JPH05505604A - アシルリン酸エステルおよびそれによる蛋白質の改質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 アシルリン酸エステルおよびそれによる蛋白質の改質兄肚Δ生１ 本発明は、アシルリン酸エステルの製造方法、新しいアシルリン酸エステルおよ び改質蛋白質の製造におけるそれらの使用に関するものである。

アシルリン酸エステル（塩）（カルボン酸とリン酸の混合無水物）は多くの生化 学プロセスにおける中間体として生成する。

アシルリン酸エステルは活性化されたカルボン酸のように作用する場合もあり、 かくしてアシル基が受容体へ転移するのを促進する。例えば、ある種の生体にお いてミトコンドリア内のアシル補酵素Ａを形成する際に、酢酸エステルは、アセ チル基を補酵素Ａへ転移する前に、ＡＴＰとの反応を通じて酢酸キナーゼによっ て活性化され、アセチルリン酸エステルを生成する。

（Ｗａｌｓｈ、　Ｃ，、Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｍｅｃｈａｎ ｉｓｍｓ、　Ｗ、　Ｈ。

Ｆｒｅｅｍａｎ　Ｃｏ、：　ＮｅｗＹｏｒｋ、　１９７９．２３４〜２３８頁） 。アミノ酸はリポソーム上で、ペプチドおよび蛋白質に取込まれる前に、アミノ アシルアデニラートとして活性化される（同書、２４１〜２４８頁）。

アシルリン酸エステルを製造するために報告された手順には多くの制限がある。

アセチルリン酸フェニルはリン酸フェニルと無水酢酸から製造されている（Ｊｅ ｎｃｋｓ、　Ｗ、Ｐ、；　Ｃａｒｒｉｕｏｌｏ。

Ｊ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　１９５９．２３４．１２７２．１２ ８０；　ＤｉＳａｂａｔｏ、　Ｇ、。

Ｊｅｎｃｋｓ、　Ｗ、　Ｐ、、　Ｊ、　Ａｍ　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、、　１９６ １．８３．４４００　；０ｅｓｔｒｅｉｃｈ、　Ｃ，Ｈ，、Ｊｏｎｅｓ、　Ｍ、 Ｍ、、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１９６６．５．２９２６；　０ｅｓｔｒｅ ｉｃｈ、　Ｃ，Ｈ，、Ｊｏｎｅｓ、　Ｍ、　Ｍ、、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ 、　１９６７、６．１５１５；　Ｂｒ１ｇｇ５．　Ｐ、Ｊ、他、　Ｊ、　Ｃｈｅ ｍ、　Ｓｏｃ、　Ｂ、１９７０．１００８）が、リン酸フェニルの代りにリン酸 アルキルを使用するのに、この方法を拡張すると純度が低く不特定な生成物が得 られる（Ｊｅｎｃｋｓ。

Ｗ、Ｐ、　Ｃａｒｒｉｕｏｌｏ、　Ｊ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　 １９５９、上、１２７２）。アミノアシルアデニラートを合成する古典的な方法 （ジシクロへキシルカルボジイミドを使用する、Ｎ−プロテクトしたアミノ酸と アデニル酸のカップリング）も純度の低い生成物を生じる（Ｂｅｒｇ、　Ｐ、、 　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　１９５８．２３３．６ｏ８）。

アセチルリン酸ジメチルをアセトン中で沃化ナトリウムと反応させることによっ てアセチルリン酸メチルが製造された（Ｋｌｕｇｅｒ、　Ｒ，、Ｔｓｕｉ、　Ｗ 、　Ｃ，、Ｊ、　Ｏｒｇ、　Ｃｈｅｍ、、　１９８０．４５．２７２３およびＫ ｌｕｇｅｒ、　Ｒ，、Ｔｓｕｉ、　Ｗ、Ｃ，、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　ａｎｄ　Ｃｅ １ｌ　Ｂｉｏｌ、　１９８６、鉦、４３４）　。アセチルリン酸ジメチルの合成 には塩化アセチルとリン酸トリメチルを長時間還流することが必要である（　Ｗ 　ｈ　ｅ　ｔ　ｓ　ｔ　ｏ　ｎ　ｅ　、　Ｒ、、米国特許２，６４８，８９６； およびケミカルアブストラクト１９５４、坦、８２５０　；およびＫｌｕｇｅｒ 、　Ｒ，、Ｗａｓｓｅｒｓｔｅｉｎ。

Ｐ、、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１９７２、■、１５４４）。しかし、本発 明者は、この反応はより複雑な酸塩化物または二酸塩化物、例えば塩化スクシニ ルまたは塩化フマリルに拡張できないことを見出した。

アセチルリン酸ジメチルを製造するための可能性のある代わりのルートは、アシ ルハロゲン化物をジメチルリン酸塩と反応させることである。塩化アセチルはト リエチルアンモニウムジメチルリン酸塩と反応してアセチルリン酸ジメチルを生 成すると報告さているが、その物質は“′不純で不安定な状態”でしか単離され ていない（Ａｖｉｓｏｎ、　Ａ、　Ｗ、　Ｄ、、　Ｊ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、 　１９５５　、７３２）。

この代替的なルートには、ジエステルは水中で非常に反応性であるので、有効で あるためには厳密に水を排除しなければならないという追加的な制限がある（Ｋ ｌｕｇｅｒ、　Ｒ，、Ｗａｓｓｅｒｓｔｅｉｎ。

Ｐ、、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１７２．１１．１５４４）。

アシルリン酸エステルの中のモノエステルは中性の水溶液中では安定であると見 出されており（Ｋｌｉｎｍａｎ、　Ｊ、　Ｐ、、　Ｓａｍｕｅｌ。

Ｄ、、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　１９７１、■、２１２６）　、アミノ基 を色々な部位でアセチル化し、これが陰イオンまたは蛋白質を拘束すると報告さ れている（Ｋｌｕｇｅｒ、　Ｒ，、Ｔｓｕｉ　Ｗ、　Ｃ，、Ｊ、　Ｏｒｇ、　Ｃ ｈｅｍ、。

１９８０、位、２７２３；　Ｋｌｕｇｅｒ、　Ｒ，、Ｔｓｕｉ　Ｗ、Ｃ，、Ｂｉ ｏｃｈｅｍ、　ａｎｄＣｅｌｌ　Ｂｉｏｌ、、　１９８６、銃、４３４およびＵ ｅｎｏ、　Ｈ，他、　Ａｒｃｈ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　１９８６、担、７９５）　、　Ｋｅｒｎ 他（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　１９８５、註、１３２１）は、アミノアシル アデニル酸はそれが正常な基質（ｎｏｒｍａｌ　５ｕｂｓｔｒａｔｅ）ではない アミノ酸から酵素によって作られる際に、アミノアシルｔ−ＲＮＡシンテターゼ のアミノ残基を選択的にアシル化することを示した。アセチルリン酸メチルはヘ モグロビンの２−３−ジホスホグリセリン酸結合部位の領域でアミノ基を特に独 占的にアシル化することが見出されている（Ｕｅｎｏ　Ｈ，他、　Ａｒｃｈ、　 Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、　１９８６、担、７９５およびＵｅｎｏＨ，他、１９８９、垣 、１２３４４）。

泣肌ダ災曳 本発明者は、アシルリン酸エステルはエーテル溶媒の存在下で、ジアルキルまた はジフェニルリン酸エステル（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）とハロゲン化アシルの反応 によって都合よく、かつ高い収率で製造できることを見出した。得られたジアル キルまたはジフェニルアシルリン酸エステルはアルカリ金属ハロゲン化物との反 応によってたやすくそれらの相当する塩に変換される。本発明者は、また、この プロセスは改質蛋白質、例えば改質ヘモグロビンを製造するための架橋剤として 使用できる新しいアシルリン酸エステルを製造するのに有用であることを見出し た。

したがって、本発明は下記の式Ｉのアシルリン酸エステルを製造するための方法 を提供するものであり、（式中、ＲとＲ＋は同じでも良く、または異なっていて も良く、これらは４つまでの炭素原子を有する直線状のまたは分枝したアルキル 基、フェニルまたはベンジルを表わし；ｎは整数であり； ｎが１の場合は、Ｒ２は下記の基 Ｒ’　−Ｃ− （式中、Ｒ４は直線状のまたは分枝したアルキル、アルケニルまたはアルキニル 、環式アルキル、環式アルケニル、あるいはアルキル、アルケニル、アルキニル 、アリール、アリールアルキルまたはアリールアルケニルで置換されていても良 いアリールを表わし）、または ｎが少なくとも２の場合は、Ｒ２は下記の基（式中、ｎは少なくとも２であり、 Ｒ４は上に定義された通りである）、 を表わし）、 この方法は （ａ）下記の式Ｈ （式中、ＲとＲ１は上に定義された通りであり、Ｒ３は対イオンである） の化合物を、 （ｉ）ｎが１である式Ｉの化合物を必要とするときは、下記の式ＩＩＩ （式中、Ｒ４は上に定義された通りであり、Ｒ５はエステル化反応について広く 知られている離脱基である）の化合物と、極性有機溶媒の存在下で反応させ、ま たは（ｉ　ｉ）ｎが少なくとも２である式Ｉの化合物を必要とするときは、化学 量論的な量の、下記の式ＩＶ（式中、ｎは少なくとも２であり、Ｒ４とＲ５は上 に定義された通りである） の化合物と、極性有機溶媒の存在下で反応させ、さらに（ｂ）所望によって、得 られたアシルリン酸エステルをそれらの塩に変換する、ことから構成されている 。

本発明の１つの実施態様によれば、下記の式（ＩＩ）Ｃ式中、ＲとＲ１は上に定 義された通りであり、Ｒ３は対イオンである） の化合物を、下記の式ＩＩＩ （式中、Ｒ４は上に定義された通りであり、Ｒ５はエステル化反応について広く 知られている離脱基である）の化合物と、極性有機溶媒の存在下で反応させ、さ らに所望によって、得られた下記の式Ｉａ （式中、ＲとＲ１は同じでも良く、または異なっていても良く、しかもこれらは ４つまでの炭素原子を有する直線状のまたは分枝したアルキル基、フェニルまた はベンジルを表わす；Ｒ４は直線状のまたは分枝したアルキル、アルケニル、ま たはアルキニル、環式アルキル、環式アルケニル、あるいはアルキル、アルケニ ル、アルキニル、アリール、アリールアルキルまたはアリールアルケニルで置換 されていても良いアリールである）の化合物をそれらの塩に変換することからな る式Ｉａのアシルリン酸エステルまたはそれらの塩を製造する方法が提供される 。

