JPH05507615A - ポリサッカライドヒドロラーゼの活性化 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ポリサッカライドヒドロラーゼの活性化技術分野 本発明はポリサッカライドヒドロラーゼ（ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ　ｈｙ ｄｒｏ−１ａｓｅ）の効果を増加する方法に関する。 背景技術 ポリサッカライドヒドロラーゼはグループＥＣ３，２，１に分類されそしてポリ サッカライドを基質とする酵素である。例として、エンドグルカナーゼ（ｅｎｄ ｏ−ｇｌｕｃａｎａｓｅ）　、例えばそれぞれグルカンである澱粉、セルロース 及びプルランのエンド型加水分解を促進するα−アミラーゼ、セルラーゼ及びプ ルラナーゼが挙げられる。 ポリサッカライドヒドロラーゼの多くの工業的用途が知られている。すなわち、 グルコース（デキストロース）もしくはマルトースの製造のため（例えば、ＥＰ 　Ｓ３．９０９）又はマルトトリオースへのプルランの加水分解のための液化澱 粉の糖化において糖化酵素と一緒にプルラナーゼを使用することが知られている ０例えば繊維の色の清澄化のためにセルラーゼを使用することが知られている（ ＥＰ　２２０，０１６）。 発明の記述 本発明者らは、驚くべきことに、ある種の水溶性ポリマーの添加がポリサッカラ イドヒドロラーゼの効果を存意に増加させることを見出した。 従って、本発明は、ビニルピロリドン、ビニルアルコール、アクリルアミド及び 可溶性アクリレートの群から選択された１又は複数の七ツマ−の水溶性ポリマー を溶解した形で反応系に導入することを特徴とする、ポリサッカライドヒドロラ ーゼの効果の増加方法を提供する。 本発明の他の観点は、前記水溶性ポリマーの存在を特徴とする、ポリサッカライ ドヒドロラーゼを用いる酵素的方法を提供する。 最後に、本発明は前記水溶性ポリマーを含んで成ることを特徴とするポリサッカ ライドヒドロラーゼ調製物を提供する。 報告されているように（例えば、米国特許Ｎ１１Ｌ４．５７２，８９７）、ｐｖ ｐハ酵素活性になんらの影響を与えることなく酵素（例えばプロテアーゼ、グル コースイソメラーゼ）の造粒におけるバインダーとして知られており、ＰｖＰは また酵素（例えば、パーオキシダーゼ、プロテアーゼ）の貯蔵安定性を改良する ことが知られている（例えば、Ｅｒ２Ｏ３，０６２，Ｗｏ　９０１００５９３） 、　Ｖ、Ｊａｎｃｓｉｋ、　Ｊ、Ｍｏ１．Ｃａｔａｌ、６（１）、４ｌ−５０（ １９７９）はＰｖＰにより１種のアルドラーゼの阻害を報告している。Ｆ。 Ｅ、Ｐｒａｄｏ　ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ閣、２６０（８）、　４９５２−７ （１９８５）はＰｖＰによるインベルターゼの活性化を報告している。　Ｊ、Ｒ ｏＬＪａｌｋｅｒら、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｓ＋ｉ−ｓ　ｔｒｙ　（Ｏｘｆｏｒｄ） 　、　１９　（３）　、　３７３−８　（１９８０）は、Ｏ−ジフェノールオキ シダーゼ（カテコラーゼ）がＰｖＰにより阻害され、他方ｐ−ジフェノールオキ シダーゼ（ラッカーゼ）はＰＶＰにより影響を受けないことを報告している。　 