JPH05508147A - Ｌ―グルタミン酸の輸送を阻害する方法 - Google Patents

Ｌ―グルタミン酸の輸送を阻害する方法

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JPH05508147A JP90515858A JP51585890A JPH05508147A JP H05508147 A JPH05508147 A JP H05508147A JP 90515858 A JP90515858 A JP 90515858A JP 51585890 A JP51585890 A JP 51585890A JP H05508147 A JPH05508147 A JP H05508147A
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チェンバリン，エイ．リチャード
ブリッジズ，リチャード　ジェイ．
コットマン，カール　ダブリュー．
エス． スタンレー，マーク
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ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｌ−グル　ミン　の　°を　る 本発明は、国立衛生研究所によって授与された助成金（Ｇｒａｎｔ）　Ｎｏｓ、 　ＮＳ−２５４０１およびＭＳ−０１２２７、および米国陸軍によって授与され た契約Ｎｏ、　ＤＡＡＬ−０３−８６−に−００６７のもとで、政府の援助によ り行われた。米国政府は本発明に対し権利を有する。
＆豆旦宵盈 Ｌ−グルタミン酸は哺乳類の脳で最も豊富に存在する興奮性神経伝達物質の一つ であり、かくして、中枢神経系の大多数のシナプス伝達に関与している。この酸 性アミノ酸は、神経伝達の過程の間に多くの異なるタンパク質（興奮性神経伝達 物質のレセプター、輸送系、および酵素）の結合部位と相互作用することが知ら れているにもかかわらず、これらの相互作用の特異的な構造上の詳細については 知られていない。
多くの証拠によって、Ｌ−グルタミン酸の興奮性作用を媒介するシナプス後部レ セプターにはいくつかの種類が存在すること、およびその結果生じる興奮性シグ ナルを終結させる高アフィニティーの輸送系が存在することが確かなものとして 確立された。インビボでは、内因性のし一グルタミン酸あるいはグルタミン酸様 分子がこれらの各部位に結合するが、インビトロでは、様々なグルタミン酸アナ ログは選択的アフィニティーを示し、そのことにより、個々のレセプターのクラ スを薬理学的に区別し得る。特に、３つの主要な興奮性アミノ酸伝達レセプター の型が、種々のアゴニスト：Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸塩（ＮＭＤＡ）　 、カイコン酸塩（ＫＡ）　、およびｑｕｉｓｑｕａｌｔａｔｅ　（ＱＡ）　、と の特徴的な相互作用によって区別されている。これらのアナログは、いろいろな りラスの伝達レセプターを経験的に同定し、そして特徴付けるのに非常に貴重で あるという事実にもかかわらず、観察される結合特異性を特異的な分子のフンフ ォメーションによって説明する統一のモデルはつかみどころのないままである。
伝達シグナルの終結のための迅速な化学的分解に依存する系とは異なり、Ｌ−グ ルタミン酸は高アフィニティー輸送によってシナプス間隙から除去される。この 場合もまた、いくつかの競合阻害剤が同定されているにもかかわらず、この輸送 系に結合する基質のコンフォメーション上の要求性についてはほとんど知られて いない。この取り込みメカニズムの機能的特徴に対する関心は、グルタミン酸（ および他の興奮性アゴニスト）の過剰量は神経毒性であり、例えば、虚血、低血 糖、てんかん、ハンチントン病、およびアルツノ＼イマー病のような神経異常に 重要な役割を果たしているようであるという最近の所見とともに、劇的に高まっ た。
従って、輸送系に影響を及ぼす化合物のさらなる発見は、輸送系を理解する上で 決定的であり、また、輸送系に関連した様々な疾患を治療するのに有用であろう 。出願人は、Ｌ−グルタミン酸の高アフィニティー輸送に対する強力で選択的な 阻害剤を発見することにより、この必要性を充足させた。
Ｒ朋フと１旨 神経伝達物質の輸送体を下記の構造を有する化合物と接触させる工程を包含する 、神経伝達物質をシナプスから除去する輸送を阻害する方法であって あり、および Ｒ２＝　ＯＲ３，ＮＲ３２，アルキル、あるいは置換されたアルキル。
およびＲ３＝アルキルあるいは置換されたアルキルである：方法。
区ｊ目とｌ星１１咀 図１はＬ−グルタミン酸、Ｌ−トランス−２，４−ＰＤＣ，）レオーβ−ヒドロ キシーＤ−アスパラギン酸、Ｄ−アスパラギン酸およびジヒドロカイニン酸の比 較を示す。
図２は、ＰＤＣのジアステレオマーの合成を示す。
図３は、Ｌ−トランス−２，４−ＰＤＣによる、シナブトソーム中へのＬ−グル タミン酸の輸送の阻害を示す。３Ｈ−Ｌ−グルタミン酸（１０μＭ）のシナプト ソームへの取り込みは、３７℃で２０μＭのＰＤＣの異性体が存在する場合と存 在しない場合で行った。図に示した曲線は代表的な実験からのものであり（ｎ・ ２−４速度測定）、そして平均±ＳＤで表している。輸送速度を一次回帰分析で 決定して、バックグラウンドおよび非特異的取り込みで補正した。ＰＤＣおよび その異性体の効果をコントロールの輸送速度に対する％±ＳＤ　（ｎ　＝　８− １６速度測定）で表した。
１１囚１皿屋旦ｌ 内因性の神経伝達物質として、Ｌ−グルタミン酸はシナプス伝達の過程の間で、 いくつかの異なるタンパク質と相互作用する。これらの相互作用には、シナプス 応答を媒介する多数のレセプター、およびシナプス間隙からし一グルタミン酸を 除去してその興奮性シグナルを終結させるのに関与している輸送系が包含される 。おそらくこれらのタンパク質はそれぞれ、特異的なし一グルタミン酸のフンフ ォーマ−を結合する。なぜなら、コンフォメーション上に偏ったアナログ同志は 個々の部位と、異なる選択性で相互作用する結果、様々なタンノｆり質（レセプ ター、輸送タンパク質、酵素、など）上の結合部位を識別するからである。この 仮説は、Ｌ−トランス−ピロリジン−２，４−ジカルボン酸（以後、「Ｌ−トラ ンス−２，４−ＰＤＣＪと呼Δ：）はナトリウム依存性のグルタミン酸輸送の強 力な阻害剤であるが、３つのクラスの興奮性グルタミン酸レセプターに（まあま り結合しないことを示す本明細書中の結果によって、さらに支持されている。こ の選択性に基づいて、Ｌ−）ランス−２，４−ＰＤＣは、トメチル−Ｄ−アスパ ラギン酸（ＮＭＤＡ）　、カイニン酸（ＫＡ）　、およびｑｕｉｓｑｕａｌｉｃ 　ａｃｉｄ　（ＱＡ）のレセプターに結合するのに必要な特徴とは異なる、この 取り込み系に結合するのに必要な特異的構造／コンフォ−シヲンの特徴を具現す る。
Ｌ−グルタミン酸の輸送体の正確な性質は知られていないが、この輸送体は一般 にタンパク質であると考えられている。このため、本明細書中ではこの輸送体を タンパク質とする。しかしながら、本発明には、本発明の化合物が輸送体に結合 する限りにおいて、実際の組成にかかわらず輸送体を阻害することが包含される と解される。
正常のＣＮＳ組織中のグルタミン酸輸送の阻害は意味深い生理学的結果を生じ得 る。以前の研究では、加えたし一グルタミン酸の興奮性作用は輸送阻害剤を同時 投与すると延長することが示されているけれども、輸送能を大きく減少させると 、シナプス間隙にＬ−グルタミン酸の潜在的興奮毒性レベルが蓄積される結果と なろう。一方、グルタミン酸の輸送阻害はまた、シナプス間隙における伝達物質 の半減期を増加させることによって折衷経路を増加し得る。
Ｌ−グルタミン酸の取り込みの特異的阻害剤が利用可能になることにより、神経 伝達における輸送系の役割を評価するのに有用なプローブが提供される。本発明 は、グルタミン酸のコンフォーマ−の模倣体としてフンフォ−ンヨンが明確な、 比較的に硬直したＰＤＣ体を使用するという戦略が、取り込み系に対するのみな らず興奮性レセプターに対しても選択的な結合について化学的基礎の新しい理解 を与えるものであることを証明している。
従って、本発明は、下記の構造を有する化合物と接触させる工程を包含する、神 経伝達物質をシナプスから除去する輸送を阻害する方法であって ト −１（ＯＨン（ＯＲ３）　；またＣ０ＮＨＲ３：の任意の組合わせであり、およ び Ｒ２＝　ＯＲ３，ＮＲ３２，アルキル、あるいは置換されたアルキル。
およびＲ３＝アルキルあるいは置換されたアルキルである；方法、を提供する。
本発明は、特にシナプスからのし一グルタミン酸の除去の阻害によって実証され る。しかしながら、当該分野の当業者にはＬ−グルタミン酸を結合する物質はま た、Ｌ−グルタミン酸様化合物、例えば、Ｌ−アスパラギン酸、システィン酸、 ホモシスティン酸、および神経伝達物質として作用し得る他の興奮性アミノ酸ア ナログをも結合することが認識されている。従って、唯一の判断基準は、阻害さ れる化合物が本発明の化合物と同じ輸送系に結合する神経伝達物質であることで ある。
本発明は、特に１４ランス−ピロリジン−２，４−ジカルボン酸の効力を証明す ることによって、このような化合物の効力を示している。別の化合物もまた、こ の効力に必要な必須のコンフォメーションを維持する場合には同様の効力を有し 得る。
本発明はまた、上述した化合物の１種あるいはそれ以上を投与することを包含す る、Ｌ−グルタミン酸、あるいはＬ−グルタミン酸様分子、の欠乏に関連した病 態あるいは病理を治療する方法、を提供する。これらの欠乏は、老化、外傷、お よびアルツハイマー病あるいはハンチントン病のような進行性疾病における運動 性機能不全、記憶の喪失、あるいは他の中枢神経系の欠陥につながり得る。