本発明の第２の実施態様によれれば、 （式中、ＲとＲ１は上に定義された通りであり、Ｒ３は対イオの化合物を、下記 の式ＩＶ （式中、ｎは少なくとも２であり、Ｒ４は上に定義された通りであり、Ｒ５はエ ステル化反応について広く知られている離脱基である） の化合物と、極性有機溶媒の存在下で反応させ、さらに所望によって、得られた 式ｒｂ （式中、ＲとＲ１は同じでも良く、または異なっていても良く、またこれらは４ つまでの炭素原子を有する直線状のまたは分枝したアルキル基、フェニルまたは ベンジルを表わす；ｎは少なくとも２の整数であり、Ｒ４は直線状のまたは分枝 したアルキル、アルケニルまたはアルキニル、環式アルキル、環式アルケニル、 あるいはアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキルまた はアリールアルケニルで置換されていでも良いアリールである） の化合物をそれらの塩に変換することから成る式Ｉｂのアシルリン酸エステルま たはそれらの塩を製造する方法が提供される。

また本発明は、式Ｉｂの新しいアシルリン酸エステルまたはそれらの塩を提供す る （式中、ＲとＲ１は同じでも良く、または異なっていても良く、これらは４つま での炭素原子を有する直線状のまたは分枝したアルキル基、ベンジルまたはフェ ニルを表わし、ｎは少なくとも２の整数であり、Ｒ４は直線状のまたは分枝した アルキル、アルケニルまたはアルキニル、環式アルキル、環式アルケニル、ある いはアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキルまたはア リールアルケニルで置換されていても良いアリールを表わす）。

また、本発明は、改質ヘモグロビンの製造における架橋剤として、上に定義され た式Ｉｂの新しいアシルリン酸エステルまたはその塩を使用することを企図して いる。

さらに本発明は、ヘモグロビンを上に定義された式Ｉｂの新しいアシルリン酸エ ステルまたはその塩で架橋することによって得られる改質ヘモグロビンを企図し ている。

さらにまた本発明は、 （ａ）ヘモグロビンを上に定義された式Ｉｂのアシルリン酸エステルまたはその 塩で架橋し；そして （ｂ）生じるヘモグロビンを精製する、ことから成る改質ヘモグロビンの製造法 を企図している。

屋亙左１囲 図面を参照して本発明をさらに説明する。

図中、 第１図は、デオキシヘモグロビンをフマリルビス（リン酸メチル）　（ｍｅｔｈ ｙｌ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）で処理した後の反応混合物の陰イオン交換ＨＰＬＣ （高速液体クロマトグラフィー）のクロマトグラムを示し。

第２図は、カーボンモノキシヘモグロビンをフマリルビス（リン酸メチル）で処 理した後の反応混合物の陰イオン交換ＨＰＬＣのクロマトグラムを示し； 第３図は、２，３−ジホスホグリセリン酸の存在下で、フマリルビス（リン酸メ チル）で処理されたデオキシヘモグロビンから生成する反応生成物の陰イオン交 換ＨＰＬＣクロマトグラムを示し；そして 第４図は、２，３−ジホスホグリセリン酸の不在下で、デオキシヘモグロビンを フマリルビス（リン酸メチル）で処理した後の反応混合物のクロマトグラムを示 すものである。

ル肌０１凱象毀且 上に述べたように、本発明は式Ｉ （式中、ＲとＲ１は同じでも良く、または異なっていても良く、そして４つまで の炭素原子を有する直線上のまたは分枝したアルキル基、フェニルまたはベンジ ルを表わし。

ｎは整数であり； ｎが１の場合は、Ｒ２は基 （式中、Ｒ４は直線状または分枝したアルキル、アルケニルまたはアルキニル、 環式アルキル、環式アルケニル、あるいはアルキル、アルケニル、アルキニル、 アリール、アリールアルキルまたはアリールアルケニルで置換されていても良い アリールである）、または ｎが少なくとも２の場合は、Ｒ２は基 （式中、ｎは少なくとも２であり、Ｒ４は上に定義された通りである）のアシル リン酸エステルまたはそれらの塩を製造する方法を提供するものであり、 この方法は （ａ）式ＩＩ （式中、ＲとＲ１は上に定義された通りであり、Ｒ３は対イオンである） の化合物またはその塩を （ｉ）ｎが１である式Ｉの化合物が必要な時は、式ＩＩＩ（式中、Ｒ４は上に定 義された通りであり、Ｒ５はエステル化反応について広く知られている離脱基で ある）の化合物と、極性有機溶媒の存在下で、または（ｉｉ）ｎが少なくとも２ である弐■の化合物が必要なときは、化学量論的な量の式ＩＶ （式中、ｎは少なくとも２であり、Ｒ４とＲ５は上に定義された通りである） の化合物と、極性有機溶媒の存在下で反応させ、さらに（ｂ）所望によって、得 られたアシルリン酸エステルをそれらの塩に変換する、 ことより構成されている。

本発明の１つの実施態様では、式１ａ （式中、Ｒ，Ｒ’及びＲ４は上に定義された通りである）の化合物が上に述べら れた反応ステップ（ｉ）を用いて製造さ本発明の第２の実施態様にしたがえば、 式Ｉｂ（式中、ｎは少なくとも２であり、Ｒ，Ｒ’およびＲ４は上に定義された 通りである） の化合物が上に述べられた反応ステップ（ｉ　ｉ）を用いて製造される。

ｎが２である反応ステップ（ｉ　ｉ）を使用する反応は一般的に次の略図によっ て表わされる。

式ＩＩの化合物において、ＲとＲ１は同じでも良いし、または異なっていても良 く、またそれらは４つまでの炭素原子を有する直線状のまたは分枝したアルキル 基、フェニルまたはベンジル、好ましくはメチル、エチルまたはベンジルを表わ す。式ＩＩの化合物中のＲ３は対イオンであり、代表的にはナトリウム、リチウ ム、カリウム、好ましくはナトリウムイオンのようなアルカリ金属イオンである 。

本発明の方法に使用される式ＩＩＩおよびＩＶの化合物で、Ｒ４は直線上のまた は分枝したアルキル、アルケニルまたはアルキニル、環式アルキル、環式アルケ ニル、あるいはアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキ ルまたはアリールアルケニルで置換されていても良いアリール、好ましくは直線 状のアルキルまたはアルケニル、フェニル、フェニルアル　゛キル、フェニルア ルケニル、ジフェニルアルキル、ジフェニルアルケニルあるいはナフチルでも良 い。式ＩＮ及び■■の化合物中のＲ５はエステル化反応について広く知られてい る離脱基である。適当な離脱基の例はクロロ−、ブロモ−およびヨード−である 。代表的な離脱基を示すエステル化反応についての一般的な議論はＭｏｒｒｉｓ ｏｎ、　Ｒ，Ｔ、およびＲ，Ｎ、　Ｂｏｙｄ、○ｒｇａｎｉｃＣｈｅｍｉｓｔｒ ｙ、　３ｄ　Ｅｄ、、　Ａ１１ｙｎ　ａｎｄ　Ｂａｃｏｎ、　Ｉｎｃ、、ボスト ン、１９７４、６７２〜６７４頁に見出される。

本発明にしたがえば式ＩＩＩの化合物による反応、　（すなわち、反応ステップ （ｉ））に対しては、ＲとＲ１がメチルまたはベンジルであり、Ｒ３がナトリウ ムまたはリチウムイオンである式ＩＩの化合物とＲ５がクロロ−基である式ＩＩ Ｉの化合物が好ましい。最も望ましいのは、式ＩＩの化合物がジメチルリン酸ナ トリウムであり、式ＩＩの化合物においてＲ５がクロロ−基の場合である。

本発明にしたがえば式ＩＶの化合物による反応、　（すなわち、反応ステップ（ ｉｉ））に対しては、ＲとＲ１がメチルであり、Ｒ３がナトリウムまたはリチウ ムイオンである式ＩＩの化合物と、ｎ　カ２〜５であり、Ｒ４がアルケニル、フ ェニル、フェニルアルキルまたはジフェニルアルケニルであり、Ｒ５がクロロ− 基である式ＩＶの化合物が好ましい。式ＩＩの化合物がジメチルリン酸ナトリウ ムであり、Ｒ５がクロロ−基であるのが最も好ましい。

ｎが２であり、２つのカルボニル基と併せてＲ４がフマリル、イソフタリル、テ レフタリル、スチルベン３，３′　−ジカルボン酸またはスチルベン４，４′− ジカルボン酸であり、Ｒ５がクロロ−基である式ＩＶの化合物と、ｎが３であり 、３つのカルボニル基と併せてＲ４が１．　３．　５−ベンゼントリカルボン酸 である式ＩＶの化合物が最も好ましい。

本発明にしたがえば式■の化合物を製造するための方法は極性有機溶媒、特にエ ーテル溶媒の存在下で行なわれる。適当なエーテル溶媒はジエチルエーテル、ジ オキサンまたはテトラヒドロフランであり、テトラヒドロフランが好ましい。

その方法に対する反応温度はかなり広い範囲内で変えることができる。一般的に その方法は一２０℃から７５℃、好ましくは２０℃から５０℃、最も望ましくは ２０℃から２５°Ｃの温度範囲内で行なうことができる。

本発明にしたがう方法において、出発物質として使用される式Ｉ１．　ＩＩＩま たはＩＶの化合物は文献から知られており、または文献から知られている方法で 製造することができる。例えば、ジメチルリン酸ナトリウムはリン酸トリメチル と沃化ナトリウムからアセトン中で作ることができる。

温度範囲に依存し、反応時間は数時間から数日である、代表的には、２０℃から ５０℃の範囲の温度で、反応時間は１時間と７２時間の間であり、好ましくは４ ８時間である。反応は一般的に常圧下、乾燥雰囲気中で行なわれる。

式ＩＩの化合物と式ＩＶの化合物の反応（すなわち反応ステップ（ｉｉ））につ いては、化学量論的な量の式ＩＩの化合物が加えられる。例えば、ｎが２の式Ｉ の化合物を製造する際には、式ＩＩの化合物の２当量が式ｒｖの化合物と反応さ せられる。

必要であれば、この反応の生成物を適当な溶媒や溶媒混合物から再結晶によって 、またはカラムクロマトグラフィーによって精製してもよい。

式Ｉの化合物はアルカリ金属ハロゲン化物、例えば、沃化ナトリウム又は沃化リ チウムとの反応によってそれらの相当する塩に変換することができる。好ましく は、式Ｉの化合物はアセトンのような溶媒の存在下で化学量論的な量の沃化ナト リウムと反応させることによってそれらの塩に変換される。相当する塩への変換 は、一般的に一２０°Ｃ〜８０℃、好ましくは２０°Ｃ〜２５℃の温度範囲で行 なわれ、反応時間は約１〜１２時間の間であり、好ましくは１２時間である。

