JP5398712B2 - 鼓膜または外耳道再生剤 - Google Patents

Description

本発明は、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を担持したゼラチンスポンジと、被覆材料とを組み合わせた、鼓膜または外耳道再生剤に関する。

鼓膜穿孔は、鼓膜に裂傷や穿孔等の欠損を生ずる症状であり、その原因はさまざまであるが、肉眼的に鼓室内が乾燥し活動性の炎症がない症例では、できる限り早期に閉鎖することが望ましいと考えられる。鼓膜閉鎖の最大の利点は、聴力の上昇である。内耳が障害されておらず、中耳に特別な病変がなければ、通常鼓膜閉鎖後は全例で聴力改善が得られ、QOLの上昇に大きく寄与する。

鼓膜穿孔がある場合、単に鼓膜で十分な音を捉えられないだけでなく、直接鼓室内に侵入した音が、蝸牛の正円窓を通じて入り、正規のルートで入った音と蝸牛内でぶつかり合うキャンセル効果によって、いっそう聞こえ（言葉の聞き取り）を妨げることになる。また、外耳道側に中耳が直接さらされることになり、結果として感染に対する抵抗が減弱し、中耳炎を惹起しやすくなる。また、長期的感染状況は内耳機能低下による、感音難聴や平衡機能障害を引き起こす。これらのことから、できる限り鼓膜は閉鎖していることが好ましい。

鼓膜閉鎖は、その穿孔の大きさによってさまざまな治療法がとられているが、基本的には現行の治療法の大半が、手術によるものである。一般的には、鼓膜形成術や鼓室形成術が施行されている。前者では、耳後部の皮膚切開と自家組織の採取・移植、後者はこれらの操作にくわえて、外耳道剥離が必須である。鼓膜穿孔が大きくなると、鼓膜の代用としての自家組織（側頭筋膜）移植も手術手技として難易度が上がる。すなわち、手術を施行しても確実に聴力が改善するとは限らない。術後の鼓膜再穿孔や耳周囲の違和感、耳鳴りなど多くの後遺症の可能性がある。さらに術後鼓膜が潜在化、肥厚するなどして、本来の鼓膜とは程遠いものになり、聴力も低下する。また、これらの手術では、通常1日〜数週間程度の入院加療を伴い、患者の精神的・肉体的・経済的負担も大きくなるなどの難点がある。

同様に、骨露出を伴うような外耳道軟部組織欠損に関しても、従来は手術療法のみしか治療法がなく、耳後部外切開と自家組織採取といった処置が必要不可欠であった。

近年、増殖因子を担持させた生体適合性の足場素材（scaffold）を用いた再生医学的な鼓膜再生法が提唱されている（例えば、特許文献１参照）。特に、増殖因子として塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を用い、足場素材としてコラーゲン膜やキチン膜などのシート状の薄膜を用いた治療例がいくつか報告されている（非特許文献１〜３）。また、ｂＦＧＦを含むコラーゲンの円筒状部材を用いた外耳道再建用形成品が記載されている（特許文献２）。

外科手術によらない他の鼓膜再生法として、羊膜で鼓膜穿孔部を被覆し、フィブリン糊で接着させる方法が報告されている（非特許文献２）。

しかしながら、従来の再生医学的な治療法の有効性は、比較的小さな鼓膜穿孔や外耳道欠損に限定され、ある程度以上の大きな鼓膜欠損や耳小骨にかかる欠損がある場合は、修復不可能なため適応外であった。

一方、ゼラチンスポンジは手術時の止血剤として用いられているが、耳疾患の治療における薬剤の徐放性担体としても使用されている（特許文献３）。

国際公開第２００６／００７４１７号パンフレット 特開２００７−１２５２５２公報 米国特許出願公開第２００７／０１６０６４８号明細書

白馬ら，日本耳鼻咽喉科学会会報，110巻，4号，p.261，2007年 白馬ら，頭頸部外科，16巻，1号，p.9-13，2006年 二井ら，日本耳鼻咽喉科学会会報，110巻，4号，p.299，2007年

