して反応を停
止した後、遠心分離処理（２０，０００×ｇ、２０分
間）して得られた上澄液をＨＰＴＬＣ上で１−ブタノー
ル：２−プロパノール：水＝３：１２：５の溶媒を用い
て１度展開し、さらに１−ブタノール：アセトン：水＝
４：５：１の溶媒を用いて２度展開した後、オルシノー
ルで染色を行ったところ、ラミナリビオース、ラミナリ
トリオース、およびそれ以上の重合度を有するラミナリ
オリゴ糖類の生成が認められた。ラミナリオリゴ糖類の
収率は６１％であった。また、グリコース、グルコース
−１−リン酸あるいは未反応の水溶性パラミロンの量は
３９％であった。

【００１７】

【実施例２】実施例１と同様の方法で得られたユ−グレ
ナ藻体２０ｇ (湿重量) を４℃の低温に保持した２．５
％ホルムアルデヒド−２００ｍＭカコジル酸ナトリウム
緩衝液（ｐＨ７．０）５０ｍｌ中に２時間浸漬処理して
固定化した後、４℃の低温に保持した５０％エタノール
５０ｍｌ中に３０分間浸漬処理して脱脂し、凍結乾燥を
行って本発明に用いるユ−グレナ藻体を得た。このよう
にして得られたユ−グレナ藻体と実施例１と同様の方法
で得られた水溶性パラミロン１０ｇを２ｍＭのＥＤＴＡ
および２５％濃度のグリセロールを含む０．１ＭのＨＥ
ＰＥＳ緩衝液５０ｍｌに懸濁させた後、蒸留水４０ｍｌ
を添加し、４０℃、１日間反応させた。そして、遠心分
離処理（３，０００×ｇ、１０分間）を行ってユ−グレ
ナ藻体を除去した後、その上澄液を１００℃、４分間加
熱処理して反応を停止し、遠心分離処理（２０，０００
×ｇ、２０分間）を行って上澄液を得た。この上澄液を
十分量の水で平衡化した活性炭カラム（５×４５ｃｍ）
に供給した後、活性炭カラムを蒸留水５ｌで洗浄し、副
産物のグルコースおよびグルコース−１−リン酸を除去
した後、５０％エタノール溶液５ｌでラミナリオリゴ糖
類を溶出させた。このラミナリオリゴ糖類を含む５０％
エタノール溶液については、ロータリーエバポレーター
を用いて、約１００ｍｌとなるまで濃縮した後、凍結乾
燥を行ったところ、ラミナリビオース、ラミナリトリオ
ース、ラミナリテトラオースなどのラミナリオリゴ糖類
混合物５．８ｇが得られた。

【００１８】

【発明の効果】本発明の方法によると、ユ−グレナ藻体
および／またはユ−グレナ藻体抽出物を用いることによ
り、多量かつ安価にラミナリオリゴ糖を合成することが
できる。このようにして得られるラミナリオリゴ糖につ
いては、ビフィズス菌の増殖促進作用など、種々の生理
活性が期待されており、医薬品、機能性食品、飼料など
の素材としての利用が期待される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｈ 3/06 (Ｃ１２Ｐ 19/00 Ｃ１２Ｒ 1:89）

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 水可溶化β−１，３−グルカンにリン酸
   非存在下、ユーグレナ藻体および／またはユーグレナ藻
   体抽出物を作用させることを特徴とするラミナリオリゴ
   糖の製造法。
2. 【請求項２】 水可溶化β−１，３−グルカンが、ユー
   グレナ藻体の生産するパラミロンである請求項１記載の
   ラミナリオリゴ糖の製造法。