JPH05504889A - １６Ｓ及び２３ＳｒＲＮＡ遺伝子間のスペーサー領域から誘導される非ウイルス微生物検出用ハイブリダイゼーションプローブ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １６Ｓ文び２３ＳｒＲＮＡ遺伝子間のスペーサー領域から誘導される非ウィルス 微生物検出用ハイブリダイゼーションプローブ 本発明は、ハイブリダイゼーション手順により生物学的サンプル中で非ウィルス 微生物の特異的検出に使用するための、リポソームリボ核ｗｉ（ｒＲＮＡ）遺伝 子、特に１６Ｓ及び２３ＳｒＲＮＡ遺伝子闇のスペーサー領域から誘導される核 酸プローブに係る。

二二１０年間に多数の微生物で目覚ましい進歩が遂げられているが、現在使用さ れている診断手順はまだ手間がかかり、非感受性であり、非特異的である。これ らの欠点の多くは核酸プローブを使用することにより解決することができる。こ れらの核酸プローブの例としては、全ゲノムデオキシリボ１ｍ　（ＤＮＡ）、プ ラスミド、リボプローブ又は合成オリゴヌクレオチドを挙げることができ、これ らのプローブは生物学的サンプル中に存在するゲノムＤＮＡ、メンセンジャーＲ ＮＡ又は安定ＲＮＡ種を標的にすることができる。必ずしもそうでなくてもよい が、合成オリゴヌクレオチドを使用すると好適である。オリゴヌクレオチドは化 学的方法と使用して迅速に大量に合成することができ、貯蔵寿命が長く、容易に 精製及び標識できる。

ＤＮＡプローブ技術を使用して微生物を確実に診断にするためには、使用される プローブは高特異性（即ち池の生物に由来する核酸と交差反応すべきでない）且 つ高感度（即ち検出しようとする生物の全部ではないとしてもほとんどの株がプ ローブと反応すべきである）であるべきである。

従って、好適標的配列は以下の特徴を有するべきである。

（ｉ）配列は該当生物の各部のゲノム中に存在すべきである。

＜ｉｉ）進化による配列の相違は、一方では該当種を他の密接に関連する種から 区別できるようにするなめに十分な配列相違があり、他方では使用されるプロー ブで該当種の全部を検出できるようにするために十分な配列保存があるように構 成されるべきである。

種特異的プローブは多数の生物について記載されている。

最近の文献ではＴｅｎｏｖｅｒ、Ｃｌ１ｎ、Ｍｉｃｒ。

しかしながら、ゲノム中のどの遺伝子から特異的プローブ配列を誘導できるのか については不明である。プローブ開発にあたっては、最終的に対象生物に対して 特異的になるようなフラグメント３得るために大規模な選択手順に従わなければ ならないことが多かった（Ｋｏｒｏｌｉｋ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｇｅｎ、Ｍｉｃ ｒｏｂｉｏｌ、１３４：５２１　５２９．１９８８；　Ｇｒｉｍｏｎｔ　ｅｔａ ｌ、、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　２１：４３１−４３７．１９８５ ＋　Ｗｅｌｃｈｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１４： １００２７−１００４４．　１９８６；　Ｄｏｎｅｇａｎ　ｅｔａｌ、、Ｍｏ１ ．Ｃｅ１１．Ｐｒｏｂｅｓ　３：１３−２６．　１９８９；　Ｂｅａｕｌｉｅｕ 　ａｎｄ　ＲＯＹ、Ａｂｓｔｒａｃｔ　ｎｒ　Ｄ２４９．　Ａｂｓｔｒａｃｔｓ 　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｎｎｕａｌ　Ｍｅｅｔｉｎｇｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａ ｎ　５ｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１９８９）、はとん どの場合、特異的フラグメントが誘導される遺伝子の機能又は実態は解明されて おらず、別の特異的プローブが所望される毎にスクリーニング手順を手探りで繰 り返さなければならない、上記基準を満たし且つ偏在する遺伝子が厳密に同定さ れるならば、時間と手間のかかる選択が不要になる。

１６Ｓ又は２３ＳｒＲＮＡ遺伝子は、既に記載されている方法を使用して配列を 容易に得ることができ、種特異的検出に使用可能なこれらの高保存性遺伝子内に 種々の領域が存在することが知られているので、プローブ開発に頻用されている 。しかしながら、生物によっては進化による核酸配列保存性が非常に高いため、 例えば１６Ｓ及び２３ＳｒＲＮＡ遺伝子から高特異性で高感度のプローブを誘導 できない場合がある。更に、これらの遺伝子の保存性の結果、標的配列のみで１ 又は少数のミスマツチに基づいて２種の生物を区別しなければならないことが多 くなり、ハイブリダイゼーションのストリンジエンシーが必要になる。これらの 条件から少しでも外れると、誤認の恐れがある。

従って、１６Ｓ及び２３ＳｒＲＮＡ遺伝子から特異的プローブを誘導することが できなかった種を含むほとんどの生物に種特異的な１０−ブを開発することがで き、好ましくはより広いストリンジエンシー範囲を有する偏在遺伝子を特徴付け ることができるならば、非常に有利である。

各細胞生物は、その転写物がリポソームの機能とタンパク質の合成とに不可欠で あるため、リポソームＲＮ　Ａシストロンを有する。一般に、遺伝子はゲノム中 に多重コピー存在する。真正細菌では１６ＳｒＲＮＡ遺伝子［小サブユニ・ノド ｒ　ＲＮ　Ａ　（ｓ　ｒ　ＲＮ　Ａ　）に同じ］はｒ　ＲＮ　Ａシストロンの５ ゛末端に位置し、２３ＳｒＲＮＡ　［大サブユニ・ノドｒＲＮＡ　（ｌ　ｒＲＮ Ａ）に同じ］が後続する。５ＳｒＲＮＡ遺伝子はシストロンの３°末端に位置す る。１６Ｓ、２３Ｓ及び５Ｓ遺伝子はスペーサー領域により分離され、これらの スペーサー領域には転写後プロセッシングに関与する転移ＲＮＡ　（ｔＲＮＡ） 遺伝子及びシグナル配列が位！し得る。まず最初にｒＲＮＡシストロンは前駆物 質ＲＮＡ分子として転写される。この−次転写物はエンドリボヌクレアーゼ及び エキソリボヌクレアーゼにより更にプロセ・ツシングされ、成熟産物を生成する 。従って、スペーサー領域配列は生物のゲノム中のみに存在するのではなく、前 駆体ＲＮＡ分子及びプロセッシング産物中にも存在する。真正細菌ｒＲＮＡシス トロンの構造及びプロセ・ンシングは、Ｇｅｇｅｎｈｅｉｍｅｒ　ａｎｄ　Ａｐ ｉｒｉｏｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｒｅｖ、±５・５０２−５４１．１９８１に 詳細に記載されている。

真植生物の核ゲノム中の状況は多少異なり、５ｒＲＮＡ及び１ｒＲＮＡ間に５． ８３ＲＮＡ遺伝子が位置しており、５ＳｒＲＮＡ遺伝子は別個の長いタンデムア レー中Ｇこ配置されている（Ｐｅｒｒｙ、　Ａｎｎｕ、Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ 、先５：６０５−６２９．　１９７６；　Ｌｏｎｇ　ａｎｄ　Ｄａｗｉｄ、Ａｎ ｎｕ、Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　旦ニア２７−７６４．　１９８０＞、Ｌ力為 しながら、真核生物のミトコンドリア又はクロロプラスト中のｒＲＮＡシストロ ンは実際に原核生物である（Ｂｏｒｓｔ　ａｎｄ　Ｇｒｉｖｅｌｌ、Ｎａｔｕｒ ｅ　２９０：４４３−４４４．　１９８１）。

文献には非常に少数の真核又は原核生物のスペーサー領域の核酸配列しか記載さ れていない〈例えばＹｏｕｎｇｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２ ５４：３２６４−３２７１．　１９７９．及びＭａｒｔｅｎｓ　ｅｔ　ａｌ、、 Ｓｙｓｔｅｍ、Ａｐｐｌ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、９：２２４−２３０．　１９８ ７＞、これらのデータから核酸配列保存を確実に予想することはできず、従って 、特異的プローブの選択のためのスペーサー領域の適応については全く推定する ことができない。

より詳細には、真植生物に関して、生物学的サンプル中で微生物の検出に使用さ れ、１６Ｓ及び２３　Ｓ　ｒ　ＲＮＡ遺伝子間のスペーサー領域から誘導される ハイブリダイゼーション１０−プは未だに報告されていない、真核生物の大小サ ブユニットｒＲＮＡ遺伝子間の対応するスペーサー領域についても何ら解明され ていない。

真核生物に関する限り、リポソーム遺伝子スペーサーからクローニングされたフ ラグメントの使用がＬｅｉｓｈｍａｎｉａに関する分類学的研究に記載されてい る（Ｒａｍｉｒｅｚ　ａｎｄ　Ｇｕｅｖａｒａ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｃｈ、Ｐａｒａ ｓｉｔｏｌ、２２：１７７−１８３．　１９８７）、Ｌかしながら、使用された 領域及び研究のアプローチは、特に以下に述べる理由により、小ｒＲＮＡ及び大 ｒＲＮＡ遺伝子間のスペーサー領域から誘導されるプローブを使用するために当 業者には無益である。

（ｉ）Ｒａｍｉｒｅｚ及びＧｕｅｖａｒａにより使用されたリポソーム遺伝子ス ペーサーは５ｒＲＮＡ及び１ｒＲＮＡ間のスペーサー領域ではなく、２つの隣接 するｒＲＮＡシストロン間に存在する配列であり、このようなスペーサーは真植 生物ではｒ　ＲＮ　Ａシストロンの反復単位間にしか見いだされず、５ｒＲＮＡ 及びＩｒＲＮＡ遺伝子間の内部スペーサーには無関係である。

（ｉｔ）遺伝子スペーサーフラグメントを使用するしユ艷」３ｓｈｍａｎｉａ分 類群間の区別は、制限フラグメントパターンを比較することにより得られ、使用 されるフラグメントは非特異的である。

従って、サザンプロット分析を用いずに簡単なハイブリダイゼーションプロトコ ルを使用してフラグメントで区別することは不可能である。

リポソーム遺伝子スペーサー中に高特異的プローブが存在し得るということも立 証されていない。

従って、本発明の目的は、細菌種のような特定生物のｒＲＮＡ遺伝子間のスペー サー領域から誘導される種特異的プローブを提供することである。

本発明の別の目的は、Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａ　Ｂ−立旦ユ」ｓ　ａ　ａｌａｃｔｉ ａｅ、５ｔｒｅ　ｔｏｃｏｃｃｕｓｎｅｕｍｏｎ　ｉａｅ、Ｃａｎ　ｌ　ｏｂａ ｃｔ−ｅ　ｒ株を検出するための、１６Ｓ−２３ＳｒＲＮＡスペーサー領域から 誘導されるＤＮＡプローブを提供することである。

本発明の更に別の目的は、ドツトスポット、鎖置換、コンペティション、サンド イッチ又は逆ハイブリダイゼーション試験のようなパイプリダイゼーシゴン試験 により生物学するための、１６３−２３ＳｒＲＮＡ遺伝子スペーサー領域から誘 導されるＤＮＡグローブを提供することである。