従来、外科手術に頼らざるを得なかった大きな鼓膜穿孔や外耳道軟部組織欠損をも修復可能な、再生医学的な手法による鼓膜および外耳道再生法の開発が切望されている。したがって、本発明の目的は、欠損部の大きさや位置に関係なく欠損を修復しうる、新規な鼓膜・外耳道再生剤を提供することである。

本発明者は、上記の目的を達成すべく鋭意検討を重ねた結果、従来の手法はいずれも、鼓膜穿孔または外耳道軟部組織欠損部に張り付けたシート状の足場素材の底面に沿って周囲組織を伸ばし、欠損部を修復しようというものであることに着目した。元来膜状である組織を再生させることを目的とするのであるから、シート状の素材を足場として用いるという発想は、一見合理的であるように思える。しかし、鼓膜穿孔または外耳道軟部組織欠損が平面的な部位のみであれば、これでも修復可能であろうが、鼓膜の形状は複雑で、しかも耳小骨が付着するため、鼓膜欠損が大きくなればなるほど平面的なシート状の素材で全体を覆うのは困難になる。完全に欠損部を覆うことができなければ、鼓膜の修復は不可能となるか、周囲組織との癒着が生じ後遺症を残す。外耳道軟部組織に関しても同様である。
以上の理由から、本発明者は、シート状の素材を用いるという従来の発想を転換し、欠損部位全体を立体的に覆うことが可能な素材を用いることを重視して、ゼラチンスポンジを足場材として採用した。すなわち、ｂＦＧＦ溶液を含浸させたゼラチンスポンジを、鼓膜または外耳道の欠損部を覆うように留置した。ゼラチンスポンジはコラーゲンを分解したもので、コラーゲンと比較して隙間がおおく自由度の高い素材であるため、細胞が成長する足場として機能する一方で、細胞の伸長する方向を妨げないという特質がある。したがって、従来のように再生組織がシート状素材の底面に沿って伸長するのではなく、ゼラチンスポンジ内部に再生組織が侵入して伸長することを目的としている。
さらに、その際、フィブリン糊またはアルギン酸もしくはその塩をスポンジ表面に適用して、該スポンジを欠損部に被覆固定した。組織再生用基材を生体接着材を用いて周辺組織に固定する手法は知られているが、本発明者は、単なる接着剤としてではなく、再生部位を外部と遮断し、生体内培養の良好な環境を創出するという目的で、スポンジ表面を被覆材料で被覆した。また同様の観点から、鼓膜穿孔や外耳道軟部組織欠損の辺縁部が陳旧化している場合には、メスあるいはタンパク質変性薬剤などにより辺縁部の新鮮化を行った。
その結果、従来法では適応外であった、2/3以上を欠損する鼓膜穿孔や創部径が2cmを超える外耳道軟部組織欠損であっても、すべての症例で欠損の閉鎖および聴力の改善が認められる一方、後遺症は観察されなかった。
以上より、本発明者は、ｂＦＧＦを担持したゼラチンスポンジと被覆材料とを組み合わせて用いることにより、従来は外科手術に頼らざるを得なかった重度の鼓膜穿孔および外耳道軟部組織欠損患者に対しても、安価で、簡便かつ安全に、鼓膜および外耳道の再生が可能であることを確認して、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］塩基性線維芽細胞増殖因子を担持したゼラチンスポンジを含有し、被覆材料と組み合わせてなる、鼓膜または外耳道再生剤。
［２］被覆材料がフィブリン糊または水溶性高分子多糖類もしくはそれらの誘導体である、［１］記載の剤。
［３］水溶性高分子多糖類がキチン、キトサン又はアルギン酸もしくはその塩である、［２］記載の剤。
［４］鼓膜穿孔または外耳道軟部組織欠損の辺縁部が新鮮化されていることを特徴とする［１］から［３］のいずれかに記載の剤。
［５］治療上有効量の塩基性線維芽細胞増殖因子を坦持したゼラチンスポンジを、鼓膜穿孔または外耳道軟部組織欠損患者の鼓膜穿孔または外耳道軟部組織欠損部に留置し、被覆材料で被覆することを含む鼓膜または外耳道の再生方法。
［６］被覆材料がフィブリン糊または水溶性高分子多糖類もしくはそれらの誘導体である、［５］記載の再生方法。
［７］水溶性高分子多糖類がキチン、キトサン又はアルギン酸もしくはその塩である、［６］記載の再生方法。
［８］鼓膜穿孔または外耳道軟部組織欠損の辺縁部を予め新鮮化させておくことを特徴とする［５］から［７］のいずれかに記載の再生方法。
［９］鼓膜または外耳道再生剤を製造するための、被覆材料およびゼラチンスポンジに担持させた塩基性線維芽細胞増殖因子の使用。
［１０］被覆材料がフィブリン糊または水溶性高分子多糖類もしくはそれらの誘導体である、［９］記載の使用。
［１１］水溶性高分子多糖類がキチン、キトサン又はアルギン酸もしくはその塩である、［１０］記載の使用。
［１２］鼓膜穿孔または外耳道軟部組織欠損の辺縁部が新鮮化されていることを特徴とする［９］から［１１］のいずれかに記載の使用。

