JPH05508863A - セラミドを使用して細胞分裂を誘導する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 セラミドを使用して細胞分裂を誘導する方法関連出願の相互参照 本出願は１９９０年８月１３日出願の同時係属出願第５６６、９７８号の一部継 続出願であり、同出願の内容はここで参照したことによって本明細書中に記載さ れているものとする。

発明の分野 本発明は細胞分裂を誘導するための化合物および方法の分野に関するものである 。さらに詳細には、本発明は細胞分化を誘導するだめの、および異常な細胞増殖 を特徴とする状態の治療のための、セラミドおよび誘導体の使用に関するもの本 明細書に開示する研究は国立衛生研究所補助金ＥＳ　００１５５およびＣＡ４６ ７３８により一部援助された。米国政府は本発明において一定の権利を有する。

発明の背景 多くのヒト悪性および非悪性疾患の目立った特徴の一つは細胞の過剰増殖である 。これらの疾患では、細胞が異常に速い速度で増殖する。癌性腫瘍および白血病 に認められる細胞の成長と分裂は抑制不可能であり、体内でのこれらの細胞の急 速な進展はこのことにより一部説明される。同様に、乾せんのような幾つかの非 悪性疾患でも、細胞は異常に速い速度で成長・分裂する。これらの疾患では過剰 増殖細胞は比較的未分化の状態で認められる。未分化の細胞は成長・分裂が可能 である。しかし細胞が一旦分化すると、増殖能力を失う。細胞増殖を停止させる ために細胞分化を誘導し、それによって疾患を抑制することを目的とした幾つか の治療法が提案されている。

最近、スフィンゴ脂質は細胞の成長、癌化、および分化に重要な役割を果たして いることが明らかにされた（ワイ・ニー・ハンナン（Ｈａｎｎｕｎ．Ｙ．Ａ．） およびアール・エム・ベル（Ｂｅ１１．Ｒ．Ｍ．）（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３　：　５００−５０７）　５スフィンゴ脂質分解生成物は新しい種類の細 胞調節分子として浮上一つある。スフィンゴ脂質分解生成物であるスフィンゴシ ンおよびリゾスフィンゴ脂質は、細胞調節およびシグナル伝達にお番する中ＩＣ ・的な酵素であると信じられているプロティンキナーゼＣを阻害する（ワイ・ニ ー・）１ンナン（Ｈａｎｎｕｎ．Ｙ．Ａ．）（１９８６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ ｍ．２旦１：１２６０４−１２６０９）、　スフィンゴ脂質およびリゾスフィン ゴ耳旨質４ま種々の哺乳動物細胞において重要な細胞反応に影響を与え、そ己て 抗腫瘍プロモーター活性を示ｔ　（ワイーエーー／＼ンナン（Ｈａｎｎｕｎ，Ｙ ．Ａ．）（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３５：６７０−６７４：クイ−１−− ／ｎ，　Ｙ．　Ａ．　）ら（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：１３ ６２０−１３６２６　：イー・ウィルソン（Ｗｉ　１　ｓｏｎ，　Ｅ．　）ら（ １９８７）Ａｒｃｈ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２５９：２０４−２１４）。

１９８７年１２月１日発行のキャトシンプーラス（Ｃａｔｓ　ｉｍｐｏｏｌａｓ ）に対する米国特許第４，７１０．４９０号は、脈管形成作用を持つ分子を含む 月旨質を含有する組成物を開示する。この脂質は哺乳動物、と（１；大網番；由 来する。

既知の脂質たとえばガングリオシドとの混合物もまた脈管形成作用を有する。こ の組成物はインビトロとインビボで血管の成長を刺激した。ガング１ノオシド１ よ最大の脈管形成作用を有するのに対し、セラミド誘導体のような糖月旨質１ヨ １よとんどまたは全く作用を持たない。

１９８７年６月１６日発効のキャトシンプーラス（Ｃａｔｓ　ｉｍｐｏｏｌａｓ ）に対する米国特許系４，６７３．６６７号は、哺乳動物の大綱抽出物Ｉこ由来 するプラスミン阻害物質を開示する。この物質は脂質成分を有する。ガング１ノ オシドは最大のプラスミン抑制活性を示した。種々のセラミドまた（まセラミド 誘導体の試料が有するプラスミン阻害活性は全く無いかご（わずかであった。

１９８９年４月１２日公告の日本国特許出願第Ｈｌー９３５６２号（ま腫瘍の治 療に有用なスフィンゴシン誘導体を開示している。

１９８９年３月２８日発効のベル（Ｂｅｌｌ）ｌ二対する米国特許第４．８１６ 。

４５０号は、プロティンキナーゼＣの阻害に有用な長鎖塩基、一般（こスフィン ゴシンおよびスフィンゴシン誘導体を開示する。プロティンキナーゼの活性イヒ １よ、腫瘍のプロモーション、細胞の悪性化、および抗腫瘍剤１′−よる抑制御 作用の理解Ｉ：不可欠であることが確認されている。

細胞分化を誘導するインターフェロンは腫瘍治療薬としての可能性を試験された 。同様に、ヒト骨髄性白血病細胞系であるＨＬ−６０細胞の分化を誘導するビタ ミンＤ、ちまた、腫瘍治療薬としての可能性を試験された。ビタミンＤ３は細胞 分化を誘導できるが、それに要する大量のビタミンＤ３は体内のカルシウム代謝 を容認できないほど妨害することから、この化合物を腫瘍の治療に使用すること は実現性がない。

細胞の過剰増殖を特徴とする疾患の治療法を開発する努力がなされた１こもか力 λわらず、これらの疾患の治療法は依然として必要である。したがって、細胞分 化を誘導するための方法および組成物を提供することが、本発明の目的である。

細胞の表現型を変えるための方法および組成物を提供することも本発明の目的で ある。さらに、細胞の過剰増殖を特徴とする疾患の治療のための方法および組成 物を提供することも本発明の目的である。さらに、異常な細胞分化を特徴とする 哺乳動物の疾患または異常な状態の予防および寛解のための方法および組成物を 提供することも、本発明のもう一つの目的である。本発明のその他の目的は、本 明細書および付属する請求の範囲を検討することにより明らかになるであろう。

発明の概要 本発明は細胞分化を誘導するための組成物および方法を提供する。また本発明は 、細胞の表現型を変えそして細胞の過剰増殖を特徴とする疾患を治療するための 方法および組成物も提供する。本発明の方法では、化合物は哺乳動物、通常ヒト の患者に、治療に有効な量投与され、かかる化合物は構造式Ｉを持つ。

Ｒ４−ＣＣ−ＣＨ２０ＨＩ 式中のＲｏはＣ１から約Ｃ２゜までのアルキル基またはアルケニル基：Ｒ２はヒ ドロキシル基またはアル−キシ基またはＨ：Ｒ１はＨまたは低級アルキル基： Ｒ４はＣ０Ｒ５、ＳＯ２Ｒ５またはＣ３Ｒ，であり、ここでＲ５はＣＩから０２ ゜までのアルキル基、アルケニル基またはアルキニル基であって、これらの基は ＯＨ，，５ＨＳＯＲｓ　、ＳＲｓ　、ＮＲｔ　Ｒａ　、Ｃ０ＯＲ＊　、およびＣ ＯＮ　Ｒ１ｏ　Ｒａの各官能基のうち１１１！以上と置換されていてもよく、た だしＲｅ　、Ｒ７、Ｒａ　、Ｒ１、およびＲ１゜は独自に、約１０個までの炭素 を使用するＨ、アルキル基、アリール基、アルカリル基、およびアリールアルキ ル基とする。

本発明の化合物は、細胞の過剰増殖が存在するかまたは細胞分化の著しい障害が 存在する状態の治療に有用である。したがって、本発明の化合物および医薬製剤 は、細胞の分化を誘導するための医薬品の調製または製造またはその両方におい て有用である。

図面の簡単な説明 図１は、１．２５−　（ＯＨ）！　Ｄ、に反応したセラミドの用量依存性のグラ フを示す。

図２は、１．２５−　（ＯＨ）！　Ｄ３に反応したセラミドの質量増加の経時的 変化を示す。

図３は、ＨＬ−６０細胞が１．２５　（ＯＨ）ｔ　Ｄｓ処理に反応した総リン脂 質（Ａ）、ホスファチジルコリン（Ｂ）、およびスフィンゴミエリン（Ｃ）の質 量変化のグラフである。

図４は、Ｃ＋ｓ／Ｃｘセラミドおよび１ｎＭの１．２５　（ＯＨ）ｚ　ＤｓがＨ Ｌ−６０細胞分化を誘導する能力を示す。

図５は、Ｃ＋ａ／ＣｚセラミドがＨＬ−６０細胞の成長に及ぼす影響のグラフを 示す。

図６は、１．２５　（ＯＨ）！　Ｄｓが存在しない場合にＣｌａ／　Ｃｚセラミ ドがＨＬ−６０細胞の成長に及ぼす影響のグラフを示す。

図７は、Ｃ１，／Ｃ２セラミドにより誘導されたＨＬ−６０細胞分化の経時的変 化のグラフを示す。

図８は、細胞においてＣ＋ｓ／Ｃ２セラミドがＨＬ−６０細胞中のスフィンゴミ エリンの質量に及ぼす影響を示す。

図９および図１０は、ＣＩｌ／Ｃ２セラミドの一過性増加がＨＬ−６０細胞分化 に及ぼす影響のグラフを示す。

図１１は、（’Ｈ）ＣＩ８／Ｃ２セラミドのＨＬ−６０細胞への取り込みおよび 代謝の薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）薄層板の２４時間露光後のオートラジ オグラムを示す。

図１２は、［’Ｈ］Ｃ＋ｓ／Ｃ２セラミドのＨＬ−６０細胞への取り込みおよび 代謝を示す、ＨＬ−６０細胞から抽出した脂質のグラフを示す。

図１３は、１．２５−　（ＯＨ）２　Ｄｓにより誘導したＨＬ−６０細胞分化に 対するスフィンゴシンの影響のグラフを示す。

好ましい実施態様の詳細な説明 出願者は、セラミドおよびセラミド誘導体の投与により、骨髄性白血病細胞系で あるＨＬ−６０細胞の分化が誘導されることを発見した。セラミドまたはセラミ ド誘導体の投与は細胞の増殖を遅延し、そして細胞が正常な単球を示す分化した 表現型を呈するよう誘導する。この効果は他の型の細胞でも現れると信じられる 。

もとは急性骨髄性白血病患者から分離されたヒト細胞系ＨＬ−６０は、骨髄性細 胞の分化を研究するために頻繁に使用されている。これらの細胞は、ジメチルス ルフオキシドやレチノイン酸のような物質により処理したとき、顆粒球に成熟す るよう誘導され、またはホルボールエステルである１α、２５−ジヒドロキシビ タミンＤ、またはガングリオシドＧＭ３と共にインキュベートすると単球／マク ロファージ様細胞に成熟するよう誘導される。これらの化合物の大部分により起 こる成熟の機序は知られていない。ＨＬ−６０前白血病細胞系の特徴および分化 研究用の細胞モデルとしての使用の概説については、ニス・ジェイ・コリンズ（ ｃｏｌｌｉｎｓ、Ｓ、Ｊ、）（１９８７）Ｂｌｏｏｄ　ヱ０　：１２３３−１２ ４４を参照のこと。細胞の過剰増殖を特徴とする疾患の治療における本発明の化 合物の有用性を示すために、この良く知られた細胞モデルを使用した。

