JP3513249B2 - 糖質分解酵素の反応活性化法 - Google Patents
糖質分解酵素の反応活性化法Info
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ゼ等の糖質分解酵素の反応活性化法に関する。
からなる主鎖を切断するα−アミラーゼ、β−アミラー
ゼ、α−1,6 結合及びその近傍を切断するプルラナー
ゼ、イソアミラーゼ、イソプルラナーゼ、ネオプルラナ
ーゼ等の澱粉枝切り酵素、グルコースを生成するグルコ
アミラーゼ、β−1,4 結合からなるセルロースを分解す
るエキソ及びエンドグルカナーゼ、セロビオヒドラーゼ
等のセルラーゼ、その他にはβ−グルゴシダーゼ、キシ
ラナーゼ、ペクチナーゼ、リゾチーム等が知られてい
る。
維産業、医薬品産業、及び食料品産業等で広く利用され
てきた。また、懸かる糖質分解酵素のうち、セルラー
ゼ、アミラーゼを衣料用及び食器用洗浄剤や漂白剤に配
合することにより、主に皮脂汚れや澱粉汚れに対して洗
浄力が飛躍的に向上することが見出されている。
れている糖質分解酵素の殆どは、産業上利用可能な酵素
量を提供し得る量に至るまでの酵素生産性が十分ではな
く、酵素反応性を十分に利用することが困難である。ま
た酵素生産性が十分であっても、反応にかかる酵素の必
要量が多く使用するためには高い費用が要求され、事実
上利用が困難になる場合がある。また酵素利用時におけ
る問題点としては、酵素の熱安定性等の問題により反応
を長時間実行すると酵素が失活し、産業上利用が困難に
なることなどが挙げられる。
決するための手段として、酵素生産性向上や保存安定性
の向上等の他に、酵素反応系において酵素の反応速度を
向上させる方法、即ち酵素反応の活性化法についても従
来から検討されてきた。
ルラーゼに対するβ−グルコシダーゼの併用、α−アミ
ラーゼ及びβ−アミラーゼに対するグルコアミラーゼや
澱粉枝切り酵素の併用等に代表されるような各種酵素の
相乗効果を利用したもの、プロテインエンジニアリング
技術を利用し、特異的にアミノ酸残基を置換することに
よる酵素反応速度の向上を利用したもの、酵素固定化
法、酵素反応系に特定のイオンや両親媒性物質等の酵素
反応活性化剤を利用した方法がこれまでに報告されてい
る。なかでも酵素反応活性化剤を利用する方法は非常に
簡便でかつ剤によっては安価になる可能性が期待され
る。このような活性化剤に関しては、これまでに特定の
ノニオン活性剤、ポリオキシエチレンリン酸エステル及
びカルボキシベタイン型両性活性剤をセルラーゼ反応系
に加えることによって得られるもの(特開昭60−210984
号)や、エンドグルカナーゼやα−アミラーゼ又はプル
ラナーゼ反応系に特定の水溶性ポリマーを添加すること
によって得られるもの(特表平5−507615号)、特定の
セルラーゼにアクチンを加えることで得られるもの〔FE
BS Letter, 187, 101-104(1985) 〕、特定のアミラーゼ
に対して塩素イオンを加えることで得られるもの〔Cli
n. Biochem.,16, 224-228(1983)〕、n−ヘキサンにTwe
en20 (ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレー
ト、アトラス・パウダー社)を添加して得られる逆相ミ
セル系を利用してアミラーゼ及びセルラーゼの酵素活性
を高めること〔Biotechnol. Bioeng.,29, 901-902(198
7) 〕などが報告されている。しかしながら、これらの
活性化法は酵素の反応速度をある程度高めることはでき
るものの、未だその活性化力が十分でない等の問題があ
った。
応速度を十分に活性化させる剤を提供することにある。
質分解酵素の反応活性化剤について鋭意探索を続けてき
たところ、セルラーゼ、アミラーゼ等の糖質分解酵素の
反応系に対して、低級アルキル硫酸塩及び低級アルキル
スルホン酸塩を添加することによって酵素活性が著しく
活性化されることを見いだし、本発明を完成させるに至
った。
アルキル鎖長が1〜4のアルキル硫酸塩及びアルキル鎖
長が1〜4のアルキルスルホン酸塩からなる群から選ば
れる1種または2種以上の塩の存在下に行なうことを特
徴とする糖質分解酵素の反応活性化法を提供するもので
ある。換言すれば本発明の方法は、糖質分解酵素の基質
(糖質)分解活性を、アルキル鎖長が1〜4のアルキル
硫酸塩及びアルキル鎖長が1〜4のアルキルスルホン酸
塩からなる群から選ばれる1種または2種以上の塩によ
り向上させるものである。
ホン酸塩としては、いずれもアルキル基の炭素数が1か
ら4のものが使用され、対イオン種としてはナトリウ
ム、カリウム、リチウム等のアルカリ金属塩、アンモニ
ウムイオン等の1価の陽イオンが挙げられるが、好まし
くは炭素数1から2のアルキル硫酸塩及びアルキルスル
ホン酸塩、さらに好ましくはメチル硫酸ナトリウム及び
メチル硫酸カリウムが挙げられる。アルキル基の炭素数
が多くなると、高濃度添加することによってアニオン性
のミセルを形成しやすくなり、逆に反応が抑制されやす
くなるため好ましくない。
は、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラー
ゼ、プルラナーゼ、イソアミラーゼ、イソプルラナー
ゼ、ネオプルラナーゼ等のアミラーゼ、及びエキソ及び
エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ等のセルラ