本発明の更に別の目的は、Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａ　Ｋ」Ｌｌ」−ｒｒｈｏｅａｅ、 Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎ　１ｔｉｄｉｓ、Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌａ　ｃ ａｊａｒｒｈａｌ法を提供することである。

本発明は、非ウィルス生物、特に原核生物、より特定的には細菌のｒＲＮＡＲＮ Ａ遺伝子間−サー領域の少なくとも約１５ヌクレオチドから構成されるプローブ に係る。

本発明はより詳細には、非ウィルス生物、特に原核生物、より特定的には細菌の ｒＲＮＡ遺伝子間、特に１６Ｓ及び２３　Ｓ　ｒ　ＲＮＡ遺伝子間のスペーサー 領域の約１５ヌクレオチド〜はは最大数のヌクレオチド、より好ましくはスペー サー領域の約１５〜約１００ヌクレオチドから構成されるプローブに係る。

以下の文中で「スペーサー領域Ｊなる用語は、ｒＲＮＡ遺伝子間−より特定的に は１６Ｓ及び２３ＳｒＲＮＡ遺伝子間のスペーサー領域を意味する。

本発明は、検出すべき非ウィルス生物、特に原核生物、より特定的には細菌に固 有であるように選択されたｒＲＮＡ遺伝子間のスペーサー領域の配列にハイブリ ダイズするために十分相補的なオリゴヌクレオチドを構築する段階を含む方法で 得られるようなハイブリダイゼーションアッセイ用１０−プに係り、ｒＲＮＡ遺 伝子間のスペーサー領域の前記配列は、 一＊目的生物のｒＲＮＡ遺伝子間のスペーサー領域のヌクレオチド配列を、最近 隣種のｒＲＮＡ遺伝子間のスペーサー領域のヌクレオチド配列と比較し、 車最近隣種のうちの少なくとも１種のｒＲＮＡ遺伝子間のスペーサー領域との間 に少なくとも１つのミスマツチを有する目的生物のｒＲＮＡ遺伝子間のスペーサ ー領域の少なくとも約１５ヌクレオチド、好ましくはスペーサー領域の約１５〜 はぼ最大数のヌクレオチド、より好ましくは約１５〜約１００ヌクレオチドの配 列を選択することにより、又は 一本短縮スペーサー領域を得るように、目的生物のスペーサー領域からｔＲＮＡ 遺伝子及び場合によりシグナル配列を欠失させ、 ＊少なくとも約１５ヌクレオチド、好ましくは約１５〜スペーサー領域のほぼ最 大数のヌクレオチド、より好ましくは約１５〜約１００ヌクレオチドから構成さ れ且つ目的生物の核酸（ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ）と特異的にハイブリダイズす ることが可能な特異的ヌクレオチド配列を試行錯誤により決定することにより選 択される。

本発明は特に、ｒＲＮＡ遺伝子間のスペーサー領域が１６３ｒＲＮＡ遺伝子及び ２３ＳｒＲＮＡ遺伝子間の転写スペーサー領域であるような７０−ブに係る。

追って概説するように、数種の微生物のスペーサー領域をクローニングし、配列 決定及び比較した。比較の結果。

スペーサー領域の核酸配列は高保存性のｒＲＮＡ遺伝子に比較して生保存性（ｓ ｅ＋５ｉ−ｅｏｎｓｅｒｖｅｄ　ｎａｔｕｒｅ）であることが判明した。従って 、スペーサー領域はｒＲＮＡ遺伝子それ自体よりもプローブの開発に好適である ０図１．２及び１０は、高度に関連する生物（例えば同−遺伝種からの高度に関 連する株ン間に高度の配列相同性があることを示す。

図３及び７に示すように、並の関連性を有する生物間では多少大きい配列相違が 認められた０図４〜６に示すように、関連性の低い種間では罪著な配列相同性は （ｔＲＮＡ配列を除き）全くないことが判明した。

下記表では、異なる株の１６３ｒＲＮＡ配列の相同値（１６Ｓｈｏｍ）（配列相 同％）と、スペーサー領域の対応する相同値（スペーサーｈｏｍ）に比較した。

相同値（１６３ｈｏｍ及びスペーサーｈｏｍ）は、Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔｉｃ ｓ　Ｉｎｃ、及びＧｅｎｏｆｉｔ　ｓＡ＊ｐＣＧｅｎｅソフトウェア（１９８９ 年４月２０日リリース６．０１）を使用して計算した。比較したヌクレオチドの 総数３括弧内に示す、この結果から明らかなように、スペーサー領域は１６Ｓｒ ＲＮＡ分子よりも低保存性である。

１土ｎ　１ｔｉｄ上ｓ、Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌａ　ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ、Ｈ ａｅｍｏ　ｈｉｌｕｓ　ｄｕｃｒｅび感度の高いプローブを誘導することができ た。１６Ｓ及び／又は２３ＳｒＲＮＡ分子中で高特異性プローブを見いだすこと ができなかったＮｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎることができた０本明細書に記 載する以外の穫（例えば他ｒｏｉｄｅｓ種、Ｃｈｌａｍ　ｄｉａ種等）の特異的 プローブも同様にスペーサー領域配列から誘導できる。

１６Ｓ及び２３ＳｒＲＮＡ遺伝子間の転写スペーサー領域から誘導されるプロー ブの標的は、検出すべき細胞中に存在するゲノムＤＮＡ及び前駆体ＲＮＡ分子で ある。前駆体ＲＮＡ分子は一本鎖であり、多重コピー存在し得るので、前駆体Ｒ ＮＡ分子を検出すると有利である。他方、ＤＮＡ分子はＲＮＡ分子よりも酵素分 解を非常に受けにくい、従って、ハイブリダイゼーション前にＲＮＡ分解を生じ ないように十分に生物学的サンプルを処理及び／又は保存できない場合には、Ｄ ＮＡターゲツティングが好適である。

１６Ｓ−２３ＳｒＲＮＡ転写スペーサー領域から誘導される７０−ブの別の利点 は、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）を使用する酵素増幅後に標的検出する点にあ る。多くの微生物のスペーサー領域は例えば、夫々１６Ｓ及び２３ＳｒＲＮＡ遺 伝子の３′末端及び５′末端の保存領域に割り当てられた同一プライマーを使用 して酵素的に増幅され得る。

ｒＲＮＡ遺伝子の高保存性を利用すると、同−試薬及びプロトコルを使用して好 適には同時に多数の生物のスペーサー領域を増幅し、その後、該当生物のスペー サー領域に特異的にターゲツティングするプローブを使用して増幅フラグメント を検出することができる。同時に増幅されたフラグメントの同時且つ特異的検出 のために有利な方法は、逆ハイブリダイゼーションである。

スペーサー領域は保存配列により交叉されているので、この領域をＰＣＲ技術に よりクローニング及び配列決定するのは藺草であり、同一プロトコルを多種の生 物に適用することができる。従ってスペーサー領域の配列は、１６Ｓ又は２３　 Ｓ　ｒ　ＲＮＡに割り当てられた保存プライマーを使用するｒＲＮＡ遺伝子の酵 素的増幅により得られる。スペーサー領域３占めるフラグメントの増幅に使用可 能な塩基プライマー対の例を以下に挙げる。

プライマー対１　：　ＴＧＧＣＴＣＡＧＡＴ　ＴＧ＾＾ＣＧＣＴＧ（：　ＣＧＧ Ｃ及びＣＣＴＴＴＣＣＣＴＣＡＣＧＧＴＡＣＴＧ［、Ｔプライマ一対２　：　Ｔ ＧＧＧＴ［；＾＾ＧＴ　ＣＧＴ＾＾Ｃ＾＾ＧＧ　Ｔ＾及びＣＡＣにＴＣＣＴＴＣ ＧＴＣＣＣＣＴ。

増幅したフラグメントをそのまま、又は固有制限部位と認識する制限酵素で消化 後に２つのサブフラグメントとしてクローニングすることができる０Ｍ１３でＰ ＣＲｊｌｌｌＪをクローニングするためのストラテジーは、Ｍｅｄｌｉｎｅｔ　 ａｔ、（Ｇｅｎｅ　７↓：４９１−４９９．１９８８）に記載されている。

同一ストラテジーを使用してプラスミドベクターでクローニングすることができ る。このアプローチによると、塩基プライマーの５′末端から固有制限部位を含 むヌクレオチド配列と伸長させ、フラグメントを順方向にクローニングする。プ ラスミドベクターにクローニング後、ジデオキシチェーンターミネーション法を 使用してスペーサー領域を配列決定することができる。

このアプローチはゲノムバンク又は選択された制限エンドヌクレアーゼフラグメ ントを使用する従来のクローニング手順に比較して著しく簡単で時間がかからな い。

クローニングせずにＰＣＲフラグメントで配列決定反応を直接実施すると、より 迅速に配列情報が得られるが、クローン化フラグメントから生成された配列情報 のほうがより正確且つ完全である。ＰＣＲフラグメントに比較して、クローン化 遺伝子フラグメントは容易に大量精製できるので、配列決定段階を明瞭に読み取 ることができる。プローブ配列中に１つでもミスマツチがあると１０−ブは無効 になるので、配列を得る際には速度よりも精度のほうが著しく優先される。

上記に要約したアプローチによりスペーサー配列を得る容易さを考慮すると、プ ローブが所望される生物のスペーサー領域のヌクレオチド配列を最近隣種のスペ ーサー領域のヌクレオチド配列と比較するのが、特異的プローブ配列を誘導する ために好適な方法である。

最近隣種とは、ＤＮＡ相同の点で最も密接に関連することが知られており且つ該 当生物と区別されなければならない分類群と意味する。

該当生物の分類学的位置に依存して、最近隣種は該当生物に非常に高度に関連し 、結合度が７５％以上であってもよいし、関連度が低く、有効なりＮＡ相同百分 率を示さなくてもよい、初期再生レート法では結合度の値は約３０％以下であり 、固相ＤＮＡ　：　ＤＮＡハイブリダイゼーション法ではＤＮＡ相同は更に低く 、１０〜２０％の結合度になる。

一方、該当生物を区別すべき最近隣穫のヌクレオチド配列と入手できない場合に は、試行錯誤により特異的プローブを選択することができる。その場合、スペー サー領域の任意の場所に位１し得る特異的プローブ領域を各生物毎に実験的に定 義しなければならない、ｔＲＮＡ遺伝子やシグナル配列のようなスペーサー領域 中のほんのわずかの領域しかプローブ領域として先験的に除外できない場合もあ る。

しかしながら、１６Ｓ−２３ＳｒＲＮＡスペーサー領域は一般に小さく１通常９ ００ｂｐ以下であるので、大規模にスクリーニングしなくても良好なプローブ配 列を容易に見いだすことができる。

例えば１６Ｓ及び２３ＳｒＲＮＡ遺伝子間の７００ｂｐのスペーサー領域の場合 、ｔＲＮＡ及びシグナル配列を欠失させることにより得られる「短縮」スペーサ ー領域は約５００ｂｐであり得る。

本明細書中に使用する「生物学的サンプル」なる用語は、該当標的配列が探査さ れる臨床サンプル（膿、痰、血液、尿等）、環境サンプル、細菌コロニー、汚染 又は純粋培養物、精製核酸等のような試料を意味する。