ｐｖｐはまた、酵素の活性になんらの影響を与えることなく酵素の回収において も使用されていることが報告されている（ＥＰ　２６２．６５１．　ＥＰ　２１ ４，５３１、米国特許隘４．１４４，１３０　、米国特許隘４．０１６，０３９ ）。 しかしながら、従来技術は、ＰｖＰによるポリサンカライドヒドロラーゼの活性 化を当業者に予想させる示唆を与えていない。 発明の詳細な記載 ２弘ユｊ二２Ｌ九土上去）］Ｌ辷二（ 本発明は、ポリサンカライドヒドロラーゼ、すなわち酵素命名法（Ｅｎ、ｚｙｓ ｅ　Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ）に従うグループＥＣ３，２，１の、ポリサ・２ カライドを基質とする酵素の活性化のために適用される。これは特に、エンドグ ルカナーゼ、すなわちガルカン（グルコース単位のポリマー）のエンド型加水分 解を行う酵素、例えばセルラーゼ、プルラナーゼ又はα−アミラーゼ、の活性化 に通用される。 セルラーゼ（ＥＣ３，２，１，４）はフミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）　（特に Ｈ。 ラヌギノーサ（Ｈ，１ａｎｕ紅凹且）、米国特許Ｎｃｔ４．４３５．３０７３又 はトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｓ＋ａ　）　（例えば、Ｔ、ビリデ（Ｔ、 　ｖｉｒｉｄｅ）、Ｔ、リーゼイ（Ｔ、　ｒｅｅｓｅｉ）又はＴ、コニンギ−（ Ｔ、　舷蛙■■）　）に由来することができ、あるいはＰＣＴ／Ｄに９０１００ １２３に従って製造することができる。　ＥＰ　６３，９０９に記載されている ように、プルラナーゼ（ＥＣ３，２，１，４１）はバシルス（Ｂａｃｊｌｌｕｓ ）　、特にＢ、アシドブルリチクス（Ｂ、　ａｃｉｄｏ　ｕｌｌｕｌ　ｔｉｃｕ ｓ　）に由来することができる。 α−アミラーゼはバシルス、例えばＢ、アミロリクエファシェンス（Ｂ、　ａｍ 　ｆｏｌｉ　ｕｅｆａｃｉｅｎｓ）　、Ｂ、リケニホルミス（８，ｌ１ｃｈｅｎ ｉｆｏｒ−粗）、又はＢ、ステアロサーモフィルス（Ｂ、　ｓｔｅａｒｏｔｈｅ ｒｍｏ　ｈｉｌｕｓ）に由来することができる。 本発明はまた、例えばアスペルギルス（Ａｓ　ｅｒ　１ｌｌｕｓ　）特にＡ。 ニガー（Ａ、紅ＬＬ）に由来するイヌリナーゼ（ＥＣ３，２，１，７）の活性化 にも通用できる。 鼠１煎五五 本発明はポリサッカライドヒドロラーゼを用いる工程において酵素の効果を増加 するために役立つ。 １例として、ＥＰ　２２０，０１６に記載されているように繊維の色の清澄化の ためにセルラーゼを用いる工程が挙げられる０色の清澄化において、酵素及びＰ ｖＰを場合によっては活剤と共に用いることができる。 他の例は、グルコアミラーゼ、β−アミラーゼ及びマルトース生成アミラーゼの 群から選択された糖化酵素と共にプルラナーゼの存在下での液化澱粉の糖化であ る。この例は、プルランをマルトトリオースに加水分解するためのプルラナーゼ の使用である。 水星１爽ユヱ二 本発明において使用されるポリマーは、モノマーであるビニルピロリドン、ビニ ルアルコール、ビニルカルボキシレート（例えば、０１〜０４カルボキシレート 、例えばアセテート）、アクリルアミド及びアクリレート（例えば、アルカリ金 属アクリレート、例えばアクリル酸ナトリウム）の１又は複数から成るポリマー である。