JPH0586185B2

JPH0586185B2 -

Info

Publication number: JPH0586185B2
Application number: JP60048350A
Authority: JP
Inventors: Katsutoshi Yoshizato; Toshio Taira; Teruo Myata
Original assignee: Koken Co Ltd
Current assignee: Koken Co Ltd
Priority date: 1985-03-13
Filing date: 1985-03-13
Publication date: 1993-12-10
Also published as: JPS61207340A

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明はバイオテクノロジー領域或はハイブリ
ツドオーガンの領域において使用されるコラーゲ
ン基質の処理方法に関し、特にコラーゲン基質に
高い細胞の増殖性を賦与するための処理方法に関
する。

（従来の技術及び解決すべき問題点）近年、先端技術であるバイオテクノロジーの領
域では動物細胞を体外に取り出しin vitroで大量
に培養増殖して細胞の生産する有用物質を生産す
ることが行われており、また人工臓器の領域では
膜透過や物理吸着と云うような単なる物理的機能
に基づく人工臓器でなく、細胞を組みこんで細胞
の生理活性を有効に生かした所謂ハイブリツドオ
ーガンの研究が活発化しており、徐々に実用化の
段階に近づきつゝある。しかして、このようにバ
イオテクノロジーやハイブリツドオーガンの分野
ではin vitroで細胞を容易に増殖させる技術の開
発が強く要望されているところである。他方、細
胞培養の研究もいろいろ行なわれており、通常ガ
ラスまたはプラスチツク皿の中で培養が行なわれ
ているが、容器の性質により細胞の接着増殖に思
わしくない場合があり、このような場合培養皿内
面に細胞培養に都合の良い物質をコーテングする
ことが行なわれており、各種細胞の接着増殖を高
めることが種々研究されている。

ところで、コラーゲンは生体中では細胞間マト
リツクスとして細胞の足場物質の役割と同時に細
胞の分化器官形成に密接に関わつていることも知
られている。したがつて、生体内と同条件のコラ
ーゲン基質は細胞を生体内と同じような状態で保
持するのには最も理想的な基質ということができ
るが、生体内と同じ状態の細胞は通常は増殖が活
発でなく、細胞の大量培養で有用物質を生産する
場合、または培養皿中で細胞増殖を行う場合など
は不都合である。したがつてコラーゲンを基質と
して用いる場合細胞の増殖能を向上させるために
は、コラーゲンに何らかの修飾処理を行なう必要
がある。すなわち、本発明は細胞の増殖に都合の
良いコラーゲンを提供するためコラーゲン基質を
処理する方法に関する。

（問題点を解決するための手段）本発明の要旨は、細胞培養用またはハイブリツ
ドオーガン用コラーゲン基質に、紫外線またはガ
ンマー線照射、エチレンオキサイドガス処理、ヘ
キサメチレンジイソシアナート処理及びアルデヒ
ド類処理からなる細胞増殖性向上の修飾処理の少
なくとも１種を施すことを特徴とするコラーゲン
基質の細胞増殖性向上処理方法である。

これらの処理によりコラーゲンの細胞増殖能は
十分高められる。コラーゲン基質として使用する
コラーゲンの種類としては酸可溶性コラーゲン、
またはペプシン処理によりテロペプチドを除去し
たアテロコラーゲン或いは不溶性コラーゲン線維
分散液等何れでもよい。そして処理されるコラー
ゲン基質は乾燥状態でコラーゲン分子がランダム
に分布しているアモルフアスコラーゲン膜でも、
またコラーゲン線維膜でも、更にコラーゲン基質
が湿潤状態等どのような状態のコラーゲンでも細
胞増殖能は増大する。また、細胞としては線維芽
細胞、表皮細胞、肝細胞などに対して特に有効で
あつた。基質として培養皿にコラーゲンをコーテ
イングする場合は、培養皿の面積１cm²当り0.2μｇ
〜450μｇのコラーゲンがあればよく、好ましく
は0.2〜50μｇ／cm²である。その他、サスペンジヨ
ン培養で用いるコラーゲンミクロフエアー基質、
ハイブリツドオーガンのコラーゲン基質にも適用
できる。コラーゲンミクロフエアー基質は直径
100〜1000μの球形でその表面に細胞を接着させ
てサスペンジヨン培養で増殖させるものであり、
また、ハイブリツドオーガンを作成する場合、
膜、スポンジ、毛細管（hollow fiber）など目的
に最適な各種形状のコラーゲンが必要である。例
えば人工皮膚の場合には真皮に対応する部分をス
ポンジ構造にすることが望ましい。またハイブリ
ツド人工肝臓や人工膵臓の場合半透膜のコラーゲ
ン毛細管の外表面に細胞を増殖させ、内表面に血
液を流すことが行なわれる。これら何れの形状を
有するコラーゲン基質に対して細胞の増殖性を高
める修飾処理を施すことができる。