本発明は、シナプス間隙でのし一グルタミン酸の半減期を増加させることによっ て、損傷された経路におけるＬ−グルタミン酸の興奮性シグナルを増強する方法 を提供する。脳卒中、進行性疾病、脳組織あるいはを髄の外傷のような病気では 、興奮性経路の機能が損失している。Ｌ−グルタミン酸の除去を阻害することに よって、伝達物質の興奮性シグナルを増強し、そして放出の減少およびシグナル の弱小化を補い得る。
本発明はまた、病理的状態によってエネルギー状態の悪くなった細胞からの潜在 的神経毒性であるし一グルタミン酸の放出を減少、あるいはブロックする方法、 およびこれに伴う二次的な病気を防ぐ方法を提供する。取り込み過程に対する現 在のモデルは、輸送体のタンパク質が基質分子の膜を通過し細胞の中へ移動する のを助ける際に丁度［回転式改札口（ｔｕｒｎｓｔｉｌｅ）　Ｊのように作用す ることを示している。この点から言えば、基質は細胞膜を通過するいずれの方向 にも移動し得る。Ｌ−グルタミン酸のような化合物を細胞の内側に濃縮するため には、多量のエネルギーが使われなければならない（すなわち、能動輸送）。エ ネルギーレベルが枯渇すると、これは病理的状！！（酸素欠乏症、虚血、外傷、 てんかん発作）に付随すると考えられるが、その結果、輸送タンパク質の逆作用 によって細胞内のグルタミン酸が細胞から放出されるであろう。しかしながら、 し−）ランス−２，４−ＰＤＣあるいは類似の誘導体が、輸送系の阻害剤として 同定され、かつ取り込みの真の基質でないならば、この化合物は輸送タンパク質 に結合し、細胞外方向に結合部位をロックする。その結果、輸送系を渋滞させ、 そして膜輸送を生理学的にブロックすることによって細胞からのグルタミン酸の 放出を遅延あるいは防止する。
この放出を減少させる能力によって細胞外グルタミン酸の興奮毒性に伴う病理的 損傷が減少する。
本発明はさらに、輸送体のタンパク質と相互作用するのに必要とされる化学的性 質を同定するためのメカニズムを提供する。鏡像体の純度と、調製したＬ−グル タミン酸アナログの限定されたコンフォメーション（すべてり、　Ｌ、シスおよ びトランス異性体）とによって、これらのアナログ上の官能基の三次元の特徴が 決定され得る。従って、グルタミン酸の輸送の強力な阻害剤が合成され、同定さ れただけでなく、輸送体への結合に必要とされる化学的要求性もまた決定された 。このように、Ｌ−）ランス−２，４−ＰＤＣを用いた結合研究の結果得られた コンフォメーションのデータは、輸送体への結合を目的とする他の誘導体を設計 するうえで重要なモデルとして働く。
結合部位のモデル化は従来は不可能であった。なぜなら、従来の化合物は純粋で ないか、あるいはコンフォメーション的に曲がりやすすぎたからである。従って 、Ｌ−）ランス−２，４−ＰＤＣまたはそのアナログのグルタミン酸輸送体に結 合するためのコンフォメーションを有する任意の部分（ｍｏｔａｔｙ）を製造し 、同じ機能で使用し得る。従って、Ｌ−グルタミン酸のみならず、他の既知の輸 送阻害剤も同様の幾何学をとり得るはずである。この概念を試験するために、Ｌ −グルタミン酸、Ｌ４ランス−ＰＤＣ，および従来から輸送阻害剤として同定さ れている、トレオーβ−Ｌ−アスパラギン酸、Ｄ−アスパラギン酸、およびジヒ ドロカイニン酸についてＭＭＸを最小とするコンフォメーションを、各々の対が フンフォメーシッン上最小となるようにα−カルボキシル基、α−アミノ基、お よび遠位のカルボキシル基の原子間の偏差の平均を計算して比較した。図１に示 すように、これらの各酸性アミノ酸の特異的コンフォメーションの間にはかなり ホモロジーがある。各フンフォーマ−は明瞭化のために水素を省いて示しており 、モしてα−カルボキシル／Ｃα結合はｙ軸方向にあり、モしてα−カルボキシ ル基、α−アミ７基（黒で示している）、および遠位のカルボキシル基はｘｙ平 面にあるように並べである（ジヒドロヵイニン酸のイソプロピル基もまた明瞭化 のために省略している）。Ｌ−グルタミン酸のフンフォーマ−１５は、溶液中で 約２０％を占めることが報告されているスタガード型コンフォメーションと非常 に類似した局所極小値構造を有する。Ｌ−グルタミン酸およびＬ−）ランス−Ｐ ＤＣの間でそれぞれの対同志を全て比較すると、コンフォーマ−１５と７とが最 も緊密に重なり合う。同様の比較をトレオーβ−ヒドロキシ−し一アスパラギン 酸、Ｄ−アスパラギン酸、およびジヒドロカイニン酸についても行い、１６．１ ７、および１８を得た。
これらの化合物は同様の官能基を共有するが、本明細書中の分析の助けによって 、以前は明白にされてはいなかったコンフォメーションの類似性が明かにされた 。例えば、Ｌ−トランス−ＰＤＣおよびジヒドロカイニン酸のフンフォーマーヲ 視覚的に比較する場合、直感的にピロリジン環を重ね合わせようとしがちである が、官能基間の満足のいく対合は１８におけるように、プロリンの環そのものは 並べ置かれない場合にのみ得られる。図１に示す５個のフンフォ−シ１ンは全て 、折り畳み配置中の２個のカルボ牛／ル基が、カルボキシル基の炭素間を隔てる 距離が４．２±０．３人であり、モして遠位のカルボキシル基と窒素の距離が３ ４±０３人であるように配置されていることによって特徴付けられる。このよう にして決められた官能基の配列は、５個の化合物が図に示すフンフォメーション で輸送タンパク質に結合することを示している。さらに、Ｌ４ランス−ＰＤＣは 興奮性アミノ酸のレセプター結合を阻害しないので、この結果は、同定された官 能基の配列はグルタミン酸輸送系に特異的であるという仮説を支持している。
本発明はまた、興奮性アミノ酸レセプターのアゴニストに感受性である生物を選 択的に殺すメカニズムを提供する。興奮性アミノ酸レセプターのアゴニストはあ る無を推動物に対して有毒であることが古くから知られていた。この最も良い例 はカイニン酸であり、これはもともと抗回虫（腸管内回虫）薬として記載された 。Ｔ、　Ｔａｋａｍｏｔｏの、Ｋａｉｎｉｃ　Ａｃ１ｄ　ａｓ　Ｔｏｏｌｉｎ　 ＮｅｕｒｏｂｆｏｌｏｇｙＳＥｄ、ＭｃＧｅｅｒらの、Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ 、Ｎ、Ｙ、（１９７８）、これは本明細書中に参考として援用される。Ｌ−グル タミン酸の除去を阻害するＬ４ランス−２，４−ＰＤＣの能力もまた、細胞外の 興奮性アゴニストを過剰に蓄積させるので有毒で宵り得る。従って、これらの輸 送阻害剤は無を推動物に対して毒素として有用であり得る。
本明細書中で述べているように、提供された化合物がシナフスカらのし一グルタ ミン酸の輸送を阻害し得るので、この方法は効果的であり得る。該化合物はＬ− グルタミン酸の除去を競合的に阻害するので、Ｌ−グルタミン酸はシナプス中に 残存し、神経学的伝達においてレセプターに結合し得る。そしてその結果、Ｌ− グルタミン酸の欠乏による影響を克服し得る。
本発明の化合物を投与する手段は当該分野では周知のものであり、効力を増強す る目的で容易に改変し得る。例として、通常の懸濁剤、分散剤を含有する水溶性 懸濁液、あるいは産業規格に従って処方し得る、湿潤剤の保存薬包素剤、芳香剤 、あるいは甘味料を包含する。同様に、水を加えることによって水性懸濁液を調 製する分散粉末および分散顆粒が提供され得る。
上述した化合物の最適濃度は様々な要因、例えば、所望の投与回数、投与経路（ 経口、腹腔内、静脈内、あるいは手術中ＣＮＳ組織に直接投与）、効果の持続時 間、必要とされる修復および／あるいは保護の量、疾病あるいは外傷の重篤度、 毒性学的検討の結果、あるいは有害な副作用レベル、および化合物またはそのキ ャリアーの化学的性質から考慮すべき点からなる関数である。
上述した化合物の、本発明で推奨される有効な投与量は０゜０１ｍｇ／ｋｇおよ び１００　ｍｇ　／　ｋｇの間であり；好ましくは、０．５ｍｇ／ｋｇおよび１ ０＋ＴＩｇ／ｋｇの間であり；そして最も好ましくは、０．５ｍｇ／ｋｇおよび ５ｍｇ／ｋｇの間である。特定の投与方法における化合物の有効な投与量は、標 準動物あるいは臨床試験技術によって容易に決定し得る。しかしながら、投与の 単位組成物は薬理学的に効果的な活性成分の量を含有する。
下記の実施例は、単に本発明を説明したものであって、これに限定しようとする ものではない。さらに、実施例では図面に示す特定の構造に対する参照番号が用 いられている。
実施例Ｉ 化学 シスおよびトランスＬ−ピロリジン２，４−ジカルボン酸は、それぞれ４および ７で示しているが、市販のトランス−４−ヒドロキシ−し−プロリンから合成し た（図２）。４の合成には、出発物質であるプロリン誘導体１に、ＣＢＺクロリ ド、トシル酸のエタノール溶液、およびトシルクロリド／ピリジンを順次反応さ せて、保護されたトシル体２に変換した。シアン化物にょるトシル基のＳｓ２置 換によって、シスのニトリルエチルエステルを得、これに湿性メタノール中でＰ ｉｎｎｅｔ反応およびエステル交換反応を行って、３を得た。続いて、得られた ジエステルをけん化し、そして最後に水素化分解して、４を、４７％の全体の収 率で得た。トランス二価酸７の調製に必要なシスのトシル酸エチルエステル５は 、Ｎ−ＣＢＺ−トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−７’ロリンをＪｏｎｅｓ酸化し 、そして得られたケトンをＮａＢＨａにより立体選択的に還元することによって 容易に調製される。次に、エステル化およびトシル化によって収率６６％で５を 得た。このトシル体の７への変換は、上述した４段階の置換／　Ｐ　ｉ　ｎｎｅ 　ｒ／脱保護を順次行うことによって行い、その収率は約４９％であった。
