JPH05236982A - デキストランの製造法 - Google Patents
デキストランの製造法Info
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- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
るデキストランを、澱粉またはα-1,6結合を有する澱粉
分解物などの安価な原料から酵素化学的に効率的に製造
する方法を提供する。 【構成】澱粉またはα-1,6結合を有する澱粉分解物に、
枝切り酵素およびデキストリンデキストラナーゼを作用
させる工程を包含するデキストランの製造法。
Description
の分野で利用されているデキストラン(αー1,6-グルカ
ン)を、澱粉またはα-1,6結合を有する澱粉分解物から
酵素化学的に効率的に製造する方法に関する。
して、ロイコノストック属菌であるLeuconostoc mesent
eroidesあるいはそれに由来するデキストランスクラー
ゼ(以下、DSaseという)を使用して産業的に生産さ
れ、医療あるいは生化学などの分野で利用されている。
DSaseは、蔗糖の構成糖であるグルコースのみを利用し
てデキストランを生産するが、この際、同じく構成糖で
あるフラクトースはデキストラン生産には全く利用され
ずに遊離する。このような作用機構ゆえに、DSaseを用
いて蔗糖からデキストランを生産する場合には、対糖収
率が決して50%を越えることはない。実際には37%
程度の収率しか得られていない。
aseという)は約40年前に糸引きビールの原因菌であ
るグルコノバクターオキシダンスATCC11894株
(Gluconobacter oxydans; American Type Culture Coll
ection Strain No.11894)より粗精製され、重合度3以
上のα-1,4結合を有するマルトオリゴ糖からデキストラ
ンを生成することがすでに報告されている(Journal of
Biological Chemistry、第192巻、第161〜174頁(195
1))。この報告によると、DDaseは重合度3以上のα-1,4
結合した直鎖のアミロース(マルトオリゴ糖を包含す
る)、および澱粉などの加水分解物の非還元末端側のグ
ルコース残基を転移することによってデキストランを生
成する。しかしながら、DDaseを各種糊化澱粉に作用さ
せてもデキストランの生成は認められない。可溶性澱粉
からのデキストランの収率も20%程度にすぎない。こ
のことは、DDaseが可溶性澱粉などの構造中に存在する
分枝部分、すなわちα-1,6結合したグルコースを側鎖と
して有する構造の付近には作用できず、未反応部分が多
く残るためと考えられる。この事実はβ-アミラーゼ限
界デキストリンがDDaseの基質とならないことから確か
められる。
ストランの生産収率は低いため、デキストランの安全性
が広く認められているにもかかわらず、高価なものとな
り、食品への利用がほとんど行われていない。もし安価
にデキストランを供給できるならば、安全性の高い優れ
た食品用多糖としての利用が期待できる。そのためには
安価な原料からより高収率で効率的にデキストランを生
産する必要がある。
を解決するものであり、その目的とするところは、医療
あるいは生化学などの分野で利用されているデキストラ
ンを、澱粉またはα-1,6結合を有する澱粉分解物などの
安価な原料から酵素化学的に効率的に製造する方法を提
供することにある。
造法は、澱粉またはα-1,6結合を有する澱粉分解物に、
枝切り酵素およびデキストリンデキストラナーゼを作用
させる工程を包含し、そのことにより上記目的が達成さ
れる。
素は、イソアミラーゼまたはプルラナーゼである。
るデキストリンデキストラナーゼ(DDase)は、グルコノ
バクターオキシダンスATCC11894株(Gluconoba
cteroxydans; American Type Culture Collection stra
in No.11894)、グルコノバクターオキシダンスATCC
11895株(Gluconobacter oxydans; American Type
Culture Collection strain No.11895)などの菌に存在
する酵素として従来から知られている。DDaseを有する
これら酢酸菌においては、病原性などは知られておら
ず、従ってこれらの菌由来のDDaseを食品原料加工に用
いても安全である。本発明においては好ましくは、上記
DDaseは、本発明者らによる精製法(特願平3-69590号に
おいて詳細に記載されている)により精製されたものが
用いられる。
製法は、例えば、次のとおりである。
CC11894株(Gluconobacter oxydans; American T
ype Culture Collection strain No.11894)、グルコノ
バクターオキシダンスATCC11895株(Gluconoba
cter oxydans; American Type Culture Collection str