本明細書中に使用するｒｒＲＮＡ遺伝子スペーサー領域から誘導」なる用語は、 該当プローブがＤＮＡフラグメントから形成されるかＲＮＡフラグメントから形 成されるかに関係なく、又はクローン化フラグメント（ＤＮＡの場合）から構成 されるか又は合成オリゴヌクレオチドから構成されるかに関係なく、該当プロー ブがゲノム又は転写ＲＮＡ分子中に通常存在するリポソームＲＮＡ遺伝子間のス ペーサー領域に配置された配列とハイブリダイズすることを意味する。

Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ株を検出するための本発明のハイブ リダイゼーションプローブは、−核酸グループ。

グループＮＧＩＩ： Ｃ（：ＡＴＧＣｆ；ＴＣＣＴＴＡＴＴＣＴＡＣＴ　ＴＣ（：ＣＮＧＩＩＣＣＣ＾ ＾ＧＴＡＧ＾＾Ｔ＾＾ＣＧＡＣにＣＡＴＣＧ　ＮＧ［１１ＣＣＣＣ＾＾ＧＵＡＧ ＾＾Ｕ＾＾ＣＧＡＣＧＣＡＵＣＧ　ＮＧＩＩＩＣＲＣＧＡＵＧＣＧＵＣＧ　ＵＵ ＾圓ＣＵＡＣＵ　ＵＣＧＣＮｆ；ＩＩＲグループＮ（：Ｉ２： ＴＴＣＧＴＴＴＡＣＣＴＡＣＣＣにＴＴＧＡ　ＣＴ＾＾ＣＴ＾＾ＧＣ＾＾＾ＣＮ ［、ＩＺＧＴＴＴＧＣＴＴＡＣＴＴＡＧＴＣ＾＾ＣＣＧＧＴＡＧＧＴ＾＾＾ＣＣ ＾＾　ＮＧＩ２ｒＣＧＵＵＵＧＣＵＵＡＣＵＵＡＣ：ＵＣＡＡＣＧ　ＧＧＵＡＧ （：ＵＡＡＡ　ＣにＡＡ　ＮＣｌ２１ＣＲＵＵにＣ［ＩＵＵＡＣＣＵＡＣＣＣＧ ｔｌＵにＡ　ＣＵＡＡＧＵＡＡＧＣＡＡＡＣＮＧＩ２Ｒから選択される核酸に属 しており且つ１５〜！！択された核酸の最大数のヌクレオチドを含む配列、又は 下記の場合のいずれにおいても１０−ブが対応する非修飾配列と同一のＲＮＡ又 はＤＮＡ標的とハイブリダイズするという条件下で、 ｍ−夫々の末端のいずれかに１又は数個のヌクレオチドが付加もしくは除去され ているか、 前記配列のいずれかで１個以上のヌクレオチドが置換されているか、 その両方により前記配列のいずれかと異なる変異配列を出するための本発明のハ イブリダイゼーションプローブは、−核酸グループ： グループＮ旧１： Ｇｆ；ＴＣＡＡＧＴＧＴ　ＧＡＣＧＴＣＧＣＣＣＴＧ　ＮＭｒｌＣＡＣ：ＧにＣ ＧＡＣｆｌ：　ＴＣＡＣＡＣＴＴＣＡ　ＣＣＮ旧１１ＣＣＡＧＣＣＣＧＡＣＧ　 ＵＣＡＣＡＣＵＵＧＡ　ＣＣＮＭＩＩＩＣＲＧＧＵＣ＾＾ＧＵＧＵ　ＧＡＣＧＵ Ｃｔｌ：ＣＣ［ｌ’　Ｕに　ＮＭＩＩＲグループＮＭＩ２： ＧＴＴＣＴＴＧＧＴＣ＾＾にＴＧＴＧＡＣＧ　ＴＣＮＭＴ２ＣＡＣｆ；ＴＣＡＣ ＡＣＴＴＧＡＣＣ＾＾Ｇ＾＾ＣＮＮｌ２ｒＣＧＡＧ（ｔｌｃＡｃＡｃ　ＵＵ（、 ＡＣＣ＾＾Ｇ＾＾Ｃ８８１ＺＩｃＲＧＵＵＣＵＵＧＧＵＣＡＡＧＵＧ［ＩＧＡＣ Ｇ　ＤＣＮＭＩ２Ｒグループ８Ｍ１３： ＧＣＧＴＴＣＧＴＴＡ　ＴＡＧＣＴＡＴＣＴＡ　ＣＴＣＴ［；ＣＮＭＩ３［：Ｃ ＡＣＡＧＴＡＧＡ　ＴＡＧＣＴＡＴ＾＾ＣＣ＾＾Ｃｆ；ＣＮＭＩ３１ＣＧＣＡＣ ＡＧＵＡＧＡ　ＵＡｌｌ；ＣＵＡ［Ｉ＾＾ＣＧ＾＾ＣにＣＮ１４１３１ＣＲＣＣ にＵＵＣにＵＵＡ　ＵＡＧＣＵＡＵＣｔｌＡ　ＣＵＧＵＧＣＮＭＩ３Ｒグループ ８８１４： ＴＧＣＣＴＴＣＧＡＴ　ＡＴＴＧＣＴＡＴＣＴ　ＡＣＴＧＴにＣＡ　ＮＮｌ４Ｔ ｆ；ＣＡＣＡＣＴＡ（：　ＡＴＡＧＣ＾＾ＴＡＴ　Ｃ［ｌ、＾＾ＣＣ：ＣＡ　Ｎ Ｍ　Ｉ４　ＩＣυにＣＡＣＡＣυＡ［；　ＡＩＩＡＧＣＡＡＩＩＡＵ　ＣＧＡＡ Ｃ［：ＣＡ　８ＭＩ４１ＣＲＵにＣ１；ＵＵＣＩ；ＡＵ　ＡＵｔｌＧＣＵＡｔｌ ＣＩＩ　ＡＣＵ［；ＵにＣＡ　ＮＭＩ４ＲグループＮ旧５： ＴＴＴＴにＴＴＣＴＴＧＧＴＣＡＡＧＴ［；丁［；ＡＣＧＴＣＧＣＣＣＴ［；＾ ＾Ｔｆ；ＣＡＴＴＣＴにＴＴＣＣＡＴＴＮ）４Ｉ５ ＾＾ＴＧＧ＾＾ＣＡＧ＾＾ＴＣＣＡＴＴＣＡＣ：ＣＧＣＧＡＣにＴＣＡＣＡＣＴ ＴＧＡＣＣ＾＾Ｇ＾＾Ｃ＾＾＾＾ＭＩ５１Ｃ ＾ＡＵＧ　ＧＡＡＣＡＧＡＡ　ＵＣＣＡ　Ｕ　ＵＣＡＧＧＧ　Ｃｌｌ；ＡＣＣＵ ＣＡＣＡＣＵ　ＵＧ　ＡＣＣＡ　Ａに　Ａ　Ａ　Ｃ＾＾＾＾ＮＭＩ５１ＣＲ １ｌｌＪｔｌＵＧＵＩＩｃ［ＩＵＧＧｔｌｃＡＡＧ　ＵＧＵＧＡＣＧ［１ＣＧＣ Ｃ（’ＵＧＡＡＵＧＧＡＵＵＣ［Ｉ［；ＩＩＩＩｃｃＡＵＵＭＩ５Ｒ グループＮＭＩ６： Ｔ丁ＴＧＣＣＴ＾＾Ｃ＾１丁ＣＣＧＴＴＧＡ　ＣＴＡＧ＾＾ＣＡＴＣＡＧＡＣＮ ＭＩ８ＧＴＣＴＧＡＴＧＴＴ　ＣＴＡＧＴＣ＾＾ＣＧＧ＾＾ＴＧＴＴＡ（：Ｇ　 ＣＡＡＡ　ＮＭＩ６１ＣＣＵＣＵＧＡＵＧｔｌＵ　ＣＵＡＧ［ＩＣＡＡＣＧ　［ ；ＡＡＵＧＵＵＡＧＧ　ＣＡＡＡ　ＮＭＩ６ＩＣＲＵＵＵＧＣＣＩＪＡＡＣＡＵ ＵＣＣＧｔｌＵＧＡ　ＣＵＡにＡＡＣＡＵＣＡＧＡＣＮ［６Ｒから選択される核 酸に属しており且つ１５〜選択された核酸の最大数のヌクレオチドを含む配列、 又は下記の場合のいずれにおいても１０−ブが対応する非修飾配列と同一のＲＮ Ａ又はＤＮＡ標的とハイブリダイズするという条件下で、 −・夫々の末端のいずれかに１又は数個のヌクレオチドが付加もしくは除去され ているが、 ・前記配列のいずれがで１個以上のヌクレオチドが置換されているか、 ・その両方により前記配列のいずれがと異なる変異配列を検出するための本発明 のハイブリダイゼーション１０−ブは、 一核酸グループ： グループＢＣ［１： Ｔ丁ＡＡＡＣＡＴＣＴ　丁ＡＣＣＡＡＡｆ；　ＢＣＩＩＣＴＴＴＧｆ；ＴＡＡＧ 　ＡＴＧＴＴＴＡＡ　ＢＣＩＩＩＣＣＵＵＵＧＧＵＡＡＧ　ＡＵＧｔｌＵｔｌＡ Ａ　ＢＣＩＩＩＣＲｌｌ［ＩＡＡＡｃＡｔｌｃ［ｌ　［１ＡＣＣＡＡＡＧ　ＢＣ ＩＩＲグループ８Ｃ１２： ＴＴＧＡ丁にＴＴＴＡ　ＡＡＣＴＴＧＣＴＴに　ＧＴＧＧＡ　ＢＣＩ２ＴＣＣＡ ＣＣＡＡＧＣＡＡにＴＴＴＡＡＡＣＡＴＣＡＡ　ＢＣｌ２１ＣＵＣＣＡＣＣＡＡ ＧＣＡＡＧＩＪＩＪＵＡＡＡＣＡＩＪＣＡＡ　ＢＣｌ２１ＣＲＵＵｆ；ＡＵＧＵ Ｕ［ＪＡ　＾ＡＣＵＵＧＣＵＵ（：　Ｃ１にＧＡ　ＢＣｒ２Ｒから選択される核 酸に属しており且つ１５〜選択された核酸の最大数のヌクレオチドを含む配列、 又は下記の場合のいずれにおいてもプローブが対応する非修飾配列と同一のＲＮ Ａ又はＤＮＡ標的とハイブリダイズするという条件下で、 −・夫々の末端のいずれかに１又は数個のヌクレオチドが付加もしくは除去され ているが、 ・前記配列のいずれかで１個以上のヌクレオチドが置換されているか、 ・その両方により前記配列のいずれがと異なる変異配列をための本発明のハイブ リダイゼーションプローブは、−核酸グループ。