ゼラチンスポンジを足場素材として用いることで、鼓膜や外耳道の欠損部位全体を立体的に覆うことが可能となり、完全に欠損部を覆うことができる。また、鼓膜組織はゼラチンスポンジの内部を進んで再生する。したがって、本発明によれば、大規模もしくは複雑な欠損であっても、鼓膜や外耳道の修復が可能となる。
また、ゼラチンスポンジ表面を被覆材料でカバーすることで、乾燥や感染を防ぎ、外部と隔絶された良好な培養環境を作り出すことができる。
さらに、ゼラチンスポンジは生体内では1か月以内に加水分解されて消失し、鼓膜および外耳道軟部組織再生に有利に働く。

本発明の鼓膜再生剤を用いた鼓膜再生治療の一例を示す図である。Ａ．鼓膜の約2/3に及ぶ大穿孔を認める。Ｂ．鼓膜穿孔縁を鼓膜切開刀にて傷をつけ、全周性に新鮮創を形成。Ｃ．bFGF担持ゼラチンスポンジを穿孔部に留置し、フィブリン糊で固定。Ｄ．処置3週間後。上皮により鼓膜穿孔完全閉鎖。Ｅ．処置6週間後。上皮がやや薄くなり、より鼓膜に近いものとなる。Ｆ．処置12週間後。さらに、正常の鼓膜に近いものとなる。 本発明の外耳道再生剤を用いた外耳道再生治療の一例を示す図である。Ａ．真珠腫を除去した創部は軟部組織の欠損と骨露出が認められる。Ｂ．ゼラチンスポンジ塊にbFGFを含浸させ、創部を十分覆うようにbFGFゼラチンスポンジ塊を留置。Ｃ．アルギン酸またはその塩（あるいはフィブリン糊）で固定。Ｄ．処置2週間後。表面に残ったアルギン酸またはその塩などを除去すると、創部が完全に閉鎖され、正常組織に近い状態で再生がなされていることが確認できた。

本発明の鼓膜・外耳道再生剤に用いられる増殖因子ｂＦＧＦは、細胞への直接増殖効果と血管増殖効果とを有する。鼓膜は3層構造を有しており、本来の伝音機能を最大限に発揮するためには、この3層構造の維持が重要である。しかし、鼓膜が破れ自然治癒する場合、3層構造が維持されないまま上皮層のみが再生された薄い鼓膜をしばしば経験する。
その再生には足場としての線維芽細胞の増殖と3層構造を支える十分な血流の維持が不可欠である。この観点からｂＦＧＦは理想的な要素を備えている。すなわち、その名が示すとおり、線維芽細胞を増殖する直接作用を有し、また、血管を誘導して周囲組織に栄養を供給する作用を兼ね備えているからである。