ain No.11895)、またはグルコノバクターに属するその
他のDDase生産菌を、常法により培養する。培養後、採
取した菌体をそのままあるいは細胞破壊した後、緩衝液
に懸濁する。緩衝液としては、酢酸緩衝液などDDaseが
安定に存在できるpHの水溶液を用いることが望まし
い。必要に応じて菌体を除去することにより、粗酵素液
が得られる。
により、次のようにして精製される。まず、上記粗酵素
液(菌体を含んでいてもよい)を、極性の低い有機溶媒
で抽出し、これを除去する。水層を集め、透析した後、
疎水クロマトグラフィーに供する。次に、吸着したタン
パク質を、水と容易に混合し得るアルコール類(例え
ば、エチレングリコール)などを含有する緩衝液で溶出
した後、これを濃縮し、同じく緩衝液で平衡化したゲル
濾過カラムに供し回収する。上記低い極性の有機溶媒と
は、ヘキサンの極性を0、水の極性を9としたときに5
より低いものをさしていう。例えばn-ブタノール、クロ
ロホルムなどが好適に用いられる。上記疎水クロマトグ
ラフィーに吸着した酵素を溶出する際には、例えば、極
性が5以上の有機溶媒が好適に用いられる。このような
有機溶媒としては、アルコール類(例えば、n-ブタノー
ル、エチレングリコールなど)、アセトンなどが挙げら
れる。
特徴を有する。
オリゴ糖に作用し、それら基質の非還元末端側のグルコ
ース残基を転移することによってデキストランを生産す
る。この作用は、反応に用いた物質がマルトース(重合
度=2)となるまで進行する。このDDaseの作用はマル
トオリゴ糖の還元末端に位置するグルコースが水素添加
などの修飾を受けていても同様である。
下で30分置いた時にpH2.5〜6.0で安定である。
下で30分置いた時に45℃以下で安定である。本酵素は55
℃まで活性を有する。
って生成したデキストランをデキストラナーゼを用いて
分解後、この時生じる還元力を測定することによりデキ
ストラン生成量を求める。力価は、1分間に1μmolの
グルコース単位がデキストランとなる時の酵素量を1U
とする。
の構造中に存在するα-1,6グルコシル結合を切断する酵
素であり、例えば、イソアミラーゼまたはプルラナーゼ
が挙げられる。本発明に用いる澱粉とは、分解処理をし
ていない未分解の澱粉である。澱粉の分解物とは、ここ
では澱粉の酸加水分解物、またはα-アミラーゼなどの
酵素処理による分解物をさしていい、分子中にα-1,6結
合を有する。澱粉分解物の分解限度は特に限定されな
い。
澱粉分解物に酵素化学的に作用させるには通常の酵素反
応の条件が採用され得る。例えば、本発明で用いる酵素
反応の条件は、好ましくはpH3.5〜5.5、温度20〜4
5℃、そして反応時間3〜72時間である。このときに
用いる枝切り酵素およびDDaseは粗精製のものでも良い
が、好ましくは、精製酵素が用いられる。原料である澱
粉またはα-1,6結合を有する澱粉分解物の一部が未反応
で残る場合には、澱粉液化型α-アミラーゼなどをさら
に加えて、これを分解すれば良い。しかし、反応条件が
適切でかつ酵素量および反応時間が充分であれば、原料
である澱粉またはα-1,6結合を有する澱粉分解物は未反
応で残ることはなく、エタノール沈澱法などの通常の多
糖体分離取得法でのみで、効率的に純度の高いデキスト
ランを取得できる。
が、α-1,6結合には作用しない。しかし、その分解物で
あってα-1,4結合のみを有する多糖類には作用し、デキ
ストランを生成する。DDaseを澱粉またはα-1,6結合を
有する澱粉分解物に作用させると、デキストラン分子を
形成するべく、そこに存在するα-1,4結合した非還元末
端グルコース残基をα-1,6結合様式で転移させるのであ
るが、澱粉分解物の構造中に存在する分枝部分の近辺で
その反応は停止する。それゆえ、α-1,6結合をもたない
直鎖のα-1,4オリゴ糖が、デキストラン製造における良
い原料となり、最も良い原料は澱粉を枝切り酵素で分解
したときに得られる短鎖アミロースであると考えられ
る。発明者はさらに研究をすすめ、澱粉またはα-1,6結
合とα-1,4結合とを有する分解物にDDaseと枝切り酵素
とを併用することにより、短時間で効果的にデキストラ
ンが生成することを見い出した。本発明においては、DD
aseと枝切り酵素が同時に澱粉またはα-1,6結合を有す
る澱粉分解物に作用し;もしくは、枝切り酵素が澱粉ま
たはα-1,6結合を有する澱粉分解物に作用してこれらの
α-1,6結合を分解し、次いで、これにDDaseが作用す
る。例えば、DDaseとイソアミラーゼとを用いると、イ
ソアミラーゼによって澱粉またはα-1,6結合を有する澱
粉分解物より短鎖アミロースを生成しながら、この生成
したアミロースに対してDDaseが作用してデキストラン
を生成する。この際、過剰のイソアミラーゼが反応に用
いられた場合には、反応途中において短鎖アミロースが
生成し、これが沈澱する場合があるが、この短鎖アミロ
ースは最終的にはデキストランへと変換されるので、特
に問題なく高収率でデキストランを製造することができ
る。一般に、イソアミラーゼを過剰に使用することが推
奨される。これに対してイソアミラーゼの使用量が少な