グループＨＤＩＩ・ ＴＴ＾丁Ｔ八丁へ；ＣＣＣＧＡＣ［；ＣＡＴＡＴ　ＴＧ　１（Ｄ１１ＣＡ八Ｔ八 ＴＧＣＣＴ　ＣＧＣＧＣＡＴＡＡＴ　ＡＡ　１（ＯＩＩＩＣＣ＾＾ｕＡｕｃｃｃ ｕ　ＣＧＣにＣＡＵ＾＾Ｕ　＾＾　ＩＩＤＩＩＩＣＲＵ［ＩＡＵυ＾υＧＣＧ　 ＣＧＡＧＧＣＡＩＩＡＩＪ　ＵＧ　ＨＤＩＩＲから選択される核酸に属しており 且つ１５〜選択された核酸の最大数のヌクレオチドを含む配列、又は下記の場合 のいずれにおいても１０−プが対応する非修飾配列と同一のＲＮＡ又はＤＮＡ標 的とハイブリダイズするという条件下で、 −・夫々の末端のいずれかに１又は数個のヌクレオチドが付加もしくは除去され ているか、 ・前記配列のいずれかで１個以上のヌクレオチドが置換されているか、 ・その両方により前記配列のいずれかと異なる変異配列を出するための本発明の ハイブリダイゼーションプローブは、−核酸グループ： グループ１１１１１： ＾Ｃｆｌ：ＣＡＴＣ＾＾＾ＴＴＧＡＣＣＣＣＡＣＴＴ　旧■１＾＾ＧＴＧＣＧＧ ＴＣ＾＾ＴＴＴＧＡＴＧＣＧＴ　）ＩＩＩＩＩＣＡＡＧｔｌ（：ＣＧＧＵＣＡＡ ＵＵＵＧＡＵＧＣＧＯＨＩＩＩＩＣＲＡＣＧＣＡＩＪＣ＾ＡＡ　［ｌ［１ＧＡＣ ＣＧＣＡＣＩＪＵ　ＩＩＩＩ［グループＨ［２゜ ＾ＣＴＴＴｆ、＾＾ＣＴＣ＾＾＾＾ＣＴＴ＾＾＾Ｇ　Ｈ１１２ＣＴＴＴ＾＾ＧＴ ＴＴ　ＴＣＡＣＴＴＣ＾＾＾ＧＴ　ＨｒｌＺＩＣＣＵＵＵ＾＾ＧＵＵＵ　ＵＣＡ ＣＵＵＣ＾＾＾Ｇｔｌ　Ｆ！＋Ｉ２１ＣＲＡＣＵＵＵＧＡＡＧＵ　ＧＡＡＡＡＣ ｔｌＵＡ＾＾ＧＦＩＩ［２Ｒから選択される核酸に属しており且つ１５〜選択さ れた核酸の最大数のヌクレオチドを含む配列、又は下記の場合のいずれにおいて もプローブが対応する非修飾配列と同一のＲＮＡ又はＤＮＡ標的とハイブリダイ ズするという条件下で、 −・夫々の末端のいずれかに１又は数個のヌクレオチドが付加もしくは除去され ているか、 ・前記配列のいずれかで１個以上のヌクレオチドが置換されているか、 ・その両方により前記配列のいずれかと異なる変異配列を含む。

Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ　ｅｒｔｕｓｓｉｓ株を検出するための本発明のハイブリ ダイゼーションプローブは、−核酸グループ。

グループＢｐＨ： ＣＣＡＣＡＣＣＣＡＴ　ＣＣＴＣＴＧＧＡＣＡ　ＧＧＣＴＴ　ＢＰ１１＾＾ＧＣ ＣＴＧＴＣＣＡＧＡＧにＡＴＧＧＧ　ＴＧＴＧＧ　ＢＰ［１１Ｃ＾＾ＧＣＣ［ｌ ＧυＣＣＡＧＡＧＧ＾υＧＧ（：　ＵＧＵＧＧ　ＢＰＩＩＩＣＲＣＣＡＣＡＣＣ ＣＡＵ　ＣＣＵＣＵＧにＡＣＡ　にＧＣＵＵ　ＢＰＩＩＲから選択される核酸に 属しており且つ１５〜選択された核酸の最大数のヌクレオチドを含む配列、又は 下記の場合のいずれにおいてもプローブが対応する非修飾配列と同一のＲＮＡ又 はＤＮＡ標的とハイブリダイズするという条件下で、 −・夫々の末端のいずれかに１又は数個のヌクレオチドが付加もしくは除去され ているか、 ・前記配列のいずれかで１個以上のヌクレオチドが１損されているか、 ・その両方により前記配列のいずれかと異なる変異配列をを検出するための本発 明のハイブリダイゼーション１０−ブは、 一核酸グループ・ グループ５ＰＩＩ： ＧＴＧＡＧＡＧＡＴＣＡＣＣ＾＾Ｃ丁ＡＡＴ　ＧＣＡ　５ＰＩＩＴｆ；ＣＡＴＴ ＡＣＴＴ　ＧＣＴＣＡＴＣＴＣＴ　ＣＡＣ５ＰＩＩＩＣυＧＣＡＵＵＡＣｔｌＵ 　ＧＧｔｌにＡｔ１Ｃ１ｌＣＵ　ＣＡＣ５Ｐ１１１ＣＲＧＵＧＡＧＡＧＡ［ＩＣ ＡＣＣＡＡＧＵＡＡＵ　ＧＣＡ　５ＰＩＩＲグループ５ＰＩＮ： ＾Ｇｆ、八＾ＣへＣＣＧ　ＣＡＴＴＧにＴＣＴＴ　５ＰＩ２＾＾ＧＡＣＣ＾＾Ｔ Ｇ　ＣＧＣＡＧＴＴＣＣＴ　５ＰＩ２１Ｃ＾＾ＣＡＣＣ＾＾ＵＧ　Ｃ（：ＣＡＧ ＵＵＣＣＵ　ＳＰ■２ＩＣＲ八Ｇ＋、Ａ＾Ｃｕ１ｌ；ＣＧＣＡＵＵＧＧｔｌＣｔ ｌＵ　５ＰＩ２Ｒグループ５ＰＩ３： ＧＡ（：ＴＴＴＡＴにＡ　ＣＴに＾＾＾［、ｔｌ：ＴＣＡ［、＾＾　５Ｐ１３Ｔ ＴＣＴ［；ＡＣＣＴＴ　ＴＣＡＧＴＣＡＴ＾＾＾ＣＴＣ５ＰＩ３１Ｃ１１ＵｃＵ ＧＡｃｃ１．ｌＩＩ　ＵＣＡＧ［ＩＣＡＵＡＡ　ＡＣＵＣ５ＰＩ３ＩＣＲＧＡＣ ｕＵＵＡＵＧＡ　Ｃ１１ＣＡＡＡＧＧＵＣＡにＡＡ　５ＰＩ３Ｒから選択される 核酸に属しており且つ１５〜選択された核酸の最大数のヌクレオチドを含む配列 、又ζよ下記の場合のいずれにおいてもブローブカ（対応する１１修飾配列と同 一のＲＮＡ又はＤ　Ｎ　Ａ　ａ的とハイブリダイズするという条件下で、 −夫々の末端のいずれかに１又は数個のヌクレオチドが付加もしくは除去されて いるか、 ・前記配列のいずれかで１個以上のヌクレオチドが１換されているか、 ・その両方により前記配列のいずれかと異なる変異配列をを検出するための本発 明のハイブリダイゼーション１０−ブは、 一核酸グループ： グループ５ＡＩＩ・ ＡＡＴＣにＡＡＡＧに　ＴＴＣＡＡＡＴＴＧＴ　Ｔ　５ＡＩＬ＾＾Ｃ＾＾ＴＴＴ Ｇ＾　八ＣＣＴＴＴＣＣＡＴ　Ｔ　５ＡＩＩＩＣ＾＾Ｃ＾＾ｔｌＵＵＧＡ＾ＣＣ ＵＩＪＩＪＣＧＡｔｌ　ＩＩ　５Ａ１１１ＣＲ＾＾ＵＣＣ＾＾＾ＧＧ　ＵＵＣＡ ＡＡＵＵＧｔｌ　Ｕ　ＳＡ［ＩＲグループ５ＡＩ２： ＣＣ＾＾＾ＣＣＴＧＣＣＡＴＴＴＧＣＧＴＣＴＴ　５ＡＩ２＾＾ＧＡＣＧＣ＾＾ ＾ＴＧＧＣＡＧにＴＴＴ　ＣＣＳＡＩ２１ＣＡＡＧＡＣＧＣＡＡ＾　ＩＪＧＧＣ ＡＧＧＵＩＩｔｌ　ＣＣ５ＡＩ２１ＣＲＧＧＡ＾＾ＣＣ［ＩＧＣＣＡＵｕＵＧＣ ＧｔｌＣ０１１５ＡＩ２Ｒグループ５ＡＩ３・ ＴＣＣＡＣＧＡＴＣＴ　ＡＧ＾＾＾ＴＡＧＡＴ　ＴＧＴＡＧ＾＾　ＳＡＩ３ＴＴ ＣＴＡＣ＾＾ＴＣＴＡＴＴＴＣＴＡＧＡ　ＴＣＧＴＧＧＡ　Ｓ＾１３ｒＣＵｔｌ ＣＵＡＣＡＡＵＣＵＡＵＩＩＵＣＵＡＧＡ　ＵＣＧＵＧＧＡ　５ＡＩ３１ＣＲＵ ＣＣＡＣにＡ［ｌＣ［Ｉ　ＡＧ＾＾＾ＵＡＧＡＩＪ　［ＩＧＩＪＡＧ＾＾　５Ａ Ｉ３ＲグループＳ＾■４゜ ＴＣＴＡＧＴＴＴ丁Ａ　ＡＡＧＡＡＡＣＴＡＧ　ＧＴＴ　５ＡＩ４ＡＡＣＣＴＡ にＴＴＴ　ＣＴＴＴＡＡＡＡＣＴ　ＡにＡ　Ｓ＾ｌ４ｒＣＡＡＣＣＵＡＧＵＵＵ 　ＣＵＵＵＡＡＡＡＣＵ　ＡＧＡ　５Ａｆ４１ＣＲＵＣＵＡＧＵＵＵＵＡ　ＡＡ ＧＡＡＡＣ［ＩＡＧ　ＣＵＤ　５ＡＩ４Ｒから選択される核酸に属しており且つ １５〜選択された核酸の最大数のヌクレオチドを含む配列、又は下記の場合のい ずれにおいてもプローブが対応する非修飾配列と同一のＲＮＡ又はＤＮＡ標的と ハイブリダイズするという条件下で、 −・夫々の末端のいずれかに１又は数個のヌクレオチドが付加もしくは除去され ているが、 ・Ｎ記配列のいずれかで１個以上のヌクレオチドが置換されているか、 ・その両方により前記配列のいずれかと異なる変異配列を含む。

本発明は更に、適切な条件でプローブがＣａｍ　Ｉ。

ハイブリダイズするという条件下で、図１０に示す１６Ｓ−２３ＳｒＲＮＡスペ 一サー配列がら誘導される１５〜最大数のヌクレオチドの配列、又はＴがＵで！ 損された対応配列、又はその相補配列５又はＴがＵで置換された対応すするため のハイブリダイゼーションプローブに係る。

グルー７ＮＧＩ　１．ＮＧＩ　２．ＮＭＩ　１．ＮＭＩ　２．ＮＭＩ３．ＮＭＩ ４．ＮＭＩ５．ＮＭＩ６．ＢＣＩ　１．ＢＣｌ２．ＨＤＩ　１．ＨＩ　Ｉ　１． ＨＩ　Ｉ２．ＢＰＩ　１，５Ｐｒ１．５ＰＩ２，５ＰＩ３，５ＡＩＬ、５ＡＩ２ ，５ＡＩ３及び５ＡＩ４に示した配列中、アルファベットは以下のヌクレオチド を表す。