本発明におけるｂＦＧＦとしてはその同族体を用いてもよい。本発明におけるｂＦＧＦおよび／またはその同族体は、天然あるいは遺伝子組換え技術により微生物または培養細胞に産生させたものから単離精製することにより、あるいはそれらを化学的修飾または生物的修飾することにより得られる。本発明で用いるｂＦＧＦとしては、特にヒトｂＦＧＦまたはその同族体が好ましい。
ｂＦＧＦの同族体とは、下記〔Ｉ〕または〔ＩＩ〕のポリペプチドを意味する。
〔Ｉ〕哺乳動物で産生されるｂＦＧＦと実質的に同一のアミノ酸配列からなるポリペプチド。ここで「実質的に同一のアミノ酸配列」とは、アミノ酸配列中の１〜６個のアミノ酸が別種のアミノ酸により置換されたものでｂＦＧＦの生物活性を有するものを意味する。〔ＩＩ〕哺乳動物で産生されるｂＦＧＦのＮ末端および／またはＣ末端、あるいは上記〔Ｉ〕のポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に、追加のアミノ酸セグメントが追加されたポリペプチド。追加のアミノ酸セグメントとは、１〜１２個のアミノ酸からなり、ｂＦＧＦの生物活性または上記〔Ｉ〕のポリペプチドの生物活性を損なわないものを意味する。

ヒトｂＦＧＦはアミノ酸１４６個のポリペプチドであるが、本発明の製剤においては、ヒトｂＦＧＦの同族体（前記〔Ｉ〕の同族体）として、例えば特表平２−５０４４６８号公報に記載のアミノ酸１４６個のポリペプチドを用いてもよい。このポリペプチドは、ヒトｂＦＧＦのアミノ酸配列を構成する６９位のシステイン（Ｃｙｓ）および８７位のシステイン（Ｃｙｓ）がそれぞれセリン（Ｓｅｒ）により置換されたものである。
また、前記〔ＩＩ〕の同族体として、例えば特表昭６３−５００８４３号公報に記載のアミノ酸１５５個のポリペプチドを用いてもよい。このポリペプチドは、ヒトｂＦＧＦのＮ末端にアミノ酸９個のセグメントが付加されたものである。
また、Ｎ末端にＭｅｔ−が付加されたアミノ酸１４７個のポリペプチドや、特表昭６３−５０１９５３号公報に記載のＮ末端にアミノ酸１１個からなるセグメントが付加されたアミノ酸１５７個のポリペプチドを用いてもよい。
特に好ましいｂＦＧＦとしては、トラフェルミン（遺伝子組換え）が挙げられる。

本発明の製剤においては、一種類のｂＦＧＦを単独で使用してもよいし、複数種を併用してもよい。さらに、前述したように、ｂＦＧＦの同族体は複数種あるが、これらの同族体についても、それぞれを単独で使用してもよいし、併用してもよい。

なお、生体内におけるｂＦＧＦの存在量は極微量であるため、本発明の製剤を商業的に安定して供給する上からは、遺伝子組換え技術により大腸菌等の微生物または培養細胞に産生させたｂＦＧＦまたはその同族体を使用することが特に好ましい。ｂＦＧＦまたはその同族体（この場合は一般に前記〔Ｉ〕のポリペプチド）を産生させるための遺伝子を微生物または培養細胞に組み込んだ場合、この微生物または培養細胞から産生されるものは、一般に、ｂＦＧＦのＮ末端および／またはＣ末端、または上記〔Ｉ〕のポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に、追加のアミノ酸セグメントが付加したもの、すなわち前述した〔ＩＩ〕のポリペプチドである。

本発明におけるゼラチンスポンジの原料となるゼラチンの種類には特に制限はなく、通常入手できるものでよい。例えば、ウシ、ブタ、ニワトリ、サケ等の骨、じん帯、腱、皮膚を酸またはアルカリで処理して得た粗コラーゲンを、水で加熱抽出したもの等が挙げられる。ゼラチンは、一種類のみではなく、原料や、溶解性、分子量、等電点等の物性の異なるものを適宜混合して用いてもよい。