シス−４−ヒドロキシ−Ｄ−プロリン８はＤ−二価酸の１１および１４の出発物 質となる。１を４に変換する工程に従って、シストシル体のエチルエステル９を 、８から３段階（８８％）で調製した。
そして、トシル体のエチルエステル（この場合では９）を対応する２、４−ピロ リジンジカルボン酸にする４段階の変換によって、トランス−４−カルボキシ− Ｄ−プロリン１１（５６％）を得た。使用されるＤ一体開始物質はトランスでは な（シスのジアステレオマーであるので、この場合のアルコール反転の過程は上 述のものとは異なる。従って、エステル９のＣ−４トシレー］・基を、ｎ−Ｂｕ ＪＯＡｃによるＳＮ２置換で反転させ、得られたアセテートをエタノール中のＮ ａ０Ｅｔにより加水分解し、そして反転したアルコール基をトシル化することに より、トランスエステル１２を７６％の収率で得た。１２に前述した４段階の工 程を行って、１２から４４％の収率で１４を得た。目的物の二価酸のエナンショ マー純度を、Ｎ−脱保護されたジメチルエステル３．６．１０および１３から調 製したＭｏ５ｈｅｒアミドの’ＨＮＭＲスペクトルを比較して測定したところ、 Ｄａｌｅ、Ｊ、Ａ、ら、Ｊ、　Ｏｒｇ、　Ｃｈｅｗ、３４：２５４３　（１９６ ９）の場合ではそれぞれ〉９５％であった。この文献は本明細書中に参考として 援用されている。最終的な二価酸の生成物は脱保護中、エピマー化が見られなか ったが、このことは、各方とも立体化学的に活性な中心が完全なまま保存されて いることを示している。
実施例■ 薬理学 シナブトソームを（ａ）Ｂｏｏｔｈ、　Ｒ，Ｆ、Ｇ、；　Ｃ１ａｒｋ、　Ｊ、Ｂ 、、　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｊ、　１７６、３６５　（１９７８）の方法で調製し、 （ｂ）Ｋｕｈａｒ、　Ｍ、Ｍ、：　Ｚａｒｂｉｎ、　Ｍ、Ｊ、、　Ｎｅｕｒｏｃ ｈｅｍ　３１．２５１　（１９７ｇ）の記載のようにシナブトソームでの取り込 みをアッセイした。これらは両方とも本明細書中に参考として援用されている。
４個のＰＤＣ異性体の結合特異性は、’Ｈ−Ｌ〜グルタミン酸のシナプトソーム への高アフィニティー輸送を阻害する能力、およびシナプス形質膜調製物（ＳＰ Ｍ）において３種のレセプターの各部位に対する放射性リガンドの結合をブロッ クする能力の両方について試験することによって測定したく本明細書中に参考と して援用されている、Ｍｏｎａｇｈａｎ、　Ｄ、Ｔ、；　Ｃｏｔｍａｎ、　Ｃ， Ｗ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ。
Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８３．７５３２　（１９８６）の記載のように、シナプス原 形質膜を調製しＮＭＤＡレセプターに対する結合を定量した）。図３に表すよう に、３Ｈ−Ｌ−グルタミン酸の取り込みアッセイにＬ−グルタミン酸に比較して ただ２倍過剰（３Ｈ−Ｌ−グルタミン酸１０μＭに対して７が２０μＭ）で含ま れるだけで、Ｌ−）ランス−２，４−ＰＤＣ異性体は、シナプトソームでの輸送 速度をコントロールレベルの１．１３　ｎｍｏ１分−’ｍｇタンパク質−１から ０．１６　ｎ＋ｓｏ１分−’ｍｇタンパク質−１減少させた。この数値は取り込 み速度が８０％以上減少することを表しており、このことは、この化合物が輸送 タンパク質と、少なくともし一グルタミン酸自身と同じくらい高いアフィニティ ーで相互作用することを示している。これとは対照的に、Ｌ−シス、Ｄ−シス、 およびＤ−）ランス異性体が同様の濃度で含まれる場合には、実質的に効果は低 いことがわかった。
１、−トランス−ＰＤＣの作用のキネティック分析を図３に示す。
３）１−Ｌ−グルタミン酸（４，６，６，１０，２５，６６μＭ）の取り込みを 、Ｌ４ランス−２，４−ＰＤＣが存在しない場合および存在する場合（ａ、　Ｏ ｒｂ、　３：　ｃ、　９：　ｄ、　１８μＭ）において、２５°Ｃで２分間追跡 した。−次回帰直線で直線を決定し、Ｌ−グルタミン酸のＫｍ値およびＶｍａｘ 値としてそれぞれ、１５，３μＭおよび１．９Ｈｍｏｌ／分／ｍｇタンパク質を 得た。Ｌ−１−ランス−２，４−ＰＤＣのＫｉ値は勾配を再プロｙトして決定し 、４６μＭの数値を得た。図３のプロットは代表的な実験を示しており、一方、 その下に表した数値は５−７回の実験の平均から決定されたものである。Ｌ−グ ルタミン酸のシナブトソーム輸送のＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋブｏ　ット （Ｖ　＊　ｎｍｏｌＬ−グルタミン酸／分／ｖａｇタンパク質；Ｓ＝μＭＬ−グ ルタミン酸）は、Ｌ−トランス−ＰＤＣの作用の濃度依存性を実証し、そして競 合阻害剤のパターンと一致したパターンを示している（すなわち、Ｖｍａｘの変 化なしにｋｌｌｌａｌ）ｌ）が増加する）。Ｌ−グルタミン酸の輸送に対するＫ ａ＋値およびＶｒａａｘ値は、２５℃で、それぞれ１６．６±２．７μＭおよび ３．４１±１．４６ｎｍｏｌ／分／＋ｎｇタンパク質であることがわかった（ｎ ＝７）。勾配の再プロット（図３、挿入図）によって、Ｌ４ランス−ＰＤＣに対 するＫｉ値は５．０６±１．５５μＭ　（ｎ　＝　５）であることが示された。
このようにして、Ｌ−トランス−ＰＤＣが配置が明確な競合的輸送阻害剤として 同定され、このことはグルタミン酸取り込みタンパク質に結合するための好まし いコンフォメ−ション（および／あるいはコンフォメーション）の相互関係を明 確に表している。
Ｌ４ランス−ＰＤＣの作用を他の既知のし一グルタミン酸輸送のプロ、カーと比 較した実験を表１に要約している。新規の阻害剤は、輸送アッセイに１０μＭ含 まれる場合、［’Ｈ］−Ｌ−グルタミン酸（５μＭ）の取り込みを、コントロー ルの４５±４％まで減少させた。用いた実験条件下では、この阻害の程度はＤ− アスパラギン酸、Ｄ、Ｌ−β−トレオーヒドロキシーアスパラギン酸、またはジ ヒドロカイニン酸のいずれかについて観察された程度よりも大きかった。ジヒド ロカイニン酸は高濃度においてのみ、し−グルタミン酸の輸送レベルを減少させ た。これらの知見は、Ｌ−トランス−ＰＤＣがこれまでに同定された内で最も強 力なグルタミン酸のブロッカ−の一つであることを示している。
表１ Ｌ−グルタミン酸の取り込みに対する競合阻害［３Ｈ］−Ｌ−グルタミン酸 化合物（μｍ）（５μＭ）の取り込み コントロールに対する％ コントロール　１００ Ｌ−）ランス−２，４−ＰＤＣ７（１０）　４５　±　４Ｄ−アスパラギン酸　 （１０）　５８　±　５Ｄ、Ｌ、−β−トレオーＯＨ−アス八へラキ″ン酸（１ ０）　７２　±　１３ノ゛ヒドロカイニン酸　（１０）　９３　±　９表１に表 す取り込みデータはコントロールに対する％平均上ｓ、ｄ、　（ｎ≧６、各々３ 回繰り返し実験）で示している。取り込みアッセイは、実施例Ｖに記載するよう に行い、非特異的取り込みおよび漏出について補正した。
ＰＤＣのコンフォーマ−の薬理学的特異性をさらに特徴付け、およびこの輸送阻 害剤が結合し得る他の可能な部位を同定するために、３Ｈ−Ｌ−グルタミン酸の ＮＭＤＡレセプターへの結合、３Ｈ−ＫＡのＫＡレセプターへの結合、および３ ＋（−ＡＭＰＡ　（α−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチルインキサシ−ルー ４−プロピオン酸）のＱＡレセプターへの結合を阻害する能力について化合物を 試験した。カイコン酸塩レセプターへの結合は、（ａ）Ｓｉｍｏｎ、　Ｊ、Ｒ， ：Ｃｏｎｔｒｅｒａ、　Ｊ、Ｆ、；　Ｋｕｈａｒ、　Ｍ、Ｊ、、　Ｊ、　Ｎｅｕ ｒｏｃｈｅＩ１１２６．１４１　（１９７６）、および（ｂ）　Ｌｏｎｄｏｎ、 　Ｅ、Ｄ、；　Ｃｏｙｌｅ、　Ｊ、Ｔ、；　Ｍｏ１ｅｃ、　Ｐｈａｒｍ。
１５、４９２　（１９７９）の方法によって定量した。これらは本明細書中に参 考として援用されている。ｑｕｉｓｑｕａｌａｔｅレセプター（ＱＡ）への結合 は、（ｃ）　Ｈｏｎｏｔｅ、　Ｔ、　；　Ｌａｕｒｉｄｓｅｎ、Ｊ、　：　Ｋｒ ｏｇｓｇａａｒｄ−Ｌａｒｓｅｎ、　Ｐ、Ｊ、、　Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ　１９８ ２．３８．１７３が記載しているように定量した。これらは本明細書中に参考と して援用されている。表２に報告するように、Ｄ−トランス−ＰＤＣだけが、３ Ｈ−Ｌ−グルタミン酸のＮＭＤＡレセプターへの結合を弱く阻害するという、い くらかの阻害活性を示すことがわかった。特に、Ｌ−トランス−２，４−ＰＤＣ は、１０′倍過剰に存在する場合でさえ、３種のレセプターのいずれに対する放 射性リガンドの結合をも有意に阻害しなかった。このように興奮性レセプターの いずれとも相互作用しないことは、その強力な輸送阻害とはまさに対照的であり 、Ｌ−トランス−２，４−ＰＤＣをＬ−グルタミン酸の輸送系の特異的プローブ として同定する。
表２ 二価酸４．７．１１および１４の競合結合の研究ＱＡレセプター　ＫＡレセプタ ー　ＮＭＤＡレセプターへの３Ｈ−ＡＭＰＡ　への３［１−ＫＡ　への３［１− Ｌ−ＧＬＵ結合　結合　結合 二価酸（濃度）　コントロールに対スる％コントロール　１００　１００　１０ ０４　（１００μＭ）　１０２±１２　１００±　１２８９±　１３７　（１０ ０μＭ）　１０９　＋　１３　１０２　＋　１０　８７　＋　１０１１　（１０ ０μＭ）　１０８±１１９２±　６　９５±　１２１４　（１００μＭ）　１１ ０±　９１０１±　６　３８±　１２（２０μＭ）７６±　５ 表の結合データはフントロールの結合に対する％士そのｓ、ｄ、で表す。結合ア ッセイを上述した方法で行い、そして非特異的結合で補正した。