また本発明は式Ｉｂの新しいアシルリン酸エステルまたはそれらの塩を提供する 。

（式中、ｎは少なくとも２、好ましくは２〜５の整数であり、ＲとＲ１は同じで も、または異なっていてもよく、そして４つまでの炭素原子を有する直線上のま たは分枝したアルキル基、フェニルまたはベンジル、好ましくはメチル、エチル またはベンジルを表わし；そしてＲ４は直線状のまたは分枝したアルキル、アル ケニルまたはアルキニル、環式アルキル、環式アルケニル、あるいはアルキル、 アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキルまたはアリールアルケニ ルで置換されていてもよいアリール、好ましくは直線状のまたは分枝したアルキ ルまたはアルケニル、フェニル、ベンジル、フェニルアルキル、フェニルアルケ ニル、ジフェニアルキル、ジフェニルアルケニルあるいはナフチルを表わす）。

最も好ましくは、式Ｉｂの化合物またはそれらの塩において、ｎは２〜３、Ｒと Ｒ１は同じで、メチル基を表わし；Ｒ４は直線状のアルケニル、フェニル、ジフ ェニルアルケニル、ベンジルまたはナフチルを表わす。

本発明における式Ｉｂの化合物の具体例としては次のようなものが含まれる： 下に示す式によって表わされるフマリルビス（リン酸ジメチル）： 下に示す式によって表わされるイソフタリルビス（リン酸ジメチル）： ２、　Ｒ＝ＣＨ，；　２　ａ、　Ｒ＝Ｎ　ａ下に示す式によって表わされるテレ フタリルビス（リン酸ジ下に示す式によって表わされるスチルベン３，３′　ジ カルボン酸ビル（リン酸ジメチル）： 下に示す式によって表わされるスチルベン４，４′　−ジカルボン酸ビス（リン 酸ジメチル）： 式Ｉｂの化合物はそれらの塩の形で存在しても良い。一般的にこれらはアルカリ 金属ハロゲン化物、例えば沃化ナトリウムおよび沃化リチウムとの塩である。式 Ｉｂの化合物の沃化ナトリウムとの塩が好ましい。

ラジカルＲ，Ｒ’およびＲ４は１つまたはそれ以上の、同一の又は異なった置換 基をもっていてもよい事が認められる。適当な置換基の例には、直線状のまたは 分枝したアルキル、ハロゲン、シアン、ニトロ、アルキルチオ、アルコキシ、ア ミノおよびヒドロキシが含まれる。

式Ｉｂの化合物およびそれらの塩は高度に選択的であり、請求核剤（ａｍｉｎｅ 　ｎｕｃｌｅｏｐｈｉｌｅｓ）とたやすく反応する。これらの化合物が蛋白質と 会合するときは、それらは隣接する核剤と反応することが見出されている。これ らの性質、すなわち陰電荷と電子的反応性によって、式Ｉｂの化合物およびそれ らの塩は蛋白質改質用の部位特異性の（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ）試薬とし て使用するのに適している。また、これらの化合物を他の選択的求電子剤と結合 させて別の型の特異性を持った試薬とすることもできる。

式Ｉｂの化合物およびそれらの塩は、血液代替品として使用できる改質ヘモグロ ビンの製造における架橋剤として特に有用である。式Ｉの化合物またはそれらの 塩は、ヒトヘモグロビンの２．３ジホスホグリセリン酸（以下、ＤＰＧと略記す る）結合部位における架橋アミノ基からの既知の距離に対する大きさの計算に基 づいて架橋剤として適宜選択できる（Ｐｅｒｕｔｚ、　Ｍ、　Ｆ、。

Ｎａｔｕｒｅ　（ロンドン）　、１９７０．２２８１２６およびＵｅｎｏ、　Ｈ ，他、Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、、　１９８６．２４４ ．　ｐ、　７９５　；およびＵｅｎｏ。

Ｈ０他、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　１９８９．２Ｊ　１２３４４）　、第 １表は、蛋白質上のアミノ基とフマリルビス（リン酸メチル）、イソフタリルビ ス（リン酸メチル）；テレフタリルビス（リン酸メチル）；スチルベン３，３′ −ジカルボン酸ビス（リン酸メチル）；またはスチルベン４，４′−ジカルボン 酸ビス（リン酸メチル）との反応から生成するアシルリン酸エステルのカルボキ シアミド誘導体についての計算された距離を示している。

式Ｉｂの化合物またはそれらの塩は配位した（オキシ−、カルボキシ−、カーボ ンモノキシ−または誘導体）および配位していない（デオキシ−）ヘモグロビン と反応させることができる。

架橋していても良いヘモグロビンはヒト、ウマ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルまた は魚のヘモグロビンでも良い。

式ｒｂの化合物またはそれらの塩とヘモグロビンの反応は約Ｏ℃から５０℃、好 ましくは３５℃の温度で起こすことができる。

反応のｐＨは約５．５から約１０、好ましくは約５から約８、最も望ましくは約 ６．８から７．５とすることができ、その反応は緩衝液、代表的には１００ｍＭ のビス−トリス緩衝液中で行なうことができる。反応時間は種々可能であるが、 一般的には充分な程度の架橋が２時間内に起こる。改質ヘモグリンは次いで文献 に知られているテクニックを用いて未反応のヘモグロビンおよび他の不純物から 分離することができる。

上述した反応を使用して改質されたヘモグロビンはＤＰＧ結合部位で架橋してい ることが見出された。特に、ＤＰＧ不在の場合は、ヘモグロビンとフマリルビス （リン酸メチル）の反応はβサブユニットの間（ｖａｌ−１から１ｙｓ−８２） で、しかも一つのβサブユニツト中の同じ残基の間で架橋されており、同様にα サブユニットの間で、各サブユニットの中の１ｙｓ−９９の間で架橋されている 物質を生成することが見出されている。ＤＰＧの存在下ではα−架橋のみが形成 される。

式１の化合物とそれらの塩はヘモグロビン分子上の選択された基に対して高度に 特異的であり、望ましい改質ヘモグロビン生成物を高い収率で生成する。

本発明におけるような改質ヘモグロビンは血液代替品または血漿エキスパンダー として使用することもてきる。改質ヘモグロビンを薬学的に許容しうるキャリア ーと組合せて薬剤組成物を製造することができる。適当な薬学的に許容しうるキ ャリアーには生理的食塩水、リンゲル液、乳酸エステル化（ｌａｃｔａｔｅｄ） リンゲル液、ロック−リンゲル液、クレブス−リンゲル液、ノ１ルトマンのバラ ンス食塩水およびヘパリン処理したナトリウム−クエン酸塩（エステル）−クエ ン酸−ブドウ糖液が含まれる。

改質ヘモグロビンは他の血漿代替品または血漿エキスパンダーと組合せても良い 。血漿代替品の例としてはポリ　（エチレンオキシド）、ポリビニルピロリドン 、ポリビニルアルコールおよびエチレンオキシド−ポリプロピレングリコール縮 金物があり、血漿エキスパンダーの例にはデキストラン、アルブミン、他の血漿 タンパク、ペクチン、バランス流動ゲラチン（ｂａｌａｎｃｅｄｆｌｕｉｄ　ｇ ｅｌａｔｉｎ）およびヒドロキシエチルデンプン等の線状多糖類がある。改質ヘ モグロビンおよび改質ヘモグロビンを含む薬剤的組成物は通常の方法を用いて投 与することができる。

さらに次の実施例を本発明を理解する目的でのみ提供するが、これらは決して本 発明の範囲を制限することを意図しているものではない。

災五匠上 ａ）アセチルリン酸ジメチル アセチルリン酸ジメチルを、予め、塩化アセチルとリン酸トリメチルの溶液を長 時間還流させることによって調製した（Ｗ　ｈ　ｅ　ｔ　ｓ　ｔ　ｏ　ｎ　ｅ　 、　Ｒ、、米国特許第２，６４８，８９６号、　１９５３；ケミカルアブストラ クト１９５４．４８．８２５０ｉ；　Ｒ，、Ｗａｓｓｅｒｓｔｅｉｎ、　Ｐ、。

Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１９７２．　ＬＬ　１５４４）　、反応は塩化アセ チルの替わりに臭化アセチルを使うことによってかなり早く完了した。しかし、 酸臭化物は、より複雑な酸塩化物からは得られないので、この方法を一般的に使 用することはできなかった。一般的な方法には、リン酸トリメチル（１０ｇ、７ １ｍｍｏ　Ｉ）に臭化アセチル（４ｇ、３２ｍｍｏ　ｌ）を５０’Ｃで１５分間 の期間にわたって滴下してアセチルジメチルリン酸エステルを製造することが含 まれている。さらに１５分間経過した後、反応溶液を２０Ｘ１ｍの直空ジャケッ ト付きカラムを通し、０．３Ｃｌルで蒸留した。過剰のリン酸トリメチルからな る最初の低沸点留分に続いて５５〜６０℃で生成物が留出した。収率、４．０ｇ 、７５％。生成物の分析：四塩化炭素中でのプロトンＮＭＲ、テトラメチルシラ ンと比較、δ２．　２　（３８，ｄ、Ｊ、、＝１．　５Ｈｚ）＋　３．７５　（ ６Ｈ，ｄ、ＪＰ−Ｂ＝１１Ｈｚ）、これらのスペクトルはアセチルリン酸ジメチ ルの１Ｈスペクトルと同じであった。　（Ａｖｉｓｏｎ　、　Ａ、Ｗ、Ｄ、、　 Ｊ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓａｃ、　１９５５７３２）。

ｂ）アセチルリン酸ジメチル ジメチルリン酸ナトリウム（１４，８ｇ、０．１ｍｍｏｌ。

リン酸トリメチルと沃化ナトリウムから）および乾燥テトラヒドロフラン（８０ ｍＬ）に溶解した塩化アセチル（７，８ｇ。

０．１ｍｍｏｌ）の懸濁液を、乾燥管を備えたフラスコ中で室温で２日間撹拌し た。反応溶液を濾過し、テトラヒドロフランを減圧下で除去した。生成する無色 の液体をクーゲル口（Ｋｕｇｈｅｌｒｏｈｒ）蒸留（アルドリツヒ・クーゲルロ ー（ＡｌｄｒｉｃｈＫｕｇｅｌｒｏｈｒ）装置、５５〜６０℃、０．３（ゲル） して１４゜２ｇ（８０％）のアセチルリン酸ジメチルを生成した。