本発明において採用できる修飾処理の一般的な
条件について説明する。紫外線照射では10W紫外
線殺菌燈を用い照射距離が約10cmの場合には１分
〜60分程度で良く、好ましくは10〜20分であり、
ガンマー線照射では0.01〜5M rad.好ましくは0.1
〜1M rad.である。エチレンオキサイド処理では
コラーゲンをコーテイングした培養用容器をポリ
エチレン袋中に入れ、室温下で減圧にして空気を
除去しながらエチレンオキサイドガスを吹き込み
0.5〜20時間好ましくは１〜４時間エチレンオキ
サイドガスにさらすことにより細胞の増殖能は高
められ、ヘキサメチレンジイソシアナート
（HMDIC）処理ではHMDICの濃度0.01〜１％好
ましくは0.05％〜0.1％の溶液をコラーゲンコー
テイング層上に流し込み室温で10分〜５時間、好
ましくは30分〜２時間接触させることによりその
細胞の増殖効果は十分に高められる。

また、アルデヒド類処理に使用できるアルデヒ
ドとしてはホルムアルデヒド、グリオキザール、
アセトアルデヒド、プロピオンアルデン、グルタ
ールアルデヒド等があるがグルタールアルデヒド
が最も好ましい。その処理条件としては室温でグ
ルタールアルデヒド0.01〜１％、好ましくは0.01
〜0.1％の溶液が好ましく、その溶液のPHとして
は５〜10、好ましくは５〜７であつた。処理時間
は10〜20分である。

これらの修飾処理は併用することができ、例え
ば紫外線照射後、更にHMDICで処理することに
よりその効果は更に増大することができる。

以下、実施例をもつて本発明を説明する。

実施例１新鮮な仔牛皮の真皮層を無菌的に取り出し、細
断後、無菌下でペプシン処理（PH3.0、ペプシン
添加量はコラーゲン重量の0.5％）を20〜25℃で
３日おこなつた。不溶性コラーゲンはすべて可溶
化し粘稠な溶液となつた。この溶液をPH7.5に
NaOH溶液で調節し、コラーゲンを沈澱させる。
遠心分離器で沈澱を集めた後、水洗し、再びPH３
のHClに溶かす。これを1μ、0.65μ、0.45μのミリ
ポアフイルターを通し、最終的に0.45μの無菌
過を行つて、0.02％の無菌、発熱物質フリーのア
テロコラーゲン溶液を得た。細胞培養皿（フアル
コン細胞培養デイツシユ、直径35mm）に１mlの上
記アテロコラーゲン溶液を入れ、デイツシユ底面
を一様に濡らした後、無菌下で風乾する。次い
で、紫外線殺菌燈（10W）から10cmの距離で10分
間照射する。

このようにして得られたコラーゲンコーテイン
グ培養皿を用いて、人皮膚線維芽細胞、ネズミ肝
細胞、ネズミ表皮細胞を培養したところ、コラー
ゲンコーテイングをしないデイツシユ、コラーゲ
ンコーテイングした紫外線照射しないデイツシユ
に較べ、明らかにこれら細胞の増殖率は高かつ
た。

実施例２実施例１の方法により組織培養デイツシユにア
テロコラーゲンをコーテイングし、風乾する。
0.5M radのガンマー線を照射後、実施例１と同
様の方法で３種の細胞を用いて培養したところ、
コラーゲンをコーテイングしないもの、コラーゲ
ンコーテイングしただけのものに較べ、非常に優
れた増殖率を示した。

実施例３実施例１の方法で組織培養デイツシユにアテロ
コラーゲンをコーテイングし、0.05％HMDICメ
タノール溶液をデイツシユに入れ室温で１時間処
理する。処理後メタノールで洗浄後、リン酸バツ
フアー生食水で十分洗浄後、実施例１と同様に３
種の細胞を用いて培養テストをしたところ、コラ
ーゲンコーテイングしないもの、コラーゲンコー
テイングしただけのものに較べ優れた増殖を示し
た。

実施例４実施例１の方法でデイツシユにアテロコラーゲ
ンをコーテイングし風乾する。0.01％グルタール
アルデヒド溶液（リン酸バツフアー、PH7.0）を
デイツシユに加え、室温で10分、処理後、リン酸
バツフアー生食水でくり返し洗浄後、実施例１と
同様に３種の細胞を用いて、培養テストをおこな
つたところ、コラーゲンをコーテイングしないも
の、コラーゲンコーテイングしたがそのまゝのも
の、に較べ、細胞の優れた増殖性が見られた。