実施例■ グルタミン酸のシナブトソームへの取り込みンナプトソームを、フィコール／ス クロース勾配遠心分離を用いて、５ｏｏｔｈら（Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｊ、　１７６ ：３６５　（１９７８）、本明細書中に参考として援用されている）の方法によ って調製した。
３Ｈ−Ｌ−グルタミン酸の取り込みは主にｋｕｈａｒおよびＺａｒｂｉｎ　（Ｊ 。
Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ　３１＋２５　（１９７８）、本明細書中に参考として援用 されている）の記載に従って行った。シナブトソームを生理的緩衝液（ｋｒｅｂ ｓ−Ｒｉｎｇｅｒリン酸緩衝液）に懸濁して、３７℃あるいは２５’Ｃで５分間 プレインキュベートした。取り込みアッセイは、’　Ｆｌ−Ｌ−グルタミン酸（ ０，５−１００μＭ）を加えることによって開始した。阻害実験では、［３１（ ］−］Ｌ−グルタミンと阻害剤（２−１８μＭ）とを同時に加えた。適当な時間 （０，５−４分）に一部分を取出して、直ちにＣＦ／Ｆガラスファイバーフィル ター上で濾過した。フィルターを迅速に２０容量の水冷緩衝液で洗浄した。フィ ルター上に存在する放射能を液体シンチレーションカウンターで測定した。取り 込み速度はバックグラウンド（すなわち、０分における取り込み）および漏出（ すなわち、０°Ｃにおける取り込み）の両方で補正した。タンパク質濃度は、Ｐ ｉｅｒｃｅ　ＢＣＡ　（ビシンコニン酸）タンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ、 　Ｒ。
ｃｋｆｏｒｄ、　ＩＬ）によって測定した。
実施例■ 興奮性アミノ酸レセプターの結合 シナプス形質膜（ＳＰＭＳ）を前述した方法（Ｍｏｎａｇｈａｎ、　Ｄ、　Ｔ。
：　Ｃｏｔ＋ｓａｎ、　Ｃ，Ｗ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅ ｔ、　ＵＳＡ　８３ニア５３２　（１９８６）、本明細書中に参考として援用さ れている）で調製した。
簡単に述べると、雄のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｖｌｅｙラット（２００ｇ）を断頭 して、その前脳を直ちに取り出し、そして脳組織を０．３２Ｍスクロースでホモ ジナイズした。分画遠心分離を行った後、シナプスに富む、ミニリンおよびミト コンドリア量は少ない膜画分を得た。この膜画分を、２００μＭ）ｌスー酢酸塩 緩衝液、ｐＨ７，２で３回洗浄し、適切なアッセイ緩衝液で約２００μｇタンパ ク質／緘に希釈した。
ＮＭＤＡ、　ＫＡ、およびＱＡレセプターへの結合は、それぞれ３Ｈ−Ｌ−グル タミン酸、３Ｈ−ＫＡ、および３）１−ＡＭＰＡを用いて定量した。結合アッセ イは、３種のレセプターの各々のクラスに対して、最適となるように選択された 時間、温度、および緩衝液の条件下で行った。３［１−Ｌ−グルタミン酸の結合 は、選択的にＮＭＤＡレセプターが標識される条件下で定量した。ＳＰＭｓを、 ５０ｍＭトＩＪスー酢酸、ｐＨ７，０で、３＋１−Ｌ−グルタミン酸（１０ｎＭ 、５０．９Ｃｉ／ｍｍｏｌ）トー緒ニ、４°Ｃで３０分間インキュベーションし た。非特異的結合は５００μＭＬ−グルタミン酸を含ませて測定した。ＫＡし曳 ブタ−は前述した方法で定量した。’Ｅｌ−ＫＡ　（１０ｎＭ、　６０Ｃｉ／ｍ ＋１ｏｌ）結合を、５ｈＭ）リス−クエン酸緩衝液中、ｐｌ’１７．　Ｏで、４ ℃で３０分間測定した。非特異的結合は１００μＭの非標識にＡを含ませて測定 した。　ＱＡレセプターはＨｏｎｏｒｓら、Ｊ、　Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ、３８： １７３−１７８（１９８２）の記載のように、３Ｈ−ＡＭＰＡ結合によって測定 した。要約すると、３　Ｈ−ＡＭＰＡ　（１０ｎＭ、　２７．６Ｃｉ／ｍ＋＊ｏ ｌ）結合を、１１００ａ　ＫＳＣＮを含む５０ｍＭ　トリス−酢酸塩緩衝液中、 ｐＨ７，２で、４℃で３０分間測定した。非特異的結合は、１００μＭのｑｕｉ ｓｑｕａｌｉｃ酸を含ませて測定した。阻害実験では、コンフォ−シコンが明確 にされているアナログ類を、適切な濃度（０，１−２００ｕ　Ｍ）で７′ッセイ 混合液中に含ませた。アッセイ（総量、１．０８ｍＬ）は、放射性標識を加えて 開始し、遠心分離によって終了させ？、−，（Ｂｅｅｋ＋ｎａｎ　Ｍｉｃｒｏｆ ｕｇｅ、最高速度で３分）ｏｆ清中の非結合の放射性リガンドを吸引して除去し 、そしてベレットの放射能を液体シンチレーションカウンターで定量した。結合 実験はすべて、１回の実験中に３回繰り返し実験を２組行った。各実験は少なく とも３回繰り返した。
（以下余白） 実施例■ 化学合成 二毅刀坊訴 明細書に記載しているように、Ｂｒｕｋｅｒ　ＷＭ　２５０　（２５０ＭＨｚ） あるいはＧｅｎｅｒａｌ　Ｅｌｅｃｔｒｉｃ　ＱＥ−３００（３００ＭＨｚ）ス ペクトロメーターのいずれかで、プロトンおよび炭素−１３の核磁気共鳴（ＮＭ Ｒ）スペクトルを測定した。有機溶媒中でのスペクトルの測定では、’ＨＮＭＲ に対しては内部標準であるテトラメチルシランからのｐｐｍで、１３ＣＮＭＲで は溶媒からのｐｐｍでデータを表した。Ｄ２０中で測定したスペクトルでは、’ ＨＮＭＲおよび”ＣＮＭＲの両方について、内部３−（トリメチルシリル）プロ ピオン酸のナトリウム塩からのｐｐｍでデータを表した。データを以下のように 表す：化学シフト、多重度（ａｐｐ−見かけ上の、５＝＝−重線、ｄ・二重線、 ｔ・三重線、ｑ・四重線、ｌ＝多重線、ｂｒ＝広い）、カップリング定数、およ び積分強度。赤外（！Ｒ）スペクトルはＰｅｒｋｉｎ−Ｅ１ｍｅｒモデル２８３ スペクトロフォトメーターで測定した。
マススペクトル（ＭＳ）はＦｉｎｎｅｇａｎ　９６１０スペクトロメーターを用 いて測定した。高分解能マススペクトル（ＨＲＭＳ）はＶＧ分析７０７０Ｅスペ クトロメーターで測定した。光学回転はＪＡＳＣＯＤＩＰ−３６０デジタル偏光 計のＰｅｒｋｉｎ−Ｅ１ｍａｒ２４１ＭＣ偏光計で得た。融点（ｍｐ）は研究所 デバイスＭｅｌ−Ｔｅａ＋ｐ融点装置で測定して、補正をしないで表す。元素分 析はＧａ１ｂｒａｉｔｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｋｎｏｘｖｉｌｌｅ、 　Ｔｅｎｎｅｓｓｅｅによって行われた。
乾燥したテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）およびエチルエーテル（Ｅｔ２０）を、 水素化カルシウムおよびｄｅｐｅｒｏｘ分子ふるい（ＦＩｕｋａ、　Ｒｏｎｋｏ ｎｋｏｍａ、　ＮＹ）から蒸留した。不活性ガス雰囲気中での操作はすべて、オ ーブンあるいはフレーム乾燥ガラス製品中のＤｒｉｅｒｊ　ｔｅ乾燥管を通過さ せたアルゴン下で行った。他に記載がなければ、抽出操作からの有機層はすべて 、Ｍｇ５ＯａあるいはＮａ２５Ｏｎで乾燥し、濾過し、そして、回転式エバポレ ーター上で溶媒を除去した。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）は０．２５　ｍ ｍのＭｅｒｃｋのプレコートしたシリカゲル板（６０Ｆ−２５４）上で行った。
フラッシュクロマトグラフィーはＩＣＮ　２００−４００メツシユシリカゲル上 で行った。
Ｎ−ベンジルオキシカルボニル　−トランスー４−ヒドロキシ−し≦４ トランス−４−とドロ牛シーＬ−プロリン１　（１０，０ｇ、　７５．３ｍ＋ｗ ｏｌ）およびＮａＨＣＯ２（１６，０ｇ、１９０＋＋ａ＋ｏｌ）をＨ２Ｏ（１６ ５＋＋Ｌ）に溶解し、次にりｏｏギ酸ベンジル（１２，５ｍＬ、　１５．０ｇ、 　８７．７＋ａｍｏｌ）のトルエン（４０ｍＬ）溶液を１５分間にわたって加え た。室温で１６時間攪拌した後、Ｃ０２の放出が終了し、そして２層に分離した 。過剰のクロロギ酸ベンジルを、エーテル（４ｘ　５０ｍＬ）で洗浄することに より水層から除去した。水浴中で水層を冷却した後、濃塩酸でｐＨ２の酸性にす ると、油状生成物が沈澱した。この油を、水層を繰り返し洗浄（ｓｘｓｏｍＬ） 　して、酢酸エチル中に抽出した。水層をさらに酸性にすると、沈殿物がこれ以 上生成しなかったことから、生成物が完全に除去されたことが示される。有機抽 出物を合わせて乾燥（ＭｇＳＯ，）　Ｌ、そして粘性油にまで濃縮させた。これ を室温で放置すると結晶化し、Ｎ−ＣＢＺ−）ランス−４−ヒドロキシ−し−プ ロリンを１９．９ｇ　（９８％）得た：ｍｐ　１０６−１０７°Ｃ（ｌｉｔ、　 １９ｍｐ　１０６−１０７°Ｃ）　；Ｉａ１２’−７５，５°（ｃ　１．０３、 　ＣＨＣｌ４）［ｌｉｔ、”　［αｌ””−７２°（ｃ　１．ＯＣＨＣｌ３）］ 。
Ｎ−ペンジルオキシ力ルボニルートランスーーヒドロキシーし一プロリンエチル エステル Ｎ−ＣＢＺ−トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリフ　（５，ＯＯｇ、　１８ ．８層ｍｏ１）およびｐ−トルエンスルホン酸−水和物（０，３６ｇ、１．９ｍ ｍｏｌ）をエタノール（３００ａ＋Ｌ）に溶解して、反応混合物をＤｅａｎ−Ｓ ｔａｒｋトラップで湿性エタノールを集めながら還流して加熱した。