以前の研究（ティー（Ｔ）・オカザキら（１９８９年１１月１５日）Ｊ、Ｂｉｏ 　Ｉ、Ｃｈｅｍ、２６４　：１９０７６−１９０８０）　で、１．２５　（ＯＨ ）！Ｄ、によるＨＬ−６０細胞の分化にはスフィンゴミエリンの代謝回転が伴う ことが報告された。ＨＬ−６０細胞の抽出物中に検出される中性スフィンゴミエ リナーゼの活性は、１．２５−　（ＯＨ）ｚ　Ｄｓ処理により誘導され、この活 性にはセラミドおよびホスホリルコリンの生成が伴うことが明らかにされた。ス フィンゴミエリン、セラミド、およびホスホリルコリンのレベルは４時間以内に 基線レベルにもどり、これはスフィンゴミエリンの再合成期を示唆し、従ってス フィンゴミエリン回路が完成する。これらの結果は、細胞活性化のあいだに、不 活性の層化合物スフィンゴ脂質が活性代謝産物に変化するスフィンゴミエリン回 路が作動することを示していると思われる。ホスファチジルイノシトール回路と は異なり、スフィンゴミエリン代謝回転はより長時間にわたって起こり、そして より長期の細胞変化に関与する可能性がある。

少なくとも３００種類の異なるスフィンゴ脂質が種々の哺乳動物細胞型において 合成される。構造的には、スフィンゴ脂質は長鎖スフィンゴイド塩基、アミドと 結合した脂肪酸、および１位の極性頭部基（ｐｏｌａｒ　ｈｅａｄ　ｇｒｏｕｐ ）とからなる。１位にヒドロキシル基を持つセラミドおよびホスホリルコリン頭 部基を持つスフィンゴミエリンを除いて、他のすべてのスフィンゴ脂質は炭化水 素頭部基を持ち、そのためスフィンゴ糖脂質と呼ばれている。これらの中性脂質 は１個（セレブロシド）から２０個以上までのグルコース単位を持つのに対し、 酸性スフィンゴ糖脂質は１個以上のシアル酸残基（ガングリオシド）または硫酸 モノエステル基（スルファチド）を持つ。はとんどのガングリオシドおよび複合 糖脂質は、細胞膜の外層（ｏｕｔｅｒ　１ｅａｆｌｅｔ）に存在すると考えられ ている。しかしスフィンゴミエリンは細胞の内部にも存在する。

本発明への使用に適した化合物は天然に存在するものもあれば、合成により作ら れるものもある。構造式■を持つ化合物は本発明の医薬製剤への使用および方法 に適している。

Ｈ Ｒ１−Ｃ−Ｃ−ＣＨＩ　ＯＨＩ ３　Ｒ４ 式中のＲ４はＣ３から約Ｃ２゜までのアルキル基またはアルケニル基：Ｒ１はヒ ドロキシル基、アルコキシ基またはＨ：Ｒ１はＨまたは低級アルキル基： Ｒ４はＣ０Ｒ５またはＳｏ、Ｒ，まりｌｔｃ　Ｓ　Ｒｓ　テあり、ここでＲ３は ｃＩからＣＨまでのアルキル基またはアルケニル基またはアルキニル基であって 、これらの基はＯＨ，ＳＨ％ＯＲａ　、ＳＲｓ　、ＮＲｔ　Ｒｓ　、Ｃ０ＯＲ＊ 　、およびｃＯＮＲ１０Ｒ８の各官能基のうち１１１以上と置換されていてもよ く、ただしＲｓ　、Ｒｔ、Ｒ，、Ｒ，、およびＲＩｏは独自に、約１０個までの 炭素を使用するＨ、アルキル基、アリール基、アルカリル基、およびアリールア ルキル基とする。

化合物は細胞可溶性であること、すなわち細胞壁を通過して細胞の内部に入るこ とが可能であることが好ましい。Ｒ１とＲ４を合わせたとき、約１０個から２８ 個の炭素を持つ化合物がより好ましい。Ｒ８とＲ４炭素鎖の全長は、Ｒ１とＲ４ のそれぞれが少なくとも１個の炭素を含むならば、どのようなＲ１とＲ４の組み 合わせにも分けられる。たとえば、Ｒ，がＣ１で、Ｒ４がＣＩＺであってもよ（ 、またはＲ１がＣｌ１ｌでＲ４が０７であってもよい。この大きさの化合物はよ り容易に細胞膜を通過して細胞の内部に入ることが明らかにされている。

Ｒ１はＣ１から約Ｃ２゜までのアルキル基またはアルケニル基であることが好ま しく、ＣＩから約ｅｚｏまでのアルキル基もしくはＣ１から０１□までのアルキ ル基またはアルケニル基であることがより好ましい。Ｒ２はＨ１ヒドロキシル基 またはアルコキシ基であることが好ましく、ヒドロキシル基またはアルコキシ基 であることがより好ましい。好ましい実施態様の１例では、Ｒ２はメトキシ基で ある。

Ｒ１はＨまたは低級アルキル基（すなわちＣＩから０６までのアルキル基）であ ることが好ましく、Ｈがより好ましい。

Ｒ４はＣ０Ｒ５，５０２ＲｓまたはＣＳＲ，であることが好ましく、ただしＲ１ はＣＩからＣｏｏまでのアルキル基またはアルケニル基またはアルキニル基とし 、これらを官能基０ＨＳＳＨＳＯＲｓ　、ＳＲｇ　、ＮＲ７Ｒ８、ＣＯＯＲｅ　 、およびｃＯＮＲ＋。Ｒ８のいずれかに置換してもよく、ただしＲｅ　、Ｒｔ　 、Ｒｓ　、Ｒｅ、およびＲｌ　Ｏは独自に、Ｈ１低級アルキル基（すなわちＣＩ からＣ６）、およびＣ１からＣＩ□までのアリール基、アルカリル基、およびア リールアルキル基とする。

Ｒ４はＣ０Ｒ５であることがより好ましく、ただし、Ｒ３はＣ７からＣｏｏまで のアルキル基またはアルケニル基とする。適切なアリール基にはフェニル基、置 換フェニル基、およびピリジン基がある。適切なアリールアルキル基にはベンジ ル基およびフェネチル基がある。

好ましい化合物にはセラミド、Ｃ＋ｓ／Ｃ，セラミド、ＣＩ８／Ｃｍセラミド、 Ｃ１□／Ｃ，セラミド、および３−０−メチルスフィンゴシンがある。これらの 化合物の命名法は本明細書の実験の部で説明する。

本発明の化合物は細胞分化を誘導するために有用である。これらは哺乳動物、通 常ヒトの患者の分化可能な細胞に、細胞の分化の誘導に有効な量を投与する。

細胞分化、細胞の分化、および類似の用語が意図する意味は、細胞が成熟し、機 能細胞の特徴を獲得する生物学的過程である。分化のあいだに細胞はたとえば、 形態または特徴を獲得あるいは喪失し、物質と結合する能力または化学反応を行 なう能力を獲得あるいは喪失するだろう。分化を誘導するという用語の意図する 意味は、分化した表現型を得るために分化可能な細胞を操作する行為を言う。一 般に、哺乳動物の細胞は未熟な未分化の細胞として開始し、次いで分化し、その あいだに成熟・分化した細胞の特徴を獲得する。

構造式Ｉの構造を持つ化合物は、細胞の表現型を変化させるためにも有用である 。細胞の形態、行動、および生化学的活性を含めたその他の特徴は、一般に細胞 の表現型として知られている。本発明のこの実施態様では、本発明の化合物を哺 乳動物、通常ヒトの患者の形質転換した表現型を持つ細胞に、細胞の表現型を同 種の正常細胞が持つ表現型に変えるために有効な量投与する。細胞の「正常な」 表現型とは、形態、マーカー、成長、環境への反応、および調節のような従来か らの基準により正常と思われる細胞を意味する。悪性化した細胞とは、自然にま たは人工的操作により正常細胞から発生し、より未熟／未分化な表現型、成長亢 進、環境および細胞成長調節への無反応性またはほとんど無反応、動物モデルに 腫瘍を発生させる能力のような癌に類似した特性を獲得した細胞である。したが って細胞の表現型を変えるとは、化合物と結合し、酵素活性を発現し、そして環 境に反応する能力、および細胞のその他の特徴を含めた、細胞の少なくとも一つ の特徴を変える行為を意味する。

本光明の化合物は細胞分化を誘導し、そして細胞の表現型を変える能力を持つこ とから、このような化合物は、細胞の過剰増殖を特徴とする疾患、または細胞の 分化に重要な障害がある疾患の治療に有用であると期待される。細胞の過剰増殖 を特徴とする疾患には、疾患の結果または症候の一つが、障害細胞の異常増殖で ある疾患が含まれる。

細胞の異常増殖は、疾患が無い場合に存在する細胞の数と比較して、存在する細 胞の数が増加することにより一般に発現する。細胞の過剰増殖は正常細胞、異常 細胞、悪性細胞のいずれにも起こり得る。細胞の過剰増殖を特徴とする疾患には 、癌性腫瘍、白血病、非悪性腫瘍、乾せん、アテローム性硬化症、およびその他 の疾患がある。このリストはこのような疾患の例として挙げたもので、限定する ものではない。これらの疾患は共通して、悪性細胞（たとえば癌、白血病、およ びリンパ腫）または前悪性細胞（たとえばを髄形成異常）または良性細胞（たと えばリンパ増殖性、良性腫瘍、および乾せん）の増殖の亢進および異常により生 に起こる。本発明の化合物による細胞増殖の抑制は、これらの疾患の障害細胞の 成長を遅延して、かなりの治療効果およびおそらく治癒効果をもたらすだろう。

この型の多くの疾患では、未分化の細胞を持つことも特徴である。未分化細胞ま たは未分化表現型とは、成熟細胞に必要な生化学的および生理学的機能的特徴が 欠如しているため、成熟細胞のように通常機能できない未熟細胞を意味する。

細胞分化の過程のあいだに、未熟細胞は成熟細胞の生化学的および生理学的特徴 を発現し始める。たとえば、インビボで幹細胞は顆粒球および単球に分化する。

未分化細胞がより健常な表現型を持つ分化した細胞に変化できないことが、正常 機能の欠如の原因である。本発明記載の化合物が持つ分化を誘導する能力は、こ れらの細胞の亢進した増殖を弱めるうえに、そして細胞が正常細胞として機能で きるようにするために必要な生化学的特徴および表現型の特徴を獲得するうえに も役立つに違いない。たとえば乾せんの場合、本発明の化合物は乾せんの異常増 殖細胞の分化を誘導すると信じられ、その結果細胞が健康な皮膚に分化するにち がいない。同様にを髄形成異常では、これらの化合物は、初期の未分化骨髄性細 胞の分化を引き起こすどｐわれ、このことは、これらの疾患による主要な健康障 害、すなわち正常な良く分化した血液細胞の数の減少、と闘ううえに重要な役割 を果たすだろう。白血病、リンパ腫、およびその他の癌もまた、これらの悪性細 胞の分化を促進することにより治療できるだろう。分化した細胞は通常分裂でき ないことから、個々の細胞はもはや悪性クローンを補充できず、転移不可能なの で、分化の促進はこれらの疾患の治療に役立つ。

腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）とガンマインターフェロンはどちらもセラミドのレベル を上昇させること、およびセラミドはＨＬ−６０細胞分化に対するこれらの物質 の効果を仲介するらしいことにより、広範囲の新生物性疾患に対する本発明記載 の化合物の有用性が強力に裏付けられる。したがって、これらの化合物はＭ瘍壊 死および腫瘍退行を誘導するうえでも有用であると期待される。

