JPH0563159B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） コラゲナーゼは硬蛋白質の一種であるコラーゲ
ンを分解する酵素であるが、例えば膠原病に罹患
すると血中のコラゲナーゼ活性が上昇するところ
から、血清のコラゲナーゼ活性を測定することに
より膠原病の検査を行なうことができる。本発明
はこのコラゲナーゼ活性を測定する試薬に関する
ものである。

（従来の技術） 血中のコラゲナーゼ活性が低いためにその測定
法は高感度でなければならない。従来、血中のコ
ラゲナーゼ活性は例えばラジオアイソトープを利
用して測定されていた。この方法は、例えば不溶
性コラーゲンにラジオアイソトープを標識し、こ
れを血清に加えて反応させる。そして、一定時間
後反応を停止させ、遠心してこの上清のラジオア
イソトープを測定するものである。

また、最近コラーゲンに蛍光物質を結合させ、
これを基質に用いてコラゲナーゼ活性を測定する
方法も報告されている（第23回日本臨床化学会大
会要旨録72頁）。

（発明が解決しようとする問題点） ラジオアイソトープを用いる方法は安全性の観
点から使用場所、使用方法等が厳しく制限され、
かつ操作が繁雑であつて大量検体の分析方法とし
ては不適当であつた。

また、蛍光物質を結合させた方法は未分解の基
質を除去しなければならないため操作が繁雑であ
るという問題点があつた。

（問題点を解決するための手段） 本発明者らはこれらの問題点を解決するべく
種々検討した結果、コラゲナーゼの基質に発光物
質とこの発光物質を発光させる物質とを結合さ
せ、この発光させる物質を励起させることにより
発光物質を発光させる方法を案出するに至り、こ
の基質を利用すれば基質を分解せずにかつ高感度
にコラゲナーゼの活性を測定できることを見出し
て本発明を完成した。

すなわち、本発明は、発光物質とこの発光物質
を発光させる物質とが結合された、測定のコラゲ
ナーゼによつて分解されうるペプチドよりなるコ
ラゲナーゼ活性測定用試薬に関するものである。

発光物質は後述の発光させる物質の作用によつ
て発光するものであればよく、例えば、フルオレ
ツセイン、4′，5′−ジトメキシフルオレツセイ
ン、ローダミン、Ｎ，Ｎ，N′，N′−テトラメチ
ルローダミン、Ｎ，Ｎ，N′，N′−テトラエチル
ローダミン、フルオレスクアミン、ダンシルクロ
ライド等の蛍光物質、ルミノール、イソルミノー
ル、アクリジニウム、これらの誘導体等の化学発
光物質などを利用できる。

発光物質を発光させる物質（以下、励起物質と
いう。）の発光させる手段は問うところではなく、
例えば励起物質の発光体であつて、エネルギー移
動等により発光物質を励起して発光させる物質
（以下、励起発光物質という。）あるいは触媒作用
により発光物質を発光させる物質などを利用する
ことができる。

励起発光物質の種類は励起対象の発光物質に応
じて定まるが、この励起発光物質は前記の発光物
質のなかから選択すればよい。発光物質と励起発
光物質の組合せの例としては、フルオレツセイン
とローダミン、フルオレツセインとイソルミノー
ル、ローダミンとルミノールなどを挙げることが
できる。

触媒作用により発光物質を発光させる物質の例
としては、ルミノール、H₂O₂に対するパーオキ
シダーゼ、イソルミノール、H₂O₂に対するマイ
クロパーオキシダーゼなどを挙げることができ
る。

発光物質及び励起物質を結合させるペプチドは
測定対象のコラゲナーゼによつて分解されうるも
のである。このペプチドは通常はコラーゲンであ
る。コラーゲンは種々の動物由来のものがあり、
さらに最近はペプチド合成によつて得ることもで
きるがその種類を問わない。

発光物質及び励起物質をペプチドに結合させる
方法は双方の官能基を考慮して決定すればよい。
官能基は、アミノ基、カルボキシル基、水酸基、
チオール基、イミダゾール基、フエニル基などを
利用することができる。これらの官能基として
は、ペプチドはヒドロキシプロリン残基等の水酸
基、リジン残基等の塩基性アミノ酸残基のアミノ
基、アスパラギン酸残基やグルタミン酸残基のカ
ルボキシル基、システイン残基等のチオール基、
ヒスチジン残基等のイミダゾール基、フエニルア
ラニン残基等のフエニル基などを挙げることがで
きる。一方、発光物質及び励起物質には必要によ
り予めアミノ基やカルボキシル基を導入しておく
のがよい。これらの官能基を結合させる方法とし
ては、例えばアミノ基相互間を結合させる場合に
は、ジイソシアネート法、グルタルアルデヒド
法、ジフルオロベンゼン法、ベンゾキノン法等数
多く知られている。また、アミノ基とカルボキシ
ル基との間を結合させる方法としては、カルボキ
シル基をサクシンイミドエステル化する方法のほ
かカルボジイミド基、ウツドワード試薬法等が知
られており、アミノ基と糖鎖を架橋する過ヨウ素
酸酸化法（Nakano法）もある。チオール基を利
用する場合には、例えばもう一方の側のカルボキ
シル基をサクシンイミドエステル化してこれにシ
ステインを反応させてチオール基を導入し、チオ
ール基反応性二価架橋試薬を用いて双方を結合す
ることができる。フエニル基を利用する方法とし
てはジアゾ化法、アルキル化法などがある。結合
方法はこれらの例示に限られるものではなく、こ
のほか例えば「Method in Immunogy and
Immunochemistry」（C.A.Williams et al，
1976，Academic Press，N.Y.）あるいは「酵素
免疫測定法」（石川ら・医学書院、1978年）等の
成書に記載されている方法のなかから適宜選択し
て利用することができる。発光物質及び励起物質
はいずれもなるげく多く結合させることが好まし
い。発光物質と励起物質の結合モル比は通常は
１：１であるが励起効率などを考慮して適宜変更
される。発光物質と励起物質を結合させる順序は
問うところではなく、いずれが先であつてもよ
く、また両方を同時に結合させてもよい。反応
後、ゲル過法、イオン交換クロマトグラフイ
ー、アフイニテイークロマトグラフイーなどを適
宜組み合わせて精製を行ない、必要により凍結乾
燥法等で乾燥する。