ーゼが挙げられる。なかでもα−アミラーゼのアミロペ
クチンや可溶性澱粉に対する分解速度や、エンドグルカ
ナーゼのカルボキシメチルセルロース(CMC)に対す
る分解活性が著しく向上する。そのなかでも特にバチル
ス・アミロリキファシエンス(Bacillus amyloliquefaci
ens)由来のα−アミラーゼ及びバチルス・エスピー(Bac
illus sp.) KSM-635株由来のセルラーゼが好ましい。な
おKSM-635 はFERM BP-1485として菌寄託されており、菌
株に関しては特開昭63−10977 号に、また詳しい製造方
法に関しては特開昭63−264699号の実施例に記載されて
いる。
ス・ズブチルス・マルバーグ(Bacillus subtilis Marbu
rg) 、バチルス・ズブチルス・ナット(Bacillus subtil
is natto) 、バチルス・リケニホルミス(Bacillus lich
eniformis)、バチルス・セレウス(Bacillus cereus) 、
バチルス・サークランス(Bacillus circulans)、バチル
ス・マセランス(Bacillus macerans) 、シュードモナス
・スヅリ(Pseudomonasstutzeri)、クレブシエラ・アエ
ロゲネス(Klebusiella aerogenes) 等の細菌、ストレプ
トマイセス・グリセウス(Streptomyces griseus)等の放
線菌、アスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)、
アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger) 等のカビ
類、イネ科及びまめ科植物の種子、ヒト及びブタなどの
動物の消化腺など多くの生物から得られているものを使
用できる。また、セルラーゼは、フミコーラ・ラニュギ
ノーサ(Fumicola lanuginosa) 、トリコデルマ・ビリデ
(Trichoderma viride)、トリコデルマ・レーセ(Trichod
erma reesei)、トリコデルマ・コニンジ(Trichoderma k
oningii)等に由来することができる。
酵素−基質反応に適用でき、反応前の酵素溶液、基質溶
液或いは緩衝溶液等、適当な時期に、アルキル鎖長が1
〜4のアルキル硫酸塩及びアルキル鎖長が1〜4のアル
キルスルホン酸塩からなる群から選ばれる1種または2
種以上の塩を添加して、これらを反応系に1〜1000mM存
在させればよく、より好ましくは、アルキル硫酸塩及び
アルキルスルホン酸塩を反応系中の濃度が1〜500mM 、
より好ましくは1〜100mM となるように添加する。
は、各種糖質分解酵素の反応を、アルキル基の炭素数が
1〜5のアルキル硫酸塩及び/又はアルキル基の炭素数
が1〜5のアルキルスルホン酸塩の存在下に行なうこと
によって得られるものであり、工業的に極めて大きな意
義を有するものである。
が、本発明はこれら実施例になんら限定されるものでは
ない。
ー(Bacillus sp.) KSM-635株(FERM BP-1485)を培養、精
製して得られたセルラーゼ成分を適当量イオン交換水に
溶解させたものを酵素液とした。20mM Glycine緩衝溶液
(pH10.0) 中にCMC(反応系における最終濃度は 1.0
%)及び表1に示すアルキル硫酸塩(添加剤)を溶解さ
せた反応液0.9 mLに酵素液0.1 mLを加え、40℃で、5分
毎に反応時間を設定し最大25分間反応させた。各反応時
間ごとに 3,5−ジニトロ−サリチル酸(DNS)法にて
還元糖の定量を行った。即ち、反応液 1.0mLにDNS試
薬1.0mLを加え、5分間、 100℃で加熱発色させ、冷却
後、4.0mL のイオン交換水を加えて希釈し、波長535nm
で比色定量した。酵素の反応速度は、反応開始時より生
成物である還元糖量が時間と共に直線的に増加する範囲
における生成物増加速度(d〔還元糖〕/d〔時間〕)
として算出し、相対反応速度としては、アルキル硫酸塩
非存在系に対するアルキル硫酸塩存在系の反応速度を百
分率で示した。以上の方法で測定したセルラーゼ反応速
度に対するアルキル硫酸塩の添加効果についての結果を
表1に示す。表1中、濃度は反応系中での濃度を意味す
る(以下同様)。
最高80%、エチル硫酸ナトリウム添加系で最高20%程度
の酵素反応の活性化が見出された。
ルスルホン酸ナトリウムの添加効果についての結果を表
1に併せて示した。表1より、エチルスルホン酸ナトリ
ウム添加系で最高100 %、プロピルスルホン酸ナトリウ
ム添加系で最高70%、ブチルスルホン酸ナトリウム添加
系で最高50%の酵素反応の活性化が見出された。
uefaciens)由来のα−アミラーゼ(生化学工業)をイオ
ン交換水に適当量溶解させたものを酵素液とした。25mM
Tris-acetate 緩衝溶液 (pH7.0)中にポテト由来アミロ
ペクチン(Sigma)(反応系における最終濃度は 0.5%) 及
び表2に示すアルキル硫酸塩(添加剤)を溶解させた反
応液 0.9mLに酵素液 0.1mLを加え、40℃で、5分毎に反
応時間を設定し最大25分間反応させた。各反応時間ごと
に3,5 −ジニトロ−サリチル酸(DNS)法にて還元糖
の定量を行った。即ち、反応液1.0mL にDNS試薬 1.0
mLを加え、5分間、100 ℃で加熱発色させ、冷却後、4.