本発明で用いられるゼラチンスポンジは、形状の複雑な鼓膜の穿孔縁や外耳道欠損の辺縁部を完全に被覆し得る程度の柔軟性を失わない範囲で、鼓膜や外耳道の欠損を閉鎖するのに十分な期間、再生組織の足場としての役割を果たせるように、耐水性を高めるべく架橋されていてもよい。架橋方法は特に限定されないが、例えば、架橋剤を用いる方法、真空熱脱水法、乾熱法、γ線照射法、紫外線照射法、電子線照射法、Ｘ線照射法などが挙げられる。

本発明のゼラチンスポンジは、多数の微細小孔を有しコラーゲンと比較して自由度の高いものである。多数の微細小孔を有することにより、足場素材として用いる場合に、周辺の細胞が容易にスポンジ内部に進入することができ、良好な鼓膜および外耳道の再生が可能となる。これは、従来のシート状の足場素材を用いた再生剤と根本的に異なる点である。すなわち、シート状のコラーゲン膜のような足場に対しては、組織はその足場の内部を進んで再生することはなく、上方か、下方かのいずれかに沿って再生する。これでは、ある程度以上の大きさの鼓膜欠損に対しては完全に欠損部を覆うことはできず、鼓膜の修復が不可能となるか、周囲組織との癒着が生じて後遺症を残す。

本発明のゼラチンスポンジの微細小孔の平均孔径は、スポンジ内部へ細胞が容易に進入して良好な細胞接着性が得られることを考慮すると約10μm以上であることが好ましく、低細胞密度による鼓膜や外耳道の再生率低下を防ぐためには約500μm以下であることが好ましい。より好ましい範囲としては、約100〜約400μmである。

本発明のゼラチンスポンジは、その機能に悪影響を及ぼさない範囲で、他の生体内吸収性高分子材料を含んでいてもよい。そのような生体内吸収性高分子材料としては、例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ−ε−カプロラクトン、乳酸−グリコール酸共重合体、グリコール酸−ε−カプロラクトン共重合体、乳酸−ε−カプロラクトン共重合体、ポリクエン酸、ポリリンゴ酸、ポリ−α−シアノアクリレート、ポリ−β−ヒドロキシ酸、ポリトリメチレンオキサレート、ポリテトラメチレンオキサレート、ポリオルソエステル、ポリオルソカーボネート、ポリエチレンカーボネート、ポリ−γ−ベンジル−Ｌ−グルタメート、ポリ−γ−メチル−Ｌ−グルタメート、ポリ−Ｌ−アラニン等の合成高分子；デンプン、アルギン酸、ヒアルロン酸、キチン、ペクチン酸及びその誘導体等の多糖類や、ゼラチン、コラーゲン、アルブミン、フィブリン等のタンパク質等の天然高分子等が挙げられる。

本発明のゼラチンスポンジは、例えば、ゼラチン水溶液を、ホモジナイザーを用いて約3000〜約10000rpmの回転数で約10秒〜約5分間攪拌して発泡させた後、該ゼラチン水溶液を適当な大きさの型枠に流延し、約-40〜約-80℃で約30〜約120分間凍結した後、この凍結物を、例えば約0.1Torrの条件で凍結乾燥することにより、製造することができる。ゼラチン水溶液の濃度が高すぎると、得られるゼラチンスポンジの柔軟性が低くなるので、例えば約3w/w%以下に調整することが好ましい。更に架橋が必要な場合には、適宜、架橋を施すことができる。

本発明のゼラチンスポンジとして、止血剤として市販されているもの（例えば、スポンゼル（登録商標）（アステラス製薬）、ゼルフォーム（登録商標）（ファルマシア・アップジョン）等）を用いることができる。

本発明のゼラチンスポンジの形状やサイズは、患者の鼓膜や外耳道の欠損部を覆うに十分な大きさであれば特に制限されない。

上記のようにして調製したゼラチンスポンジにｂＦＧＦを担持させる方法は特に限定されないが、例えば、ｂＦＧＦ水溶液をゼラチンスポンジに滴下するか、ゼラチンスポンジをｂＦＧＦ水溶液中に加えて膨潤させることができる。