Ａ：アデニル残基 Ｃ，シチジル残基 Ｇ、グアニジル残基 「Ｉｌｌ的」なる用語は、上記に定義したグループＮＧＩＩ。

ＮＧＩ２．ＮＭＩ　１．ＮＭＩ２．ＮＭＩ３．ＮＭＩ４．ＮＭＩ５．ＮＭＩ６． ＢＣＩｌ、ＢＣｌ２．ＨＤＩＩ、ＨＩＩｔ、ＨＩＩ２．ＢＰ　丁　１．　５ＰＩ Ｉ、　５Ｐｒ２．　５ＰＩ３、ＳＡＩ　１，５ＡＩ２，５ＡＩ３及び５ＡＩ４の 配列のいずれかに相補的な配列を意味する。

本発明のプローブが上記配列の片側又は両側に核酸延長部（例えばクローニング ベクターの核酸フラグメント又は該クローニングベクターから前記プローブを切 断することにより得られるワンカーフラグメント）を含む場合、このような延長 部は、追って定義するような本発明の方法により試験され得る微生物のＤＮＡ中 で上記標的以外の任意の対応する相補的核酸配列とハイブリダイズしないように 選択されるべきである。二のようなハイブリダイゼーションは寄生性であり、プ ローブの特異性を低下させる。好適プローブは、上記グループの配列のいずれか から形成される核酸フラグメントから構成され、該フラグメントは１５〜該当核 酸配列の最大数のヌクレオチドを含む。

上記ヌクレオチド配列（及び以下に記載する他の配列）において、式の左端は常 に該当配列の５°末端に対応し、右端は３′末端に対応する。

更に「グループＸのグローブＪ　（ＸＧｉＮＧＩ　１．ＮＧＩ２、ＮＭＩ　１． ＮＭＩ　２．ＮＭＩ　３．ＮＭＩ４．ＮＭＩ５゜ＮＭＩ６．ＢＣＩ　１．ＢＣｌ ２．ＨＤＩ　１．ＨＩ　Ｉ　１．ＨＩ　Ｉ２．ＢＰＩ　１．ＳＰｒ　１．５ＰＩ ２，５ＰＩ３．ＳＡｒ　１．ＳＡＩ　２．ＳＡＩ　３及び５ＡＩ４から選択され る）と称するとき、このようなプローブは上記又は下記に定義するグループに属 する核酸の１種に含まれる配列を有するものと理解されたい。

また、本明細書中で使用する「ヌクレオチド」なる用語は、特に明記しない限り リボヌクレオチド及びデオキシヌクレオチド及び修飾ヌクレオチド（例えばイノ シン）を無差別に意味するものと理解されたい、「ヌクレオチド」なる用語は更 に、修飾基（例えばハイブリダイゼーション能に根本的に影響しない化学的修飾 基）を含むヌクレオチドも包含する。このような修飾基の目的は、例えば特に該 当ＲＮＡ又はＤＮＡｊｉ（例えば他のＤＮＡ及び／′又はＲＮＡと共に生物学的 サンプル中に最初に含まれているＲＮＡ又はＤＮＡｇ）とのハイブリダイゼーシ ョン産物中がら標識又はラベルされたプローブを後で検出するために適切なマー カー又はラベルと直接又は間接的に結合し易くすることである。

例えば、このような修飾基は、適切な酵素又は蛍光又は化学発光ラベルを担持す る他の抗体により特異的に認識され得る抗体により認識可能である。可能な標識 手順については追って詳細に説明する。

本発明は更に、上記配列のいずれかを有しており且つ上記プローブの特異性Ｐ変 更しないように一部のヌクレオチドが置換したプローブにも係る。プローブは、 上記グループのいずれかに属する核酸の１種又はその一部がら構成される場合も あるが、その場合、プローブはＮｅ１ｓｓｅｒＢｏｒｄｅｔｅｌ　ｌａ　ｅｒｔ ｕｓｓｉｓ、　１旦二二工ｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａ　ａｌａｃｔｉａｅ、５ｔｒｅ 　を異性を変えない程度までその両側にヌクレオチド延長部を含む。

従って本発明は、場合によりヌクレオチド配列に少数の些少の変異を有するほと んどのＮｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｌ旦オチド配列からなるレプリカ（数字の後にＩＣ 又はＩＣＲと記述することにより表す）、又はＮｅ１ｓｓｅｒｉａｏｎｏｒｒｈ ｏｅａｅ、Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｂｒａｎｈａｍｅ ｌｌａ　ｃａｔａｒ１工　ｃｏｌｉの天然ＲＮＡ又はＤＮＡに含まれる配列に相 補的な配列（数字のみ又は数字の後にＲを記述することにより表す）から形成さ れるプローブを提供する。

より詳細には、該当Ｄ　Ｎ　Ａ中の標的配列は、このような標的に対する本発明 のプローブのハイブリダイゼーション特異性に影響しないように、場合により株 間に些少な天然部ではないとしても大部分に存在する以下の連続配列のいずれか から構成される。

Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｏｎｏｒｒｈｏｅａｅの場合、ＧＣＧ＾＾ＧＴＡＧ＾＾Ｔ ＾＾ＣＧＡＣ［：ＣＡＴＣＣＣＴＴＴＧＣＴＴＡＣＴＴＡＧＴＣ＾＾ＣＧ　（Ｃ ＴＡｆ；ＧＴ＾＾＾ＣＣ＾＾。

Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎ　１ｔｉｄｉｓの場合、ＣＡＧ（［：ＣＣＡＣ Ｇ　ＴＣＡＣＡＣＴＴにＡ　ＣＣＧＡＣｆ；ＴＣＡＣＡＣＴＴＩ；ＡＣＣ＾＾Ｇ ＾＾Ｃ１１：ＣＡＣＡ［：ＴＡ［：＾　■＾ＧＣＴ＾丁＾＾ＣＧ＾＾ＣＣＣＴＧ ＣＡＣＡＧＴＡＧ　＾丁＾ＧＣ＾＾ＴＡＴ　Ｃに＾＾ＣＣＣ＾＾＾ＴＧＧ＾＾Ｃ ＡＧ＾＾ＴＣＣＡＴＴＣＡｆ；Ｇｆ；ＣＧＡＣｆ；ＴＣＡＣＡＣＴＴＩ；ＡＣＣ ＡＧ＾＾Ｃ＾＾＾＾ＧＴＣＴ［；ＡＴＣ丁Ｔ　ＣＴＡ［；ＴＣ＾＾ＣＣＣ＾＾Ｔ ［；ＴＴＡＧ［；　Ｃ＾＾＾。

ＣＴＴＴＣ（：Ｔへ＾Ｇ　ＡＴＧＴＴＴ＾＾ＴＣＣＡＣＣ＾＾ＣＣ＾＾Ｉ：、Ｔ ＴＴ＾＾＾ＣＡＴＣ＾＾。

Ｈａｅｍｏ　ｈｉｌｕｓ　ｄｕｃｒｅ　ｉの場合、Ｃへ＾ＴＡＴＧＣＣＴ　ＣＧ ＣＧＣＡＴ＾＾Ｔ　＾＾。

Ｂｏｒｄｅｔｅｌ　Ｉａ　ｅｒｔｕｓｓｉｓ−の場合、＾＾にＣＣＴ［；ＴＣＣ ＡＧＡ（：ＣＡＴ（：ＧＧ　ＴＧＴＩＩ、［；。

旦ａｅｍｏ　ｈｉ−↓ｕｓ　１ｎｆｌｕｅｎｚａｅの場合、＾＾［；ＴＧＣＧ［ ；ＴＣ＾＾ＴＴＴＧＡＴＧＣ［：ＴＣＴＴＴ＾＾ＧＴＴＴ　ＴＣＡＣＴＴＣ＾＾ ＾　ＧＴ。

ＴＣＣＡＴＴＡＣＴＴ　Ｇ［；Ｔ［；ＡＴＣＴＣＴ　ＣＡＣ＾＾にＡＣＣ＾＾Ｔ Ｇ　Ｃ［：ＣＡＧＴＴＣＣＴＴＴＣＴ（：ＡＣＣＴＴ　ＴＣＡ（：ＴＣＡＴ＾＾ 　＾ＣＴＣ。

５ｔ−ｒｅ　ｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａ　ａｌａｃｔｉａｅの＾＾Ｃ＾＾ＴＴＴＧ＾ 　＾ＣＣＴＴＴＣＧＡＴ　Ｔ＾＾（：ＡＣにＣ＾＾＾　Ｔ（ＧＣＡ［；ＧＴＴＴ 　ＣＣＴＴＣＴＡＣ＾＾ＴＣＴＡＴＴＴＣＴＡＧＡ　ＴＣＧＴＧＧ＾＾＾ＣＣＴ ＡＧＴＴＴ　ＣＴＴＴ＾＾＾＾ＣＴ　ＡＧＡ。

本発明のプローブは、対応するヌクレオチド配列を含むインサートを含む組換プ ラスミドをクローニングし、必要に応じて適切なヌクレアーゼを使用してクロー ン化プラスミドから対応するヌクレアーゼ配列を切断し、例えば分子量に従う分 画により回収することにより形成され得る０本発明の１０−ブは、例えば従来の ホスホ−トリエステル法により化学的に合成することもできる。

本発明は更に、生物学的サンプル中でＮｅ１ｓｓｅｒｉｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａ　 ａｌａｃｔｉａｅ、５ｔｒｅ　ｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｎｐｕｍｏｎｉａｅ又はＣａ ｍ　ｖ　１しｅｒ　ｃｏｌｉ株を検出するための方法にも係り、該方法は、必要 に応じて適切な変性条件下で核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）をハイブリダイゼーショ ンできるようにしておｌｖ）た前記生物学的サンプルを、プローブとサンプル中 に存在し得る株の相補的核酸との間のＡイブリダイゼーションを可能にする条件 下で本発明のプローブと接触させる段階と、ハイブリッドが形成された場合には これを検出する段階とを含む。

本発明の方法は、該当生物を探査するサンプル中に存在する可能性のある酵母、 真菌、原生動物、他の細菌株及び／又はヒトｌ１ｌＩ胞から、Ｎｅ１ｓｓｅｒｉ ａ　ｏｎｏｒｒｎｅｕｍｏｎｉａｅ又はＣａｍ　ｖｌｏｂａｃｔｅｒ−二りに旦 ユ退びｑ１皿」ユ」−と虹ｌ且工」ゴー　ｃｏｌｉを、区別することができる１ 本発明の方法は、Ｎｅ１ｓｓｅｒｔｅｒ　ｃｏｌｉ株をサンプル中で直接又ζよ 株を培養後略こ検出する方法に係る。

ハイブリッドが検出された場合、グループＮＧＩＩ、ＮＧＩ２．ＮＭＩ　１．Ｎ ＭＩ２．ＮＭＩ３．ＮＭＩ４．ＮＭ１５、ＮＭＩ６．ＢＣＩ　１．ＢＣｌ２．Ｈ ＤＩ　１．ＨＩ　１１、ＨＩ　Ｉ２．ＢＰＴ　１．ＳＰＩ　１，５ＰＩ２，５Ｐ Ｉ３゜５ＡＩＬ、５ＡＩ２，５ＡＩ３及び５ＡＩ４のプローブのいずれかの使用 中に夫々Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａ　ＬＬＬＬＬｒｈｏｅａｅ、Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａ　 ｍｅｎｉｎ　１ｔｉｄｉｓ、Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌａ　ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ 、Ｈａｅｍｏ　ｈｊｌｕｓ　ｄｕｃｒｅ　ｉ、ＨａｅｍΣ　ｎｅｕｍｏｎｉａｅ による感染が生物学的サンプル中に存在していたと判断することができる。