セラミドおよび誘導体はリンパ球の成長を遅延することから、本発明の化合物は 哺乳動物、とくにヒトに免疫抑制を誘導するうえにも有用であると信じられる。

ステロイド、抗リンパ球抗体などのリンパ球の成長を抑制するその他の物質は、 免疫抑制を誘導するうえで重要な役割を果たしている。免疫抑制は、腎臓移植、 心臓移植、肝臓移植、およびその他の臓器移植に起こるような臓器拒絶において 、非常に重要である。また、ステロイドはセラミドを増加させるので、セラミド は免疫抑制剤としてのステロイドの効果に類似の効果を持つ可能性がある。細胞 と（にリンパ球の成長を遅延させることは、細胞の成長および細胞分裂の正常速 度を遅延するかまたは抑制することを意味する。したがって、細胞の成長を遅延 する化合物は、これらの細胞の成長および正常な機能の速度を遅延する効果を持 つ。

自己免疫疾患では自己反応性リンパ球の活性および増殖の亢進が特徴である。

リンパ球の成長を抑制すると思われるセラミドの能力は、自己免疫疾患の発病抑 制にかなり寄与すると期待される。コルチコステロイドはセラミドのレベルを上 昇させる。二と、およびコルチコステロイドは自己免疫疾患において治療的役割 を持つことから、本発明記載のセラミドおよびその他の化合物は、これらの疾患 におけるステロイドの作用を仲介する可能性があると現在では信じられる。

肥満もまた、体内の脂肪細胞の増殖および代謝の亢進を特徴とするらしい。本発 明の化合物はこれらの細胞の成長を遅延し、その結果肥満の減少に寄与する可能 性がある。腫瘍壊死因子はセラミドのレベルを上昇させることから、重要な関連 が生じる。ＴＮＦは悪液質の誘導において役割を果たしていると推定され、肥満 の治療法の候補とされている。セラミドは肥満の治療に有用であろうと現在では 信じられる。

アテローム性硬化症は、平滑筋細胞および内皮細胞の増殖の亢進およびおそらく 異常を特徴とするもう一つの疾患である。本発明記載の化合物の投与によりこれ らの細胞の成長を遅延することは、アテローム性硬化症の抑制に寄与するであろ うと期待される。

本発明の化合物は皮膚の老化防止剤としても有用であると期待される。皮膚の老 化防止剤への使用が知られているレチノイン酸は、皮膚細胞中のセラミドのレベ ルを上昇させる。レチノイン酸はセラミドのレベルを上昇させることから、セラ ミドはレチノイン酸の作用を仲介し、そして皮膚の老化防止剤に有用である可能 性がある。

本発明は、化学的予防、すなわち正常表現型から悪性化した表現型への細胞の変 化を防止または遅延するための細胞の治療、にも有用であるかもしれない。セラ ミドは悪性細胞およびその他の未分化の細胞の分化を誘導でき、したがって本発 明の化合物は、初期の（臨床的に検出不可能な）悪性細胞の増殖を誘導し、遅延 するうえで有用であると信じられる。これは強力な化学的予防剤を提供するであ ろう。同様に、レチノイン酸も化学的予防薬として有用であるかもしれず、した がって、レチノイン酸はセラミドのレベルを上昇させることから、本発明の化合 物はこの経路によっても化学的予防に有用である可能性がある。

本発明の化合物またはその薬学的に有効な塩またはその両方を、本明細書に記載 した状態および分化過程の欠損により起こるその他の状態に陥ったヒトのような 哺乳動物を治療するために使用できる製薬用組成物または医薬品に調剤できる。

製薬用組成物または医薬品は、治療に有効な量の本発明の化合物またはその薬学 的に容認できる塩またはその両方を含むことが好ましい。本発明の化合物は、疾 、叡を有するかまたは疾患を有すると疑われる哺乳動物に、単独で、または本発 明の他の化合物もしくは池の治療薬または緩和剤と併用して投与できる。本発明 の組成物はどのような方法、たとえば経口、非経口、皮肉、筋肉内、静脈内、皮 下、または局所投与によっても投与できる。実際の投与法は、既知の方法からの 類推により容易に決定でき、治療する特定の病的状態、その重症度、および患者 の年齢と状態により決まる。これらは錠剤、カプセル剤、またはエリキシル剤と して経口的に、もしくは溶液または懸濁液として非経口的に投与することができ る。

注射のために使用する溶媒は無菌液が好ましい。注射用溶媒としては、注射液の 場合に従来から使用されている安定剤、溶解補助剤、および緩衝剤のうちいずれ かまたは全部を含有する水を使用することが好ましい。好ましい添加剤にはたと えば酒石酸塩緩衝剤またはホウ酸塩緩衝剤、エタノール、ジメチルスルホキシド 、錯体形成剤（たとえばエチレンジアミン四酢酸）、粘性調節のための高分子重 合体（たとえばポリエチレンオキシド）、または無水ソルビタンのポリエチレン 誘導体がある。

本発明記載の化合物の総常用量（日用量、適用量、月用量など）は、障害細胞の 分化または細胞増殖の減少または治療する状態の改善もしくは安定化をもたらす 量とする。熟練者ならば、上記の範囲を出発点として特定の症例に使用するため の最適治療有効量を容易に決定できる。

疾患の治療のための組成物を調製または製造するとき、本発明記載の化合物また は化合物の生理学的に容認できる塩またはそれらの混合物を、生理学的に容認で きる賦形剤、キャリヤ、結合剤、保存剤、安定剤、香料、添加剤のいずれかまた は全部と共に、１単位の剤形に成形してよい。錠剤およびカプセル剤に使用でき る典型的な添加剤の例には、トラガカントゴム、アラビアゴム、コーンスターチ 、およびゼラチンのような結合剤、微結晶性セルロースのような賦形剤、コーン スターチ、前ゼラチン化デンプン、およびアルギン酸のような密封剤、ステアリ ン酸マグネシウムのような滑沢剤、ショ糖、乳糖、およびアスパルターゼのよう な甘味料、ペパーミントのような香料がある。その他の添加剤として、たとえば カプセル剤中の液体キャリヤとしての食用油、たとえば錠剤コーティング中のセ ラック、糖、およびそれらの複合物がある。

非経口注射液には有効成分を溶解または懸濁するための賦形剤として、水、ゴマ 油・ココナツ油・落花生油・綿実油のような天然植物油、およびオレイン酸エチ ルのような合成油を使用でき、必要に反応して緩衝剤、保存剤、および酸化防止 剤を含有してよい。

本発明の方法は、本発明記載の有効量の組成物を、細胞と直接接触させることに より実施できる。しかし、方法を間接的に実施すること、たとえば、本発明の化 合物のうちの１つの生成を誘導するインビボ活性を持つ化合物または組成物を投 与することによっても、本発明の範囲内で実施することができる。さらに、イン ビボで本発明の化合物に変化するプロドラッグ前駆体もまた、本発明の範囲に含 められる。

本明細書に記載する化合物の幾つかは、構造式Ｉを持つ化合物の炭素鎖中の炭素 原子の総数を反映するための、簡便な略称を付与されている。たとえば、ＣＩ。

／Ｃ２セラミドとは、ＲＩがＣｌ１ｌアルケニル基、Ｒ２がヒドロキシル基、Ｒ ３がＨ，Ｒ，がＣ０Ｒ５、Ｒｓがメチル基である構造式Ｉを有する化合物を言う 。Ｃ＋ｓ／Ｃｉセラミド中のＲ１の二重結合は、セラミド中の二重結合と同一位 置にある。したがって最初に表記した鎖には１８個の炭素があり、この鎖はＲ１ の炭素、Ｒ２が結合している炭素、Ｎが結合している炭素、および鎖の末端のＣ Ｈ，ＯＨ基を持ち、２番目に表記した鎖には２個の炭素、すなわちＲ４のアミド 基炭素とＲ３のメチル基炭素がある。化合物はこのように表記され、最初に表記 する炭素鎖はＲ１と、Ｒ，、Ｎ、およびＯＨが結合している炭素とを含み、２番 目に表記する炭素鎖はＲ４中の炭素を示す。同様にＣ１ｓ／　Ｃｓセラミドとは 、Ｒ１がｃｐｓのアルケニル基、Ｒ２がヒドロキシル基、Ｒ３がＨ，Ｒ４がＣ０ Ｒ５、Ｒｓがペンタニル基である構造式■を有する化合物を言う。Ｃ＋＋／Ｃｓ セラミドとは、Ｒ１がＣ８のアルケニル基、Ｒ２がヒドロキシル基、Ｒ８がＨ１ Ｒ４がＣ０Ｒ５、Ｒ３がヘプタニル基である構造式Ｉを有する化合物を言う。こ れらの例の各々で、Ｒ，中の二重結合はセラミドと同一位置にある。ただし他の 不飽和結合の位置も使用できる。３−ｏ−メチルスフィンゴシンとは、Ｒ１がｃ ｐｓのアルケニル基、Ｒ２がメトキシ基、ＲｓがＨｌＲ，がＣ０Ｒ５、Ｒ８がメ チル基である構造式Ｉを有する化合物を言う。

１δ、２５−ジヒドロキシビタミンＤｓ　（１，２５（ＯＨ）　２　Ｄｓ　）は ニューシャーシー州ナツトレイのホフマンーラロッシュ（Ｈｏｆ　ｆｍａｎ−Ｌ ａＲ。

ａｈ）から入手した。ＳＭとＰＣはアヴアンテイ・ポーラ−・リビズ（Ａｖａｎ ｔｉ　Ｐｏ１ａｒ　Ｌｉｐｉｄｓ）から購入し、セラミドはサペルコ（Ｓｕｐｅ ｌｃｏ）から購入した。インスリン、トランスフェリン、ＮＢＴ、およびα−ナ フチルアセテートはミズリー州セントルイスのシグマ・ケミカル社（Ｓ　ｉ　ｇ ｍａＣｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）から購入した。

セラミドおよびスフィンゴシン同族体の調製Ｎ−アセチルスフィンゴシンおよび （３ＨＥＮ−アセチルスフィンゴシンはアール・シー・ゲイバー（Ｇａｖｅｒ、 Ｒ，Ｃ，）およびシー・シー・スウイーリ−（Ｓｗｅｅｌｙ、Ｃ，Ｃ，）（Ｊ、 Ａｍｅｒ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、８旦＝３６４３−３６４７　（１９６６）　）の 記載に従って合成した。箭単にいうと、Ｎ−アセチルスフィンゴシン（Ｃ＋　ａ ／　Ｃ２セラミド）とＮ−ヘキサノイルスフィンゴシン（（、ｔｓ／ｃｓセラミ ド）は、それぞれ、無水酢酸と無水カプロン酸により中性スフィンゴシンをアシ ル化することにより調製した（収量９０％）。Ｎ−アセチル〔３Ｈ〕スフインゴ シン（比活性２．５ｘｌＯ’　ｃｐｍ／ｎｍｏｌ）は、低温のＮ−アセチルスフ ィンゴシンを乾燥した無水クロムによりピリジン／ベンゼン中で酸化して得た３ −オキソ−１−ヒドロキシ−２−アセトアミド−４−オクタデセン（収量　薄層 クロマトグラフィー（ＴＬＣ）分離後８０％）を、〔３Ｈ〕ＮａＢＨａにより還 元して調製した（収量　ＴＬＣ分離後４０％）。Ｎ−エチルスフィンゴシンは、 Ｎ−アセチルスフィンゴシンをＬｉＢＨ４により還元して調製し、分取ＴＬＣに より精製した（収量　３０％）。Ｃｏ／Ｃｍセラミドは、リオッタ（Ｌ　ｉ　ｏ 　ｔ　ｔ　ａ）ら（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｍ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　２旦＝３Ｑ３７ 　（１９８８））の方法に従って調製した。全部の構造をＮＭＲにより確認し、 ＴＬＣにより純度を確立した。純度は９７％を越えると推定された。これらの化 合物はエタノールに溶解して溶媒に移した（エタノールの最終濃度は０゜１％未 満であった）。