ゼラチンスポンジに担持させるｂＦＧＦの量は、鼓膜または外耳道を再生させるのに十分な量であれば特に制限はないが、例えば、投与部位当たり約0.1〜約1000μg、好ましくは約1〜約100μgである。

上記のようにして得られたｂＦＧＦ担持ゼラチンスポンジ製剤は、凍結乾燥することもできる。凍結乾燥する場合には、例えば、液体窒素中で30分以上または-80℃で1時間以上凍結させた後に、凍結乾燥機で1〜3日間乾燥させることにより行う。

本発明の鼓膜・外耳道再生剤は、中耳・外耳に活動性の感染・炎症がない、鼓膜穿孔または外耳道軟部組織欠損患者であれば、いずれの症例に対しても適応可能である。例えば、鼓膜穿孔症例として、慢性中耳炎、鼓膜閉鎖術ないし鼓室形成術施行後の再穿孔、外傷性鼓膜穿孔陳旧、滲出性中耳炎による鼓膜切開ないし鼓膜チューブ留置後の穿孔遺残などが挙げられる。また、外耳道軟部組織欠損症例として、例えば、外耳道真珠腫切除、鼓室形成術または外耳道腫瘍切除後で、外耳道軟部組織の欠損と外耳道骨の露出のあるものが挙げられる。

本発明の鼓膜・外耳道再生剤は、とりわけ従来の再生医学的手法を用いた治療法の適応外であった、大きな穿孔・欠損を有する鼓膜穿孔または外耳道軟部組織欠損患者に対して好ましく用いられ得る。具体的には、鼓膜穿孔においては、鼓膜の1/3以上を欠損する患者、特に2/3以上を欠損する患者についても、鼓膜の修復が可能である。また、外耳道軟部組織欠損においては、最大径が1cm以上、特に2cm以上の欠損を有する患者についても、外耳道の修復が可能である。

ｂＦＧＦ担持ゼラチンスポンジは、鼓膜または外耳道の欠損部に応じて、それよりも大きいサイズに調整され、欠損部全体を覆うように留置される。ここで欠損部の辺縁が陳旧化している場合には、組織の再生を促進するために、辺縁部を新鮮化することが望ましい。新鮮化の方法としては、例えば、メスなどを用いて傷をつけるか、酢酸アルミニウムまたは高濃度の局所麻酔薬などタンパク変性効果のある薬剤で処理することにより、辺縁部の上皮を除去する方法が挙げられる。
この薬剤による方法は、外耳道の形状が狭く、鼓膜穿孔辺縁の新鮮化が困難な場合には特に有効で、まず酢酸アルミニウムを含むゼラチンスポンジを欠損部に留置し、約３０分後に除去。この後、４％塩酸リドカインで麻酔を施行したのち変性した辺縁部（白色に変色）の組織をできる限り除去することで、新鮮化が行える。

本発明は、欠損部に留置したｂＦＧＦ担持ゼラチンスポンジの表面を、被覆材料で被覆することをさらなる特徴とする。本発明で用いられる被覆材料としては、ｂＦＧＦ担持ゼラチンスポンジを鼓膜または外耳道の欠損部に固定しておくに十分な接着性を有し、且つ外部環境と隔絶させることで、該スポンジの表面および内部に再生組織の細胞にとって好適な培養環境を提供し得る、生体適合性の材料である限り、いかなるものでも使用することができるが、例えば、フィブリン糊（血液中のフィブリノゲンおよびトロンビン抽出物；ボルヒール（登録商標）（アステラス製薬）、ティシール（登録商標）（バクスター）、ベリプラスト（登録商標）（CSLベーリング）として市販されている）、アルギン酸またはその塩（例えば、アルギン酸カルシウム、アルギン酸ナトリウム）、キチン、キトサン等の水溶性高分子多糖類が挙げられる。