Ｃ）アセチルリン酸メチル アセチルリン酸メチルをアセチルリン酸ジメチルから製造した（Ｋｌｕｇｅｒ、 　Ｌ、、　Ｔｓｕｉ　Ｗ、−Ｃ，、Ｊ、　Ｏｒｇ、　Ｃｈｅｍ、　１９０８．４ ５．２７２３）。

乾燥アセトン（１５ｍＬ）に溶解した沃化ナトリウム（２，４ｇ、１６ｍｍｏ　 Ｉ）の溶液を乾燥アセトン（１０ｍＬ）に溶解したアセチルジメチルリン酸エス テル（２ｇ、１６ｍｍｏ　ｌ）に加えた。淡黄色の溶液を室温で一晩放置した。

沈殿を半融ガラス瀘斗中で濾過して集め、乾燥アセトンと次いで塩化メチレンで 洗浄した。生成する白色粉末を真空下で乾燥し、熱イソプロパツールから再結晶 して２．２ｇ　（８０％）のアセチルリン酸メチルのナトリウム塩を生成した。

生成物の分析：重水（Ｄ２０）’ＨＮＭＲ，ＤＳＳと比較、６２．１８　（３Ｈ ，Ｊ、、Ｂ＝１．４Ｈｚ）、３．６７　（３Ｈ，ｄ、Ｊ、、＝１１．６Ｈｚ）。

スペクトルは以前報告されたアセチルリン酸メチルの’ＨＮＭＲスペクトルと同 じであった。　（同書、２７２３）。

寒ｉ匠ｌ フタリルビス（メチルリン酸ナトリウム）（ａ）フタリルビス（リン酸ジメチル ）　（１）ジメチルリン酸ナトリウム（リン酸トリメチルとアセトンに溶解した 沃化ナトリウムからの、６．　９ｇ、４７ｍｍｏｌ）と塩化フタリル（３，６ｇ 、２４ｍｍｏ　ｌ）の懸濁液を乾燥テトラヒドロフラン（６０ｍＬ、ナトリウム ベンゾフエノンケチル（ｓｏｄｉｕｍ　ｂｅｎｚｏｐｈｅｎｏｎｅ　ｋｅｔｙｌ ）からの蒸留によって乾燥）中で、窒素下、室温で三日間撹拌した。次いで、溶 液を半融ガラス漏斗を通して濾過し、溶媒を除去し、生成物を固体として放置し た。ベンゼンとエーテルからの再結晶によって白色フレークの生成物を得た（４ ．７ｇ、６１％、ｍｐ７６〜７７℃）。

生成物の分析：　ＩＲ（ＫＢｒ）　ｃｍ０　１７４３ｃｍ”；’ＨＮＭＲ（ＣＤ Ｃｌ２）６６．９３　（Ｈ−Ｃ＝Ｃ，２Ｈ，ｓ）。

４．０５　（−０ＣＨ３，１２Ｈ，ｄ、Ｊ、、Ｂ＝１１．６Ｈｚ）、”ＣＮＭＲ （ＣＤＣｌ２）：　６１５８．１２　（ｄ、Ｊ、、ｃｍ１゜９Ｈｚ）、１３４． ３９　（ｄ、Ｊ、、。＝９．４Ｈｚ）、５５．３９　（ｄ、Ｊ、、ｃｍ５．９Ｈ ｚ）、”Ｐ　ＮＭＲ（ＣＨＣＩ３）６−１５．　４（ｈｅｐｔ、Ｊ、、＝１１． 　６Ｈｚ）。生成物の分析においては、プロトンＮＭＲスペクトルはＶａｒｉａ ｎ　（パリアン）Ｔ−６０（６０ＭＨ２）またはＶａｒｉａｎ　Ｇｅｍ１ｎｉ　 （パリアン・ジェミニ）　（２００ＭＨ２）分光光度計に記録された。リンのス ペクトルはＶａｒｉａｎ　Ｘ　Ｌ　−２００分光光度計に記録された。′３ＣＮ ＭＲスペクトルはＶａｒｃａｎ　Ｇｅｍｌｎｉ分光光度計に記録された。

赤外線スペクトルは　Ｎ１ｃｏｌｅｔ　にコレット）ＳＤＸ　ＦＴＩＲ分光光度 計に記録された。

反応は（リン酸ナトリウムの溶解度を増すために）０．０１または０．１当量の １８−クラウン−６を加えて繰り返した。

何れの場合も収率はクラウンエーテル不在の場合よりも低くかった。

（ｂ）フタリルビス（メチルリン酸ナトリウム）　（ｌａ）乾燥アセトン（６ｍ Ｌ）中に溶解した沃化ナトリウム（０゜９　ｇ、６ｍｍｏ　Ｉ）を２５ｍＬのフ ラスコ中でフタリルビス（リン酸ジメチル）　（１ｇ、３ｍｍｏ　りのアセトン （６ｍＬ）溶液に加えた。溶液を振動させ、フラスコを１２時間放置した。

この際沈殿する生成物は淡黄色の粉末であった。濾過し、乾燥アセトンと塩化メ チレンで洗浄すると少し黄色がかった白色の粉末が得られ、これは真空下で乾燥 した。この物質１ｇを２０ｍＬのメタノール中に溶解して再結晶した。次いで４ ０ｍＬの１：１、エタノール：イソプロパノールを加え、溶液を３０分間放置し た。生成する結晶を集め、真空内で乾燥した（ｍｐ＞２００℃、収率９３％）。

生成物の分析：　ＩＲ（ＫＢｒ）：ｃｍ０　１７１４ｃｍ”。’ＨＮＭＲ（Ｄ２ ０）６６、　８５　（Ｈ−Ｃ＝Ｃ，２Ｈ，ｄ、Ｊ＝２Ｈｚ）、３．６５　（−０ ＣＨ１゜６Ｈ，ｄ、Ｊ、Ｂ＝１２Ｈｚ）、　１３ＣＮＭＲ（Ｄ２０）：　６１６ ３、Ｏ（ｄ、Ｊ、、ｃ＝８Ｈｚ）、１３５．６　（ｄ、Ｊ、、ｃｍ１゜６Ｈｚ） 、５４．７６　（ｄ、Ｊ、、ｃｍ６．４Ｈｚ）、分析（Ｃ６Ｈ８０＋ｏ　Ｐ　２ 　Ｎ　ａ　２　）　Ｃ＋　Ｈ＋　Ｐ　。

生成物はプロトン−カップリング（ｐｒｏｔｏｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ）　”　ＰＮ ＭＲスペクトルとプロトンＮＭＲスペクトルによって対称性のリン酸モノメチル であると固定された。ビス（リン酸ジメチル）のプロトン−カップリング”Ｐ　 ＮＭＲは単一のリンのシグナルより成り、これは２つの等価（ｅｑｕｉｖａｌｅ ｎｔ）のリンの核と（２つのメチル基からの）６つのプロトンの等価セットとの カップリングによる七重線である。各端末（ｅｎｄ）からの１つのメチル基が開 裂すると、その物質はリンＮＭＲシグナルが４重線のものに変化する。分子中の 残存プロトンのシグナルと比較すると、プロトンＮＭＲにおけるメトキシプロト ンのシグナルのインテグレーションは半分のエステル基の開裂が起こったことを 示している。

実ｍ イソフタリルビス（メチルリン酸ナトリウム）（ａ）イソフタリルビス（リン酸 ジメチル）　（２）実施例１に示したようにして、乾燥テトラヒドロフラン（５ ０ｍＬ）中に溶解した、二塩化イソフタリル（４，８３ｇ、２３ｍｍｏりとジメ チルリン酸ナトリウム（６，９ｇ、４７ｍｍｏｌ）からイソフタリルビス（リン 酸ジメチル）を製造し、収率８３％で無色の油を得た。生成物の分析：　ｒＲ（ フィルム）ｃｍ０　１７５４　ｃｍ−’　；　’ＨＮＭＲ（ＣＤＣＩ、）　６８ ゜７２　（ＬＨ，ｔ、Ｊ＝ｌ、７Ｈｚ）　、８．３５　（２Ｈ，ｄｄ。

Ｊ＝１．７，７．８Ｈｚ）　、７．６８　（ＬＨ，ｔ、Ｊ＝７．８Ｈｚ）　、４ ．０２　（１２Ｈ，ｄ、Ｊ＝１１．７Ｈｚ）、　１１ＣＮＭＲ（ＣＤＣｌ２）６ １６０．６０　（ｄ、Ｊ、、ｃｍ７．０Ｈ２）、１３７．３９　（ｄ、Ｊ、。＝ １１．５Ｈ２）、１３６．９４゜１３３．４３，１３０，３９，５６．２３　（ ｄ、ＪＰ−ｃｍ４゜８Ｈｚ）。

（ｂ）イソフタリルビス（メチルリン酸ナトリウム）　（２ａ）実施例１に示し たようにして、イソフタリルビス（リン酸ジメチル）　（１，８２ｇ、４．８ｍ ｍｏ　Ｉ）と沃化ナトリウム（１，４４ｇ、９．６ｍｍｏｌ）から収率９５％で イソフタリルビス（メチルリン酸ナトリウム）を製造した。生成物の分析＝ｍｐ ＞２００℃；ＩＲ（ＫＢｒ）ｃｍ０　１７２０”’°１；１ＨＮＭＲ（Ｃ２０） 　δ８．５２　（ＩＨ，ｔ、Ｊ＝１．８Ｈｚ）。

８．１７　（２Ｈ，ｄｄ、Ｊ＝１．８．　７．９Ｈｚ）　、７．５２　（ＬＨ， ｔ＋　Ｊ＝７．９Ｈｚ）、３．５６　（６Ｈ，ｄ、Ｊ、−８＝１１．４Ｈｚ）； １３ＣＮＭＲ（Ｃ２０）６１６６．４０　（ｄ。

ＪＰ−ｃｍ８．１Ｈｚ）、１３８．７２，１３７．９５　（ｄ、Ｊ、、ｃｍ１０ ．０Ｈｚ）、１３４．８　９，１３２．６６．５６゜９１　（ｄ、Ｊ、、ｃｍ６ ．２Ｈｚ）、生成物は、実施例１に示したように、プロトン−カップリング”Ｐ 　ＮＭＲスペクトルおよびプロトンＮＭＲスペクトルの分析によって対称性のリ ン酸モノメチルであると同定された。