３−０−メチルスフィンゴシンの調製 ３−ｏ−メチルスフィンゴシンは、カーター（Ｃａｒｔｅｒ）ら（Ｊｏｕｒｎａ ｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１９２：１９７−２０７．１９５１）の 記載に従って合成した。ウシ脳セレブロシド（カナダ、オンタリオ州ロンドン、 サーダリー・リサーチ・ラブダ（Ｓｅｒｄａｒｙ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｓ ）、カタログＮｏ、Ａ−４６）１００ｍｇを、丸底フラスコに入れた濃硫酸１１ ２μｌ／メタノール２．３ｓ／に溶解した。この混合液を撹拌しながら６時間加 熱、還流した。加熱後、反応混合液を氷上で約１５分間冷却した。脂肪酸の沈殿 物とメチルエステルを、ブフナー（Ｂｕｃｈｎｅｒ）ロートで＃１ワットマン（ Ｗｈａｔｍａｎ）紙により濾過して除去した。残留する脂肪酸とエステルを除去 するために、濾液を石油エーテル１ｍ１（各抽出）により４回抽出した。エーテ ルを真空下で約１５分間除去した。この溶液を４ＮのメタノールＫＯＨ（ｍｅ　 ｔｈａｎｏｌｉｃ　ＫＯＨ）により中和しくｐＨ試験紙により判断して５．５ｓ ／まで）、沈澱した硫酸カリウムをブフナーロートで＃１ワ・ットマン紙により 濾過して除去した。濾過液を４°Ｃで一晩貯蔵しく冷蔵）、夜間に生成した新た な硫酸力ＩＪウム沈殿物を濾過して除去した。ｐＨ試験紙により判断してｐＨ１ ０になるまで６ＮのＮａＯＨを溶液に加えた。次にこの溶液をジエチルエーテル で２回抽出した。エーテル抽出液をまとめ、水で１回洗浄し、真空下、硫酸ナト リウム上で乾燥した。乾燥した抽出物をクロロホルム：メタノール（’１：１） に溶解した。

試料をサンバシヴアロコ（Ｓａｍｂａｓ　１ｖａｒｏｃｏ）およびマツククルア −（ＭｃＣｌｕｅｒ）（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｌｉｐｉｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ ４　：１０６−１０８．１９６３）の記載に従って薄層クロマトグラフィー（Ｔ ＬＣ）により精製した。分取ＴＬＣ薄層板、展開溶媒としてクロロホルム：・メ タノール＝２Ｎ水酸化アンモニウム（４０：１０：１）、およびマーカーとして スフィンゴシンを使用して、生成物を分離した。薄層板の小部分を、ニンヒドリ ン噴霧により可視化した。３−ｏ−メチルスフィンゴシンは薄層板の高部まで移 動し、最も速く移動する成分であることが明らかになった。３−ｏ−メチルスフ ィンゴシンに相当するシリカ帯を薄層板から削り取り、３−ｏ−メチルスフィン ゴシンをクロロホルム、メタノール（１：　１）によりシリカから溶出した。溶 出液を２．００Ｏｒｐｍで約５分間遠心分離機（ＩＥＣ）にかけ、上澄みを清潔 な試験管に移した。シリカからのクロロホルム：メタノール（１：　１）による ３−。

−メチルスフィンゴシンの溶出を反復し、上澄みをまとめた。まとめた上澄みを 真空下で乾燥し、エタノールに再び懸濁し、全収量１１ｍｇの３−〇−メチルス フィンゴシンが得られた。

細胞培養 ヒト骨髄性白血病ＨＬ−６０細胞（４５代培養）を入手し、１０％胎仔ウシ血清 を含有するＲＰＭＩ　１６４０培地（ミズリー州セントルイス、シグマ・ケミカ ル社（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、））に加え、３７’Ｃの５％Ｃ０ ２インキユベーター内で増殖させた。この細胞をリン酸緩衝溶液（Ｐ　Ｂ　Ｓ’ ｌで２回洗浄し、血清を含有せず、インスリン（５ｍｇ／す・ソトル）とトラン スフェリン（５ｍｇ／リットル）を含有する培地に再び浮遊させたのち、種々の 化合物による処理を行なうた。

脂質の質量測定 表示した時間に細胞を収穫したのち、脂質をブライ（Ｂ　１　ｉ　ｇｈ）および ダイヤ−（Ｄｙｅｒ）（Ｃａｎ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｐｈｙｓｉｏｌ、３ヱ： ９１１−９１７　（１９５９））の方法により抽出した。試料を窒素ガスの下で 乾燥し、クロロホルムＯ，１ｍｌに溶解した。４０μｌを薄層クロマトグラフィ ー（ＴＬＣ）（メルク（Ｍｅｒｃｋ））に使用し、４０μｌをリン脂質リン酸の 測定に使用した（二重反復測定）。リン酸塩をビー・パン・ヴエルドホーヴエン （ＶａｎＶｅｌｄｈｏｖｅｎ、Ｐ、）およびジーーｖミールツ（Ｍａｍｍａ　ｅ 　ｒ　ｔ　ｓ。

Ｇ、）（Ａｎｎ、Ｂｉｏｃｈ’ａｍ、工６１　：　４５−４８　（１９８７）） の記載番二従って測定した。スフィンゴミエリン（ＳＭ）とホスホリルコリン（ ＰＣ）を同定するために、クロロホルム：メタノール：酢酸：Ｈ，Ｏ：　（５０ ：３０：８：５）（展開溶媒Ａ）またはクロロホルム：メタノール：　２Ｎ　Ｎ Ｈ４ＯＨ（６０：３５：５）（展開溶媒Ｂ）で、ＴＬＣ薄層板に展開した。展開 溶媒Ａと展開溶媒Ｂの組み合わせを二次元ＴＬＣに使用した。薄層板をヨード蒸 気で染色したのち、ＳＭとＰＣに相当するスポットを削り取り、クロロホルム： メタノール（１：１）で抽出し、リン脂質リン酸を測定した。

セラミドの測定 セラミドの質量を、ブレイス（Ｐｒｅｉｓｓ）ら（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ。

２６１：８６９７−８７００．１９８６）とノくン・ヴエルドホーヴエン（Ｖａ ｎＶｅｌｄｈｏｖｅｎ）（Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１旦３：１７７−１８９ ゜１９８９）の記載に従い、５ｎ−１，２−ジアシルグリセロール（ＤＡＣ）キ ナーゼを使用して酵素的に測定した。ＨＬ−６０細胞中のセラミドのセラミド１ −リン酸への変化を確認するために、セラミドリン酸とホスファチジン酸を、ク ロロホルム：メタノール：酢酸（６５：１５：５Ｌクロロホルム：ピリジン：ギ 酸（６０・３０：８）、およびクロロホルム：アセトン：メタノール：酢酸：Ｈ ２０（６：　２　：　２）のような異なる展開溶媒系により、ＴＬＣで分離した 。Ｒｆの値を標準セラミドのそれと比較した。さらに、セラミド１−リン酸をア ルカリ性加水分解（７０６Ｃ１ＩＮ　ＮａＯＨ中で２０時間）によりスフィンゴ シン１−リン酸に変化させ、ブタノール、酢酸・Ｈ２Ｏ（６：　２　：　２）ま たはクロロホルム：アセトン：メタノール：酢酸：Ｈ２Ｏ（１０：４：２：２： １）を含有する展開溶媒に加え、Ｒｆの値を標準スフィンゴシン１−リン酸のそ れと比較し、０．４５または０．４２で同一であることが明らかになった。

ＨＬ−６０細胞の成長および分化の分析細胞の成長は、血球針を使用して定量し た。細胞の生存能力は、トリパンブルーの除去能力により判断した。生存能力は 、特に記載が無い場合、常時８０％以上であった。ニトロブルーテトラゾリウム （ＮＢＴ）還元能力を、マクロファージ・単球系と顆粒球系の両方のマーカーと して使用し、非特異エステラーゼをマクロファージ／単球系のマーカーとして使 用した。両方のマーカーを、ティー。

オカザキら（Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、１３１：５０−５７、　（１９８ ７））の記載に従って測定した。

Ｃ３Ｈ〕Ｃｐｓ／　Ｃ２セラミドの取り込みと代謝：ＨＬ−６０細胞を無血清培 地に再び浮遊させたのち、［”Ｈ）Ｃ＋ｇ／Ｃ２セラミド（ＩＸＩＯ’　ｃｐｍ ／ｍｌ）で標識し、表示した時間に収穫し、ＰＢＳにより３回洗浄した。次に脂 質をブライ（Ｂ　ｌ　ｉ　ｇｈ）およびダイヤ−（Ｄｙｅｒ）（上記）の方法に より抽出した。乾燥した試料をクロロホルム１００μｌに溶解し、２０μｌをＴ ＬＣに使用し、４０μｍをリン脂質リン酸の測定に使用した。

クロロホルム：メタノール＋　２Ｎ　ＮＨ４ＯＨ（４０：　１０　：　１）を含 有する溶媒を用いてＴＬＣで展開し、自、／Ｃ２セラミド、ＳＭ、およびスフィ ンゴシン（ＳＰＨ）を分離した。スポットを削り取り、セイフテイ・ソルヴ（Ｓ ａｆｅｔＶ　５ｏｌｖｅ、商標名）（リサーチ・プロダクツ・インターナショナ ル社（Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃ ｏｒｐ、））に加え、エルケービ−（ＬＫＢ）シンチレーションカウンター（エ ルケービー）によりカウントした。

２５　（ＯＨ）２　Ｄｓに反応したセラミド生成の用量依存性および時間依存性 ：セラミドの質量を、以前にジアシルグリセロールの定量のために開発された（ 上記のヴアン・ヴエルドホーヴエンｆｆａｎ　Ｖｅ　１ｄｈｏｖｅｎ）らを参＠ ）ジアシルグリセロールキナーゼ試験を用いて測定した。大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ ）ＤＡＣキナーゼはセラミドをセラミド１−リン酸に大量に変化させる。細胞セ ラミドをセラミド１−リン酸に変化させたのち、薄層クロマトグラフィー（ＴＬ Ｃ）で標準セラミドリン酸と共に移動させることにより同定した。細胞および標 準のセラミドリン酸を４種類の溶媒系を用いてＴＬＣで展開したとき、両者のＲ ｆの値は同一であった。さらにセラミドリン酸のアルカリ性加水分解により同定 が得られた。アルカリ性加水分解によりスフィンゴシン１−リン酸が生成し、こ れはブタノール：酢酸：ＨｘＯ（６：２：２）溶媒系を用いたＴＬＣで標準と共 に移動した（Ｒｆ＝０．４５）。

図１に示すように、１．２５　（ＯＨ）ｔ　ＤｓによりＨＬ−６０細胞を処理す ると、処理の２時間後にセラミドのレベルが用量依存性に上昇した。データは対 照（ＣＩｌｌ／Ｃ，セラミドが存在しない場合）に対する百分率で示しである。

棒は二重反復測定の標準偏差を表す。セラミドの基線レベルはリン脂質１ｎｍｏ 　１中２６．１±０．８２ｎｍＯ１であった。結果は３回の異なる実験の代表値 である。

セラミドの最大上昇はｉｏＯｎＭの１．２５−　（ＯＨ）２　Ｄｓにより生じた 。

この濃度の１．２５　（ＯＨ）！　Ｄｓでは、セラミドの質量が対照より４１％ 増加した。１．２５　（ＯＨ）２　Ｄｓに対するセラミド生成の用量依存性は、 １１００−３００ｎで最大に達する１、２５　（ＯＨ）ｚ　Ｄｓに対するＨＬ− ６０細胞分化の用量依存性と良く類似した。したがってこれらの結果は、セラミ ド生成と細胞分化のあいだの量的関係を示唆する。