本発明の有利な実施態様によると、Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａれるプローブは、生物学 的サンプル中に存在し得るＮｅ１ａ　ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ、Ｈａｅｍｏ　ｈ ｉｌｕｓｄｕｃｒｅｖｉ、）（ａｅｍｏ　ｈｉｌｕｓ　１ｎｆｌｕｅ１ｏｂａｃ ｔｅｒ　ｃｏｌｉ株のＤＮＡ全体及びＲＮＡとハイブリダイズするプローブであ る。

ハイブリダイゼーション条件は、例えばハイブリダイゼーション温度、媒体の成 分の性質及び濃度、並びに形成されるハイブリッドの洗浄温度等の数個のパラメ ーターに依存して監視され得る。

ハイブリダイゼーション及び洗浄温度は１０−プ（その核酸組成、種類及び長さ ）に応じて上限を制限され、本発明のプローブの最高ハイブリダイゼーション又 は洗浄温度は約３０〜５８℃である。温度がこれ以上になると、デュプレクシン グはプローブと凛的との間に形成されるハイブリッドの解離（又は変性）に競合 する。

好適ハイブリダイゼーション媒体は約３ＸＳＳＣ（ＬＸｓｓｃ＝ｏ、１５Ｍ　Ｎ ａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７，０）、約２５ｍＭのリンａ ｌｌ液分ｐＨ７１，２０°ｇ脱イオン化ホルムアミド、０．０２％Ｆｉｃｏｌ　 Ｉ、０．０２％ウシ血清アルブミン、０．０２％ポリビニルピロリドン及び約０ ．１ｍｇ／ｍｌの剪断変性サゲ精子ＤＮＡを含有する。

好適洗浄媒体は、約３ＸＳＳＣ１２５ｍ　Ｍリンｗｉ緩衝液ｐＨ７，１及び２０ ％脱イオンホルムアミドを含有する。

他のハイブリダイゼーション又は洗浄媒体も使用できる。

しかしながら、プローブ又は媒体に変更を導入する場合、必要な特異性を得るた めにプローブを使用可能な温度は、Ｂ、Ｄ、ＨＡＭＥＳ　ａｎｄ　Ｓ、Ｊ、ＨＩ ＧＧＩＮＳ。

（ｅｄｓ、）、Ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、Ａ　 ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ａｐｐｒｏａｃｈ、　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、０ｘｆｏｒｄ 、Ｕ。

Ｋ、、　１９８５に記載されているような既知の関係に応じて変更すべきである 。

この点では、一般にＤＮＡ　：　ＤＮＡハイブリッドはＲＮＡ：ＤＮＡ又はＲＮ Ａ　：　ＲＮＡハイブリッドよりも安定性が低いことにも留意すべきである。従 って、検出すべきハイブリッドの性質に依存して、特異的検出を実施できるよう にハイブリダイゼーション条件を適応させるべきである。

本発明に従って、一般にＮｅ１ｓｓｅｒｉａ　ＬＬＬＬが特異的となるような値 にハイブリダイゼーション温度を適宜調節することにより実施され得る。このよ うな場合、より厳密な条件で洗浄する必要はない。

本発明の別の実施態様によると、ハイブリダイゼーション温度を必ずしもハイブ リダイゼーションが特異的となるような値に調節する必要はなく、特に、ハイブ リダイゼーションが特異的となるような値に対応する温度で洗浄を実施するので あるならば、ハイブリダイゼーションが特異的となるような温度よりも低い温度 でハイブリダイゼーションを行ってもよい。

グループＮ　Ｇ　Ｉ　１のプローブでＮｅ１ｓｓｅｒｉａ　Ｌｏｎｏｒｒｈｏｅ ａｅ株を検出（及び他の細菌分類群から区別）するための方法の実施！ｇ様によ ると、ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄温度は約５０°Ｃに調節すると適 切であり、媒体は上記に定義した類である。

グループＮＧＩ２のプローブでＮｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｊｉＬｏｎｏｒｒｈｏｅａ ｅ株を検出（及び他の細菌分類群から区別）するための方法の実施態様によると 、ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄温度は約５０℃に調節すると適切であ り、媒体は上記に定義した類である。

グループＮＭＩＩのプローブでＮｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎ　１ｔｉｄｉｓ 株な検出（及び他の細菌分類７力１ら区別）するための方法の実施態様によると 、ノ１イブ１ノダイゼーション及び／又は洗浄温度は約４５℃に調節すると適切 であり、媒体は上記に定義した類である。

グループＮＭＩ２のプローブでＮｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎ二にＬ二正ＬＬ株を 検出（及び他の細菌分類群から区別）するための方法の実施態様によると、ハイ ブリダイゼーション及び／又は洗浄温度は約４５℃に調節すると適切であり、媒 体は上記に定義した顕である。

グループＮＭＩ３のプローブでＮｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎ　ｊｔｉｄｉｓ 株を検出（及び他の細菌分類群から区別）するための方法の実施態様によると、 ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄温度は約４０℃に調節すると適切であり 、媒体は上記に定義した票である。

グループＮ　Ｍ　Ｉ　４のプローブでＮｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎ　１ｔｉ ｄｉｓ株を検出（及び他の細菌分類群から区別）するための方法の実施態様によ ると、ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄温度は約４８℃に調節すると適切 であり、媒体は上記に定義した類である。

グループＮＭＩ５のプローブでＮｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎ　１ｔｉｄｉｓ 株を検出（及び他の細菌分類群から区別）するための方法の実施態様によると、 ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄温度は約５８℃に調節すると適切であり 、媒体は上記に定義した票である。

グループＮＭＩ６のプローブでＮｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｍＬＬＬＬＬ二見二±ＬＬ 株を検出（及び他の細菌分類群から区別）するための方法の実施態様によると、 ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄温度は約５０℃に調節すると適切であり 、媒体は上記に定義した想である。

グループＢＣＩＩのプローブてＢｒａｎｈａｍｅ　Ｉ　ｌ　ａｃａｔ、ａｒｒｈ ａｌｉｓ株と検出（及び他のａｍｍ原票群ら区別）するための方法の実施態様に よると、ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄温度は約３０℃に調節すると適 切であり、媒体は上記に定義した想である。

グループＢＣｌ２のプローブでＢｒａｎｈａｍｅ　Ｉ　Ｉａｃａｔａｒｒｈａｌ 　ｉｓ株を検出（及び他の細菌分類群から区別）するための方法の実施態様によ ると、ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄温度は約４２℃に調節すると適切 であり、媒体は上記に定義した頂である。

グループＢＰＩＩのプローブでＢｏｒｄｅｔｅ　Ｉ　Ｉ　ａｅｒｔｕｓｓｉｓ株 を検出（及び他の細菌分類群から区別）するための方法の実施態様によると、ハ イブリダイゼーション及び／又は洗浄温度は約５５℃に調節すると適切であり、 媒体は上記に定義した類である。

グループＨＤＩＩのプローブでＨａｅｍｏ　ｈｉｌｕｓ±ｕｃｒｅ　ｉ株を検出 （及び他の細菌分類群から区別）するための方法の実施！！！様によると、ハイ ブリダイゼーション及び／又は洗浄温度は約４０℃に調節すると適切であり、媒 体は上記に定義した類である。

グルー７８　ｒ　ｒ　１．　ノブロープでＨａｅｍｏ　ｈｉｌｕｓ−４ｎｆ　Ｉ ｕｅｎｚａｅ株を検出（及び他の＃Ｉ菌分票群から区別）するための方法の実施 態様によると、ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄温度は約５５℃に調節す ると適切であり、媒体は上記に定義した雇である。

グループＨ１ｒ２のプローブでＨａｅｍｏ　ｈｉｌｕｓｉｎｆ　Ｉｕｅｎｚａｅ 株を検出（及び他の細菌分類群から区別）するための方法の実施！ｇ様によると 、ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄温度は約３５℃に調節すると適切であ り、媒体は上記に定義した類である。

グループＳＡ■ｌのプローブで５ｔｒｅ　ｔｏｃｏｃｃｕｓ　旦」Ｌ且」−１≦ −立」−１」−株を検出（及び他の細菌分類群から区別）するための方法の実施 態様によると、ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄温度は約３５℃に調節す ると適切であり、媒体は上記に定義した星である。

グループ５Ａｒ２のプローブで５ｔｒｅ　ｔｏｃｏｃｃｕｓ　旦」Ｌ旦」−且」 二ｔｉａｅ−株を検出（及び他のｍ回分類群から区別）するための方法の実施！ 様によると、ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄温度は約４５℃にｙ！節す ると適切であり、媒体は上記に定義した粟である。

グループ５ＡＩ３のプローブで影ｎ二ｏｃｏｃ二ＬΣ　ａ　ａｌａｃｔｉａｅ株 を検出（及び他の細菌分類群から区別）するための方法の実施態様によると、バ イブ、リダイゼーション及び／又は洗浄温度は約４５℃に調節すると適切であり 、媒体は上記に定義した類である。

グループ５ＡＩ４のプローブで旦±ｍ笠立ユ匹≦工ｕｓ　ａ　ａｌａｃｔｉａｅ 株を検出（及び他の細菌分類群から区別）するための方法の実施態様によると、 ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄温度は約３７℃に調節すると適切であり 、媒体は上記に定義した類である。

グループ５ＰＩＩのプローブで５ｔｒｅ　ｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｎｅｕｍｏｎｉａ ｅ株を検出（及び他の細菌分類群から区別）するための方法の実施態様によると 、ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄温度は約４５℃に調節すると適切であ り、媒体は上記に定義した票である。

゛　グループ５ＰＩ２の７０−ブで５ｔｒｅ　ｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｎｅｕｍｏｎ ｉａｅ株を検出（及び他の細菌分類群から区別）するための方法の実施態様によ ると、ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄温度は約４５℃に調節すると適切 であり、媒体は上記に定義した票である。

グループ５ＰＩ３のプローブでＳｔｒユ、（ユユユえユｕｓ　ｎｅｕｍｏｎｉａ ｅ株を検出（及び他の細菌分類群から区別）するための方法の実ｍＷ様によると 、ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄温度は約４５℃に調節すると適切であ り、媒体は上記に定義した類である。

本発明は更にＮｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎ　１ｔｉｄｉｓ株を特異的に検出 するためのキットに係り、該キットは、 −Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎ　ｉｔｊ二ｄｉｓユに特異的な１０−プ、即 ちグループＮＭｒ　１．ＮＭＩ　２．ＮＭＩ３、ＮＭＩ４．ＮＭＩ５又はＮＭＩ ６のプローブと、−これらのプローブとＮｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎＬｉｔ ｉｄｉｓ株のＤＮＡ及び／又はＲＮＡのみとの間にハイブリダイゼーション反応 を生じさせることが可能なＭ漬液又は該Ｍｌ液を生成するために必要な成分と、 〜前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブリッドを適時検出するた めの手段とを含む。