１６時間後、反応総量が約５０ｍＬに減少するまでは常に、いっばいになったト ラップを空にし、次に、トシル酸塩を過剰のＮａＨＣＯｔ　（０，８ｇ、　１０ ｍｍｏｌ）で中和した。揮発性物質を真空中で除去し、残査を酢酸エチル（１０ ０１Ｌ）で希釈して、塩が油を含まな（なるまで０．５時間混合物を攪拌した。
固体をセライト−に２ＣＯ３で濾過して除去し、そして、フィルターケークを酢 酸エチル（５０ｍＬ）で洗浄した。濾液を合わせて濃縮して、真空中で洗浄して 、更に精製することなく次の段階で用いるのに充分な純度を有する、濃厚な淡黄 色の油として、粗トランスヒドロキシエステルを５．６ｇ　（１ｏｏ％）得た： （以下余白） ７．２７　（ｍ、　５　Ｍ）、　５．１８−４．９９　（ｍ、　２　Ｈ，ＰｈＣ Ｈ２）、　４．５２−４．４６　（ｍ、　２２．３８−２．２３　（ｍ、Ｉ　Ｈ ，Ｈ−３）、２＋１２−２．００　（！Ｉｔ　ｌ　Ｈ，Ｈ−３３，１，２６−１ ，１０（ｔ、Ｊｍ７．ｌ　Ｈｌ、３　Ｈ，Ｃｏ、ＣＨ３ＣＯ，，２昏１１Ｄｋｉ １．ｌ）’ｆｑ　）；　”ＣＮＭＲ（７５，５ＭＨ１，ＣＤＣｌ、）　６　１７ ２．７４．　１７２．５５．　１５４．９８．　１５４．６０．　ｌコロ、コ５ ゜０６．１１．　１２８．３８．　１２８．コｌ、　１２７．９３．　１２７． ７７、１２７．７２．　６９．９４゜６９．２０．６７．２２．６７．１４．６ １＋２７．６１．１４．５７．９９．５７．７６、５５．１６゜５４．５６．　 ）９．０９．　３Ｂ、３３．　１４．０４．　１３．９２：　ＸＲ（ＣＭＣＩ、 ）　）６２０−３２００（ｂｒｏａｄ）、２９９０．　１７３７．　１７００． 　ユ４２０．　ｌコ５５．　１１９０．　１１７０　ａｍ°’；ＬＲＭＳ（ＣＩ 、７０　ｅＶ、イソブ９ｙ　）　ｍ／ｅ　２９４　（ＭＨ”、Ｚｏｏ）、２５０ 　（８コ）、２２０（１９）、１５８　（１Ｂ）、９１　（ｓｓ）；　襠　（ｒ ：工、７０　ａＶ）　ｍ／ｅ　２９コ、１２６０（２９３，ユ２６コ　ｃａｌｅ ｄ　ｆｏｒ　Ｃ，、）！、？Ｎｏ、）。
Ｎ〜　ベンジルオキシカルボニル　−トランスー４−トシルオキジーープロリン エチルエステル　２ Ｎ−ＣＢＺ−トランス−４−ヒドロキシ−し−プロリンエチルエステル（５，６ ｇ、　１９ｍｍｏｌ）および無水ピリジン（４，６ａ＋Ｌ、　４．５ｇ、　５７ ｍ＋ｉ。
ｌ）のＣＨＣ］３溶液（３０ｍＬ）に、Ｊ）−トルエンスルボニルクロライド（ ７，２ｇ、３８ｍｍｏｌ）を一度に加えた。室温で７２時間攪拌後、反応液をＣ Ｈ２Ｃｌ２　（７０１１１Ｌ）　テ希釈し、１０％ＨＣＩ　（４ｘ　１０＋ＩＩ Ｌ）　’Ｔ”繰り返し抽出してピリジンを除去した。有機層を乾燥（Ｍｇ５Ｏａ 　）　Ｌ、金色の油に濃縮した。これをシリカゲルのフラッシュクロマトグラフ ィー（１・Ｌ　２：１エチルエーテル−石油エーテルヲ用いる傾配溶離）により 精製して、無色の油として純粋な２を８．２ｇ（９８％）得た： ２．６２−２．３８　（ｍ、ｌ　Ｈ，Ｈ−３）、２．４５＋２．４コ　Ｃ５ｔ　 コ　Ｈ，ＰｈＣＨ，）、２．２３−３７４　（２ン、２０２　（２）、１５ｇ　 （２４）、９ｉ　（１００）；　）ｒＲＭＳ　（Ｅ工、４０　ａＶ）　ｍ／ｅ４ ４７．１３３７　（４４７，１コ５１　ｃａｌｃｄ　ｆｏｒ　Ｃ２２Ｈ，Ｎｏ、 ｉ）。
ＤＭＳＯ（１５＋ａＬ）中のトシル体２（５，１９ｇ、１１．６ｍｍｏｌ）の混 合物を攪拌しながら、これに微粉末ＮａＣＮ　（０，８５ｇ、　１７ｖ＋＋ｏｌ ）を加えた。反応混合物を８０℃で４時間油洛中で加熱し、次に一晩室温に冷却 した。ブライン（６ｉＬ）およびＨ２Ｏ（）糺）をオレンジ−赤の反応物に加え 、得られた溶液をＥｔ２０　（ＳＸ　１５＋ｉＬ）で抽出した。有機抽出物を合 わせて乾燥（ＭｇＳＯａ）　シ、そして真空中で揮発性物質を除去して、粗黄色 シロップを得た。これを、フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、４：３ エチルエーテル−石油エーテル）により精製し、所望のシスニトリルエチルエス テル（２コ１ｇ、　Ｉｉ６％）を無色の粘性油として得た：Ｎ−ベンジルオキシ カルボニル　−シスー４−カルボキシーーブロ１ンジメチルエステル　３ シスニトリルエステル（１，９１ｇ、　５．３１ｍｍｏｌ）のメタノール溶液（ １５！ＩＬ）に、メタノール（１３ａ＋Ｌ）中のＨＣＩ　（２−３ｇ、６３ａ＋ ｍｏｌ）を加えた。室温で３．５日攪拌後、反応をＮａＨＣＯ３（ｓ、ｓｇ、　 ６５ｍｍ。
ｌ）でクエンチし、次に真空中で濃縮した。ナトリウム塩から生成物を抽出する ために、残査をＴＨＦ　（３０ｍＬ）で希釈した。固体を濾過して除去し、フィ ルターケークをＴＨＦで洗浄し、そして、濾液および洗浄液を合わせて濃縮した 。得られた淡黄色の残査をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲノペ４：３ エチルエーテル−石油エーテル）で精製し、無色の油として３を１．９ｇ　（９ ４％）を得た： （２５０ＫＨ，ＣＤＣｌ、）　６　７．３７−７．２７　（ｍ、５　Ｈ）、５． ２２−５．０１　（ｍ、２　Ｈ。
ＰｈＣＨ２）、４．４５−４．コ５　（ｒｒ＋、ｌ　Ｈ，Ｈ−２）、３．９８− ３．６７　（ｍ、２　Ｍ、、Ｈ−５）。
コ、７５＋３．５７　（ｓ、３　Ｈ，Ｃ−２Ｃｏ、ＣＨ，）ｌ　コ、７０５＋３ ．７００　（ｓ、コ　Ｈ，Ｃ−４１７２，２３，１７２，０５，１７１，９８， １５４，ココ、１５コ、８０．　ｌコロ、１９．　ｌコロ、１５゜１２８ｊ６． 　１２Ｂ、３０．　１２７．９７．　１２７．９２．　１２７．１ｉ１７．　１ ２７．７４．　６７．１７゜６７．０６．　５Ｂ、６０．　５Ｂ、２９．　５２ ．２ｇ、５２．２０．　５２．１０．　４Ｂ、８コ、４Ｂ、３４゜（３２１１２ １２ｃａｎｅｄ　ｆｏｒ　Ｃ，６Ｍ、、Ｎｏ、）　。
ジメチルエステル３　（０，７５１ｇ、　２．３７＋ａｍｏｌ）を１：ＩＴＨＦ −Ｅ１２０　（７ｉＬ）に懸濁し、攪拌しながら、４Ｍ　ＮａｏＨ（１３３ａ＋ Ｌ、　５．３３＋＊ｍｏｌ）を滴下して加えた。加えていく間に、反応溶液は均 質になった。攪拌を５０分間行って、その後反応混合物をＥｔ２０　（２Ｘ　７ ｉＬ）で２回抽出した。濃ＨＣＩにより水層を酸性にして油状の生成物を沈澱さ せた。これを酢酸エチル（３Ｘ　８ｉＬ）で抽出した。捨てる前に、前の抽出か らのエチルエーテル層をＨ２Ｏ（２Ｘ　４ｉＬ）で洗浄した。そして、水性の洗 浄液を酸性の水層に加えた。
すべての水性溶液を酢酸エチル（２ｘ８＋Ｌ）で再び抽出した。
有機層を合わせて乾燥（ｙｇｓｏ、　）　シ、濾過し、濃縮して、無色の固体と してジカルボン酸０．６８ｇ　（９７％）を得た。これはＣＨ３０Ｈ−Ｅｔ２０ から再結晶させ得るが、この段階で直接用いるには充分純度が高い。： ｍｐ　１７５−４７６°Ｃ：　（ａ八−２７冒ｃ　１．０５．　ＣＭ、ＯＨ）： 　’ＨＮＸＲ（２５０ＫＨｚ、ＣＤ、ＯＤ）　６　７．４０−７．２６　（！１ １．　５　Ｍｌ、５．１８−５．０３　（ｍ、２　Ｈｚ　ｐｈｃＨ２）１４．４ ０−４．３１４ｍ、　ＩＨ，）ｌ−２）、　：１．８５　（ａｐｐ　ｄｄ、　、 ？−１０，７，１２Ｈｚ、　ｌ　Ｈ。
Ｈ−５）、３．７５−３．６７　（！ＩＩ　Ｌ　Ｈ，！４−５）、コ、２〕−３ ＋１９　（ｍ、　Ｌ　Ｈ，Ｈ−４）。
２．６６−２．５１　（ｍ、１　Ｍ、１４−コン、　２．コト２．２４　（ｍ、 ユ　Ｈ，Ｈ−コン；　′３ＣＮＭＲ（７５，５）ＩＯ４ｚ、ＣＤ、ＯＤ）　６　 １７５．６５．１７５．３５．　１７５．２２．　１５６．３５．　１５６．０ ５゜１３７．８６．　ｌ：１７．７３．　１２９．５５．　１２９．４６．　１ ２９＋１３．　１２９＋００．　１２Ｂ、８８゜１２８．６４．　６Ｂ、３４． 　６０．１Ｂ、５９．８５．　５０＋１９．　４９．７４．　４コ、４２．　４ ２．６７゜３４．２０．　コ３．２７：　ＸＲ（１０３ｒ）　）６００−２１０ ０　（ｂｒｏａｄ）、１７４０．　１６８５．　１６３５゜ユ４５０．　１４１ ５．　１３６０．　１２４０．　１１４０．　Ａｎａｌ、Ｃａ１ｃｄ　ｆｏｒ　 Ｃ１４Ｈ，、Ｎｏ、：　Ｃ。
５７、コ４＋　Ｈ，５，１６；　Ｎ、　４．７８．　Ｆｏｕｎｄ：　Ｃ，５７， ２５；　Ｈ，５，２５；　Ｎ。
シス−４−カルボキシ−し−プロリン　４Ｎ−ＣＢＺ−シス−４−カルボキシ− し−プロリン（０，４５５ｇ、１．５５ｍｍｏｌ）をメタノール（３７＋ａＬ） に溶解し、Ｐａｒｒ攪拌瓶に移した。１０％Ｐｄ−Ｃ（０，０８０ｇ）を加えた 後、混合物をＰａｒｒ装置上で４８−５０ｐｓｉ。
０．５時間水素雰囲気下で攪拌した。触媒をセライトで濾過して除去した。フィ ルターケークを水で洗浄し、濾液および洗浄液を合わせて真空中で濃縮し、白い 固体を得た。これを１１１２０−エタノールニア七トンから再結晶して、無色の プリズムとして４を０．２０６ｇ　（８４％）得た； ｒｎｐ　２２５−２２６”Ｃ：［ａ］２５Ｄ−４０”　（ｃ　１．０２．　Ｘ２ ０）；　’ＨＮＫＲ（２５０ＫＨｚ、　Ｃ２０）　６４．２５　（ｄｄ、　Ｊ− ８，６，７＋４　Ｈｚ、　ｌ　Ｈ，Ｈ−２）、　３．７２　（ｄｄ。
Ｊｗ１２．０．　６．７　Ｈｚ、ｌ　Ｈ，Ｈ−５）、３．５７　（ｄｄ、Ｊ−１ ２，０，８，０Ｈｚ、１　Ｈ。
Ｈ−５）、コ、コ８　（ｍ、ＬＭ、Ｈ−４）、２．７１　（ａｐｐ　ｄｔ、Ｊ− １３，７，８，６Ｈｚ、ｌ　Ｈ。
１）４０．　１２３０　ａｍ”；　Ｍ５　（ＣＩ、７０　ｅＶ、　Ｘ９７　）　 ｍ／ｅ　１６０　（Ｍ］（’″ｒ　１４Ｌ１１４　（１００）、Ａｒｔａｌ、　 Ｃａ１ｃｄ　ｆｏｒ　Ｃ６Ｈ９ＮＯ，：　Ｃ，４５，２８；　Ｈ，５，７０；　 Ｎ。
５１．８０．　Ｆｏｕｎｄ：　Ｃ，４５，３１；　Ｈ，５，５１；　Ｎ、　８． ７５−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル　−シスー４ヒドロキシ−し一プロＩジエ チルエステル Ｎ−ＣＢＺ−トランス−４−ヒドロキシ−し−プロリン（２，６５ｇ、　１０． 　Ｏｍｍｏｌ）をアセトン（２ｈＬ）に溶解して、水塩中で一５℃に冷却した。