0mL のイオン交換水を加えて希釈し、波長535nm で比色
定量した。酵素の反応速度は、反応開始時より生成物で
ある還元糖量が時間と共に直線的に増加する範囲におけ
る生成物増加速度として算出し、相対反応速度として
は、アルキル硫酸塩非存在系に対するアルキル硫酸塩存
在系の反応速度を百分率で示した。以上の方法で測定し
たアミラーゼ反応速度に対するアルキル硫酸塩の添加効
果についての結果を表2に示す。表2より、メチル硫酸
ナトリウム添加系で最高40%、エチル硫酸ナトリウム添
加系で最高10%程度の酵素反応の活性化が見いだされ
た。
Claims (10)
- 【請求項1】 アミラーゼ及びセルラーゼから選ばれる
糖質分解酵素の反応を、反応系中の濃度が1〜 1000mM
の、アルキル鎖長が1〜4のアルキル硫酸塩及びアルキ
ル鎖長が1〜4のアルキルスルホン酸塩からなる群から
選ばれる1種または2種以上の塩の存在下に行なうこと
を特徴とする糖質分解酵素の反応活性化法。 - 【請求項2】 糖質分解酵素が、バチルス(Bacillus)属
の細菌から産生されるα−アミラーゼである請求項1記
載の糖質分解酵素の反応活性化法。 - 【請求項3】 糖質分解酵素が、バチルス・アミロリキ
ファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)から産生さ
れるα−アミラーゼである請求項1記載の糖質分解酵素
の反応活性化法。 - 【請求項4】 糖質分解酵素がセルラーゼである請求項
1記載の糖質分解酵素の反応活性化法。 - 【請求項5】 糖質分解酵素が、バチルス(Bacillus)属
の細菌から産生されるセルラーゼである請求項4記載の
糖質分解酵素の反応活性化法。 - 【請求項6】 糖質分解酵素が、バチルス・エスピー(B
acillus sp.)KSM-635 株の細菌から産生されるセルラー
ゼである請求項5記載の糖質分解酵素の反応活性化法。 - 【請求項7】 糖質分解酵素がアミラーゼであり、アル
キル硫酸塩及びアルキルスルホン酸塩が、アルキル鎖長
が1〜2のアルキル硫酸塩及びアルキル鎖長が1〜2の
アルキルスルホン酸塩からなる群から選ばれる1種また
は2種以上である請求項1〜3の何れか1項記載の糖質
分解酵素の反応活性化法。 - 【請求項8】 アルキル硫酸塩及びアルキルスルホン酸
塩が、メチル硫酸ナトリウム、メチル硫酸カリウム、エ
チル硫酸ナトリウム、エチルスルホン酸ナトリウム、プ
ロピルスルホン酸ナトリウム及びブチルスルホン酸ナト
リウムから選ばれる1種または2種以上である請求項1
〜6の何れか1項記載の糖質分解酵素の反応活性化法。 - 【請求項9】 糖質分解酵素がアミラーゼであり、アル
キル硫酸塩及びアルキルスルホン酸塩が、アルキル鎖長
が1〜2のアルキル硫酸塩である請求項1〜7の何れか
1項記載の糖質分解酵素の反応活性化法。 - 【請求項10】 糖質分解酵素がセルラーゼであり、ア
ルキル硫酸塩及びアルキルスルホン酸塩が、アルキル鎖
長が1〜2のアルキル硫酸塩及びアルキル鎖長が2〜4
のアルキルスルホン酸塩からなる群から選ばれる1種ま
たは2種以上である請求項1〜7の何れか1項記載の糖
質分解酵素の反応活性化法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP1995063992A JP3513249B6 (ja) | 1995-03-23 | 糖質分解酵素の反応活性化法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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JP1995063992A JP3513249B6 (ja) | 1995-03-23 | 糖質分解酵素の反応活性化法 |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH08256768A JPH08256768A (ja) | 1996-10-08 |
JP3513249B2 true JP3513249B2 (ja) | 2004-03-31 |
JP3513249B6 JP3513249B6 (ja) | 2004-07-07 |
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JPH08256768A (ja) | 1996-10-08 |
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