本発明は更にＮｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｏｎｏｒｒｈｏｅ−ａｅ株を特異的に検出す るためのキットに係り、該キットは、 −Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｏｎｏｒｒｈｏｅａｅに特異的なプローブ、即ちグルー プＮ（、ＩＩ又はＮＧＩ２のプローブと、 −これらのプローブとＮｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ株のＤ’ＮＡ 及び／又はＲＮＡのみとの間にハイブリダイゼーション反応を生じさせることが 可能な緩衝液又は該ｌ！衝漬液生成するために必要な成分と、−前記ハイブリダ イゼーションにより形成されたハイブリッドを適時検出するための手段とを含む 。

本発明は更にＢｒａｎｈａｍｅｌｌａ　ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ株を特異的に検 出するためのキットに係り、該キットは、 一上記Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌａ　ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓに特異的なプローブか ら選択された少なくとも１種のプローブ、即ちグループＢＣＩＩ又はＢＣＴ２の プローブと、−これらのプローブとＢｒａｎｈａｍｅｌｌａ　ｃａｔａｒｒｈａ ｌｉｓ株のＤＮＡ及び／又はＲＮＡのみとの間にハイブリダイゼーション反応を 生じさせることが可能な緩衝液又は該緩衝液を生成するために必要な成分と、− 前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブリッドを適時検出するため の手段と３含む。

本発明は更にＨａｅｍｏ　ｈｉｌｕｓ　ｄｕｃｒｅ　ｉ株を特異的に検出するた めのキットに係り、該キットは、−上記Ｈａｅｍｏ　ｈｉｌｕｓ　ｄｕｃｒｅ　 ｉに特異的な１０−ブから選択された少なくとも１種のプローブ、即ちグループ ＨＤＩＩのプローブと、 −これらのプローブとＨａｅｍｏ　ｈｉｌｕｓ　ｄｕｃｒＬＬ二株のＤＮＡ及び ／又はＲＮＡのみとの間にハイブリダイゼーション反応を生じさせることが可能 な緩衝液又は該緩衝液を生成するために必要な成分と、−前記ハイブリダイゼー ションにより形成されたハイブリッドを適時検出するための手段とを含む。

的なプローブから選択された少なくとも１種のプローブ、即ちグループＢＰ１１ のプローブと、 −これらのプローブとＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ　Ｅ」−二重」工リダイゼーション 反応分生じさせることが可能なＭＷｒ液又は該［漬液を生成するために必要な成 分と、−前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブリッドを適時検出 するための手段とを含む。

本発明は更に旦ａｅｍｏ　ｈｉｌｕｓ　１ｎｆｌｕｅｎｚａｅ株を特異的に検出 するためのキットに係り、該キットは、 一上記Ｈａｅｍｏ　ｈｉｌｕｓ　１ｎｆｌｕｅｎｚａｅに特異的なプローブがら 選択された少なくとも１種のプローブ、即ちグループＨＩＩＩ又はＨＩＩ２のプ ローブと、−これらのプローブと比立二旦工」」ロー１ｕＬ　１ｎｆｌｕｅｎｚ ａｅ株のＤＮＡ及び／又はＲＮＡのみとの間にハイブリダイゼーション反応を生 じさせることが可能な緩衝液又は該［漬液を生成するために必要な成分と、−前 記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブリッドを適時検出するための 手段とを含む。

−上記５ｔｒｅ　ｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａ　ａｌａｃｔｉａ先に特異的なプローブ から選択された少なくとも１種のプローブ、即ちグループ５ＡＩＬ、５ＡＩ２， ５ＡＩ３又は）　５ＡＩ４のプローブと、 −これらのプローブと５ｔｒｅ　ｔｏｃｏｃｃｕｓ　１ｉａｌａｃｔｉａｅ株の ＤＮＡ及び／又はＲＮＡのみとの間にハイブリダイゼーション反応を生じさせる ことが可能なＷｌｌｒ液又は該緩衝液を生成するために必要な成分と、−前記ハ イブリダイゼーションにより形成されたハイブリッドを適時検出するための手段 とを含む。

ロープ、即ちグループ５ＰＩＩ、５ＰＩ２又は５ＰＩ３のプローブと、 −これらのプローブと５ｔｒｅ　ｔｏｃｏｃｃｕｓ　ＪＬＬｅｕｍｏｎｉａｅ株 のＤＮＡ及び／又はＲＮＡのみとの間にハイブリダイゼーション反応を生じさせ ることが可能なＩＩ衝漬液は該ｙＩ衝漬液生成するために必要な成分と、−前記 ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブリッドを適時検出するための手 段とを含む。

に検出するためのキットに係り、該キットは、から選択された少なくとも１種の プローブと、−これらのプローブとＣａｍ　１ｏｂａｃｔｅｒ　二ＬＬ−Ｌ二及 びＣａｍ　１ｏｂａｃｔｅｒ　ｃｏｌｉ株のＤＮＡ及び／又はＲＮＡのみとの間 にハイブリダイゼーション反応を生じさせることが可能なＭ漬液又は該緩衝液を 生成するために必要な成分と、 一前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブリッドを適時検出するた めの手段とを含む。

本発明の１０−プは、核酸１０−プを利用するアッセイの特異性を増加するサン ドイッチハイブリダイゼーションシステムで使用することができる。核酸１０− ブに基づくアッセイにおけるサンドイッチハイブリダイゼーションの原理及び使 用は既に記載されている（例えばＤＵＮＮ　ａｎｄ　ＨＡＳＳＥＬ、　Ｃｅ１ｌ 、　１２：　２３−３６；　１９７７；　ＲＡＮＫＩ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｇｅｎ ｅ。

２１：　７７−８５；　１９８３）。直接ハイブリダイゼーションアッセイは好 ましい速度を有するが、サンドイッチハイブリダイゼーションは信号対雑音比が 高いという点で有利である。更に、サンドイッチハイブリダイゼーションは核酸 プローブに基づくアッセイの特異性を増加することができる。

適正に設計するならば、サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイは実際に 、同一生物の２種の異なる核酸部分を認識する２種のグローブを使用する場合、 核酸プローブに基づく試験の特異性を最大にすることができ、る、満足しなけれ ばならない唯一の要件は、２種のプローブの両方が（ｉ）標的生物の同一核酸分 子にハイブリダイズし、且つ（ｉｉ）同一の非標的生物にハイブリダイズしない ことである。

２種の所与のプローブｒ及びｒＩを使用する場合、サンドイッチハイブリダイゼ ーションシステムは次のように説明することができる。

プローブＩは生物（Ｃでなく）Ａ及びＢ由来の核酸とハイブリダイズする。

プローブＩＩは生物（Ｂでなく）Ａ及びＣ由来の核酸と絶対的に必要であるので 、生物Ａ由来の核酸がサンプル中に存在する場合のみに検出可能なシグナルが発 生される。

プローブの一方が検出すべき生物に特異的である場合には、他方のプローブは第 １のプローブよりも同一標的分子にハイブリダイズするのであれば、特異的配列 から構成しても非特異的配列から構成してもよい。

本発明のプローブは、同一標的分子にハイブリダイズする別の非特異的又は特異 的プローブと夫々組み合わせて丈Ｃａｍ　Ｉｏｂａｃｔｅｒ　’ｅ’ｕｎｉ及び ｍ１ｏｂａｃｔｅｒ　ｃｏｌｉに特異的なサンドイッチハイブリダイゼーション アッセイで使用することができる。

サンドイッチハイブリダイゼーションプロセスでは、標的ＤＮＡ又はＲＮＡを探 査する生物学的サンプルに１０−ブを同時に加えてもよいし、別々に加えてもよ い。

本発明は更に生物学的サンプル中でＮｅｌｓｓｅｒｉａｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ株 をｉｎ　ｖｉｔｒｏ検出するためのサンドイッチハイブリダイゼーションアッセ イ用キットに係り、該キットは、 一同一核酸分子を標的にし且つ少なくともＩＮがＮｅ　ｉ　５ｓｅｒｉａ　ｏｎ ｏｒｒｈｏｅａｅに対して特異的である少なくとも２種の１０−ブと、 −これらのプローブとＮｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ株のＤＮＡ及 び／又はＲＮＡとの間にハイブリダイゼーション反応を生じさせることが可能な 緩衝液又は該ＩＩ衝漬液生成するなめに必要な成分と、−前記ハイブリダイゼー ションにより形成されたハイブリッドを適時検出するための手段とを含む。

本発明は更に生物学的サンプル中でＮｅｔｓｓｅｒｉａｍｅｎｉｎ　１ｔｉｄｉ ｓ株をｉｎ　ｖｉｔｒｏ検出するためのサンドイッチハイブリダイゼーションア ッセイ用キットに係り、該キットは、 一同一核酸分子を標的にし且つ少なくとも１種がＮｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉ ｎ　１ｔｉｄｉｓに対して特異的である少なくとも２種のプローブと、 −これらのプローブとＮｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｉｔｉｄｉｓ株のＤＮＡ 及び／又はＲＮＡとの間にハイブリダイゼーション反応を生じさせることが可能 な緩衝液又は該緩衝液を生成するために必要な成分と、−前記ハイブリダイゼー ションにより形成されたハイブリッドを適時検出するための手段とを含む。

本発明は更に生物学的サンプル中でＢｒａｎｈａｍｅｌＩａ　ｃａｔａｒｒｈａ ｌｉｓ株をｉＨｖｉｔｒＱ検出するためのサンドイッチハイブリダイゼーション アッセイ用キットに係り、該キットは、 一同一核酸分子を標的にし且つ少なくとも１種がＢｒａｎｈａｍｅｌｌａ　ｃａ ｔａｒｒｈａｌｉｓに対して特異的である少なくとも２Ｎの１０−ブと、 −これらのプローブとＢｒａｎｈａｍｅｌｌａ　ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ株のＤ ＮＡ及び／又はＲＮＡとの闇にハイブリダイゼーンヨ〉反応３生しさせることが 可能なＭ漬液又は該緩衝液３生成するために必要な成分と、−前記ハイブリダイ ゼーションにより形成されたハイブリッド３適時検出するための手段とを含む。

本発明は更に生物学的サンプル中でＨａｅｍｏ　ｈｉｌｕｓ　ｄｕｃｒｅｖｉ株 をｉｎ　ｖｉｔｒｏ検出するためのサンドイッチハイブリダイゼーションアッセ イ用キットに係り、該キットは、 一同一核酸分子を標的にし且つ少なくとも１種がＨａｅｍｏ　ｈｉｌｕｓ　ｄｕ ｃｒｅ　ｉに対して特異的である少なくとも２Ｎのプローブと、 −これらのプローブとＨａｅｍｏ　ｈｉｌｕｓ　ｄｕｃｒＬＬ二株のＤＮＡ及び ／又はＲＮＡとの間にハイブリダイゼーション反応を生じさせることが可能なＩ ！衝漬液は該緩衝液を生成するために必要な成分と、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブリッドを適時検出するた めの手段とを含む。

本発明は更に生物学的サンプル中でＨａｅｍｏ　ｈｉｔｕｓ　１ｎｆｌｕｅｎｚ ａｅ株をｉｎ　ｖｉｔｒｏ検出するためのサンドイッチハイブリダイゼーション アッセイ用キットに係り、該キットは、 一同一核酸分子を標的にし且つ少なくとも１種がＨａｅｍ旦」ト上−１１ｕｓ　 １ｎｆｌｕｅｎｚａｅに対して特異的である少なくとも２種のプローブと、 −これらのプローブとＨａｅｍｏ　ｈｉｌｕｓ　１ｎｆｌｕｅｎｚａｅ株のＤＮ Ａ及び／又はＲＮＡとの間にハイブリダイゼーション反応を生じさせることが可 能な緩衝液又は該ＩＩ衝漬液生成するために必要な成分と、−前記ハイブリダイ ゼーションにより形成されたハイブリッドを適時検出するための手段とを含む。