い場合には、デキストラン製造における所要時間が長く
なるがデキストランの収率が低下することはない。
はα-1,6結合を有する澱粉分解物のα-1,6結合に作用す
るが、その作用部位は澱粉分子の外側に存在する分枝部
分に限られ、内部の分枝部分には作用しない。従って、
プルラナーゼは単独では澱粉に作用しないと言われてい
る。このプルラナーゼとDDaseとを併用すると、澱粉分
子の外側に存在するα-1,6結合に対してプルラナーゼが
作用し短鎖アミロースが生成する。生成した短鎖アミロ
ースおよび枝切りされた澱粉の外側の直鎖部分はDDase
の作用によりデキストランへと変換される。澱粉の外側
の直鎖部分がデキストランへと変換されて短くなるにつ
れて、澱粉の内部に存在する分枝部分が露出するため、
この部分のα-1,6結合がプルラナーゼの作用により切断
され、短鎖アミロースおよび直鎖部分が生じ、これにDD
aseが作用する。この繰り返しによって澱粉は完全に消
失し、デキストランが高収率で製造できる。このメカニ
ズムは、マルトースの製造において澱粉にβ-アミラー
ゼとプルラナーゼとを併用すると、プルラナーゼが効率
良く澱粉の枝切り酵素として作用するのに類似してい
る。
トランを高収率で取得するに際し、枝切り酵素とDDase
とを同時に作用させること、または枝切り酵素の作用中
にDDaseを作用させることを特徴としている。本発明方
法により、例えば、澱粉の分解物として可溶性澱粉を原
料に用い、枝切り酵素をDDaseと同時に作用させたとき
のデキストランの収率を、DDaseのみを作用させたとき
のデキストランの収率と比較すると、DDaseと枝切り酵
素とを併用した方がはるかに高い収率でデキストランを
製造できる。これまでDDaseの作用についてはほとんど
研究が行われたことがなく、澱粉中のα-1,6結合付近で
反応が停止すること、あるいは、この部分がイソアミラ
ーゼまたはプルラナーゼにより切断されることによりDD
aseが再び作用することについて明らかにされていなか
った。これらの事実は、本発明によって初めて明らかに
された。
590号の方法で得られた1U/mlDDase0.75mlおよび12,500U
/mlイソアミラーゼ(天野製薬製、商品名「イソアミラ
ーゼ「アマノ」」、1,250,000U/ml)5μlを加え、pH
4.8で30℃にて30時間反応させた。この反応液を1
5分間沸騰水中で加熱した後、4.5mlのエタノールを加
え、4℃で1時間放置し、これを遠心分離して沈澱を集
めた。このとき得られた沈澱を乾固することにより、デ
キストランを19.5mg得た。収率は65.0%であった。本実
施例の結果を表1に示す。実施例2〜5、比較例1およ
び2、および参考例1の結果もあわせて表1に示す。
に実施例1と同様の1U/mlDDase0.75mlおよび400U/mlプ
ルラナーゼ(林原生物化学研究所製、商品名「プルラナ
ーゼ」、40U/mgタンパク質)10μlを加え、pH4.8で
30℃にて30時間反応させた。この反応液を15分間
沸騰水中で加熱した後、4.5mlのエタノールを加え、4
℃で1時間放置し、これを遠心分離して沈澱を集めた。
このとき得られた沈澱を乾固することにより、デキスト
ランを10.2mg得た。収率は68.0%であった。
実施例1と同様の0.3U/mlDDase2mlを加え、pH4.8で3
0℃にて48時間反応させた。この反応液を15分間沸
騰水中で加熱した後、8mlのエタノールを加え、4℃で
1時間放置し、これを遠心分離して沈澱を集めた。この
とき得られた沈澱を蒸留水4mlに溶解し、これに200U/ml
液化型のα-アミラーゼ(上田化学工業製、商品名「フ
クタミラーゼ」、300,000U/g)を加え、40℃で1時間
反応させた。この反応液を4℃で2時間放置し、これを
遠心分離したところ、デキストランの沈澱は得られなか
った。
施例1と同様の10U/mlDDase0.2mlおよび実施例1と同様
の5,900,000U/mlイソアミラーゼ5μlを加え、pH4.8
で40℃にて66時間反応させた。この反応液を15分
間沸騰水中で加熱した後、6mlのエタノールを加え、4
℃で1時間放置し、これを遠心分離して沈澱を集めた。
このとき得られた沈澱を乾固することにより、デキスト
ランを280mg得た。収率は51.9%であった。
施例1と同様の10U/mlDDase0.2mlおよび実施例2と同様
の400U/mlプルラナーゼ20μlを加え、pH4.8で40℃
にて66時間反応させた。この反応液を15分間沸騰水
中で加熱した後、6mlのエタノールを加え、4℃で1時
間放置し、これを遠心分離して沈澱を集めた。このとき
得られた沈澱を乾固することによりデキストランを28.6
mg得た。収率は52.9%であった。
1と同様の0.2U/mlDDase1mlを加え、pH4.8で30℃に
て16時間反応させた。この反応液を15分間沸騰水中
で加熱した後、6mlのエタノールを加え、4℃で1時間
放置し、これを遠心分離して沈澱を集めた。この沈澱を
0.5mlの蒸留水に溶解し、これに比較例1と同様の100U/
ml液化型α-アミラーゼ50μlを加え、37℃で30分