ＨＬ−６０細胞に対する１、２５−　（ＯＨ）！　Ｄ３の作用に反応したセラミ ドのレベルの時間依存性も検討した。図２に示すように、ＨＬ−６０細胞を１１ −００ｎのＣ１ｓ／　Ｃ２セラミドで処理したのち、指定された時点で収穫した 。セラミドの質量を「実験方法」に記載したように測定した。２回の測定から結 果を得た。

欅は標準偏差を表す。データは３回の異なる実験の代表値である。ＨＬ−６０細 胞を１１００ｎの１．２５−　（ＯＨ）ｚ　Ｄｓ　（図１に示した用量反応関係 から最適濃度）で処理したとき、セラミドのレベルは最初の２時間にわたって徐 々に増加し、次いで基線レベルに戻った。最初の増加はｉ、２５−　（ＯＨ）２ 　Ｄ３処理の３０分後に検出され（基線値より７％増加）、２時間後に４１％の 最大増加に達した（図２）。

これらの研究は、１．２５　（ＯＨ）！　Ｄｓはセラミドのレベルの時間および 用量依存性の一過性増加を誘導し、この増加はＨＬ−６０細胞の分化開始より明 らかに前である（最大セラミド生成は２時ｒｊＪ′ｄｋであるのに対し、分化に よる表現型の変化は２−４日後に起こる）ことを示す。セラミドの生成は１．２ ５−（ＯＨ）！　Ｄｓに反応した最も初期の生化学的変化であると思われること から、これらの研究は脂質メディエータ−としてのセラミドの役割を示唆する。

スフィンゴミエリンからのセラミドの奪取：以前の研究（ティー・オカザキら（ 上記））で、１．２５−　（ＯＨ）　２Ｄ、は同時にホスホリルコリンおよびセ ラミドのレベルの変化を伴うスフィンゴミエリンの加水分解を誘導し、その後、 スフィンゴミエリンが再合成されて基線レベルに戻ることを明らかにした。セラ ミドがスフィンゴミエリンから大量に生成したことを確認するために、加水分解 したスフィンゴミエリンの質量を測定し、生成したセラミドの質量と比較した。

図２に見られるように、セラミドの質量は２時間後に最大に達し、そのときのセ ラミドの最終的生成量はリン脂質ｌｎｍｏｌ中１３±２ｐｍｏｌであった。次い でセラミドのレベルは４時間後に基線値にもどった。図３に示すように、リン脂 質の総レベル（図３Ａ）とホスファチジルコリンの総レベル（図３Ｂ）は、１． ２５　（ＯＨ）＊　Ｄｓ処理の４時間後まで、有意に変化しなかった。しかし、 スフィンゴミエリンのレベルはリン脂質１　ｎｍｏ　１中５１±６ｐｍｏｌから ２時間後にリン脂質ｌｎｍｏｌ中３４±２ｐｍｏｌまで低下した（図３Ｃ）。リ ン指貫ｌｎｍ０１中１７±４ｐｍｏｌのスフィンゴミエリンの最終的減少は、リ ン脂質ｌｎｍｏｌ中１３±ｐｍｏ　ｌのセラミドの質量の最終的増加に非常に近 い。これらの結果は、ＨＬ−６０細胞に対する１、２５−（ＯＨ）２　ＤＳの作 用に反応したスフィンゴミエリンの分解からセラミドが生成することを強く示唆 する。〔３Ｈ〕パルミチン酸塩でスフィンゴ脂質を標識することにより、他のス フィンゴ脂質はこの時間のあいだに１．　２５−　（ＯＨ）　！　ＤＳに反応し て有書な変化を受けないことが明らかにされ、スフィンゴミエリンのプールが種 々のスフィンゴ脂質のなかで最大の標識プールを構成した。したがって、セラミ ドがスフィンゴミエリン以外のスフィンゴ脂質の加水分解に由来する可能性はあ りそうもない。しかし、これらの研究は、１．２５〜（ＯＨ）ｔ　Ｄｓに反応し たセラミドのデノポ合成の可能性を否定するものではない。もっともスフィンゴ ミエリンの有意で釣り合った加水分解を見れば、この可能性はありそうもない。

これらのデータは、ＨＬ−６０細胞中の総リン脂質が１５．６±１．Ｏｆｍ。

ｌ／細胞であり、ＰＣとＳＭは総リン脂質のそれぞれ５３．３±２．３％と５． ′１±０．６％を占めることも明らかにする。これらは、〔３Ｈ〕コリンを使用 して両脂質を標識することによりＳＭ／ＰＣ比が０．０５−０．１０であること を明らかにした以前のデータ（ティー・オヵザキ、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２ ６４：１９０７６−１９０８０　（１９８９年））と非常に近い。これらの結果 より、３Ｍレベルの最終的減少は総リン脂質レベルの変化の１．　５−２．　０ ％を占めるに過ぎないことから、総リン脂質の有意な変化が無い理由も説明され る。

獲スフィンゴミエリンの加水分解およびセラミドの生成を誘導する外来性の細菌 スフィンゴミエリナーゼを添加すると、ＨＬ−６０細胞分化を誘導する１、２５ 　（ＯＨ）２０ｓの能力が増強されることが明らかにされている（ティー・オカ ザキら、上記）。しかし、高濃度の細菌スフィンゴミエリナーゼを使用するとき には、膜ホスファチジルコリン（Ｐ　Ｃ）の加水分解が加わり、そのため解釈に 制約がある。

この問題を解決し、そしてセラミドが細菌スフィンゴミエリナーゼに類似の作用 を持つか否かを直接試験するために、アミド結合に酢酸を持つ合成細胞透過性セ ラミドすなわちＣｉｓ／Ｃ２セラミドを調製した。天然に存在するセラミドと比 較してＣ＋　ａ／　Ｃ２セラミドは炭素数が１４−１６個少なく、したがって、 水への溶解度がより高い。同様の条件下で、長いＮ−アシル鎖を持つ天然のセラ ミドは、５０μＭで、細胞成長および細胞分化に影響を及ぼさず、これは長鎖Ｎ −アシル基セラミドの取り込みが少ないこととあい通じる。

これは、天然に存在するＤＡＣより短いアシル鎖を持つジオクタノイルグリセロ ールおよびオレオイルアセチルグリセロールのような細胞透過性ＤＡＣ同族体で も同様である。ＨＬ−６０細胞を同時に最適濃度以下の１．２５−　（ＯＨ）２ Ｄｓ　（１ｎＭ、最適濃度の１００分の１）と様々な濃度のＣ＋ｓ／Ｃ２セラミ ドにより処理したとき、細胞分化の亢進が認められた。

ＨＬ−６０細胞（２，５Ｘ１０Ｓ個／ｍｌ）を同時に様々な濃度のＣ＋ａ／Ｃｚ セラミドとｌｎＭの１．２５−　（ＯＨ）！　ＤＳにより処理した。細胞分化を ＮＢＴ還元能（斜線の入った捧）とＮＳＥ活性（斜線の無い棒）により判定した 。細胞成長に対するＣ１＠／Ｃ２セラミドの効果を挿入図に示す。３回の異なる 実験から結果を得た。棒は標準偏差を表す。

図４に示すように、Ｃ１８／Ｃ！セラミドは１．２５　（ＯＨ）ｚ　Ｄｓ分化の 用量依存性の亢進を引き起し、最大効果は１μＭで生じた。処理の４日後、１μ ＭのＣ＋ｓ／ＣｚセラミドはＮＢＴ還元活性を１１．９±２．９％から５７．８ ±１゜４％に、非特異エステラーゼ（ＮＳＥ）活性を２．２±０．９％から３９ ．２±７．２％に増加させた。同じ濃度範囲で、Ｃｉ　ｓ　／　Ｃ２セラミドは 細胞生存能力には有意に影響を与えずに、細胞成長の軽度の抑制を引き起こした （図４挿入図）。

細胞生存能力は富時８０％より上であった。細胞成長の軽度の抑制があったにも かかわらず、１μＭのＣｌｓ／　Ｃ！セラミドにより誘導されたＮＢＴ陽性細胞 とＮＳＥ陽性細胞の絶対数は、４日目に対照と比較してそれぞれ０．９Ｘ１０’ 個／ｍｌから２．５４Ｘ１０’偲／ｍｌに、０．１６Ｘ１０’個／ｍｌから１． ７２×１０５個／ｍｌに増加した。

細胞透過性セラミドは１．２５−　（ＯＨ）！　ＤＳに依存せずにＨＬ−６０細 胞分化を誘導する 閾値以下の濃度の１．２５−　（ＯＨ）！　ＤＳと低濃度のＣＩｓ／　Ｃｔセラ ミド（１００ｎＭ−１μＭ）のあいだの強い相乗作用は、高濃度のＣＩｓ／Ｃ２ セラミドが１．２５−　（ＯＨ）２　ＤＳの添加に依存せずに分化を誘導する可 能性を示唆する。

ゆえに、合成Ｃ＋ａ／Ｃｚセラミドが細胞の成長および分化に及ぼす効果を検討 した。増加する濃度のＣｒｓ／Ｃ２セラミドによりＨＬ−６０細胞を処理すると 、図５に示すような細胞成長の用量依存性の抑制が起きた。Ｃ＋ｓ／Ｃｚセラミ ドの様々な濃度を次のように示す二〇　−対照、黒い菱形　−１μＭ１黒い四角 形−３μＭ１黒い丸　−６μＭ、黒い三角形　−１０μＭ０３回の測定から結果 を得た。欅は標準偏差を示す。１０μＭのＣＩ８／Ｃ！セラミドは７日目までに 著しい細胞の消失を引き起こした。３０％以上の細胞で処理２日目までに分化が 誘導されたことから、細胞の消失は単なる毒性に起因するのではなく、少な（と も部分的にＣ＋　ｓ／　Ｃｚセラミドによる細胞分化の誘導に起因する可能性が ある。

図６に示すように、増加する濃度のＣｒｙ／Ｃｔセラミドは１、ＮＢＴ還元能お よびＮＳＥ活性の誘導による定量に従えば、４日目までにＨＬ−６０細胞の分化 の漸増を引き起こした。ＮＥＴ活性は斜線の入った欅で表し、ＮＳＥ活性は白い 棒で表しである。結果は３回の測定の平均である。棒は標準偏差を表す。細胞を 様々な濃度のＣｏ／Ｃｔセラミドにより４日間処理した。６μＭのＣｒｓ／Ｃｘ セラミドによる処理後、ＮＢＴ陽性細胞は０±１．０％から５３．２±１．６％ に増加し、ＮＳＥ陽性細胞は１．０±１．９％から４６．４±６．０％に増加し た。

１μＭという低濃度のＣ＋ａ／Ｃｚセラミドによっても、分化した細胞の有意な 増加が認められた。

セラミドにより処理したＨＬ−６０細胞の形態的表現型の検査により、１．２５ 　（ＯＨ）２　Ｄｓが誘導する単球の表現型に一致する形態的変化が明らかにな った。これらの細胞では、細胞質対校の比の増加、小葉状で偏心性の核、および 核小体ならびにアズール顆粒の消失が特徴である。細胞はＮＢＴ還元能とＮＳＥ 活性も獲得し、後者は単球分化の特異マーカーである。