尖五鯉土 テレフタリルビス（メチルリン酸ナトリウム）３＋　Ｒ＝ＣＨ３；　３ａ、Ｒ＝ Ｎａ （ａ）テレフタリルビス（リン酸ジメチル）　（３）実施例１に示したようにし て、乾燥テトラヒドロフラン（５０ｍＬ）に溶解した　エレフタリルニ塩化物（ ４，８３ｇ、２３ｍｍｏｌ）とジメチルリン酸ナトリウム　（６，９ｇ、４７ｍ ｍｏｌ）からテレフタリルビス（リン酸ジメチル）を製造して、白色の固体を得 た。エーテルを加えたベンゼンからの再結晶によって結晶を生じた：　ｍ　ｐ　 ８１〜８２℃、収率９１％。生成物の分析：　Ｉ　Ｒ（ＫＢｒ）　ｃｍ０　１７ ４３　ｃｍ”。’ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ、）６８．　１０　（４Ｈ，ｓ）　、４． 　００　（１２Ｈ。

ｄ、Ｊ、、Ｂ＝１２Ｈｚ）、　１３ＣＮＭＲ（ＣＤＣＩ３）６１６０゜００　（ ｄ、Ｊ、−ｏ＝７．９Ｈｚ）、１３３．１０　（ｄ、Ｊ、−ｏ＝８．６Ｈｚ）、 １３０．　９０．　５５．　４８　（ｄ、Ｊ、＝４゜７Ｈｚ）。

（ｂ）テレフタリルビス（メチルリン酸ナトリウム）（３ａ）実施例１に示した ようにして、アセトンに溶解したテレフタリルビス（リン酸ジメチル）　（１ｇ 、２．　６ｍｍｏ　１）と沃化ナトリウム（０，７８ｇ、５．２ｍ　ｍｏｌ）か ら収率９５％でテレフタリルビス（メチルリン酸ナトリウム）を製造した。

生成物の分析：　ｍ　ｐ　＞　２００℃；　ＩＲ（ＫＢｒ）ｃｍ０　１７１５　 ｃｍ”　；　’ＨＮＭＲ（Ｃ２０）６７．９３　（４Ｈ，ｓ）、３゜５６　（６ Ｈ，ｄ、Ｊ、、、＝１１．５Ｈｚ）；１３ＣＮＭＲ（Ｃ２０）δ１６６．３６　 （ｄ、Ｊ、、＝８．１Ｈｚ）　、１３６．６３　（ｄ、Ｊ、、。＝７．０Ｈｚ） 、１３３．３５．５６．７２（ｄ、Ｊ、ｃｍ２．６Ｈｚ）、分析（Ｃ１０”　１ ０．ｏｌｏ”　２　”ａ２）ＣＨＰ、生成物は、実施例１に示したようにして、 プロトン−カップリング”Ｐ　ＮＭＲスペクトおよびプロトンＮＭＲスペクトル の分析によって対称性のリン酸モノメチルであると同定された。

夾族匠Σ スチルベン３，３′−ジカルボン酸ビス（メチルリン酸ナトリウム） （ａ）スチルベン３，３′　−ジカルボン酸スチルベン３，３′−ジカルボン酸 をトラランド、ジエイ（Ｔｏｌａｎｄ、　Ｊ、）他、Ｊ、　Ａｍ　Ｃｈｅｍ、　 Ｓｏｃ、１９５３．１５．２２６３頁の方法によって製造した。

（ｂ）スチルベン３，３”−ジクロルギ酸ニスチルベン３，３”−ジカルボン酸 （４，９ｇ、１８ｍｍ。

１）、塩化チオニル（５０ｍＬ）および触媒量の乾燥ジメチルホルムアミド（１ ０滴）を１２時間還流させた。過剰の塩化チオニル（２０ｍＬ）を蒸留除去し、 生成物は黄色針状に結晶化した。濾過によって結晶（２，５３ｇ、８．３ｍｍｏ ｌ、４６％）を集め、エーテルで控え目に洗浄し、吸引して乾燥した。

トルエンから再結晶すると純粋な物質（ｍｐ１７９〜１８１°Ｃ）が得られた。

’　ＨＮＭＲ（ＣＤＣＩ、）δ３．６８　（１６Ｈ。

ｓ）、７．０７　（２Ｈ，ｓ）、７．２Ｃ）−７，５１（Ｈ，ｍ）。

（ｃ）スチルベン３，３″−ジカルボン酸ビス（リン酸ジメチル）（４） スチルベン３，３′−ジクロルギ酸（２，４ｇ、７．９ｍｍｏ１）とジメチルリ ン酸ナトリウム（２，３ｇ、１５．８ｍｍｏｆ）を乾燥テトラヒドロフラン中で 、窒素下、４８時間撹拌した。反応混合物を濾過し、溶媒を蒸発させて固体を得 た。これをベンゼン／エーテルから再結晶させて純粋な物質（２，６２ｇ、５． 　４ｍｍｏ　！、収率６８％）を得た。生成物の分析：’ＨＮＭＲ（ＣＤＣＩ３ ）δ８．１９　（ＩＨ，ｔ、Ｊ＝ｌ、６Ｈｚ）　、７．　９９　（ＩＨ，ｄｔ、 Ｊ＝１．　６．　７．　７Ｈ，ｚ）　。

７、　９５　（ＬＨ，ｄｔ、Ｊ＝１．　６Ｈｚ、７．　７）　、７．　５２（Ｌ Ｈ，ｔ、Ｊ＝７．７Ｈ２）、４．０２　（１２Ｈ，ｄ、Ｊ＝１１．７Ｈｚ）；１ ３ＣＮＭＲ（ＣＤＣＩ、）６１６１．００（ｄ、Ｊ、、。＝８．３Ｈｚ）、１３ ７．６０，１３２．５０゜１３０．００，１２９．３３，１２８．９１，１２８ ．７４゜１２８．５６　（ｄ、Ｊ、、ｃｍ８．５Ｈｚ）、５５．３５　（ｄ。

Ｊ、ｏ＝５．４Ｈｚ）、薄層クロマトグラフィー：Ｒ，＝０．２９　（シリカプ レート、１：１ジクロロメタン：酢酸エチル）。

（ｄ）スチルベン３，３′−ジカルボン酸ビス（メチルリン酸ナトリウム）　（ ４ａ） 上述したようにして、アセトン中に溶解したスチルベン３゜３′−ジカルボン酸 ビス（リン酸ジメチル’Ｉ　（３，５２ｇ、７゜３ｍｍｏｌ）と沃化ナトリウム （２，１９ｇ、１４．６ｍｍ。

１）から収率９３％でスチルベン３，３“−ジカルボン酸ビス（メチルリン酸ナ トリウム）を製造した。生成物の分析：ｍｐ〉２００℃、ＩＲ（ＫＢｒ）ｃｍ０ １７１４　ｃｍ”　；’ＨＮＭＲ（Ｄ２０）６１．５１　（２Ｈ，ｄ、Ｊ＝７． ９Ｈｚ）、７゜４７　（２Ｈ，ｓ）７．２２　（２Ｈ，ｄ、Ｊ＝７．９Ｈｚ）、 ７゜１０　（１２Ｈ，ｔ、Ｊ＝７．９Ｈ２）、６．５６　（ｓ、２Ｈ）。

３．６２　（６Ｈ，ｄ、Ｊ＝１１．４Ｈｚ）、　ＣＮＭＲ（Ｄ、０）６１６７． ００　（ｄ、Ｊ、、ｃｍ８．３Ｈｚ）、１４０゜０１、１３４．８８，１３２． ３０，１３２．０８．１３１゜９４．１３１．７６．１３０．０５　（ｄ、Ｊ、 、。＝８．１Ｈｚ）。

５６．９５．薄層クロマトグラフィー：Ｒ，＝０．３９　（シリカプレート、エ タノール）。生成物は、実施例１に示したようにして、プロトン−カップリング ”Ｐ　ＮＭＲスペクトルとブロントンＮＭＲスペクトルの分析によって対称性の リン酸モノメチルであると同定された。

塞１Ｌ１［ スチルベン４，４′−ジカルボン酸ビス（メチルリン酸ナトリウム）、 （ａ）スチルベン４，４”−ジカルボン酸スチルベン４，４′−ジカルボン酸を トウランド、ジエイ・他Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、、　１９５３．７ ５＝　２２６３頁の方法によって製造した。

（ｂ）スチルベン４，４″−ジクロルギ酸スチルベン４，４”　ジカルボン酸（ ５ｇ、１８．６ｍｍｏ　ｌ）、塩化チオニル（６０ｍＬ）および触媒量の乾燥ジ メチルホルムアミド（０，２５ｍＬ）の懸濁液を２４時間還流した。ジカルボン 酸は溶解しなかったが、直接に二酸塩化物変換し、これも大部分反応媒体中に不 溶であった。反応溶液を１２時間冷凍した。濾過によって黄色の結晶生成物を集 め、アセトンで控え目に洗浄し、乾燥するまで吸引した（５．　２　ｇ、１７ｍ ｍｏ　ｌ。

収率９２％）。生成物の分析：ｍｐ２３８℃。’ＨＮＭＲ（ジメチルスルホキシ ド−ｄ６）６７、　９５　（４Ｈ，ｄ、Ｊ＝１０Ｈｚ）、７．７３　（４Ｈ，ｄ 、Ｊ＝１０Ｈｚ）、７．４８　（２Ｈ，ｓ）。

（ｃ）スチルベン４，４′−ジカルボン酸ビス（リン酸ジメチル）（５） スチルベン４，４−ジクロルギ酸（２，６ｇ、８．　５ｍｍ。

ｌ）とジメチルリン酸ナトリウム（３，１５ｇ、２１．３ｍｍｏりを乾燥テトラ ヒドロフラン中で、窒素化、５０°Ｃて４８時間撹拌した。半融ガラス漏斗を通 して反応混合物を濾過し、蒸発によって溶媒を除去して粗生成物を得た。テトラ ヒドロフラン／エーテルから再結晶して純粋物（１，１９ｇ、２３％）を得た。

生成物の分析：ｍ９１７６〜１７７°Ｃ，ＩＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ２）６８．　０ ８　（４Ｈ，ｄ、Ｊ＝８．　５Ｈｚ）　、７゜６５　（４Ｈ，ｄ、Ｊ＝８．　５ Ｈｚ）　、７．　２９　（２Ｈ，ｓ）　。

４、　０３　（１２Ｈ，ｄ、Ｊ＝１１．　７Ｈｚ）　、　１３Ｃ１６０，５（ｄ 、Ｊ、、ｃｍ８．１Ｈｚ）、１４２．５．　１３１．　１．　１３０、　５．　 １２７．　１．　１２７．０．　５５．　２　（ｄ、ＪＰ−ｃｍ５゜９Ｈｚ）。