このポリマーはホモポリマーであってもよく、又はコポリマー、例えば ブロックコポリマーもしくはランダムコポリマーであってもよい。 本発明において使用されるｐｖｐは５，０００〜１，０００．ＯＯＯ、特許５． ０００〜ｓｏ、ｏｏｏの平均分子量を有する。ｐｖｐＯ量は好ましくは、工程条 件において０．００３〜３　、　ＰＶＰ／ｋｇ乾燥固形分、又は反応媒体中０． ００５〜５％である。酵素調製物中、ＰｖＰの量は好ましくはｏ、ｏｏｓ〜１０ ％、特に０．１〜５％（すべて重量％）である。プルラナーゼの場合、ｐｖｐＯ 量は好ましくは５×１０４〜５　Ｘｌ０−”ｇ　Ｐ％’Ｐ／ＰＵＮ　テある。 ポリマーの量は好ましくは、反応系において０．５〜１００■／し、例えば０． ５〜５０■／Ｌであり、又は酵素調製物中でｏ、ｏｏｓ〜１０％、例えば０．１ 〜５％である。 本発明において使用されるＰＶＡは好ましくは低級（例えばＣ１〜Ｃ，）カルボ ン酸の部分的に加水分解されたポリビニルエステルであり、特に、７５％以上、 特に９０％以上、例えば９５％以上の加水分解度を有するポリ酢酸ビニルである 。　ＰＶＡは好ましくは５．０００〜２００，０００　、例えば２０．０００〜 ２００，０００　、特に５０．０００〜ｉｏｏ、ｏｏｏの分子量を有する。 前記のコポリマーは好ましくはビニルピロリドン対ビニルアルコール又はアクリ ルアミドの比率ｌ：１０〜１０：ｌ（モル基準）を有するランダムコポリマーで ある。 ■！星１隻 本発明の酵素調製物は、貯蔵及び出荷のために通する安定化された液体又は非粉 塵性顆粒の形で提供されてもよく、あるいはそれはすぐに使用するための水溶液 であってもよい。 非粉塵性顆粒は例えば米国特許先４，１０６．９９１及び慰４，６６１，４５２ （いずれもＮｏｖｏ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉ　Ａ／Ｓ）に記載されているようにして 製造することができ、そして場合によっては当業界において知られている方法に より被覆されてもよい。 液体酵素調製物は例えば、ポリエチレングリコールのごときポリオール、糖アル コール又は炭水化物、例えばシェークロースを例えば２０〜８０％、好ましくは ５０％以上の量で添加することにより安定化されてもよい。安定剤として乳酸を 使用することもでき、そして液体はまた安息香酸ナトリウムのごとき防腐剤を典 型的には０．１〜０．５％含有することができる。本発明の液体プルラナーゼ調 製物はまた０、１〜２％のＳＯ□に相当する亜硫酸ナトリウム又は亜硫酸水素ナ トリウムを含有することができる。 意図される用途に依存して、酵素は他の活性成分と混合することができる。すな わち、プルラナーゼは、前記の糖化酵素と共にプルラナーゼを含有する混合酵素 調製物として使用することができる。 セルラーゼはｐｖｐと共に、液体でも顆粒状でもよい活剤組成物に導入すること ができる。 セルー−ゼ′ＣＥｖＵ）の“ ０、ＩＭ　Ｔｒｉｓｉｌ衝液（ｐＨ９，０）中に３３．３ｇ／ＬのＣＭＣ（Ｈｅ ｒｃｕｌｅｓ　７　ＬＦＤ）を含有する基質溶液を調製する０分析されるべき酵 素サンプルを同じ緩衝液に溶解する。　１０Ｍ１の基質溶液及び０．５ｄの酵素 溶液を混合し、そして４０°Ｃに温度調整された粘度計（例えば、Ｈａａｋｅ　 ＶＴ　１８１゜ＮＶセンサー、１８１ｒｐ■）に移す、１セルラ一ゼ粘度単位（ ＣＥＶＵ）はこれらの条件下で粘度を半分に低下させる酵素の量として定義され る。 