アルギン酸塩（アルギン酸カルシウム）を調製し、膜状に成型する方法としては、例えば、2%アルギン酸ナトリウム水溶液3.3mlを、10ml容ペトリディッシュの底面全体がこの水溶液に接触するように均一に流延する。その後、3%塩化カルシウム水溶液5mlを同じペトリディッシュ上に均一に広げ、アルギン酸ナトリウム水溶液と塩化カルシウム水溶液が十分に接触するようにした後、数分待つ。残存している液を除去後、蒸留水で洗浄し、自然乾燥させることによりアルギン酸カルシウム膜を調製する。乾燥後、膜を剥がし、適当な大きさに形成し、EOガス滅菌を施すことにより被覆材料として調製することができる。

該被覆材料が液体の場合は、欠損部に留置したｂＦＧＦ担持ゼラチンスポンジの表面に数滴を滴下したり、自体公知の噴霧器を用いてスプレーすること等により投与することができる。また、該被覆材料がシート状物質の場合、欠損部に留置したｂＦＧＦ担持ゼラチンスポンジの表面を被覆するように載置することができる。

以下、実施例を示して本発明をさらに具体的に説明するが、これらは本発明を何ら限定するものではない。

実施例１ 鼓膜再生
１）患者の選択
患者は、鼓膜穿孔を有し中耳・外耳に活動性の感染・炎症がないことを確認した慢性中耳炎症例（n=9）、鼓膜閉鎖術ないし鼓室形成術施行後の再穿孔症例（n=7）、外傷性鼓膜穿孔陳旧症例（n=5）、滲出性中耳炎による鼓膜切開ないし鼓膜チューブ留置後の穿孔遺残例（n=10）など種々の症例を含む。鼓膜穿孔の大きさは問わない。
鼓膜穿孔の大きさにより患者を3群に分類した。すなわち、鼓膜穿孔が1/3以下、1/3〜2/3、2/3以上に及ぶものをそれぞれGrade I、II、IIIとした。

２）処置方法と経過観察
鼓膜穿孔があり、かつ活動性の感染・炎症がないことを確認し、4%塩酸リドカインに浸した綿花を鼓膜穿孔部に当てるように外耳道内に挿入する。約15分後、顕微鏡下に、鼓膜穿孔縁に鼓膜切開刀などで傷をつけ、穿孔縁の上皮を全周性に除去した（図１Ｂ）。引き続き、鼓膜穿孔より大きなゼラチンスポンジ（スポンゼル（登録商標）：アステラス）塊にbFGF（フィブラスト（登録商標）：科研製薬）を含浸させ、鼓膜穿孔部位を十分覆うようにbFGF担持ゼラチンスポンジ塊を留置した（図１Ｃ）。この後、これをフィブリン糊（ベリプラスト（登録商標）：CSLベーリング）数滴で固定した。
処置後、患者に強い鼻すすりや鼻かみなど耳に圧力がかかるようなことをしないよう、また、洗髪、入浴時に耳に水が入らないように指導した。

3週後の診察では、表面に残った被覆材料およびゼラチンスポンジが固着しているので、これをローゼンの探針などで丁寧に除去すると、その下面に再生した鼓膜が認められた（図１Ｄ）。1回の処置で穿孔が閉鎖しない症例に対しては、同処置を繰り返し行った。
再生鼓膜は、この時点では肥厚しており血管に富んだ組織であるが、時間の経過とともに薄くなり（図１Ｅ）、約2か月で正常鼓膜と判別できなくなった（図１Ｆ）。

３）結果
本法によって26名31耳の鼓膜再生治療がなされた。その結果を表１に示す。結果は、閉鎖に要した処置回数、閉鎖率、聴力改善の程度、麻酔時間を除く処置時間、後遺症の有無を、穿孔の大きさ（Grade I〜III）ごとにまとめた。また、ｂFGFを使用せず、生理食塩水のみを浸したゼラチンスポンジを鼓膜穿孔部に留置した５症例の結果を表２に示した。