ジゴーンズ試薬（７，５＋ａＬ、　２０．Ｏｍｍｏｌ）を加えて、水浴を取り除 き、そしてインプロパツール（１ｍＬ）により過剰のジＷ　−ンズ試薬をクエン チする前に、２．２５時間室温で攪拌した。２時間攪拌後、濃い緑色の沈殿から 緑色の溶液をデカントし、真空中で濃縮した。残査を酢酸エチル（２ＱａＬ）お よびブライン（１０＋ｏＬ）間に分配した。層を分離後、有機層をブライン（１ （１ｍＬ）でさらに１回洗浄し、この抽出から得られた水層を前の抽出から得ら れたものと合わせた。すべての水溶液を酢酸エチル（１５＋ｎＬ）で洗浄し、こ の有機層を前の層と合わせた。上述した濃い緑色の沈殿物を水（５ＱａＬ）に溶 解し、ＮａＣ１で飽和させて、酢酸エチル（５Ｘ　１０ａ＋Ｌ）で抽出した。有 機層をすべて合わせて、乾ｍ　（ＭｇＳＯａ）　シ、真空中で濃縮して、黄色い 油として粗Ｎ−ＣＢＺ−４−ケトーＬ−プロリンを得た。これをさらに精製する ことなく用いた。このケトン体をメタノール（５ＱａＬ）に溶解し、反応フラス コを水浴中で０°Ｃに冷却した。ＮａＢＨａ　（１，４４ｇ、　３８．０ｍｍ＋ ｏｌ）の水溶液（５ｍＬ）を滴下して加えた。２０時間冷凍庫（−５°Ｃ）に静 置して反応した。揮発性物質を真空中で除去した。残査を）１２０　（１０１Ｌ ）で希釈し、濃ＨＣＩでｐ）１２−３の酸性にし、次に酢酸エチル（２Ｘ　１０ ａ＋Ｌ）で抽出した。水層をＮａＣ１で飽和し、再び酢酸エチル（２Ｘ　１ｈ＋ Ｌ）で抽出した。水層を濃縮すると白い固体が得られ、これを酢酸エチル−ＴＨ Ｆ２：ｆ　（３０ｍ（１）で希釈して、０．５時間穏やかに還流して加熱した。
塩をセライトによる濾過によって除去した。この濾液と前の抽出から得られた有 機層を合わせて、乾燥（ＭｇＳＯ４）　Ｌ、濃縮して粗Ｎ−ＣＢＺ−ンスー４− ヒドロキシ−し−プロリンを黄色い油として得た。残査を触媒量のｐ−トルエン スルホン酸−水和物（０，２５ｇ、　１．３１ｍｍ。
ｌ）を含むエタノール（１５０ａＬ）で溶解した。反応混合物をＤｅａｎ−Ｓｔ ａｒｋ　）ラップで湿性エタノールを集めながら還流して加熱した。３６時間後 、反応総量が約５０ｍＬになるまで、いっばいになったトラップを常に空にした 。トシル酸をＮａＨＣＯ２（０，５ｇ−６、０＋ａ＋＋＋ｏｌ）で中和後、溶媒 を真空中で除去し、残査を酢酸エチル（７５ｍＬ）で希釈し、そしてナトリウム 塩から生成物を抽出するために混合物を０．５時間激しく攪拌した。固体をセラ イト−Ｋ２　Ｃｏ　３による濾過によって除去し、そしてフィルターケークを酢 酸エチル（１５ｍＬ）で洗浄した。濾液および洗浄液を合わせて濃縮した。得ら れた残査をフラッシュクロマトグラフィー（エチルエーテルを用いる、シリカゲ ル）によって精製することにより、シスヒドロキンエチルエステル（２，１ｇ、 　８３％）を黄色い油として得た： Ｎ−ベンジルオキシカルボニル　−シスー４−トシルオキジーープロリンエチル エステル　５ Ｎ−ＣＢＺ−シス−４−ヒドロキシ−し−プロリンエチルエステル（６゜４ｇ、 　２２＋ａｍｏｌ）および無水ピリジン（５，３１ｍＬ、　５．２ｇ、　６５ｍ ＋ｍｏｌ）のＣＨＣＬ３溶液（３５ｍＬ）にｐ−）ルエンスルホニルクロライド （８，３ｇ、　４４ｍｍｏｌ）を一度に加えた。室温で７日間攪拌後、反応液を ＣＨ２Ｃｌ２　（１００ａＬ）で希釈し、ピリジンを１０％ＨＣＩ　（４Ｘ　１ ３ｍＬ）で抽出して除去した。有機層を乾燥（Ｍｇ５Ｏ□）し、そして黄色い油 に濃縮した。これを７ラソシニクロマトグラフイー（シリカゲル、５：４石油エ ーテルーエーテルを用いる）により精製して、無色の針状結晶として５を７．８ ｇ　（８０％）得た：（以千孝〉） ＣＤＣｌ、）　６　７．７５　（ａｐｐ　ｄ、：Ｉ−８，４１（ｚ、２　Ｍｌ、 ７．３４−７．２８　（ｍ、７　Ｍｌ。
５．１８−５．０４　（ｍ、コＨ，ＰｈＣＨ７ａｎｄ　Ｈ−４）、　４．５２− ４．４１　（ｍ、　ｌ　Ｈ，Ｈ−２）、ＣＤＣ１，）　６１７０．８９．　１７ ０．５７．１５４．２０．１５３．８９．　１４５．１２．　１４５．０９゜Ｄ ６．ｌｌ、１３３．８Ｂ、　Ｌ２９．９１．　１２９．８５．　１２８．：１８ ．　１２８．コ２．　１２Ｂ、Ｏコ。
１２７．９１１．１２７．８６．１２７．７７、１２７．５ｇ、　７８．６２． ７７．７４．６７．２１．６７．１５゜６１．４７．　５７．５コ、　５７．） ０．　５２．２５．　５１．９９．　コア、０７．　３５．９８．　２１．５９ ゜Ｎ−ベンジルオキシカルボニル　−トランスー４−シアツーープロ１ジエチル エステル 微粉末ＮａＣＮ　（０，４９ｇ、　１０ｍｍｏｌ）を、攪拌されているＤＭＳＯ （７ｍＬ）中の５　（３，０ｇ、　６．７ｍｍｏｌ）の混合物に懸濁した。反応 フラスコを８０°Ｃで３時間油浴中で加熱し、この間にＮａＣＮが完全に溶解し 、反応混合物が深いオレンジ色に変わった。室温に冷却後、反応液をブライン（ ３ａ＋Ｌ）およびＨ２Ｏ（４＋＋Ｌ）で希釈し、次にＥｔ２０　（５ｘ　１１ｍ Ｌ）で抽出した。有機層を合わせて乾燥（Ｍｇ５Ｏ，）シ、黄色のシロ１ブに濃 縮した。これを、フラッシュクロマトクラフィー（シリカゲル、１：１エチルエ ーテル−石油エーテル）により精製し、無色の粘性油としてＮ−ＣＢＺ−トラン ス−４−シアノ−し一プロリンエチルエステルヲ１．４２ｇ　（、７０％）得た ：Ｎ−ベンジルオキシカルボニル　−トランスー４−カルボキシーープロリンジ メチルエステル　６ Ｎ−ＣＢＺ−トランス−４−シア／−Ｌ−プロリンエチルエステル（１゜１９ｇ 、　３．９５＋ａｍｏｌ）のメタノール溶液（８ｍＬ）にＥＩＣＩ　（１，４４ ｇ、　３９．５ｍｍｏｌ）メタノール（１ｈＬ）を加えた。４日後、反応液をＮ ａＨＣＯｓ　（３，７ｇ、　４４１１１１０１）でクエンチし、次に真空中で濃 縮した。
ナトリウム塩から生成物を抽出するために残査をＴＨＦ　（２５ｍＬ）で希釈し た。固体を濾過して除去し、フィルターケークをＴｌ１Ｆで洗浄し、濾液および 洗浄液を合わせて濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、１： １エチルエーテル−石油エーテルを用いる）により残査を精製して、無色の油と し３．７５＋３．５８　（Ｓ、３　Ｈ，Ｃ−２Ｃｏ２ＣＨ，、１４１１，ｌｉｌ 転ｐＪ刊で、３．７０＋３．６９　（ｓ。
１２８．３５．　１２８．２ａ、１２７．９４．　１２７．８９．　１２７．７ ８．　１２７．６６、　６７．１５゜６７．０コ、　５８．７０．　５８．３６ ．　５２．３４．　５２．ニア、　４ｇ、９４．　４ｇ、２９．　４１．６Ｂ。
（Ｅ工、２１　ａＶ）　ｍ／ｅ　３２１．１２０６　（コ２１．１２１２　ｃａ ｌｃｄ　ｆｏｒ　Ｃ１６Ｈ１？Ｎｏ、）。
ト　ベンジルオキシカルボニル　−トランスー４−カルボキシ≦ヨ乙−エヱ ジメチルエステル６　（０，５０２ｇ、１．５６ｍｍｏｌ）を３．２７ＩＩＦ− Ｈ２Ｏ（５ｍＬ）に懸濁して、攪拌しながら４Ｍ　ＮａＯＨ（０，９０ｍＬ、　 ３．６ｍｍｏｌ）を滴下して加えた。５５分間攪拌後、反応混合物をＥｔ２０　 （２Ｘ　５ｍＬ）で抽出した。濃１１１ＣＩにより水層を酸性にして油状の生成 物を沈澱させた。これを酢酸エチル（３ｘ　６ｍＬ）で抽出して水層から取出し た。捨てる前に、前の抽出で得られたＥｔ２ｏ層をＨ２Ｏ（２Ｘ　４ｍＬ）で洗 浄した。そして、これらの水層の洗浄液を酸性の水層に加えた。すべての水溶液 を酢酸エチル（２ｘ６ｍＬ）で抽出して、酢酸エチル層をすべて合わせ、乾燥（ Ｍｇ５Ｏａ　）　Ｌ、濾過した。そして、濃厚な粘性の無色の油に濃縮した。こ れヲ室温で結晶化して最終的にト（ベンジルオキシカルボニルートランスー４ー カルボキン−し一プロリンを０．　４８０ｇ　（　１００％）得た：（ν人手４ ≧ｂ） ｍｐ　９１３−１００°Ｃ：　（α３２５．−３７°（ｃ　Ｏ．８４，　ＣＨ， ＯＨ）　；　１Ｈ　ＮＭＲ　（３００ｇＭ，　ＣＤ３０Ｄ）　６　７．３６−７ 、２８　（ｍ，　５　Ｈ）、　５．１５−５．０１　（ｍ，　２　Ｈ，　ＰｈＣ Ｈ，）。
４、４５−４．コ９　（ｍ，　ｌ　Ｈ，　Ｈ−２）、３．８１−３．６７　（ｍ ，　２　Ｈ，　Ｈ−５）、３．２７−３．１４１５５、０６，　１５４．５６， 　ｌコア、８９，　エコ７、８５，　１２９．１５，　１２９．０４，　１２８ ．５８。
１２８、コ９，　１２Ｂ．０７，　６７、２４，　６７、１６，　５９．６１． 　５９＋１４，　４９．７Ｂ，　４９．１７。
ｍ／ｅ　２９コ．０９０１　（２９３．０８９９　ｃａｌｃｄ　ｆｏｒ　Ｃ，４ Ｈ，、Ｎｏ，）。
トランス−４−カルボキシ−Ｌ−プロ１　ン　７Ｎ−ＣＢＺ−　トランス−４− カルボキシ−Ｌ−プロリン（０．４５８ｇ，　１．５６ｍｍｏｌ）をメタノール （　５０ａ＋Ｌ）に溶解し、Ｐａｒｒ攪拌瓶に移した。
１０％Ｐｄ−Ｃ　（０．０８０ｇ）を加えた後、混合物をＰａｒｒ装置上で４８ −５０ｐｓｉ，　０．　５時間水素雰囲気下で攪拌した。触媒をセライトによる 濾過によって除去して、フィルターケークを水で洗浄した。