次にＣ＋ａ／Ｃｚセラミドに反応した時間依存性分化を、最少の細胞毒性で最大 の分化を引き起こす最適濃度として６μＭのＣ１ａ／　Ｃｔセラミドを使用して 検討した。細胞分化はＮＢＴ還元能とＮＳＥ活性により判定した。６μＭのＣ＋ ａ／Ｃ２セラミドの添加は、図７に示すように、処理７日目までにＮＢＴｌｉｌ 性ｍ胞とＮＳＥ陽性細胞をそれぞれ６１１％と５６％まで次第に増加させた。図 ７では、６μＭのセラミドにより処理したＨＬ−６０細胞を黒い形で示し、セラ ミドにより処理しなかった細胞を白い形で示す。ＮＢＴ還元能を　および丸で示 し、ＮＳＥ活性を四角で示す。

これらの結果は、Ｃ＋ａ／Ｃｔセラミドの単独添加はＨＬ−６０細胞に単球表現 型への分化を誘導することができ、６μＭのＣ１ｌ／Ｃ２セラミドは１．２５− （ＯＨ）！　Ｄｓと類似の有効性を示すことを明らかにする。１１００ｎの最適 濃度でＣＩｓ／　Ｃ２セラミドは４日目に７４土６％の細胞にＮＢＴ還元能を、 ５１．４±４％の細胞にＮＳＥを誘導する。これに対しＣ＋ｓ／Ｃｚセラミドで は５３．２±１．６％と４６．４±６％である。

図８に示すように、Ｃ，、／Ｃ２セラミドをＨＬ−６０細胞に添加してもスフィ ンゴミエリンの細胞内レベルは変化しなかった。表示した時間のあいだＨＬ−６ ０細胞を５μＭのＣ＋ｓ／Ｃｔセラミドにより処理した。スフィンゴミエリンを 「実験方法」に記載したように抽出・測定した。データは対照（Ｃ＋ｓ／Ｃ２セ ラミドが存在しない場合）に対する百分率で表しである。棒は標準偏差を示す。

２回の異なる実験から結果を得た。これらの結果は、Ｃ＋ａ／Ｃｚセラミドおよ び細菌スフィンゴミエリナーゼ（ＳＭａｓｅ）がＨＬ−６０細胞分化に及ぼす効 果は、セラミドにより仲介され、ＳＭレベルの変化自体により仲介されるのでは ないことを強く示唆する。

第二メツセンジャーとしてのセラミドの役割をさらに検討するために、セラミド へのＨＬ−６０細胞の短時間ばく露が、分化の誘導に充分であるか否かを調べる 実験を実施した。細胞に加えたＣ　＋　ｓ／　Ｃ２セラミドは、細胞の反復洗浄 後、溶媒にもどし抽出（ｂａｃｋ−ｅｘｔ　ｒａｃ　ｔ）でき、その結果３回の 洗浄後、最初のＣＩＪＣ！セラミドの２０％未満が細胞ベレットと共に残留した 。　１，２５−　（ＯＨ）２　Ｄｓは約２時間にわたって内因性セラミドを上昇 させることから、ＨＬ−６０細胞をＣＩ８／Ｃ２セラミド（０，５−２μＭ）に ２時間ばく露した。

Ｃ１１１／Ｃ２セラミドをもどし抽出し、分化を調べた。細胞をＣｌ１ｌ／Ｃ２ セラミド無しにまたはＣ１１／Ｃ２セラミド（０，５μＭ１１μＭまたは２μＭ ）により２時間（図９と図１０）または４時間（図１０）処理し、ＲＰＭ　Ｉ　 １６４０培地により３回洗浄し、次に無血清ＲＰＭＩ　１６４０培地に再び浮遊 させた。表示した日（図９）または処理のウォッシュアウトの４日後（図１０） に、「実験方法」の記載に従ってＮＢＴ還元能により分化を測定した。棒は標準 偏差を表す。図９では、白い丸はＯμＭのＣ１ａ／Ｃ！セラミドを表す。黒い三 角形は０．５μＭのＣ＋ｓ／Ｃｚセラミドを表す。黒い四角形は１μＭのＣ＋ａ ／（：ｚセラミドを表す。黒い丸は２μＭのＣ＋ａ／Ｃ２セラミドを表す。図１ ０では、０μＭのＣｔｓ／Ｃｚセラミドを白い欅で表す。０．５μＭのＣＩ８／ Ｃ２セラミドを粗い網目の棒で表す。

１μＭのＣ＋ａ／ｃ、セラミドは細かい網目の棒で表す。２μＭのＣ＋ａ／Ｃｔ セラミドを灰色の棒で表す。２回の異なる実験から結果を得た。Ｃ＋ｓ／Ｃ２セ ラミド（１μＭまたは２μＭ）はこれらの条件下でＨＬ−６０細胞のかなりの分 化を引き起しく図９）、このことはＨＬ−６０細胞の２時間のＣ＋ｓ／Ｃｚセラ ミドへのばく露が、分化の誘導に充分であることを示す。４時間のば（露しても 、分化は有意に増加しなかった（図１０）。これらの研究は、短時間の高濃度の セラミドへのＨＬ−６０細胞のばく露が、分化への介入に充分であることを示唆 する。

セラ２ドおよびスフィンゴシン同族体がＤ３に誘導されたＨＬ−６０細胞分化に 及ぼす影響 スフィンゴシンはインビトロおよび異なる細胞系においてプロティンキナーゼＣ の薬学的阻害剤である。セラミドは酸性または中性またはその両方のセラミダー ゼの作用により代謝されてスフィンゴシンになる可能性があることから、ＨＬ− ６０細胞に対するセラミドの作用が、スフィンゴシンの生成に帰せられるか否か を検討した。１．２５　（ＯＨ）ｚ　ＤｓによるＨＬ−６０細胞の処理後、スフ ィンゴシンは検出できなかった。さらに、Ｃ＋ｓ／ＣｚセラミドをＨＬ−６０細 胞に添加しても、測定可能なスフィンゴシンの生成は起こらなかった。これらの 実験のために、Ｃ１，／Ｃ２セラミドのスフィンゴシン塩基の第３炭素を〔３Ｈ 〕で標識した。細胞（５ｘ　１０’個／ｍｌ）を４μＭの（’Ｈ）Ｃ１８／Ｃｍ セラミド（ＩＸＩＯ’　ｃｐｍ／ｍ＋）で標識した。Ｃ＋ｓ／Ｃｔセラミドをエ タノールに溶解して投与した。（’Ｈ）Ｃ，／Ｃ！ＣｍミドをＨＬ−６０細胞に 添加すると、図１１および図１２に見られるように、標識したＣＩｌ／Ｃ２セラ ミドが速やかに取り込まれたが、スフィンゴシンへの変化は起こらなかった。Ｃ ＋ｓ／Ｃｚセラミドの取り込みは処理の０．　５時間後に約２０％であった。残 りのセラミド（８０％）は無変化で培地中に残留した。図１１はＴＬＣ薄層板の オートラジオグラフィーを示す（２４時間感光後）。図１２では、「実験方法」 に記載したように脂質を抽出し、ＴＬＣにより分離し、そして放射活性を測定し た。セラミドは白い丸で表す。スフィンゴミエリンは白い四角形で表す。スフィ ンゴシンは黒い丸で表す。

同様に、Ｃ＋ａ／Ｃｚセラミドで標識した細胞に１．２５−　（ｏＨ）２Ｄ、を 添加しても、スフィンゴシンの生成を引き起こさなかった。標識のごく一部がス フィンゴミエリンに変化した（Ｉｊ［識１２時間後に２．８％）。これらの研究 は、１゜２５−　（ＯＨ）２　Ｄ３はスフィンゴシンの生成を導かないこと、お よび外因性セラミド同族体は細胞に添加したとき（１，２５（ＯＨ）２　Ｄｓの 存在する場合と存在しない場合）、スフィンゴシンに代謝されないことを示す。

スフィンゴシンはＨＬ−６０細胞内で、主にセラミドおよびその他のスフィンゴ 脂質に取り込まれることにより、ゆっ（りと代謝される（ニー・エッチ・メリル （Ｍｅｒｒｉｌｌ、Ａ、Ｈ，）ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６１：１２６１ ０−１２６１５　（１９８６））。しかし、上記の研究は、セラミドから生成し たスフィンゴシンが急速に代謝され、そのため上記の方法による検出を逃れた可 能性を否定はしない。目的はセラミドの効果の仲介におけるスフィンゴシンの役 割を検討することであるので、スフィンゴシンがセラミドと類似の作用をもつか 否かを試験した。

図１３に示すように、ＨＬ−６０細胞を同時に様々な濃度のスフィンゴシンと最 適濃度以下の１．２５−　（ＯＨ）２　Ｄ３　（１ｎＭ）により４日間処理した とき、ＮＢＴ還元能およびＮＳＥ活性は対照と比較して変化が無かった。ＨＬ− ６０細胞（２，５Ｘ１０’個／ｍｌ）を１ｎＭの１．２５−　（ＯＨ）ｚ　Ｄ３ の存在下で、様々な濃度のスフィンゴシンにより４日間処理した。細胞分化をＮ ＢＴ還元能（斜線の入った棒）およびＮＳＥ活性（白い棒）により判定した。ス フィンゴシンがＨＬ−６０細胞成長に及ぼす効果を挿入図に示す。３回の測定か ら結果を得た。

棒は標準偏差を示す。

これらの研究は、スフィンゴシンが、セラミドの効果とは明らかに異なり、Ｈし 一６０細胞分化を誘導する１、２５　（ＯＨ）２　Ｄｓの能力を増強しないこと を示す（図４と図１３を比較せよ）。　〔３Ｈ〕スフインゴシンはＨＬ−６０細 胞により効率的に取り込まれ、このことはスフィンゴシンの効果の欠如が取り込 みの少なさに起因するのではないことを示す。さらに、スフィンゴシンはＣ＋ｓ ／Ｃ２セラミドに誘導される遅延と匹敵するレベルまでＨＬ−６０細胞の成長を 確かに遅延し、このことは、分化の誘導以外のスフィンゴシンの細胞効果を示す 。分化を促進せずにＨＬ−６０細胞成長を遅延するスフィンゴシンの能力もまた 、セラミドの主な作用はＨＬ−６０細胞の成長速度とは無関係な分化の誘導であ ると言う考え方を支持する。細胞分化におけるスフィンゴシンに依存しないセラ ミドの役割をさらに裏付けるために、合成セラミドおよびスフィンゴシン同族体 を調製し、最適濃度以下の１．．２５−　（ＯＨ）２　ＤｓによるＨＬ−６０細 胞分化を促進する能力について試験した。表１に示すように、Ｃ１，／Ｃ！Ｃｍ ミドとＣ＋ｓ／Ｃ，セラミドはどちらも、１１００ｎの１．２５−（ＯＨ）！　 Ｄｓにより認められるものと比較して、ＮＢＴ還元能およびＮＳＥ活性の有意な 増加をもたらしただ。Ｃ＋＋／ＣｓセラミドもＮＢＴ還元能およびＮＳＥ活性の 有意な増加を引き起こした。Ｃ＋＋／Ｃｓセラミドによる研究は、スフィンゴシ ンが重要な役割を持つ可能性の否定に特に関わりが深い。Ｃ＋＋／Ｃｓセラミド の脱アシル化は、スフィンゴシンが持つインビトロおよび細胞効果が欠如してい ることが明らかにされているＣ１１−スフィンゴシン同族体（エッチ・ノーシリ （Ｎｏｒ　ｊ　ｉ　ｒｉ、　Ｈ，）ら、上記）の生成を引起す。