ｂFGFを使用せず、生理食塩水のみを浸したゼラチンスポンジでも若干の鼓膜閉鎖傾向を認めた。これは、足場の留置のみでも鼓膜の再生が促進されることを示しており、ごく軽度の鼓膜穿孔に対しては閉鎖が可能と考えられるが、鼓膜穿孔が大きい場合は、処置回数を増やしても閉鎖することはできなかった。
一方、ｂFGFを添加した場合、鼓膜穿孔の大きさにかかわりなくすべての症例で、鼓膜穿孔が閉鎖している。このことは、足場のみでは、細胞の再生に限界があることを示しており、ある程度以上の大きさの鼓膜穿孔症例に対しては、ｂFGFなど成長因子の添加が必要不可欠であると考えられる。また、聴力改善の程度も、鼓膜穿孔の大きさにかかわりなく、正常レベルにまで回復しており、機能的にも回復した鼓膜の再生がみられた。

実施例２ 外耳道軟部組織再生
１）患者の選択
患者は、外耳道真珠腫切除後（n=7）、鼓室形成術後（n=2）、外耳道腫瘍切除後（n=1）で、いずれも外耳道軟部組織の欠損と外耳道骨の露出を認めた症例である。欠損の大きさは問わない。

２）処置方法と経過観察
創部に活動性の感染・炎症がないことを確認し、局所麻酔を施行した。顕微鏡下に、外耳道真珠腫および外耳道腫瘍の症例では、外耳道内より真珠腫および腫瘍を切除した後、また、鼓室形成術後の外耳道骨露出症例では、メスなどで新鮮な創部を形成した後に、創部より大きなゼラチンスポンジ塊にbFGFを含浸させ、欠損部を十分覆うようにbFGF担持ゼラチンスポンジ塊を留置した（図２Ｂ）。この後、これをフィブリン糊数滴またはアルギン酸カルシウム膜で被覆した（図２Ｃ）。
患者には、耳かきの禁止や入浴、洗髪、洗顔時に外耳道内に水が入らないように指導した。

２、３週間後の診察では、表面に残った被覆材料およびゼラチンスポンジが固着しているので、これをローゼンの探針などで丁寧に除去すると、その下面に完全に再生した外耳道上皮および軟部組織が認められた（図２Ｄ）。１回の処置で再生が不十分である場合には、同処置を繰り返し行った。

３）結果
本法によって10症例の外耳道再生治療がなされた。その結果を表３に示す。結果は、閉鎖に要した処置回数、閉鎖率、麻酔時間を除く処置時間、後遺症の有無を、欠損の大きさ（Grade I〜III）ごとにまとめた。

本発明によれば、本格的手術処置を伴わず、外来での10分程度の処置のみで鼓膜穿孔および外耳道軟部組織欠損を治療することができるので、入院や頻繁な通院が不要となる。また、欠損の大きさや原因にかかわりなく、鼓膜・外耳道再生が可能であるので、従来の再生医学的手法では、治療適応外であった患者をも対象とすることができる。さらに、手技が簡単で、繰り返し処置しても後遺症がなく、まったく正常な鼓膜・外耳道の再生が可能である。また、処置直後より聴力が回復し、日常生活にも全く支障がない。したがって、患者の精神的・肉体的・時間的・経済的負担が軽減され、医療経済的にも極めて優れている。
本出願は、日本で出願された特願２００８−１６７７４４（出願日：平成２０年６月２６日）を基礎としており、その内容はすべて本明細書に包含されるものとする。

Claims (4)

1. 塩基性線維芽細胞増殖因子、ゼラチンスポンジおよび被覆材料を組み合わせてなる、鼓膜または外耳道再生剤であって、使用時、該ゼラチンスポンジは該塩基性線維芽細胞増殖因子を担持した状態で再生部位に留置され、該被覆材料は該再生部位を外部と遮断する、剤。
2. 被覆材料がフィブリン糊または水溶性高分子多糖類もしくはそれらの誘導体である、請求項１記載の剤。
3. 水溶性高分子多糖類がキチン、キトサン又はアルギン酸もしくはその塩である、請求項２に記載の剤。
4. 鼓膜穿孔または外耳道軟部組織欠損の辺縁部が新鮮化されていることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の剤。