濾液および洗浄液を合わせて真空中で濃縮し、白色固体を得た。これをｈＯ−Ｅ ｔＯＨ−アセトンから再結晶して、無色０プリズムとして７を０．１８７ｇ　（ ７５％）得た；（以下余白） ４５．２Ｌ：　Ｈ，５，６４：　Ｎ、Ｃ６８゜シス−４−ヒドロキシ−Ｄ−プロ リン８　（１０，０ｇ、　７６、３ｍｍｏｌ）をＮａ［ＩＣ０３（１６，０ｇ、 　１９０ｍｍｏｌ）を含むＮ２０　（１６５＋ａＬ）に溶解した。トルエン（４ ０ｍＬ）中のクロロギ酸ベンジル（１２，５ｍＬ、　１５．０ｇ、　８７．７ｍ ｍｏｌ）を３０分間にわたって室温でロートにより滴下して、この攪拌溶液に加 えた。１６時間反応を攪拌した。この時までに、Ｃ０２の発生は終了し、そして ２層に分離した。過剰のクロロホルムベンジルをエーテル（３Ｘ　５０ｍＬ）で 洗浄して水層から除去した。水層を水浴中で冷却し、濃ＨＣＩでｐＨ２の酸性に すると油状の生成物が沈澱した。この油を酢酸エチル（５ｘ５０ｍＬ）で洗浄を 繰り返して水層から抽出した。水層をさらに酸性にしても沈殿物がこれ以上生成 しなかったことから、抽出が完全であることが示された。有機層を合わせてブラ インで洗浄し、乾爆（ＭｇＳＯ□）して、そして無色の粘性油に濃縮した。これ を室温で静置して結晶化い−ＣＢＺ−シスー４−ヒドロキシ−Ｄ−プロリンを１ ９．４２ｇ　（９６％）得た：　ｍｐ　１１０−１１１°Ｃ（ｌｆｔ、　”ｅｐ 　１１０．５−１１１．５℃）　；［ａ］２５＋２４．４°（ｅ　１．０．　Ｃ ＨＣｌ３）［ｌｉｔ、＋　９　［α］　２５　＋　２ＥＩ　Ｄ ６．３°（ｃ　１゜Ｏ，ＣＨＣｌ３）］−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル　−シ スー４−ヒドロキシーＤ−プロリンエチルエステル Ｎ−ＣＢＺ−シス−４−ヒドロキシ−Ｄ−プロリン（５，ＯＯｇ、１８．８ｍｍ ｏｌ）を、触媒量のｐ−）ルエンスルホン酸−水和物（０，３ｇ％　１．６ｍｍ ＋。
ｌ）を含むエタノール（３００ｍＬ）で還流してエステル化した。
湿性エタノールをＤｅａｎ−Ｓｔａｒｋ　トラップ中に集めた。１６時間後、反 応液量が約ＳＯｍＬに減少するまでは常に、トラップが満たされるごとに空にし た。トシル酸を過剰のＮａＨＣＯ３（０，５ｇ、　６ｍｍ。
ｌ）で中和した。揮発性物質を真空中で除去し、残査を酢酸エチル（１００ｍＬ ）で希釈して、ナトリウム塩から油状生成物を除去するために０．５時間混合物 を撹拌した。固体をセライトによる濾過によって除去し、フィルターケークを酢 酸エチル（Ｓ。
ｍＬ）で洗浄した。濾液および洗浄液を合わせ真空中で濃縮して、無色の油とし て粗シスヒドロキシエステルを５．６ｇ　（ｔｏｏ％）得た：　’ＨＮＭＩ？お よびＩＲスペクトルは鏡像異性体であるＮ−（ベンジルオキシカルボニル）−シ ス−４−ヒドロキシ−し−プロリンエチルエステルのスペクトルとあらゆる点で 同じであった；（以下余白） ′ＩＣＮＭＲ（７５，５ＭＩＨｚ、ＣＤＣｌ、）　６　１７４．５４．　１７４ ．３５．　１５４．１ｉ１７．　１５４．２１゜１３６．２４．　１３６．１１ ．　１２８＋３９．　１２８．コｌ、　１２７．９９．　１２７．９６．　１２ ７．８３゜１２７．７４．　７０．９９．　７０．０１．　６７．１Ｂ、６１． ８Ｂ、６１７２．　５Ｂ、１７．　５７．７７゜Ｎ−ベンジルオキシカルボニル 　−シスー４−トシルオキシーＤ−プロ１ジエチルエステル　９ 前述した方法を用いて、Ｎ−ＣＢＺ−シス−４−ヒドロキシー〇−プロリン（４ ，７ｇ、　１６ＩＩ１ｍｏｌ）を変換して無色の針状結晶として９を。
６ｇ（９２％）得た：　ｉｐ　９１−９２℃Ｃｃｘ　Ｅ’、’＋２７°（ｃ　１ ．１．ＣＨＣｈ）　；　；Ｃベクトルは鏡像異性体である５のスペクトルとあら ゆる点で同じであった。Ａｎａｌ、　Ｃａ１ｅｄ　ｆｏｒ　Ｃ２２１（２５ＮＯ ＝、Ｓ：　Ｃ，５９，０５；　Ｈ，５，６３；　Ｎ、　３．１３　Ｆｏｕｎｄ： 　Ｃ，５８，８７；　Ｈ，５，６８；　Ｎ、　３．０？。
Ｎ−ベンジルオキシカルボニル　−トランスー４−シアノーＤ−フローンエチル エステル ９　（１，０ｇ、　２．２３ａ＋ｍｏｌ）をＤＩｉｌＳＯ中でＮａＣＮで処置し て、無色の油としてＮ−ＣＢＺ−１−ランス−４−シフノー〇−プロリンエチル エステル（０，４８ｇ、　１．６ｍｍｏｌ、７２ｚ）を得り：　［ｃｒ］２５＋ ４０’　（ｃ　１．０．　Ｃ１（ＣＩ〕 ３）　；　’ＨＮＭＲおよびＩＲスペクトルは鏡像異性体であるＮ−（ベンジル オキシカルボニル）−トランス−４−シアノ−し−プロリンエチルエステルのス ペクトルとあらゆる点で同じであった；（以下余白） １３ＣＮＭＲ（７５，５Ｍｚ、　ＣＤＣｌ、）　Ｊニア１．２１．　１７１．１ ：ｌ、　１５３．Ｂ６．　１５コ、４２．　ｌコ５．７７、　ｌコ５．７０．　 １２８．３Ｂ。
１２Ｌ２９．　１２８．１０．　１．２Ｂ、０３．　１２７．８６．　１２７． ７４．　１１．７コ、　ｌｌａ、６１゜６７．４５．　６７．３Ｂ、６１．６５ ．　６ユ、５６、５ｇ、０２．　５７．６１．　４９．ココ、４ａ、ａＯ。
コ４．コ９．　３３．３Ｂ、２６．８２．　２６．１５．　ｌコ、９２．　ｌコ Ｊｌ；　ＬＲＭ５　（Ｃｌ、７０　ｅＶ。
イ１／ブ９”／　Ｉ　ｍ／ｅ　３０３　（ＫＭ”、Ｚｏｏ）、２５９　（８４） 、９１　（８５）：　ＫＲＭＳ　（ＥＺ。
７０　ａＶ）　ｍ／ｅ　）０２．１２５３　（コ０２．１２６６　ｃａｌｃｄ　 ｆｏｒ　Ｃ，、Ｈ，、Ｎ２０．）。
Ｎ−ベンジルオキシカルボニル　−トランスー４−カルボキシーＤ−プロｉンジ メチルエステル　Ｏ Ｌ鏡像体６を調製した前述の方法を用いて、Ｎ−ＣＢＺ−）ランス−４−シアノ −Ｄ−プロリンエチルエステル（０，４７ｇ、　１．６ｍｍｏｌ）を変換して無 色の油である１０を０．４７ｇ（９４％）得た＝［α］書８＋４１゜（ｃ　１． １３．　ＣＨＣｌ３）　；スペクトルは鏡像異性体である６のスペクトルとあら ゆる点で同じであった； ＬＲＭ５　（Ｃｌ、　７０　！！Ｖ、Ａ−１４”９７　）　ｍ／ｅ　３２２　（ ＭＷ”。
１００）、　２７８　（４５１）、　２６２　（４）、　１８６　（１６）、　 ９１　（２８）；　ＫＲＭＳ　（ＥＺ、　７０ｅＶ）　ｍ／＠　コ２１．１２コ ｌ　（３２１，１２１２ｃａｌｃｄ　ｆｏｒ　Ｃ，、Ｍ、、Ｎｏ、）。
Ｎ−ベンジルオキシカルボニル　−トーンスー４−カルボキシ≦ヒゲ」！Ｌｚ ジメチルエステル１０　（０，３３６ｇ、　１．０５ｍｍｏｌ）を上述したよう にサポニン化して、無色の非常に粘性の油としてＮ−ＣＢＺ−）ランｘ−４−カ ルホ４　シーＤ−フｏ　ＩＪ　ンヲ０．２９４ｇ　（９Ｈ）　ａり：　［ａ］； ÷３９°（ｃ　０．５１．　ＣＨ３０Ｈ）　；スペクトルは＃ＩＩ像異性体であ るＮ−（ベンジルオキシカルボニル）−トランス−４−カルボキシ−Ｌ−７’ロ リンのスペクトルとあらゆる点で同じであった。
トランス−４−カルボキシ−Ｄ−７’ロ１　ン粗Ｎ−ＣＢＺ−トランスー４〜カ ルボキシ−Ｄ−プロリン（０，２９４ｇ、　Ｌｏｏ□。ｌ）を水素添加して無色 のプリズムとして１１を０．１３８ｇ　（８７％）得た：　ｍｐ　２１９−２２ ０℃：［α］；５＋５１°（ｃ　１．０４．　Ｈ２Ｏ）。スペクトルは鏡像異性 体である７のスペクトルとあらゆる点で同じであった。
８Ｍ５　（Ｅｌ、　２２　ｅＶ）　ｍ／ｍ１６０．０６１１　（１６０，０６１ ０ｃａｌｃｄ　ｆｏｒ　Ｃ，Ｈ，？ＪＯ，＋Ｈ”）、１５９．０５コＯ（１５９ ，０５３２ｃａｌｅｄ　ｆｏｒ　Ｃ６Ｈ？ＮＯ，）、　入ｎａ１．　Ｃａ１ｃｄ 　ｆｏｒ　Ｃ６Ｈ，ＮＯ，：　Ｃ，４５，２８；　Ｈ。
５．７０７　Ｎ、　８．８０．　Ｆｏｕｎｄ　Ｃ，４４，８２；　Ｈ，５，６Ｌ 　Ｎ、　８．７１−　ベンジルオキシカルボニル　−トランスー４−アセトキシ ーＤ−プロリンエチルエステル トシル体９　（４，ＯＯｇ、　８．９４ｍｍｏｌ）のアセトン（２５ｍＬ）溶液 （こｎ−ＢｔｌＪＯＡｃ　（４，０４ｇ、１３．４ｍｍｏｌ）を加えて、得られ た混合物を室温で２０時間攪拌した。反応混合物を濃縮後、得られた黄色の油を ｔｈｏ　（ＳｍＬ）で希釈し、エチルエーテル（５Ｘ１１ａ＋Ｌ）で抽出した。
有機層を合わせて乾燥（ＭｇＳＯａ）　シ、濃縮した。粗生成物をフラノシコク ロマトグラフイ−（シリカゲル、４：３石油エーテルーエーテルを用いる）によ り精製して、無色の油として純粋なアセテートを２．４９ｇ（８３％）得た；（ 以下余白） Ｎ−ＣＢＺ−）ランス−４−アセトキシ−Ｄ−プロリン（２，４５ｇ、　７．３ １ｍｍｏｌ）のエタノール溶液（５０＋ａＬ）を攪拌しながら、それに新しく調 製したＮａ０Ｅｔ／ＥｔＯＨ（（１，０１７ｇ、　ＥｔＯＨ１＋ａＬ中に０．７ ｍ＋ｗｏｌ　Ｈａが溶解している）を加えた。室温で２０分間攪拌後、反応液を Ｎ■ｔｃ１　（０，１ｇ）でクエンチし、真空中で油状の固体に濃縮した。
所望のアルコールは、エチルエーテル（５ＱａＬ）で残量を希釈し、セライトに よって溶液を濾過し、エチルエーテルでフィルターケークを洗浄し、そして濾液 および洗浄液を合わせ真空中で濃縮して、無色の油として単離した（２．０１ｇ 、９４％）。
アルコールは次の段階で直接用いるのに充分純粋であった：［ａ　］２５＋５９ °（ｃ、　１．０４　ＣＨＣｈ）　；スペクトルは鏡像異性体であるＮ−（ベン ジルオキシカルボニル）−トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンエチルエス テルのスペクトルとあらゆる点で同じ１ゾグタ７　）ｍ／ａ　２９４　（Ｍｌ（ ”、１００）、２５０　（９８）、２２０　（２４）、１５ｇ　（２５）。
９１　（８９）；　ＨＲＭＳ　（Ｅｌ、５０　ｍＶ）　ｒｎ／ａ　２９コ＋１２ ７２　（２９３，１２６コ　ｃａｌｃｄ　ｆｏｒＣ，５Ｈ，９Ｎｏ、）・ Ｎ−ベンジルオキシカルボニル　−トランスー４−トシルオキシーＤ−プロリン エチルエステル　Ｉ Ｌ鏡像体を作るために前述した方法によってＮ−ＣＢＺ−）ランス−４−ヒドロ キシー〇−プロリンエチルエステル（１，５Ｌｇ、　５．１６ｍｍ。
ｌ）から、トシル体１２　（２，２４ｇ、　９７％）を無色の油として調製した ：［α］３　ｄ　＋２９°（ｃ　１．０１．　Ｃ）ｉｃｈ）。スペクトルはあら ゆる点で鏡像異性体２のスペクトルと同じであった。　ＨＲＭＳ　（Ｅｌ、　２ ６ｅＶ）　ｍ／ｅ　４４７．１３３１　（４４７，１３５１ｃａｌｃｄ　ｆｏｒ 　Ｃ２２Ｈ２５ＮＯ？Ｓ）。