実施例 肛 黒い綿の小切れをＴｅｒｇ−Ｑ−Ｔｏｍｅｔｅｒ　（商標）中で３回の反復洗浄 により処理し、次にそれぞれをすすぎそして乾燥した。洗浄条件は次の通りであ った。 液体容量　８００ｍ 撹拌　１００回／分 洗浄時間　３０分間 洗洗浄度　４０℃ ｐＨ７，０ 水の硬度　９　ｄＢ 織繊維　ｉｏｏ％綿 繊維の量　２枚の小切れ／８００！ｄ、それぞれ１０Ｘｆ５ｃｍ すすぎ時間　流れる水道水中で３０分間乾燥　ライン乾燥、室温（１６時間） 洗剤は市販のＵＳ液体洗剤であり、２ｇ／Ｌの量で使用した。この洗剤に種々の 量のＰＶＰ　（分子量３０，０００）を加えた。 米国特許Ｎｕ４，４３５，３０７に従って製造されたＨ、インソレンス（Ｈ，１ ｎｓｏｌｅｎｓ）からのセルラーゼを、洗浄の直前に０．５０又は１００　ＣＥ ＶＵ／＋ｄの量で洗剤溶液に加えた。 小切れの表面を反射光の測定により分析した。この測定において、白色光を表面 に投射し、反射／ｉｌ和（ｒｅｍｉｓｓｉｏｎ）を１６の波長において’Ｅｌｒ ｅｐｈｏ　２０００Ｊ　Ｄａｔａｃｏｌｏｒ　Ｓｃｈｗｅｉｚ装置により検出し た。これらの検出の結果を処理してＲｕｎ　ｔｅｒ軸にした。この軸のし一軸は 灰色値（ｇｒｅｙ　５ｃａｌｅ　ｖａｌｕｅ）　（１００：黒色、０：白色）を 表わす。 酵素の効果は、灰色／すり切れ観を生じさせる損傷したセルロースファイバーを 除去することであり、そして灰色値の測定により酵素処理の定量的表現が得られ る。結果はセルラーゼ及びＰｖＰを用いないで処理された表面に対するΔＬとし て表現される。 ０　％ＰＶＰ　０　１．１４　１．３８０．１％ＰＶＰ　Ｏ，２５１，４９１， ８０，５％ＰＶＰ　Ｏ，１７１，６４１，８４１，０％ＰＶＰ　Ｏ，１１１，８ ２１，８７セルラーゼの色清澄化効果がＰｖＰの添加により増加することがわか る。 ｌ　セルー−ゼ　びｐｖｐ　いての　の　の゛この実験は例１と同様に行ったが 、洗剤の代りに緩衝系を用い、そしてＰＶＰの代りにＰＶＡを用いた。　ＰＶＡ は７２．０００の平均分子量及び９８％の加水分鮮度を有していた。緩衝系は５ ％（ｗ／ｗ）のトリエタノールアミン、１０％エタノール及び８５％Ｈ２０を含 有した。使用量は２ｇ／Ｌであった。 結果（例１と同様にΔして表わす、）：立堕１　ｔｏ　ｃ眼ツｌｊＬ　顕四遍黒 乙ＬＯｍｇ／Ｌ　ＰＶＡ　Ｏ，００，２１０，５３１００１ｇ／ＬＰＶＡ　−０ ，２１０，７１１，０８Ｈ盃ＰｖＡＰｖＰコポリマーによるセルラーゼのゞこの 実験は例２のようにして行ったが、ＰＶＡの代りにビニルアルコールとビニルピ ロリドンとのランダムコポリマーを用いた。 ０　［／ＬＰＶＡ／ＰＶＰ　Ｏ，００，２１０，５３１００［／ＬＰＶＡ／ＰＶ Ｐ　Ｏ，１５０，９８１，０８１ｐｖｐ　アクリルアミドコポリマーによるセル ー−ゼの゛この実験は例２と同様にして行ったが、ＰＶＡ０代りにビニルピロリ ドンとアクリルアミドとのランダムコポリマーを用いた。 ０　■／Ｌコポリマー　０．０　０．４３　０．４９１Ｏ■／Ｌコポリマー　０ ．０６　０．４４　Ｌ９９ｆｉｉ　ＣＭＣの　にお番るトリコデルマのセルラー ゼの２６７５　ＥＧＯ／　ｇ　（Ｗｏ　９１１０７５４２に記載されているセル ラーゼ活性単位）の活性を有するＴ、リーゼイ（ＴＬｒ６ｅｓｅｉ）からのセル ラーゼを、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）の加水分解においてＰｖＰを 添加して又は添加しないで試験した。