実施例５実施例１で得られた紫外線照射したアテロコラ
ーゲンコーテイングデイツシユを更にエチレンオ
キサイドガス処理をおこなつた。デイツシユをポ
リエチレン製の袋に入れ、減圧にして空気を除去
してからエチレンオキサイドガス（ダイサイド
LS 大同酸素(株)製）を吹きこみ、ポリエチレン
袋をシールし、室温に３時間放置する。エチレン
オキサイドガス処理されたデイツシユをリン酸バ
ツフアー生食水で十分洗浄後、実施例１と同様に
３種の細胞を用い培養テストを行つたところ、実
施例１で得られた紫外線照射アテロコラーゲンコ
ーテイングデイツシユと同様に細胞の優れた増殖
性が見られた。

実施例６実施例１に得られたアテロコラーゲン溶液を濃
縮しコラーゲン濃度１％とする。これにNaOH
溶液を加えPH7.0に中和し、直ちに平板容器に入
れ、ドライアイスで冷却・冷凍する。この凍結ア
テロコラーゲンを真空凍結乾燥機で乾燥すると、
スポンジが得られる。このスポンジを厚さ１mmに
スライスし、紫外線殺菌燈（10W）で10cmの距離
から片面30分づつ、両面紫外線照射する。

上方上記１％のアテロコラーゲン溶液を希釈し
て0.1％コラーゲン濃度とした溶液を深さ１mmの
平板容器に入れ風乾すると厚さ1μm前後のアテロ
コラーゲン薄膜が得られる。この薄膜を湿潤状態
にし、上記１mm厚さのスポンジの片面に貼り付け
風乾する。風乾後薄膜側に10cmの距離から10W紫
外線殺菌罵燈で10分間紫外線照射すると、片面に
アテロコラーゲン薄膜をもつた厚さ１mmのアテロ
コラーゲンスポンジ（紫外線照射した）が得られ
た。このスポンジを実施例５と同じ様にエチレン
オキサイドガス処理して消毒したあと、リン酸バ
ツフアーで十分洗浄し薄膜面を下にして真皮線維
芽細胞をスポンジ上にまき培養すると、線維芽細
胞はスポンジ網目に入り増殖する。ついでスポン
ジの薄膜面を上にして表皮細胞を薄膜上にのせ培
養すると表皮細胞は全面に増殖し、スポンジ部を
真皮、薄膜部を表皮としたハイブリツドオーガン
人工皮膚ができ上つた。レシピエントの細胞を用
いれば拒絶反応のないそのまゝ生着するハイブリ
ツド人工皮膚となる。

実施例７実施例１で得たアテロコラーゲン溶液を濃縮し
て、濃度５％の溶液とする。この粘稠なコラーゲ
ン溶液を脱泡後、２重円筒のノズルから飽和食塩
水中の凝固液中に押し出し、毛細管状に凝固させ
る。これに紫外線殺菌燈（10W）から10cmの距離
で20分紫外線照射した後、PH7.0のリン酸バツフ
アーで中和洗浄し、次いで50％エタノール（エタ
ノール：水＝１：１）に浸漬平衡化してから凍結
乾燥すると、多孔質アテロコラーゲン毛細管がで
きる。この膜は分子量５万以上のタンパク質は通
過しない。この毛細管をエチレンオキサイドガス
消毒した後、リン酸バツフアー生食水で洗浄後、
毛細管外表面に肝細胞を接着させ培養をおこなつ
たところ、細胞は優れた増殖性を示し、全外表面
に増殖した。このように細胞増殖性のすぐれた外
表面をもつ透過性の毛細管はハイブリツド人工肝
臓、ハイブリツド人工膵臓に応用できる。

コラーゲン以外の材料で作られたハイブリツド
オーガン用の器材に、実施例１から５で述べたよ
うな方法でコラーゲンをコーテイングし、細胞の
増殖性を改善向上させることができる。

Claims

【特許請求の範囲】

１細胞培養用またはハイブリツドオーガン用コ
ラーゲン基質に、紫外線またはガンマー線照射、
エチレンオキサイドガス処理、ヘキサメチレンジ
イソシアナート処理及びアルデヒド類処理からな
る細胞増殖性向上の修飾処理の少なくとも１種を
施すことを特徴とするコラーゲン基質の細胞増殖
性向上処理方法。