Ｎ−ベンジルオキシカルボニル　−シスーーシアノーＤ−プロリンエチルエステ ル トシル体１２　（２，０２ｇ、　４．５３ｍｍｏｌ）を８０℃でＤＭＳＯ中のＮ ａＣＮにより処理して、後処理の後、無色の油としてシスニトリルエステル（０ ，８８ｇ、６４％）を得た：〔α］ら５＋３２°（ｃ　１．０４．　ＣＨＣｌ３ ）　；スペクトルは鏡像異性体であるＮ−（ベンジルオキ７カルボニル）−シス −４−ンアノーＬ−７’ロリンエチルエステルのスペクトルとあらゆる点で同じ であった；　ＨＲＭＳ　（Ｅｌ、　２２　ｅＶ）　ｔａ／ｅ　３０２．１２５５ 　（３０２，１２６６ｃａｌｃｄ　ｆｏｒ　Ｃ＋６ＨｔｇＮＯ４）。
Ｎ−ＣＢＺ−シス−４−シフ　／−Ｄ−プロリンエチルエステル（０，７５５ｇ １２、５０ｍｍｏｌ）を湿性メタノール性ＨＣ１で処置し、上述した方法で後処 理して無色の油としてジメチルエステル１３　（０，７４６ｇ、　２゜３２ｍｍ ｏｌ、９３％）を得た：　Ｃ（ｘ］２６＋４０°（ｃ　１．１５．　ＣＨＣｈ） 　；スペクトルは鏡像異性体である３のスペクトルとあらゆる点で同じであった ；　ＨＲＭＳ　（Ｅｌ、　２２　ｅＶ）　ｍ／ｅ　３２１．１２２６　（３２１ ，１２１２ｃａｌｃｄｆｏｒ　Ｃｌ６ＨＩ９ＮＯ６）。
シスジメチルエステル１３　（０，５０２ｇ、　１．５６ｍｍｏｌ）をサポニン 化して、無色のプリズムとして所望のシスジカルボキシルを０．４４ｇ　（９６ ％）得た：　ｍｐ　１７５−１７６℃；［αｌ：’＋３０’　（ｃ　１．１０， 　ＣＨ３０Ｈ）　；スペクトルは鏡像異性体であるＮ−（ベンジルオキシカルボ ニル）−シス−４−カルボキシ−Ｌ−フロリンのスペクトルとあらゆる点で同じ であった。Ａｎａｌ．　Ｃａｌｃｄ　ｆｏｒ　Ｃ１４Ｈ＋５ＮＯ６；　ｃ。
５７、３４；　Ｈ，　５．１６；　Ｎ．　４．７８．　Ｆｏｕｎｄ：　Ｃ，　５ ７．４３；　Ｈ．　５．１８；　Ｃ。
粗ＮーＣＢＺーシスー４ーカルボキシ−〇ープロリン（０．　３９８ｇ，　１． 　３６＋ｕｓｏ１）を水素添加して、無色のプリズムとして１４を０．　１６７ ｇ　（７７％）得た：　ｍｐ　２２４−２２５°Ｃ＋［αＦ；”７°（ｃ　１． ０１，　Ｈ２Ｏ）；スペクトルは鏡像異性体である４のスペクトルとあらゆる点 で同じであった。　Ａｎａｌ、　Ｃａ１ｃｄ　ｆｏｒ　Ｃ６Ｈ９ＮＯ４：　Ｃ１ ４５，２８；　Ｈ，５，７０；　Ｎ。
δ、８０．　Ｆｏｕｎｄ：　Ｃ，４５，１５；　Ｈ，５，５４；　Ｎ、８，５８ ゜実施例■ Ｍｏ５ｈｅｒアミドの調製 のための一般的方法 典型的な調製法では、Ｎ−ＣＢＺ−４−カルボキシプロシンジメチルエステル（ ０，０５９ｇ、　０．１８＋ｕ＋ｏｌ）のエタノール溶液（１２ｍＬ）をＰａｒ ｒ装置上で５０ｐｓｉ、　１０％　Ｐｄ−ｃ　（ｏ、　ｏｔ　Ｉｇ）で０．５時 間水素添加した。触媒をセライトによる濾過によって除去し、そしてフィルター ケークをエタノールで洗浄した。濾液および洗浄液を合わせて真空中で濃縮した 。残量をＴＨＦで希釈し、再び真空中で濃縮した。無色の残量をピリジン（１ｍ Ｌ）で溶解後、粗４−カルボキシプロリンジメチルエステルを（Ｓ）−（−）− α−メトキシ−α−（トリフルオロメチル）フェニルアセチルクロライド（０， ０７ｇ、　０．２８田＋ｉｏりで処理し、得られた混合物を室温で１６時間攪拌 した。褐色の反応液をＨ２Ｏ（１，５ｍＬ）でクエンチし、０゜５時間攪拌した 。Ｅｔ２０　（ＩＯＩＩＬ）で希釈して層を分離後、有機層を１０％ＨＣＩ　（ ２Ｘ　５ｍＬ）で充分に洗浄し、ＮａＨＣＯ３（２Ｘ　５ｍＬ）およびＨ２Ｏ（ ５１ＱＬ）で飽和させた。有機層を乾燦しくＭｇ５Ｏａ）　、オレンジ色の油に 濃縮した。
シス−４−カルボキシプロワンジメチルエステルの粗Ｍａｓｈｅｒアミド誘導体 のジアステレオマーの純度を３００−ＭＨｚ　’ＨＮＭＲを用いた分析で測定し た。各誘導体に対して、Ｈ−４および１個のＨ−５プロトンに対応するシグナル を分析に選んだ。
シス−４−カルボキシーーブロリンジメチルエステルのＭｏ５ｈｅｒアミド：　 ｄ　３．１Ｂ　（ｄｄ、　Ｊ＝１１．４．７．５　Ｈｌ、Ｉ　Ｈ，Ｅｌ−５）、 　２．７３−２゜６３　（ｖａ、　１　［１，Ｈ−４）：　ｄｅ＞９５％。
シス−４−カルボキシ−Ｄ−プロリンジメチルエステルのＭｏ５ｈｅｒアミド： 　ｄ　３．０１−２．８６　（ｍ、　２Ｈ，１１−４およびＨ−５）：　ｄａ＞ ９５％。
トランス−４−カルボキシプロリンジメチルエステルの粗Ｍｏ５ｈｅｒアミド誘 導体のジアステレオマーの純度を２５０−ＭＨｚ　’ＨＮＭＲを用いた分析で測 定した。各誘導体に対して、Ｈ−２に対応するシグナルを分析に選んだ。
トランス−４−カルボキシ−Ｌ−フロｉンジメチルエステルのＭＯｓｈｅｒアミ 　ド：　ｄ　４．７３　（ｄｄ、Ｊｌ１８．５．　６．９　Ｈｚ、１■、Ｈ−２ ）：　ｄａ＞９５駕。
トランス−４−カルボキシ−Ｄ−プロ瞥ンジメチルエステルのＭ。
５ｈｅｒアミ　ド：　ｄ　４．６６　（ｄｄ、Ｊ−８，７，４，７Ｈｚ、１■、 Ｈ−２）；　ｄｅ＞９５％、。
本発明を現在の好ましい実施態様に関連して記載してきたが、本発明の精神には ずれることなく、いろいろな改変がなされ得ることが理解されるべきである。従 って、本発明は下記の請求の範囲によってのみ限定される。
Ｌ−’７’ｌレクミン力ｉ＊１ｇリム９す　（ｎｍｏｌ／ｒｎｇ　９　＞ｔＶ’ ７　貫）補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）平成　４年　 ４月２４日

Claims (21)

    【特許請求の範囲】
  1. １．神経伝達物質の輸送体を下記の構造を有する化合物と接触さサる工程を包含 する、神経伝達物質をシナプスから除去する輸送を阻害する方法であって、 ▲数式、化学式、表等があります▼ ここで、▲数式、化学式、表等があります▼あるいはＣＯＮＨＲ３；の任意の組 み合わせ、および Ｒ２＝ＯＲ３，ＮＲ３２，アルキル，あるいは置換されたアルキル，およびＲ３ ＝アルキルあるいは置換されたアルキルである；方法。
  2. ２．前記神経伝達物質がＬ−グルタミン酸である、請求項１に記載の方法。
  3. ３．前記神経伝達物質がＬ−アスパラギン酸である、請求項１に記載の方法。
  4. ４．前記化合物がＬ−トランスピロリジン−２，４−ジカルボン酸である、請求 項１に記載の方法。
  5. ５．病態を有する患者に、下記の構造を有する化合物を投与する工程を包含する 、神経伝達物質の欠乏に伴う病態あるいは病理を治療する方法であって、 ▲数式、化学式、表等があります▼ ここで、▲数式、化学式、表等があります▼あるいはＣＯＮＨＲ３；の任意の組 み合わせ、および Ｒ２＝ＯＲ３，ＮＲ３２，アルキル，あるいは置換されたアルキル，およびＲ３ ＝アルキルあるいは置換されたアルキルである；方法。
  6. ６．前記病態がハンテントン病である、請求項５に記載の方法。
  7. ７．前記病態が記憶の欠陥である、請求項５に記載の方法。
  8. ８．前記記憶の欠陥がアルツハイマー病である、請求項７に記載の方法。
  9. ９．前記病態が脳卒中、虚血および脊髄外傷からなる群から選択される、請求項 ５に記載の方法。
  10. １０．前記神経伝達物質がＬ−グルタミン酸である、請求項５に記載の方法。
  11. １１．前記神経伝達物質がＬ−アスパラギン酸である、請求項５に記載の方法。
  12. １２．輸送体を下記の構造を有する化合物と接触させる工程を包含する、細胞か らシナプス中への神経伝達物質の放出を減少させる、あるいは予防する方法であ って▲数式、化学式、表等があります▼ ここで、▲数式、化学式、表等があります▼あるいはＣＯＮＨＲ３；の任意の組 み合わせ、および Ｒ２＝ＯＲ３，ＮＲ３２，アルキル，あるいは置換されたアルキル，およびＲ３ ＝アルキルあるいは置換されたアルキルである；方法。
  13. １３．Ｌ−グルクミン酸の放出を減少あるいは予防することにより、シナプス中 の過剰のＬ−グルタミン酸に関連した病理あるいは病態を治療する、請求項１２ に記載の方法。
  14. １４．前記病理あるいは病態が脳卒中、虚血および脊髄外傷からなる群から選択 される、請求項１３に記載の方法。
  15. １５．前記神経伝達物質がＬ−グルタミン酸である、請求項１２に記載の方法。
  16. １６．前記神経伝達物質がＬ−アスバラギン酸である、請求項１２に記載の方法 。
  17. １７．下記の構造を有し、 ▲数式、化学式、表等があります▼あるいはＣＯＮＨＲ３；の任意の組み合わせ 、および Ｒ２＝ＯＲ３，ＮＲ３２，アルキル，あるいは置換されたアルキル，およびＲ３ ＝アルキルあるいは置換されたアルキルであり；該化合物が神経伝達物質の輸送 体に結合する；化合物。
  18. １８．前記神経伝達物質がＬ−グルタミン酸である、請求項１７に記載の方法。
  19. １９．下記の構造を有する化合物を該生物に投与する工程を包含する、興奮性ア ミノ酸アゴニストに感受性の生物を殺す、あるいは弱らせる方法であって ▲数式、化学式、表等があります▼あるいはＣＯＮＨ３；の任意の組み合わせ、 および そしてここで、Ｒ２＝ＯＲ３，ＮＲ３２，アルキル，あるいは置換されたアルキ ル， およびＲ３＝アルキルあるいは置換されたアルキルである；方法。
  20. ２０．前記生物が無脊髄動物である、請求項１９に記載の方法。
  21. ２１．Ｌ−トランスピロリジン−２，４−ジカルボン酸のグルタミン酸の輸送体 に結合するドメインと同じ物理構造を本質的に含有する、部分。
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