ｐｖｐの量は酵素調製物に対する重量％と して表示した。 ０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐ）１６．０）に３４．０　ｇ　／　ＬのＣＭＣ（Ｈｅ ｒｃｕｌｅｓ　７ＬＦＤ）を含有する基質溶液を調製した０分析すべき酵素サン プルを同じ緩衝液に溶解した。５ｍの基質溶液及び０．１５ｍの酵素溶液を混合 し、そして４０℃に温度調整した振動粘度計（例えば、５ｏｆｒａｓｅｒ、フラ ンス、からのＭｌνＩ　３０００）に移した。これらの条件下で粘度を半分に低 下させる酵素の量から相対活性を計算した。　ｐｖｐの添加を伴わない結果を１ ００とした。酵素サンプルの量は反応混合物中０．０１〜０．０２　ＥＧＵ／ｄ であった。 結果： ％ｐｖｐ　ｕ丼盟二 〇（比較）　１００ １％　１０３ ３％　１１０ １立　ブルーノの　”におけるプルラナーゼのゞＥＰ　６３．９０９に従って液 体プルラナーゼ調製物を作った。この調製物は１８０　ＰＵＮ／ｇのプルラナー ゼ活性及び５０％のシュークロースを含んでいた。 この調製物に種々の量のＰＶＰ（ＭＷ　１５，０００）を加え、そしてＰＵＮ法 により見かけプルラナーゼ活性を決定した。ＰＶＰ含量は調製物中の重量％とし て示す。 結果： ％ＰＶＰ　Ｐ亘Ｚ工 ０　（比較）１８０ この結果は、１．０％のＰｖＰにおける３３％増までの活性化を示している。 斑１　糖ヒにおけるプルラナーゼの゛　ヒこの例においては、ＰＶＰを含有する グルコアミラーゼ及びプルラナーゼにより液化澱粉を糖化したにの実験は、ＥＰ 　６３，９０９に記載されているのと実質上同様にして行った。 例６のプルラナーゼサンプルを用い、そして例６に示す見かけ活性に従って、す なわちＰｖＰにより活性化された調製物は対応して少なく、使用量を決定した。 酵素使用量は０．１８ＡＧ／　ｇグルコアミラーゼ及び０．０６　ＰＵＮ／ｇプ ルラナーゼであつたゆ糖化条件は６０°Ｃ１初発ｐＨ４，３であった。　２４． ４８．７２及び９６時間後にＦＩＰＬＣによる分析を行った。ｎｐｉの最大％は 次の通りであった。 同じ結果が得られ、加水分解された澱粉の糖化において、プルランの加水分解に おけると同じ活性化の程度が見られることが示された。 ｌ　イヌリナーゼの。 Ａ、ニガー（Ａ、旦ＬＬ）からのイヌリナーゼを、イヌリンの加水分解において ＰｖＰを添加して、及び添加しないで試験した。　ｐｖｐの量は酵素調製物に対 する重量％として表示した。 イヌリンの加水分解のために使用された条件は、０．０２５クエン酸緩衝液（ｐ Ｈ４，７０）中５０ｇ／Ｌのイヌリン（イヌリンＳｉｇｍａ　Ｉ　３７５４）、 ４０°Ｃ２反応時間３０分間であった。インキュベーション中に生産された還元 性炭水化物の濃度をＳｏ＊ｏｇｙｉ　Ｎｅｌｓｏｎ反応により決定した。 ＰＶＰを伴わない比較サンプルは酵素調製物ｇ当り３１０７モルの還元性炭水化 物（グルコースとして計算）を生成し、これを１００％とした。 結果： 量　のｐｖｐ％　・イヌｉン　” ０（比較）１００ １％　１０７ ３％　ＩＩＩ 要約書 ビニルピロリドン、ビニルアルコール、アクリルアミド及び可溶性アクリレート の群から選択された１又は複数のモノマーの水溶性ポリマーを溶解した形で反応 系に導入することによりポリサッカライドヒドロラーゼの効果が増加される。 補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成４年１２月１１　日