表１　種々のスフィンゴ脂質が１ｎＭの１．２５−　（ＯＨ）２０ｓにより処理 したＨＬ−６０細胞の分化に及ぼす影響処理　スフィンゴ脂質　細胞数　ＮＢＴ 陽性細胞　ＮＳＥ陽性細胞の濃度（μＭ）　（ｘｌＯ’個／ｍｌ）　％％ｌｎＭ 　１，２５（ＯＨ）ｚＤｓ　Ｏ７，６±１．２　１１．９±２．９　２．２：０ ．９Ｃ＋　ａ／Ｃｚセラミド　０．１　７．６±１．０　３５．４±４．８本　 ２６．５±２．４本＋　ＩｎＭ　１．２５−（ＯＨ）ｚＤｓ　Ｌ、０　４．４　 ±０．１　５７．８　±１．４本　３９．２　±７．９零Ｃｒ　ａ／Ｃｓセラミ ド　（１，１７，２±１１３　３３．５±０．５零　１８．３±４．５本＋　１ ｎＭ　１，２５−（Ｏ［１）ｔ（ｈ　１．０　６．８　±１．６　５８．１　± １５本　２９．６　±１．８本Ｎ−エチルスフインコ゛／ン　０．１　５．０　 ±１．４　１６．５　±０．５　１．３　±０．３＋　１ｎｌｌ　１．２５−（ ０■）！Ｄ３　１．０　４．２±１．２　１７．８±４．５　１．０±１．０ス フインゴシン　０．１　７．８±１．６　１１．３±０．５　２．５±１，０＋ 　１ｎＭ　１．２５（ＯＨ）ｚＤｘ　１．０　５．６±０．６　１０．７±１． ７　２．５±１．０Ｃｏ／Ｃｍセラミド　０．１　２５本　１８本＋　１ｎＭ　 １．２５−（ＯＨ）ｚＤ３　１．０　３８．５本　３４．５本ＨＬ−６０細胞（ ２，５Ｘ１０’個／ｍｌ）を同時に、表示した脂質と閾値以下の濃度の１．２５ −（ＯＨ）ｚ　Ｄｓ　（１ｎＭ）により４日間処理した。３回の測定から結果を 得た。＊は対照（１ｎＭの１．　２５−　（ＯＨ）　２　Ｄｓ　）との差がＰく 領　０１で有意であることを示す。

一方、スフィンゴシンはこれらの２つの細胞分化の測定項目の有意な変化を引き 起こさなかった。スフィンゴシンによる同様の結果が以前にも指摘されている（ ヴ４−エル・スティーヴンスら（Ｓｔｅｖｅｎｓ、Ｖ、Ｌ、）Ｃａｎｓｅｒ　Ｒ ｅｓ、４９：３２２９−３２３４　（１９８９））、さらに、プロティンキナー ゼＣの強力な阻害剤であるＮ−エチルスフィンゴシンは、ＮＢＴおよびＮＳＥ活 性を基線より有意に増加させなかった。これらの研究は、セラミド誘導体は１， ２ｂ−（ＯＨ）！　ＤｓによるＨＬ−６０細胞分化を促進するが、スフィンゴシ ンとその同族体は促進しないことを示す。

以前の１研究で、１．２５　（ＯＨ）　ｔ　Ｄｓ　１ｔＨＬ　６０＄１胞中ノス フインゴミエリンの加水分解を引き起し、同時にセラミドとホスホリルコリンを 発生させことが発見され、これは調節された「スフィンゴミエリン回路」のよう に思われた（ティー・オカザキら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５４：１９０７ ６−１９０８０　（１９８０））。外因性細菌スフィンゴミエリナーゼの添加は 、閾値以下の１，２５　（ＯＨ）　２　Ｄｓの細胞分化を誘導する能力を増強し たことから、スフィンゴミエリン加水分解がＨＬ−６０細胞分化において役割を 果たしていることが示唆された。

出願者は、ＨＬ−６０細胞分化に対する１、２５−　（ＯＨ）ｚ　Ｄｓの効果を 伝達する脂質メディエータ−としてのセラミドの機能を発見した。低濃度のセラ ミド（１００ｎＭ−３μＭ）は、閾値以下の濃度の１．２５−　（ＯＨ）！　Ｄ 、の細胞分化を誘導する能力を増大する。より重要なのは、高濃度のセラミド（ １−６μＭ）は、１．２５−　（ＯＨ）ｔ　Ｄｓが存在しなくとも、ＨＬ−６０ 細胞分化を誘導できることである。分化したＨＬ−６０細胞の表現型は、１゜２ ５−　（ＯＨ）！　Ｄｓにより誘導された単球表現型と非常に類似している。こ れらの研究は、セラミドが細胞分化に対する１、２５−　（ＯＨ）！　Ｄ３の作 用の仲介に不可欠な役割を果たしている可能性を強力に示唆する。さらに、ＣＩ ８／Ｃｍセラミドは細胞をこれに僅か２時間ばく露したとき、分化を引き起こす 効果があった。このことは、１．２５−　（ＯＨ）ｚ　Ｄｓの作用に対するセラ ミドの反応が、分化の誘導に充分であることを強力に示唆する。同様に、添加し たセラミドの約２０％が細胞に取り込まれたので、この結果は、Ｃ＋ｓ／Ｃｚセ ラミドの有効濃度はｎＭの範囲（２０−１０００ｎＭ）であることも示す。

現在のところ出願者は、セラミドが細胞分化に対する１、２５　（ＯＨ）ｚＤ、 の効果を仲介する機序は知らない。セラミドの作用の直接探的は確認できなかっ た。セラミドがスフィンゴ脂質およびスフィンゴシンの前駆物質として働く可能 性があることから、その作用は代謝産物により仲介されるのかもしれない。ガン グリオシドＧＭｓは、ホルボールエステルにより誘導されたＨＬ−６０細胞分化 に反応して増加し、また、単球系細胞分化を誘導することが報告されている（エ ッチ・ノーシリ（Ｎｏｒｊ　ｉｒｉ、Ｈ，）ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａ ｄ、Ｓｃ　ｉ、８３　：　７８２−７８６　（１９８６））、セラミドはＧＭｓ のようなガングリオシドの前駆物質として働く可能性がある。しかし、１．２５ 　（ＯＨ）！　Ｄ３はＧＭｓを変化させないことが明らかにされており（エッチ ・ノーシリ　（Ｎｏｒｊｉｒｉ、Ｈ，）ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓ ｃｉ、ＵＳＡ　８３ニア８２−７８６　（１９８８））、出願者はガングリオシ ドに変化するセラミドはご（僅かであることを見出した。さらに、セラミドに対 するＨＬ−６０細胞の用量反応は、ＧＭｓについて報告されているそれよりはる かに低い（したがって、０Ｍ３の作用は、ＧＭｓがさらにセラミドに代謝される ことに起因する可能性が生じる）。

セラミドは、中性または酸性セラミダーゼの作用による１回の加水分解段階によ り生成するスフィンゴシンの前駆物質として働（可能性もある。出願者のデータ は、スフィンゴシンがセラミドの効果を仲介する役割を持つことを否定する強力 な論拠を提供する。このことは次のことにより裏付けられる：１）１゜２５−　 （ＯＨ）！　ＤｓがＨＬ−６０細胞に及ぼす作用に反応してスフィンゴシンが検 出できなかった：２）スフィンゴシンは１．２５　（ＯＨ）！　ＤｓのＨし一６ ０細胞分化を誘導する能力を増大せず、単独でもＨＬ−６０細胞の単球分化を引 き起こさなかった：３）他のセラミド誘導体はＨＬ−６０細胞分化を誘導したが 、スフィンゴシンとその類縁同族体Ｎ−エチルスフィンゴシンは１゜２５　（Ｏ Ｈ）２　Ｄ３により誘導した分化を促進しなかった：そして４）加水分解により プロティンキナーゼＣを阻害しない短鎖スフィンゴシン（ニー・エッチ・メリル （Ｍｅｒｒｉｌ、Ａ、Ｈ，）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２８：　３１３８ −３１４５　（１９８９））を生成するＣ目／Ｃｓセラミドは、細胞分化の誘導 においてＣｒ　ｓ／　Ｃ２セラミドと同様に有効であった。

Ｃ＋＋／Ｃｍセラミドを用いた研究は、スフィンゴシンの重要な役割の否定に特 に関わりが深い。Ｃ＋　１／　Ｃａセラミドの脱アシル化は、スフィンゴシンが 持つインビトロおよび細胞効果の欠如が明らかにされているＣ１１−スフィンゴ シン同族体（エッチ・ノーシリ（Ｎｏｒｊｉｒｉ、Ｈ，）ら、上記）の生成を引 き起こすだろう。

これらの２通りの経路はありそうもないことから、セラミドはその作用を仲介す る他の標的を持つ可能性がある。スフィンゴミエリナーゼの作用を受けて脂質メ ディエータ−（第二メツセンジャー）候補であるセラミドを産生ずる細胞レザバ ーとして働くスフィンゴミエリンは、ホスホリパーゼＣの作用を受けてジアシル グリセロール第二メツセンジャーを産生ずる細胞レザバーとして働くグリセロ脂 質に類似する。

ｉ、２５（ＯＨ）２Ｄ３（ＬＯＧ　Ｍ）時間（時） 時間（時） 時間（時） 時間（時） 濃ｒｚ（μＭ） ＣＩ８／Ｃ２セラミド（μＭ） −ｒ々、４Ａ 時間（日） −り勾、５ ＣＩ８／Ｃ２セラミド（μＭ） ＯＮ３Ｌ　灯！、　（：　ＮＳＥ　ｐｇ、・　ＮＢＴ、６μＭ　シミ汁”　ｍ　 ＮＳＥ、６μＭ　ゼラミＦ゛時間（日） 時間（＃ｆ） ００９Ｍ、　２ＨＲ５，■１μＭ、　２ＨＲ３゜ム０．５＄、　２ＨＲ５，・２ ７Ｊ、　２ＨＲＳ。

時間（日） ［ＩＯ，ＳＰＭ　口２μＭ 処理時間（時） −Ｕｋ、〃 ロ　セラミド ・スフィンゴシン 時間（時） 濃度　（μＭ） スフィンゴシン（μＭ） ！性！ 本発明は、細胞の分化を誘発するための方法および組成物を提供する。Ｒ，がＣ １から約Ｃ２゜までのアルキル基またはアルケニル基：Ｒ２がヒドロキシル基、 アルコキシ基またはＨＥＲ３がＨまたは低級アルキル基：Ｒ４がＣ０Ｒ５，５ｏ ２Ｒ３またはＣ５Ｒ５であり、Ｒ３がＣ１からＣｏｏまでのアルキル基またはア ルケニル基またはアルキニル基であり、これらの基はＯＨ，ＳＨ，ＯＲｓ　、Ｓ Ｒａ、ＮＲ，Ｒ，、ＣＯＯＲｅ　、およびＣ０ＮＲ＋ｏＲｓの各官能基のうち１ 個以上と置換されていてもよく、これらの官能基中のＲ，、Ｒ，、Ｒ，、Ｒａ　 、およびＲ３゜は独自に、約１０個までの炭素を使用するＨ、アルキル基、アリ ール基、アルカリル基、およびアリールアルキル基であるような構造式（Ｉ）を 有する組成物を、分化させることが可能な補乳動物細胞に、細胞の分化の誘導に 有効な量、投与する。また本発明は、細胞の表現型を変えるため、および細胞の 過剰増殖を特徴とする疾患を治療するための方法および組成物も提供する。