本発明の試薬を用いてコラゲナーゼの活性を測
定する方法としては、この試薬を適宜濃度の溶液
とし、検体のコラゲナーゼ溶液を加えて酵素反応
させ、発光物質を発光させて蛍光光度計などで測
定すればよい。励起物質に励起発光物質を用いた
ときには励起発光物質の発光を測定して消光度を
求めてもよい。

反応温度及びPHは、コラゲナーゼが最も作用し
やすいところが好ましく、通常20〜45℃程度、PH
５〜8.5程度が適当である。PHを一定に保つため
に緩衝液を用いることは好ましい。反応時間は通
常５〜60分間程度でよい。

発光物質を発光させる方法は公知の方法によれ
ばよく、例えば励起発光物質を利用する場合には
この励起発光物質の励起光を照射すればよい。

測定はレートアツセイによつて行なつてもよ
く、終点法によつて行なつてもよい。

本発明の試薬で測定しうるコラゲナーゼの種類
は特に制限されるものではないが、本発明の試薬
はコラゲナーゼの活性を高感度で測定できるとこ
ろから例えば血中のコラゲナーゼ活性の測定用試
薬として好適である。

（作用） 本発明の試薬の作用をペプチドに２種の蛍光物
質（L1，L2）を結合させた場合を例に述べると、
コラゲナーゼが作用する前はL1の励起光を照射
するとこのL1が励起され、L1の光増感このL1か
らL2にエネルギー移動が起つてL2が励起され、
L2から蛍光が発せられる。試薬のペプチドがコ
ラゲナーゼによつて分解されるとL1とL2の間の
距離が大きくなつてしまうためL1によるL2の励
起がほとんど起らなくなり、従つてL2からの蛍
光を生じなくなる。L1からの蛍光とL2からの蛍
光は波長が異なるところから反応液について特別
な分離操作を行なわなくともL1またはL2からの
蛍光を区別して測定でき、従つてペプチドの分解
量を求めることができる。

（発明の効果） 本発明の試薬は単にコラゲナーゼを接触せしめ
るだけでよく、光度計などの測定機器の感度が高
いとろこからコラゲナーゼの活性を高感度で測定
できる。操作方法が簡単なところから特に臨床分
析など大量検体の検査することができる。

（実施例） 実施例 １ Pro−Gln−Gly−Ile−Ala−Gly−Gln−Ｄ−
Arg−PHの合成コラーゲン100mgを10mlの
0.5MNa₂CO₃緩衝液PH9.5に溶かし、これにフル
オレツセインイソチオシアネート20mgを含む
DMF溶液500μlを加えて４℃で６時間反応させ
た。この反応液を充分水洗したセフアデツクスＧ
−25カラムに流してゲル過し、未反応のフルオ
レツセインを除去した。次に、アミノ化ローダミ
ン20mg及び水溶性カルボジイミド20mgをこのフル
オレツセイン結合合成コ−ラゲン溶液10mlに加
え、PHを4.5〜5.0に維持しながら室温で２時間反
応させた。反応液を0.2MNaCl及び5mMCaCl₂を
含む0.2Mトリス−HCl緩衝液PH7.8で平衡化した
セフアデツクスＧ−25カラムに流して未反応のア
ミノ化ローダミン及び水溶性カルボジイミドを除
去し、目的の基質を得た。

5.0mg／mlのこの基質溶液２mlに血清100μlを加
えて37℃で反応させた。反応中５分ごとに波長
470nmの励起光を照射し、580nmの蛍光を測定し
た。

得られた結果を第１図に示す。

実施例 ２ 可溶性ヒト胎盤コラーゲン（シグマ社製品）
100mgを0.5M炭酸緩衝液PH9.5に溶かし、これに
フルオレツセインイソチオシアネート及びローダ
ミンイソチオシアネート各５mgを含む0.1M炭酸
緩衝液PH9.51mlを加えて０℃で６時間反応させ
た。この反応液を予め0.2MNaCl及び5mMCaCl₂
を含む0.2Mトリス−塩酸緩衝液PH7.8で平衡化し
たセフアデツクスＧ−25カラムでゲル過して未
反応の上記蛍光物質を除去し、目的の基質を得
た。

この基質１mgを含む溶液１mlに血清50μlを加え
て37℃で反応させ、波長470nmの励起光を照射し
て550nm及び580nmの各蛍光の変化を測定した。

得られた結果を第２図に示す。図中、白丸及び
点線は550nmの蛍光強度の変化を、そして黒丸及
び実線は580nmの蛍光強度の変化をそれぞれ示し
ている。

【図面の簡単な説明】

図面はいずれも本発明の試薬を用いて得られた
結果を示すものであり、第１図は反応時間と蛍光
強度の変化を、そして第２図は血清希釈率と蛍光
強度の変化をそれぞれ示している。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 発光物質とこの発光物質を発光させる物質と
   が結合された、測定対象のコラゲナーゼによつて
   分解されうるペプチドよりなるコラゲナーゼ活性
   測定用試薬 ２ 発光物質が蛍光物質である特許請求の範囲第
   １項記載のコラゲナーゼ活性測定用試薬