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. １．ビニルピロリドン、ビニルアルコール、ビニルカルボキシレート、アクリル アミド及び可溶性アクリレートの群から選択された１又は複数のモノマーの水溶 性ポリマーを溶解した形で反応系に導入することを特徴とするポリサッカライド ヒドロラーゼの効果を増加させる方法。
2. ２．エンドグルカナーゼ、好ましくはセルラーゼ、α−アミラーゼ又はプルラナ ーゼの効果を増加させる、請求項１に記載の方法。
3. ３．反応系における前記ポリマーの濃度が０．５〜１００ｍｇ／Ｌである、請求 項１又は２に記載の方法。
4. ４．前記ポリマーがポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリビニルアルコール（ ＰＶＡ）、ポリアクリレート、又はビニルピロリドンとビニルアルコールもしく はアクリルアミドとのコポリマーである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の 方法。
5. ５．前記　ＰＶＰが５，０００〜１，０００，０００、好ましくは５，０００〜 ５０，０００の平均分子量を有する、請求項４に記載の方法。
6. ６．前記ＰＶＡが約７５％の加水分解度及び５，０００〜２００，０００の平均 分子量を有するＣ４カルボン酸の部分加水分解されたポリビニルエステルである 、請求項４に記載の方法。
7. ７．ビニルピロリドン、ビニルアルコール、ビニルカルボキシレート、アクリル アミド及び可溶性アクリレートの群から選択された１又は複数のモノマーの水溶 性ポリマーの溶解した形での存在を特徴とする、ポリサッカライドヒドロラーゼ を使用する酵素的方法。
8. ８．エンドグルカナーゼ、好ましくはセルラーゼ、α−アミラーゼ又はプルラナ ーゼを用いる、請求項７に記載の方法。
9. ９．綿繊維の色の清澄化のためにセルラーゼを用いる、請求項８に記載の方法。
10. １０．濃化澱粉の糖化のためにグルコアミラーゼ、β−アミラーゼ及びマルトー ス生成アミラーゼの群から選択された糖化酵素と一緒にプルラナーゼを使用する 、請求項８に記載の方法。
11. １１．ビニルピロリドン、ビニルアルコール、アクリルアミド及び可溶性アクリ レートの群から選択された１又は複数のモノマーの水溶性ポリマーを溶解した形 で反応系に含めることを特徴とするポリサッカライドヒドロラーゼ調製物。
12. １２．好ましくはセルラーゼ、α−アミラーゼ又はプルラナーゼ調製物である、 請求項１１に記載のエンドープルカナーゼ調製物。
13. １３．グルコアミラーゼ、β−アミラーゼ及びマルトース生成アミラーゼの群か ら選択された糖化酵素をさらに含んで成る、請求項１２に記載の混合プルラナー ゼ調製物。
14. １４．非粉塵顆粒又は安定化された液体の形である、請求項１１〜１３のいずれ か１項に記載の調製物。
15. １５．請求項２に記載のセルラーゼを含んで成る洗剤調製物。
16. １６．０．００５〜１０重量％、好ましくは０．１〜５重量％の前記ポリマーを 含んで成る、請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の調製物。