薄層クロマトグラフィー：Ｒ，＝０．２７　（シリカプレート、１：１ジクロメ タン／酢酸エチル）。

（ｄ）スチルベン４，４′−ジカルボン酸ビス（メチルリン酸ナトリウム）（５ ａ） 実施例１に示したようにして、アセトンに溶解したスチルベン４，４”−ジカル ボン酸ビス（リン酸ジメチル）と沃化ナトリウムからスチルベン４，４′−ジカ ルボン酸ビス（メチルリン酸ナトリウム）を製造した。生成物の分析：　ｍｐ＞ ２００℃。

ＩＲ（ＫＢｒ）ｃｍ０１７１５　ｃｍ”；　’ＨＮＭＲ（Ｄ２０）１５７、　８ ８　（４Ｈ，ｄ、Ｊ＝８．　１Ｈｚ）、７．　２７　（４Ｈ。

ｄ、Ｊ＝８．　１Ｈｚ）、６．　７７　（２Ｈ，ｓ）、３．　８０　（６Ｈ，ｄ 、Ｊ＝１１．３Ｈｚ）；１３ＣＮＭＲ（Ｄ２０）（５１６６゜７７　（ｄ、ＪＰ −ｃｍ８．３Ｈｚ）、１４４．　８．　１３３．　５゜１３２．７．１３０８　 （ｄ、Ｊ、、ｃｍ８．１Ｈｚ）、１２９．７．５６．６゜”Ｐ　ＮＭＲ：δ−２ ，３８（Ｈ，ＰＯ４から）。

実施例１に示したようにして、生成物はプロトン−カップリング”Ｐ　ＮＭＲス ペクトルとプロトンＮＭＲスペクトルの分析によって対称性のリン酸モノメチル であると同定された。

尖ｉ涯り 実施例３に示したようにして、ベンゼン１，３．５−トリカルボン酸トリス（リ ン酸ジメチル）（ジメチルリン酸ナトリウムと１．３．５−ベンゼン三塩化トリ カルボニル（１，３，５−ｂｅｎｚｅｎｅ　ｔｒｉｃａｒｂｏｎｙｌ　ｔｒｉｃ ｈｌｏｒｉｄｅ　）から作られた）と沃化ナトリウムから、その方法で使用され た化合物の量を比例して増加させることによってベンゼン１，３．５−トリカル ボン酸トリス（メチルリン酸ナトリウム）を製造した。

夾胤九影 ビス（アシルリン酸メチル）の溶液安定性を調べた。０．１００Ｍのトリス−Ｈ ＣＬ緩衝液、ｐＨ７，４，３７℃、中でフマリルビス（メチルリン酸ナトリウム ）、スチルベン３，３′ジカルボン酸ビス（メチルリン酸ナトリウム）およびス チルベン４，４′　ジカルボン酸ビス（メチルリン酸ナトリウム）を加水分解す ると”Ｐ　ＮＭＲスペクトルにおける反応物とリン含有生成物、リン酸メチルに 対するシグナルがインデグレイトする。緩衝液の加水分解またはアシル化の徴候 としてリン酸メチルの生成が観察された。このような条件下でフマリル化合物の 半減期は３６時間であった。３，３′スチルベン誘導体の半減期は１００時間で あった。４，４′　スチルベン誘導体の反応は９時間続けられ、この期間にわた ってスペクトルの変化は観察されなかった。このことは、試薬は溶液中で充分に 安定であり、それらは緩衝液と迅速には反応しないことを示している。これはア シルリン酸エステルの反応性に関する以前の報告（ディサバトウ、ジー、　（Ｄ ｉｓａｂａｔｏ、　Ｇ、）　；ジエンクス、ダブリウー・ビー、　（Ｊｅｎｃｋ ｓ、　Ｗ、　Ｐ、）、Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓａｃ、　１９６１．８３Ｌ 、４３９３゜４４００）　と一致している。

災五但ｌ ヘモグロビンの架橋 ０、　３ｍＭ、３．　０ｍＭ、３０ｍＭ、または３００ｍＭの濃度の４，４′− スチルベンジカルボン酸ビス（リン酸メチル）の溶液（２ｍＬ）をＯ，１００Ｍ のトリス−ＨＣＬ緩衝液ｐＨ７，４に調製した。緩衝液のみを含む対照溶液も作 られた。新たに作られたこれらの溶液の各々に、生成する溶液のヘモグロビンが ０．３ｍＭになるように４０　ｍ　ｇのヒトヘモグロビン（シグマ（Ｓｉｇｍａ ）化学会社）を加えた。次いで反応混合物を激しく撹拌し、３７°Ｃでインキュ ベートした。４時間後、溶液を０．１００Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７ ，０に対して４°Ｃで２０時間透析して未反応のアシルリン酸エステルを除去し た。ついでサンプルを凍結乾燥し、ＳＤＳ　（ドデシル硫酸ナトリウム）−ポリ アクリルアミドゲル電気泳動によって分析してサブユニット間架橋の程度を評価 した（ライ−バー、ケイ（Ｗｅｂｅｒ、　Ｋ、）　；オスポーン、エム（Ｏｓｂ ｏｒｎ、　Ｍ、）、Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、　１９６９、訂」、４４０６）　、電気泳動の前に、ヘモグロビンサ ンプル、架橋したウシヘモグロビン標準品（二重に結晶化させ、透析し、凍結乾 燥したシグマ・ダルトン・マーク（ＳｉｇｍａＤａｌｔｏｎ　Ｍａｒｋ）　ＶＩ Ｉ　−Ｌ　）と分子量標準品（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｗｅｉｇｈｔｓｔａｎｄａ ｒｄｓ）を、１％ドデシル硫酸ナトリウム、１％２−メルカプトエタノール、３ ６％尿素および０．０１５％ブロムフェノールブルーを含んだ０．１１Ｍのリン 酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７，０中で１５分間沸騰させて変性させた。最終的な 蛋白質濃度は２　ｍ　ｇ　／　ｍ　Ｌであり、１０〜２０μＬのアリコツト（ａ ｌｉｑｕｏｔｓ）をゲルに打ち込んだ。この方法はＢｉｏ−ＲａｄＭｉｎｉ−Ｐ ｒｏｔｅａｎ　ＩＩデュアルスラブセル装置を使用して行なわれた。ヘモグロビ ンの架橋度は、固定してクーマシー・ブリリアント・ブルーＲで染色した後、解 像電気泳動バンドを目視で比較することに　よって評価することができた。

上記方法を０．３ｍＭ、３．０ｍＭまたは３０ｍＭの濃度のフマリルビス（リン 酸メチル）、３０ｍＭの濃度の３，３′　スチルベンジカルボン酸ビス（リン酸 メチル）および０．６Ｍの濃度のアセチルリン酸メチルの溶液について繰り返し た。

ＳＤＳゲル電気泳動は、ヘモグロビンとスチルベン３，３′ジカルボン酸ビス（ リン酸メチル）、スチルベン４，４′　−ジカルボン酸ビス（リン酸メチル）と の反応、およびフマリルビス（リン酸メチル）との反応は二量体および四量体を 生成したことを示した。これらの試薬で改質されたヘモグロビンを含むレーンは （架橋したウシヘモグロビンの標準品と比べて）二量体（３２，０００）　、三 量体（４８，０００）および四量体（６４，０００）に相当するバンドを示した 。なお、より高分子量の痕跡のバンドもあった。未反応ヘモグロビンのバンドは それが単量体に充分に解離していることを示した。アセチルリン酸メチルおよび スチルベン３，３′　−ジカルボン酸と反応させたヘモグロビンについての対照 実験は、ゲルのパターンによれば、単量体状の物質を生成した。これらの結果は 、架橋反応は二官能性のアシルリン酸エステルの存在下でのみ起こることを示し ている。

実１」ＬＬ匹 架橋ヘモグロビンの特徴づけ ｐＨ１緩衝液の種類、および架橋ヘモグロビンの配位子状態の影響をフマリルビ ス（リン酸メチル）（ＦＭＰ）とヘモグロビンの反応について調べた。カーボン モノキシヘモグロビン（ＣＯＨｂ）をＦＭＰとビストリス（ｂｉｓＴｒｉｓ）中 でｐＨ７，５゜３５°で２時間反応させたときは、ＨＥＰＥＳ　［４−（２−ヒ ドロキシ−エチル）−１−ピペラジン−エタンスルホン酸］に比べて反応生成物 の量および種類において重要な違いは観察されなかった。６．８から７．５まで のｐＨの範囲ではビストリス（ｂｉｓ　Ｔｒｉｓ）中、ｐＨ７，２でＣ０Ｈｂと ＦＭＰの間の反応はもっとも顕著であった。ｐＨ７，２，３５°で１ｍＭＣ０Ｈ ｂと２ｍＭ　ＦＭＰの反応では２時間中に約７５％のヘモグロビンがフマリル誘 導体に変換され、３時間までではそれ以上の変化はほとんどなかった。１０分ま でに全ヘモグロビンの概略３５％が主要な改質成分となり、その後は評価出来る ほど変化しなかった。陰イオン交換クロマトグラフ法で観察された反応物質の２ 番目のピークは１０分で１４％から３時間で約３０％と３時間の間に増加した。

これらの結果から、反応条件は１００ｍＭビストリス中でｐＨ７，２，１ｍＭ　 Ｈｂ、２ｍＭ　ＰＭＰ、３５°Ｃで２時間として標準化された。

デオキシＨｂとＣ０ＨｂをＦＭＰと反応させることから生じる主要なおよび若干 の重要でない改質ヘモグロビンの構造の特徴づけは、可能なかぎり単一のヘモグ ロビン成分を単離することによって行なわれた。初期の分離は予備的サイズのシ ンクロパック（Ｓｙｎｃｈｒｏｐａｋ）ＡＸ　３００陰イオン交換カラム上で行 なわれた。その後の精製は、ヘモグロビンの混合物を含む陰イオン交換帯域（ｚ ｏｎｅ）を調製用サイズのシンクロバクＣＭ３００陽イオン交換カラム上で再ク ロマトグラフ法（ｒｅｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）で処理することによって 達成された。次いで陽イオン交換用クロマトグラフ法による処理からの帯域は、 バイダック（Ｖｙｄａｋ）　Ｃ−４大孔径逆相カラム（ｌａｒｇｅ　ｐａｒｅｒ ｅｖｅｒｓｅ　ｐｈａｓｅ　ｃｏｌｕｍｎ）を用いてグロビン鎖の分離処理した 。

ある場合には、未改質グロビン鎖の同定にはこれで充分であった。大部分のケー スでは、グロビン鎖を単離し、システイニル残基を安定化するため酸化またはア ミノエチル化し、トリプシンとグルコースブロテオナーゼ（ｇｌｕ−Ｃｐｒｏｔ ｅｏｎａｓｅ）で加水分解し、生成したペプチドを分離し、分析してアミノ酸組 成を調べた。表ＩＩは単離された成分とＦＭＰで処理されたヘモグロビンについ て同定された構造的改質を記載している。