間反応させた。この反応液を15分間沸騰水中にて加熱
後、1.7mlのエタノールを加え、4℃で1時間放置し、
これを遠心分離して沈澱を集めた。このとき得られた沈
澱を乾固することにより、デキストランを4.3mg得た。
収率は21.4%であった。
施例2と同様の400U/mlプルラナーゼ30μlを加え、p
H4.8で40℃にて2時間反応させた後、これに実施例
1と同様の1U/mlDDase3.6mlを加え、さらに60時間反
応させた。この反応液を15分間沸騰水中で加熱した
後、20mlのエタノールを加え、4℃で1時間放置し、こ
れを遠心分離して沈澱を集めた。このとき得られた沈澱
を乾固することにより、デキストランを745mg得た。収
率は51.7%であった。
実施例1と同様の1U/mlDDase1.5mlを加え、pH4.8で3
0℃にて6時間反応させた。この反応液を15分間沸騰
水中で加熱した後、9mlのエタノールを加え、4℃で1
時間放置し、これを遠心分離して沈澱を集めた。このと
き得られた沈澱を乾固することにより、デキストランを
42mg得た。収率は70.0%であった。
有する澱粉分解物から、簡単な操作で短時間のうちにデ
キストランを製造することができる。
Claims (2)
- 【請求項1】 澱粉またはα-1,6結合を有する澱粉分解
物に、枝切り酵素およびデキストリンデキストラナーゼ
を作用させる工程を包含するデキストランの製造法。 - 【請求項2】 前記枝切り酵素が、イソアミラーゼまた
はプルラナーゼである、請求項1に記載のデキストラン
の製造法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP04045646A JP3124356B2 (ja) | 1992-03-03 | 1992-03-03 | デキストランの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP04045646A JP3124356B2 (ja) | 1992-03-03 | 1992-03-03 | デキストランの製造法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
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JPH05236982A true JPH05236982A (ja) | 1993-09-17 |
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Family
ID=12725142
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP04045646A Expired - Fee Related JP3124356B2 (ja) | 1992-03-03 | 1992-03-03 | デキストランの製造法 |
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Country | Link |
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JP (1) | JP3124356B2 (ja) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US9657322B2 (en) | 2009-05-08 | 2017-05-23 | Rijksuniversiteit Groningen | Glucooligosaccharides comprising (alpha 1->4) and (alpha 1->6) glycosidic bonds, use thereof, and methods for providing them |
CN108300750A (zh) * | 2018-02-06 | 2018-07-20 | 江南大学 | 一种高分支糊精产品的制备方法 |
CN111172221A (zh) * | 2020-01-16 | 2020-05-19 | 齐鲁工业大学 | 一种改性淀粉的制备方法及应用 |
-
1992
- 1992-03-03 JP JP04045646A patent/JP3124356B2/ja not_active Expired - Fee Related
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WO2019153611A1 (zh) * | 2018-02-06 | 2019-08-15 | 江南大学 | 一种高分支糊精产品的制备方法 |
CN108300750B (zh) * | 2018-02-06 | 2021-11-30 | 江南大学 | 一种高分支糊精产品的制备方法 |
CN111172221A (zh) * | 2020-01-16 | 2020-05-19 | 齐鲁工业大学 | 一种改性淀粉的制备方法及应用 |
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