Ｈ Ｒ１−Ｃ−Ｃ−ＣＨ２０Ｈ（Ｉ） 手続補正書 １、事件の表示 ｐＣＴ／ＵＳ９．１１０５７４３ ２、発明の名称 セラミドを使用して細胞分裂を誘導する方法３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 住所 名　称　デユーダ・ユニバーシティ ４、代理人 住　所　東京都千代田区大手町二丁目２番１号新大手町ビル　２０６区 電話３２７０−６６４１〜６− 氏名（２７７０）弁理士湯浅恭三 ５、補正の対象 請求の範囲 （別紙） １．特許請求の範囲を以下のとおりに補正する。

ｒ１８分化させることが可能な細胞を、かかる細胞の分化の誘導に有効な量の、 下記の構造式を持つ化合物と接触させることを含む、細胞分化を誘導する方法で あって、 Ｒ１−Ｃ−−Ｃ−ＣＨ２０Ｈ ただし式中のＲ１はＣ１から約Ｃ２０までのアルキル基またはアルケニル基： Ｒ２はヒドロキシル基、アルコキシ基またはＨ； Ｒ３はＨまたは低級アルキル基； Ｒ４はＣＯＲｓ　、Ｓ　Ｏ２ＲｓまたはＣ３Ｒｓであり、ここでＲ５はＣ１から Ｃ２゜までのアルキル基、アルケニル基またはアルキニル基であって、これらの 基はＯＨ，ＳＨ，ＯＲｓ　、ＳＲａ、特表千５−５０８８６３　（１４） ＮＲ？　Ｒ１１、Ｃ０ＯＲ＊　、およびＣＯＮ　ＲＩ　Ｇ　Ｒ８の各官能基のう ち１個以上と置換されていてもよく、ただし官能基中のＲ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９ 、およびＲ４，は独自に、炭素数が約１０個までのＨ１アルキル基、アリール基 、アルカリル基、およびアリールアルキル基である。

２、　薬学的に容認できるキャリアおよび下記の構造式を持つ化合物を含有する 、細胞分化を誘導するための薬学的製剤であって、 Ｈ Ｒ，−Ｃ−−Ｃ−ＣＨ２０Ｈ １ま ただし式中のＲ１はＣ１から約Ｃ２゜までのアルキル基またはＣ１からＣＩ□ま でのアルケニル基； Ｒ２はヒドロキシル基、アルコキシ基またはＨＲ３はＨまたは低級アルキル基； Ｒ４はＣＯＲｓ　、Ｓ　Ｏ２ＲｓまたはＣ８Ｒ，であり、ここでＲ３はＣ１から ｅｇｏまでのアルキル基またはアルケニル基またはアルキニル基であって、これ らの基はＯＨ，ＳＨ，ＯＲａ　、ＳＲ６、ＮＲ７Ｒ８、ＣＯＯＲ９、およびＣ０ ＮＲＩ　ＯＲ８の各官能基のうち１個以上と置換されていてもよく、ただし官能 基中のＲ８、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、およびＲＩＧは独自にＨ１低級アルキル基、ア リール基、およびアリールアルキル基である。」 以上 国際調査報告 −一一一一一一一−ＰＣＴ／ＬＩＳ９１１０５７４３

Claims (32)

【特許請求の範囲】
1. １．分化させることが可能な細胞を、かかる細胞の分化の誘導に有効な量の、下 記の構造式を持つ化合物と接触させることを含む、細胞分化を誘導する方であっ て、 ▲数式、化学式、表等があります▼Ｉ ただし式中のＲ１はＣ１から約Ｃ２０までのアルキル基またはアルケニル基；Ｒ ２はヒドロキシル基、アルコキシ基またはＨ；Ｒ３はＨまたは低級アルキル基； Ｒ４はＣＯＲ５、ＳＯ２Ｒ５またはＣＳＲ５であり、ここでＲ５はＣ１からＣ２ ０までのアルキル基、アルケニル基またはアルキニル基であって、これらの基は ＯＨ、ＳＨ、ＯＲ６、ＳＲ６、ＮＲ７Ｒ８、ＣＯＯＲ９、およびＣＯＮＲ１０Ｒ ８の各官能基のうち１個以上と置換されていてもよく、ただしこれらの官能基中 のＲ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、およびＲ１０は独自に、炭素数が約１０までのＨ、 低級アルキル基、アリール基、アルカリル基およびアリールアルキル基である。
2. ２．Ｒ１とＲ４中の炭素数の合計が約１０個から約２８個である、請求項１記載 の方法。
3. ３．Ｒ１がＣ１からＣ２０までのアルキル基またはＣ１からＣ１２までのアルキ ル基またはアルケニル基である、請求項１記載の方法。
4. ４．Ｒ１とＲ４中の炭素数の合計が約１２個から約２６個である、請求項２記載 の方法。
5. ５．Ｒ１とＲ４中の炭素数の合計が約１４個から約２４個である、請求項２記載 の方法。
6. ６．Ｒ１がＣ１５アルケニル基、Ｒ２がヒドロキシル基、Ｒ３がＨ、Ｒ４がＣＯ Ｒ５、およびＲ５がメチル基である、請求項１記載の方法。
7. ７．Ｒ１がＣ１５アルケニル基、Ｒ２がヒドロキシル基、Ｒ３がＨ、Ｒ４がＣＯ Ｒ５、およびＲ５がペンタユル基である、請求項１記載の方法。
8. ８．Ｒ１がＣ８アルケニル差、Ｒ２がヒドロキシル基、Ｒ３がＨ、Ｒ４がＣＯＲ ５、およびＲ５がヘプタニル基である、請求項１記載の方法。
9. ９．Ｒ１がＣ１５アルケニル基、Ｒ２がヒドロキシル基、Ｒ３がＨ、Ｒ４がＣＯ Ｒ５、およびＲ５がＣ１７アルキル基である、請求項１記載の方法。
10. １０．Ｒ１がＣ１５アルケニル基、Ｒ２がメトキシ基、Ｒ３がＨ、Ｒ４がＣＯＲ ５、およびＲ５がメチル基である、請求項１記載の方法。
11. １１．前記細胞が白血病リンパ球である、請求項１記載の方法。
12. １２．薬学的に容認できるキャリアおよび下記の構造式を持つ化合物を含有する 、細胞分化を誘導するための薬学的製剤であって、▲数式、化学式、表等があり ます▼Ｉ ただし式中のＲ１はＣ１からＣ２０までのアルキル基またはＣ１からＣ１２まで のアルキル基またはアルケニル基； Ｒ２はヒドロキシル基、アルコキシ基またはＨ；Ｒ３はＨまたは低級アルキル基 ； Ｒ４はＣＯＲ５，ＳＯ２Ｒ５またはＣＳＲ５であり、ここでＲ５はＣ１からＣ２ ０までのアルキル基またはアルケニル基またはアルキニル基であって、これらの 基はＯＨ、ＳＨ、ＯＲ６、ＳＲ６、ＮＲ７Ｒ８、ＣＯＯＲ９、およびＣＯＮＲ１ ０Ｒ８の各官能基のうち１個以上と置換されていてもよく、ただしこれらの官能 基中のＲ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、およびＲ１０は独自に、Ｈ、低級アルキル基、 アリール基、およびアリールアルキル基であり；そして式中のＲ１とＲ４の炭素 数の合計は約１０個から約２８個とする。
13. １３．Ｒ１とＲ４の炭素数の合計が約１０個から約２８個である、請求項１２記 載の組成物。
14. １４．Ｒ１がＣ１からＣ２０またはＣ１からＣ１２までのアルキル基またはアル ケニル基である、請求項１２記載の製剤。
15. １５．Ｒ１とＲ４中の炭素数の合計が約１２個から約２６個である、請求項１３ 記載の製剤。
16. １６．Ｒ１とＲ４中の炭素数の合計が約１４個から約２４個である、請求項１３ 記載の組成物。
17. １７．Ｒ１がＣ１５アルケニル基、Ｒ２がヒドロキシル基、Ｒ３がＨ、Ｒ４がＣ ＯＲ５、およびＲ５がメチル基である、請求項１２記載の組成物。
18. １８．Ｒ１がＣ１５アルケニル基、Ｒ２がヒドロキシル基、Ｒ３がＨ、Ｒ４がＣ ＯＲ５、およびＲ５がペンタニル基である、請求項１２記載の組成物。
19. １９．Ｒ１がＣ８アルケニル基、Ｒ２がヒドロキシル基、Ｒ３がＨ、Ｒ４がＣＯ Ｒ５、およびＲ５がヘプタニル基である、請求項１２記載の組成物。
20. ２０．Ｒ１がＣ１５アルケニル基、Ｒ２がヒドロキシル基、Ｒ３がＨ、Ｒ４がＣ ＯＲ５、およびＲ５がＣ１７アルキル基である、請求項１２記載の組成物。
21. ２１．Ｒ１がＣ１５アルケニル基、Ｒ２がメトキシ基、Ｒ３がＨ、Ｒ４がＣＯＲ ５、およびＲ５がメチル基である、請求項１２記載の組成物。
22. ２２．細胞の分化を誘導するための医薬品の調製または製造における、下記の構 造式を持つ化合物の使用であって、 ▲数式、化学式、表等があります▼Ｉ ただし式中のＲ１はＣ１から約Ｃ２０までのアルキル基またはアルケニル基；Ｒ ２はヒドロキシル基、アルコキシ基またはＨ；Ｒ３はＨまたは低級アルキル基； Ｒ４はＣＯＲ５、ＳＯ２Ｒ５またはＣＳＲ５であり、ここでＲ５はＣ１からＣ２ ０までのアルキル基またはアルケニル基またはアルキニル基であって、これらの 基はＯＨ、ＳＨ、ＯＲ６、ＳＲ６、ＮＲ７Ｒ８、ＣＯＯＲ９、およびＣＯＮＲ１ ０Ｒ８の各官能基のうち１個以上と置換されていてもよく、ただしこれらの官能 基中のＲ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、およびＲ１０は独自に、Ｈ、低級アルキル基、 アリール基、およびアリールアルキル基であり；そして式中のＲ１とＲ４の炭素 数の合計は約１０個から約２８個とする。
23. ２３．治療に有効な量の前記の化合物が医薬品中に存在する、請求項２２記載の 使用。
24. ２４．Ｒ１とＲ４の炭素数の合計が約１０個から約２８個である、請求項２２記 載の使用。
25. ２５．Ｒ１がＣ１からＣ２０までのアルキル基またはＣ１からＣ１２までのアル キル基またはアルケニル基である、請求項２２記載の使用。
26. ２６．Ｒ１とＲ４の炭素数の合計が約１２個から約２６個である、請求項２４の 使用。
27. ２７．Ｒ１とＲ４の炭素数の合計が約１４個から約２４個である、請求項２４の 使用。
28. ２８．Ｒ１がＣ１５アルケニル基、Ｒ２がヒドロキシル基、Ｒ３がＨ、Ｒ４がＣ ＯＲ５、およびＲ５がメチル基である、請求項２２記載の使用。
29. ２９．Ｒ１がＣ１５アルケニル基、Ｒ２がヒドロキシル基、Ｒ３がＨ、Ｒ４がＣ ＯＲ５、およびＲ５がペンタニル基である、請求項２２記載の使用。
30. ３０．Ｒ１がＣ８アルケニル基、Ｒ２がヒドロキシル基、Ｒ３がＨ、Ｒ４がＣＯ Ｒ５、およびＲ５がヘプタニル基である、請求項２２記載の使用。
31. ３１．Ｒ１がＣ１５アルケニル基、Ｒ２がヒドロキシル基、Ｒ３がＨ、Ｒ４がＣ ＯＲ５、およびＲ５がＣ１７アルキル基である、請求項２２記載の使用。
32. ３２．Ｒ１がＣ１５アルケニル基、Ｒ２がメトキシ基、Ｒ３がＨ、Ｒ４がＣＯＲ ５、およびＲ５がメチル基である、請求項２２記載の使用。