ＦＭＰと反応したヘモグロビン生成物の数、クロマトグラフ溶離位置（ｅｌｕｔ ｉｏｎ　ｐｏｓｉｔｉｏｎ）および量はヘモグロビンの配位子状態および２．　 ３−ＤＰＧ　（２，３，ジホスホグリセリン酸）の存在または不存在によって変 化する。第１図はデオキシヘモグロビンをＦＭＰで処理した後の反応混合物の陰 イオン交換高速液体クロマトグラフィーのクロマトグラムである。第２図はＣ０ Ｈｂを使用した同じものである。各々の場合における帯域１は同じであり、未反 応のＨｂ　Ａを表わしている。Ｃ０Ｈｂについての２番目の主要な帯域は主とし てデオキシＨｂ反応混合物に対する３番目の帯域について見出された成分の１つ から構成されている。Ｃ０Ｈｂにおける３番目の主要な帯域はデオキシＨｂ混合 物の最後または５番目の帯域と同様にクロマトグラフ展開されると考えられる。

第３図は２．３−ＤＰＧの存在下で、ＦＭＰで処理されたデオキシＨｂから生じ る反応生成物の陰イオン交換高速液体クロマトグラフィーのクロマトグラムであ る。溶離条件は、第１図と第２図に示されるクロマトグラムで使用されたものよ り僅かに異なっている。同じクロマトフィーの条件を使用し、２．３−ＤＰＧの 不在下で、ＦＭＰと反応させられたデオキシＨｂの対照は第４図に示される。各 々における第１の帯域は未反応Ｈｂ　Ａである。第３図における２番目の帯域は 他の２つの条件のいずれにも見出されず、２つのａ−９９リシル残基の間のフマ リル架橋による改質されたヘモグロビンを含んでいる。これはバクスタートラベ ノール（Ｂａｘｔｅｒ　Ｔｒａｖｅｎｏｌ）から得られるＤＢＢＦ生成品中に見 出される主要な反応生成物と同じであり、それはビス（３，５−ジブロモサリチ ル）フマル酸（ｂｉｓ（３，５−ｄｉｂｏｒｏｍｏｓａｌｉｃｙｌ）ｆｕｍａｒ ａｔｅ）架橋剤を用いて作られる。第３図における３番目の帯域は重要な量の架 橋ヘモグロビンなしに、アルファおよびベーター鎖の両者の改質を含む生成物の 混合物であるように見える。結果は、ヒトヘモグロビンとフマリルビス（リン酸 メチル）の反応の架橋部位は２，３−ジホスホグリセリン酸を拘束する高度に陽 イオン性の部位であることを示している。２，３−ジホスホグリセリン酸の不在 下では、フマリルビス（リン酸メチル）との反応によってβサブユニツト間（バ リン−１からりシン−８２）および単一のサブユニット中の同一残基間、ならび にαサブユニット中の各々のりシン−９９間が架橋されている物質を生成する。

２，３−ジホスホグリセリン酸の存在下では、β架橋のみが形成される。

裏五餞上Ｌ イソフタリルビル（リン酸メチル）または３，３′　−スチルベンビス（リン酸 メチル）をヘモグロビンと反応させた。改質ヘモグロビン成分を高速液体クロマ トグラフィーシステムを使用し、調製用サイズのシンクロパックＡＸ３００とシ ンクロパックＣＭ３００のカラム上で精製した。β１１−β２８２およびβ１８ ２−β２８２スチルベンヘモグロビンならびにβ１１−β８２架橋およびβ１− β２８２未架橋イソフタリルヘモグロビンが単離された。

（以下余白） 敷−ユ ジカルボン酸から誘導されるジアミドのスパンから計算された、式Ｉｂの化合物 のモノエステルで架橋できるアミノ基間の推定距離。

イソフタリル　７．２ テレフタリル　７．４ ３．３′　−スチルベン　１３．７ ４．４′　−スチルベン　１３．９ （以下余白） 表Ｉ工：フマリルビス（リン酸メチル）改質ヘモグロビンからのグロビン鎖の構 造 隙盃土乞！韮土　間盃土Ｚ蚤城上　鎖蚤城上　鎖久び左置Ａ、　ＦＭＰ処理した デオキシヘモグロビンからのヘモグロビンＡＸ−ＩＣＭ−１１β−未改質 ／／　ｔｔ　ＩＩ　α−未改質 ＡＸ−２　ＣＭ−Ｉ　Ｉ　α−未改質 〃〃ＩＩ　β１１−β２８２ ＡＸ−３ｂ　ＣＭ−Ｉ　Ｉ　β−未改質ｔｔ　ｆ■　α−未改質 ／／　ｔｔ　Ｖ　（Ｚ−改質？ ｔｔ　ＶＩ　ａ　、９９−　ａ　２９９ＡＸ−３ｂ　ＣＭ−２Ｉ　ａ−未改質 ＩＩ　β１８２−β２８２ ＡＸ−３ｂ　ＣＭ−３Ｉ　β−未改質 ＩＩ　ＩＩ　α　１−フマレート？ ｔｔ　ｔｔ　ｒＩＩ　β、８２−β２８２ＡＸ−３ＣＣＭ−Ｉ　Ｉ　β１１−７ マレート　？ｔｔ　Ｉｉ　α−未改質 ＡＸ−３ＣＣＭ−２ｒ　β−未改質 ＩＩ　β−改質？ ＩＩＩ　α−未改質 ＩＶ　α−改質？ ｔｔ　ＩＩ　Ｖ　α、９９−α２９９ ＡＸ−４ＣＭ−Ｉ　Ｉ　α−未改質 ＩＴ　β１１−β２８２ ＡＸ−５ＣＭ−ＩＩ　β１８２−７マレートＩＩ　α−未改質 表　ＩＩ　（続−２） ＡＸ−ＩＣＭ−ＩＩ　β−未改質 ｔｔ　ＩＩ　α−未改質 ＡＸ−２ＣＭ−ＩＩ　β−未改質 Ｃ，ＦＭＰ処理したカーボンモノキシヘモグロビンからのヘモグロビンＡＸ−Ｉ ＣＭ−ＩＩ　β−未改質 〃〃■■　α−未改質 ＡＸ−２ＣＭ−ＩＩ　α−未改質 ／／　／／　ＩＩ　β１８２−β２８２要約書 式（Ｉ）のアシルリン酸エステルまたその塩（式中ＲとＲ１は、同じでも、また は異なっていても良く、しかも４つまでの炭素原子を有する直線状または分枝状 のアルキル基、フェニルまたはベンジルを表わし、ｎは整数であり、ｎが１の場 合は、Ｒ２は基（α）を表わし、式中、Ｒ４は直線状または分枝状のアルキル、 アルケニルまたはアルキニル、環式アルキル、環式アルケニル、あるいはアルキ ル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキルまたはアリールアル ケニルで置換されていても良いアリールであり、またはｎが少なくとも２の場合 は、Ｒ２は基（β）を表わし、式中、Ｒ４は上に定義された通りである）のアシ ルリン酸エステルまたはそれらの塩を製造する方法であり、この方法は（ａ）式 （Ｈ）の化合物またはその塩（式中、ＲとＲ１は上に定義された通りであり、Ｒ ３は対イオンである）を、（ｉ）式（１）の化合物が必要なときは、式（ＩＩＩ ）の化合物（式中Ｒ４は上に定義された通りであり、Ｒ５はエステル化反応につ いて広く知られている離脱基である）とエーテル溶媒の存在下で反応させ、また は（ｉｉ）ｎが少なくとも２である式（Ｉ）の化合物が必要なときは、化学量論 的な量の式（ＩＶ）の化合物（式中、ｎは少なくとも２であり、Ｒ４とＲ５は上 に定義された通りである）とエーテル溶媒の存在下で反応させ、さらに所望によ って、かくして得られる式（Ｉ）のアシルリン酸エステルをそれらの塩に変換す ることから構成されている。ｎが少なくとも２である式（１）の新しい化合物お よびこの新しい化合物を使用して得られる改質蛋白質も開示されている。

国際調査報告 一−−−−＾時に一一勤　ＰＣＴ／Ｃ＾　９１１０００７１

Claims (28)

【特許請求の範囲】
1. １．下記の式Ｉ ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｉ）｛式中、ＲとＲ１は、同じでも、また は異なっていても良い、４つまでの炭素原子を有する直線状または分枝状のアル キル基、フェニルまたはベンジルを表わし； ｎは整数であり； ｎが１の場合は、Ｒ２は基 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒ４は直線状または分枝状のアルキル、アルケニルまたはアルキニル、 環式アルキル、環式アルケニル、あるいはアルキル、アルケニル、アルキニル、 アリール、アリールアルキルまたはアリールアルケニルで置換されていても良い アリールである） を表わし、 ｎが少なくとも２の場合は、Ｒ２は基 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、ｎは少なくとも２であり、Ｒ４は上に定義された通りである）を表わす ｝ のアシルリン酸エステルまたはそれらの塩を製造する方法であり、 この方法は、 （ａ）下記の式ＩＩ ▲数式、化学式、表等があります▼（ＩＩ）（式中、ＲとＲ１は上に定義された 通りであり、Ｒ３は対イオンである）の化合物を （ｉ）ｎが１である上記式Ｉの化合物を必要とするときは、式ＩＩＩ ▲数式、化学式、表等があります▼（ＩＩＩ）（式中、Ｒ４は上に定義された通 りであり、Ｒ５はエステル化反応について広く知られている離脱基である）の化 合物と、極性有機溶媒の存在下で反応させ、または（ｉｉ）ｎが少なくとも２で ある上記式Ｉの化合物を必要とするときは、化学量論的な量の式ＩＶ ▲数式、化学式、表等があります▼（ＩＶ）（式中、ｎは少なくとも２であり、 Ｒ４とＲ５は上に定義された通りである） の化合物と、極性有機溶媒の存在下で反応させ、さらに（ｂ）所望によって、得 られたアシルリン酸エステルをそれらの塩に変換する、 ことから構成されているアシルリン酸エステルの製造方法。
2. ２．下記の式ＩＩ ▲数式、化学式、表等があります▼（ＩＩ）（式中、ＲとＲ１は下に定義する通 りであり、Ｒ３は対イオンである） の化合物を、下記の式ＩＩＩ ▲数式、化学式、表等があります▼（ＩＩＩ）（式中、Ｒ４は、下に定義する通 りであり、Ｒ５はエステル化反応について広く知られている離脱基である）の化 合物と、極性有機溶媒の存在下で反応させ、さらに所望によって、かくして得ら れた下記式Ｉａ ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｉａ）（式中、ＲとＲ１は、同じでも、ま たは異なっていても良い、４つまでの炭素原子を有する直線状または分枝状のア ルキル基、フェニルまたはベンジルを表わし；Ｒ４は直線状または分枝状のアル キル、アルケニル、アルキニル、環式アルキル、環式アルケニル、あるいはアル キル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキルまたはアリールア ルケニルで置換されていても良いアリールである） のアシルリン酸エステルをそれらの塩に変換することから成る式Ｉａのアシルリ ン酸エステルまたはそれらの塩を製造する方法。
3. ３．下記の式ＩＩ ▲数式、化学式、表等があります▼（ＩＩ）（式中、ＲとＲ１は下に定義する通 りであり、Ｒ３は対イオンである）の化合物を、下記の式ＩＶ ▲数式、化学式、表等があります▼（ＩＶ）（式中、ｎは少なくとも２であり、 Ｒ４は下に定義する通りでありＲ５はエステル化反応について広く知られている 離脱基である） の化合物と、極性有機溶媒の存在下で反応させ、さらに所望によって、下記式Ｉ ｂ ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｉｂ）（式中、ｎは少なくともとも２の整 数であり、ＲとＲ１は、同じでも、または異なつていても良い、４つまでの炭素 原子を有する直線状または分枝状のアルキル基、フェニルまたはベンジルを表わ し；Ｒ４は直線状または分枝状のアルキル、アルケニル、アルキニル、環式アル キル、環式アルケニル、あるいはアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール 、アリールアルキルまたはアリールアルケニルで置換されていても良いアリール である） のアシルリン酸エステルをそれらの塩に変換することから成る式Ｉｂのアシルリ ン酸エステルまたはそれらの塩を製造する方法。
4. ４．ｎが１〜５であり、Ｒ４が直線状または分枝状のアルキル、アルケニル、フ ェニル、フェニルアルキル、フェニルアルケニル、ジフェニルアルキルまたはジ フェニルアルケニルであり、Ｒ５がクロロ−、ブロモ−またはヨード一基であり 、Ｒ３がアルカリ金属イオンである、請求項１に記載の製造方法。
5. ５．ｎが１〜５であり、ＲとＲ１が同じでしかも４つまでの炭素原子を有する直 線状のアルキル基、フェニルまたはベンジルを表わし、Ｒ４が直線状または分枝 状のアルキル、アルケニル、フェニル、フェニルアルキル、フェニルアルケニル 、ジフェニルアルキルまたはジフェニルアルケニルであり、Ｒ５がクロローまた はョードー基であり、Ｒ３がナトリウムまたはリチウムイオンである、請求項１ 記載の製造方法。
6. ６．ＲとＲ１が同じで、しかもメチルを表わし、Ｒ３がナトリウムイオンを表わ し、Ｒ５がクロロ−基である請求項４記載の製造方法。
7. ７．ｎが２または３、ＲとＲ１が同じで、しかもメチル、エチルまたはベンジル であり、Ｒ４がアルケニル、フェニルまたはジフェニルアルケニルであり、Ｒ３ がナトリウムイオンであり、Ｒ５がクロロ基である、請求項１記載の製造方法。
8. ８．極性有機溶媒がエーテル溶媒である、請求項１〜７の何れか１つに記載の製 造方法。
9. ９．極性有機溶媒がジエチルエーテルジオキサンまたはテトラヒドロフランであ る、請求項１〜６の何れか１つに記載の製造方法。
10. １０．極性有機溶媒がジエチルエーテルジオキサンまたはテトラヒドロフランで ある、請求項７記載の製造方法。
11. １１．アシルリン酸エステルを、アセトンの存在下で、化学量論的な量の沃化ナ トリウムと反応させてそれらのエステルの塩に変換する、請求項第１〜７の何れ か１つまたは請求項１０記載の製造方法。
12. １２．下記の式Ｉｂ ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｉｂ）（式中、ｎは少なくとも２の整数で あり、ＲとＲ１は、同じでも、または異なつていても良い、４つまでの炭素原子 を有する直線状または分枝状のアルキル基、フェニルまたはベンジルを表わし、 Ｒ４は直線状または分枝状のアルキル、アルケニル、アルキニル、環式アルキル 、環式アルケニル、あるいはアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ア リールアルキルまたはアリールアルケニルで置換されていても良いアリールであ る） のアシルリン酸エステルまたはその塩。
13. １３．ｎが１〜５であり、ＲとＲ１が同じで、しかも４つまでの炭素原子を有す る直線状のアルキル基、フェニルまたはベンジルを表わし、Ｒ４が直線状または 分枝状のアルキル、アルケニル、フェニル、フェニルアルキル、フェニルアルケ ニル、ジフェニルアルキルまたはジフェニルアルケニルである、請求項１２記載 の式Ｉｂのアシルリン酸エステルまたはその塩。
14. １４．ｎが１〜５であり、ＲとＲ１が同じで、しかもメチルを表わし、Ｒ４がア ルケニル、フェニルまたはジフェニルアルケニルである、請求項１２記載の式Ｉ ｂのアシルリン酸エステルまたはその塩。
15. １５．ｎが２であり、Ｒ４がエチレン、フェニルまたはスチルベンを表わす、請 求項１２記載の式Ｉｂのアシルリン酸エステルまたはその塩。
16. １６．フマリルビス（リン酸ジメチル）、イソフタリルビス（リン酸ジメチル） 、テレフタリルビス（リン酸ジメチル）、スチルベン３，３′−ジカルボン酸ビ ス（リン酸ジメチル）、スチルベン４，４′−ジカルボン酸ビス（リン酸ジメチ ル）、ベンゼン１，３，５−トリス（リン酸ジメチル）またはその塩である請求 項１２記載の式Ｉｂのアシルリン酸エステルまたはその塩。
17. １７．化学量論的な量のジメチルリン酸ナトリウムをテトラヒドロフランの存在 下で、アマル酸塩化物と反応させ、さらに所望によって、得られたフマリルビス （リン酸ジメチル）を、アセトンの存在下で、化学量論的な量の沃化ナトリウム と反応させることによって、その塩に変換することより成るフマリルビス（リン 酸ジメチル）を製造する方法。
18. １８．化学量論的な量のジメチルリン酸ナトリウムを、テトラヒドロフランの存 在下で、イソフタル酸二塩化物と反応させ、さらに所望によって、得られたイソ フタリルビス（リン酸ジメチル）を、アセトンの存在下で、化学量論的な量の沃 化ナトリウムと反応させることによって、その塩に変換することより成るイソフ タリルビス（リン酸ジメチル）を製造する方法。
19. １９．化学量論的な量のジメチルリン酸ナトリウムを、テトラヒドロフランの存 在下で、テレフタル酸塩化物と反応させ、さらに所望によって、得られたイソフ タリルビス（リン酸ジメチル）を、アセトンの存在下で、化学量論的な量の沃化 ナトリウムと反応させることによって、その塩に変換することから成るテレフタ リルビス（リン酸ジメチル）を製造する方法。
20. ２０．化学量論的な量のジメチルリン酸ナトリウムを、テトラヒドロフランの存 在下で、スチルベン３，３′−ジクロロギ酸エステルと反応させ、さらに所望に よって、得られたスチルベン３，３′−ジカルボン酸ビス（リン酸ジメチル）を 、アセトンの存在下で、化学量論的な量の沃化ナトリウムと反応させることによ って、その塩に変換することから成るスチルベン３，３′−ジカルボン酸ビス（ リン酸ジメチル）を製造する方法。
21. ２１．化学量論的な量のジメチルリン酸ナトリウムを、テトラヒドロフランの存 在下で、スチルベン４，４′−ジクロロギ酸エステルと反応させ、さらに所望に よって、得られたスチルベン４，４′−ジカルボン酸ビス（リン酸ジメチル）を 、アセトンの存在下で、化学量論的な量の沃化ナトリウムと反応させることによ ってその塩に変換することから成るスチルベン４，４′−ジカルボン酸ビス（リ ン酸ジメチル）を製造する方法。
22. ２２．化学量論的な量のジメチルリン酸ナトリウムを、テトラヒドロフランの存 在下で、１，３，５−ベンゼン・トリカルボニル三塩化物と反応させ、さらに所 望によって、得られたベンゼン・１，３，５−トリカルボン酸・トリス（リン酸 ジメチル）を、アセトンの存在下で、化学量論的な量の沃化ナトリウムと反応さ せることによって、その塩に変換することから成るベンゼン・１，３，５−トリ カルボン酸・トリス（リン酸ジメチル）を製造する方法。
23. ２３．改質ヘモグロビンの製造における架橋剤としての、請求項１２〜１７の何 れか１つに記載の式Ｉｂのアジルリン酸エステルまたはその塩の使用。
24. ２４．ヘモグロビンがヒト、ウマ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルおよび魚のヘモグ ロビンより成る群から選択される、改質ヘモグロビンの製造における架橋剤とし ての、請求項１２〜１７の何れか１つに記載の式Ｉｂのアシルリン酸エステルま たはその塩の使用。
25. ２５．請求項１２〜１７の何れか１つに記載の式Ｉｂの化合物またはその塩でヘ モグロビンを架橋することによって得られる改質ヘモグロビン。
26. ２６．ヘモグロビンがヒト、ウマ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルおよび魚のヘモグ ロビンよる成る群から選択される、請求項１２〜１７の何れか１つに記載の式Ｉ ｂの化合物またはその塩でヘモグロビンを架橋することによって得られる改質ヘ モグロビン。
27. ２７．（ａ）ヘモグロビンを下記の式Ｉｂ▲数式、化学式、表等があります▼（ Ｉｂ）（式中、ｎは２〜５であり、ＲとＲ１は、同じでも、または異なっていて も良い、４つまでの炭素原子を有する直線状または分枝状のアルキル基、ベンジ ルまたはフェニルを表わし、Ｒ４は直線状または分枝状のアルキル、アルケニル 、アルキニル、環式アルキル、環式アルケニル、あるいはアルキル、アルケニル 、アルキニル、アリール、アリールアルキルまたはアリールアルケニルで置換さ れていても良いアリールである）のアシルリン酸エステルまたその塩で架橋し、 （ｂ）生成する架橋ヘモグロビンを精製することから成る改質ヘモグロビンの製 造法。
28. ２８．ヘモグロビンがヒト、ウマ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルおよび魚のヘモグ ロビンより成る群から選ばれる、請求項２８記載の改質ヘモグロビンの製造法。