本発明は更に生物学的サンプル中でＢｏｒｄｅｔｅ　ｌ　１ａ　ｅｒｔｕｓｓｉ ｓ株をｉｎ　ｖｉｔｒｏ検出するためのサンドイッチハイブリダイゼーションア ッセイ用キットに係り、該キットは、 一同一核酸分子を標的にし且つ少なくとも１種がＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ　ＬＬＬ ぢｕｓｓ　ｉ　ｓに対して特異的である少なくとも２種のプローブと、 −これらのプローブとＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ　２」」二１」＝ｓｓｉｓ株のＤＮ Ａ及び／又はＲＮＡとの間にハイブリダイゼーション反応を生じさせることが可 能な緩衝液又は該緩衝液を生成するために必要な成分と、−前記ハイブリダイゼ ーションにより形成されたハイブリッドを適時検出するための手段とを含む。

本発明は更に生物学的サンプル中でＳｔ工Ｕ二１舌ニー」−ｃｃｕｓ　ａ　ａｌ ａｃｔｉａｅ株を−ｉｎ　ｖｉｔｒｏ検出するためのサンドイッチハイブリダイ ゼーションアッセイ用キットに係り、該キットは、 一同一核酸分子を標的にし且つ少なくとも１種が５ｔｒｅｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａ 　ａｌａｃｔｉａｅに対して特異的である少なくとも２種のプローブと、−これ らのプローブと５ｔｒｅ　ｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌ」−ａｌａｃｔｉａｅ株のＤＮ Ａ及び／又はＲＮＡとの間にハイブリダイゼーション反応を生じさせることが可 能なｗＬ衝漬液は該Ｍ漬液を生成するために必要な成分と、−前記ハイブリダイ ゼーションにより形成されたハイブリッドを適時検出するための手段とを含む。

本発明は更に生物学的サンプル中で５ｔｒｅ　ｔｏｃ。

ｃｃｕｓ　ｎｅｕｍｏｎ　ｉ　ａｅ工株をｉｎ　ｖｉｔｒｏ検出するためのサン ドイッチハイブリダイゼーションアッセイ用キットに係り、該キットは、 一同一核酸分子を標的にし且つ少なくとも１種がＳｔ　ｒｅｔｏ　ｃ　ｏ　ｃ　 ｃ　ｕ　ｓ　ｎ　ｅ　ｕ　ｍ　ｏ　ｎ　ｉ　ａ　ｅに対して特異的である少なく とも２種のプローブと、−これらの１０−プと５ｔｒｅ　ｔｏｃｏｃｃｕｓ　且 」−ｅｕｍｏｎｉａｅ株のＤＮＡ及び／又はＲＮＡとの間にハイブリダイゼーシ ョン反応３生じさせることが可能な緩衝液又は該［漬液を生成するために必要な 成分と、−前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブリッドを適時検 出するための手段とを含む。

本発明は更に生物学的サンプル中でＣａｍ　Ｉｏｂａｃｔｅｒ　１二」」」ＬＬ 株３二ｎ　ｖｉｔｒｏ検出するためのサンドイッチハイブリダイゼーションアッ セイ用キットに係り、該キットは、 一同一核酸分子を標的にし且つ少なくとも１種がｍ１ｏｂａｃｔｅｒ　’ｅ’ｕ ｎｉに対して特異的である少なくとも２種のプローブと、 −これらのプローブとＣａｍ　１ｏｂａｃｔｅｒ　ＬＬ１工ＬＬ株のＤＮＡ及び ／又はＲＮＡとの間にハイブリダイゼーション反応を生じさせることが可能な緩 衝液又は該ｙＩＷＲ液を生成するために必要な成分と、−前記ハイブリダイゼー ションにより形成されたハイブリッドを適時検出するための手段とを含む。

本発明は更に生物学的サンプル中でＣａｍ　１０ｂａｃｔｅｒ　ｃｏｌｉ株を二 ｎ　ｖｉｔｒｏ検出するためのサンドイッチハイブリダイゼーションアッセイ用 キットに係り、該キットは、 一同一核酸分子を標的にし且つ少なくとも１種がｍ１ｏｂａｃユ」Ｌニー　ｃｏ ｌｉに対して特異的である少なくとも２種のプローブと、 −これらのプローブとＣａｍ　Ｉｏｂａｃｔｅｒ　ｃｏ−二株のＤＮＡ及び／又 はＲＮＡとの間にハイブリダイゼーション反応を生じさせることが可能なＨ漬液 又は該緩衝液と生成するために必要な成分と、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブリッドを適時検出するた めの手段とを含む。

本発明のグローブは、コンペティションハイブリダイゼーションプロトコルでも 使用することができる。

コンペティションハイブリダイゼーションでは、標的分子は特異的１０−ブとそ の禰体との間に形成されるハイブリッドに競合する。標的数が多ければ多いほど プローブとその補体との間に形成されるハイプリントの量は少なくなる。特異的 標的が存在していたことを示す陽性シフナルは、標的を加えなかったシステムに 比較してハイブリダイゼーション反応が低いことにより確認される。特定の実施 ！ｇ様によると、適切にＩ［ｍした特異的オリゴヌクレオチドプローブを標的分 子とハイブリダイズさせる０次に、混合物を受容器（例えばマイクロタイター皿 のウェル）に移し、特異的プローブに相補的なオリゴヌクレオチドを固定し、ハ イブリダイゼーションを続ける。洗浄後、相補的オリゴヌクレオチドとプローブ との間に形成されたハイブリッドを、使用したラベルに応じて好ましくは定量的 に測定する。

本発明のオリゴヌクレオチドは、酵素的に増幅した特異的フラグメントを生成す るためにポリメラーゼ鎖反応技術（ＰＣＲ；　Ｍｕｌｌｉｓ　ａｎｄ　Ｆａｌｏ ｏｎａ、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１５５：３３５−３５ ０．　１９８７）で増幅プライマーとして及び／又は交叉オリゴヌクレオチドプ ライマー間で増幅されたフラグメントを検出するためのプローブとして使用する ことができる。

ＰＣＲによるハイブリダイゼーションアッセイの特異性は種々のレベルに調節す ることができる。

増幅法又は検出法又はその両方は特異的であり得る０両方が特異的な場合は特異 性が最大になるので好適である。

このようなＰＣＲを利用する高特異性試験は本発明のプローブを使用して実施さ れ得る。

しかしながら、場合によっては、多様な生物に使用できるように増幅法を標準化 するために、特異的検出に結び付けられた本発明の検出プローブを交叉する保存 性プライマーを使用する非特異的増幅法が有利である。

標準化増幅法で使用される増幅プライマーは、スペーサー領域の両側の１６Ｓ及 び２３ＳｒＲＮＡ遺伝子の保存領域に見いだされる（実施例１参照）。

本発明は更に、検出すべき微生物に特異的な本発明のプローブのいずれかを使用 して生物学的サンプルに含まれる１種の微生物又は数種の微生物を同時にｉｎ　 ｖｉｔｒ。

検出するための方法にも係り、該方法によると、好ましくはプローブ領域を交叉 する少なくとも１組の１ライマーによる酵素的増幅を使用して、生物学的サンプ ル中に存在する（ＩＩ的配列を含む）ＤＮＡ及び／又はＲＮＡを標識し、増幅し た標的配列と膜上のプローブとの特異的ハイブリダイゼーションを可能にする媒 体中で、１種以上のオリゴヌクレオチドプローブを既知の位置にトントスボット した膜に前記生物学的サンプルを接触させ、ハイブリダイゼーションにより形成 されたハイブリッドを適切な手段により検出する。

増幅が必要な場合、その目的は標的配列と増幅しくそれによって標的配列の交叉 領域も増幅させ）、増幅領域のみを標識することである。

生物学的サンプル中に十分な標的配列が存在する場合、増幅は不要である。

このような場合、ハイブリダイゼーション前に例えば化学的手段により又は特異 的染料の添加によりＩＩ諏を実施すべきであり、生物学的サンプル中に存在する ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ全体を標識することに留意すべきである。

本発明は更に、生物学的サンプル中に含まれる１種の微生物又は数種の微生物を 同時にｉｎ　ｖｉｔｒｏ検出するためのキットに係り、該キットは、 −検出すべき微生物に特異的であり、膜にドツトスポットした本発明のプローブ の少なくとも１種と、−該プローブの標的配列を含むＤＮＡ及び／又はＲＮＡの 酵素的増幅を適時実施するために必要なプライマーと、−酵素的増幅が可能であ り及び７′又はこれらのプローブと検出すべき微生物のＤＮＡ及び／又はＲＮＡ との間にハイブリダイゼーション反応を生じさせることが可能なｙＩ衝漬液は該 緩衝液と生成するために必要な成分と、−前記ハイブリダイゼーションにより形 成されたハイブリッドを適時検出するだめの手段とを含む。

上記方法及びキットは、５ａｉｋｉ　ｅｔ　ａｌ、（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃ ａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８６：６２３０−６２３４．　１９８９）により記載さ れている逆ドツトプロットアッセイのような逆ハイブリダイゼーションドットブ ロットアｙセイを含む。

この場合、５′ビオチニル化プライマーを用いるＰＣＲを使用して標的配列をま ず酵素的に増幅する。第２段階では、固体支持体に固定した特異的オリゴヌクレ オチドとのハイブリダイゼーション後、増幅産物を検出する。この方法は実施例 ２に記載する変形方法のような数種の変形が考えられる０例えば、この方法はス ペーサー領域と交叉する普遍的プライマーを用いるＰＣＲｌ及び該当生物の種々 の特異的オリゴヌクレオチドプライマーをドツトスポットした膜とのハイブリダ イゼーション後に特定の臨床サンプル中に存在し得る種々の微生物の同時且つ特 異的検出に特に有利であり得る。上記のような逆ハイブリダイゼーションアッセ イで使用可能な特異的オリゴヌクレオチドプライマーの有利なパネルの例と以下 に挙げる。

に）痰パネル：　Ｍｏｒａｘｅｌｌａ（Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌａ　ｃａｔａｒｒ ｈａｌｉｓ（旨）ＣＳ　Ｆ−パネル：　Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａ　７ヱｔｉｄｉｓ工 （ｉｉｉ）尿生殖−パネル：　Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ−当 然のことながら、これらのパネルは他の臨床的に関連する微生物のプローブを加 えることにより拡張することができる。歯周ポケットからのサンプル又は血液サ ンプルのような他の臨床サンプルのパネルも利用できる。

ＰＣＨには、非普遍的に保存されたプライマー、例えばスペーサー領域自体に配 ！されたプライマーも使用することができ、ＰＣＢは１組のプライマー用いて又 は同一反応容器で種々の組のプライマーを用いて実施することができる。

増幅段階なしに逆ハイブリダイゼーションを実施することもできる。この場合、 サンプル中に存在する核酸をハイブリダイゼーション前に例えば化学的手段又は 特異的染料の添加により特異的又は非特異的にＩ識又は修飾すべきである。

はとんどの場合、スペーサー領域がら誘導され得る該当生物の特異的７０−ブの 数は、本明細書に記載するプローブに制限されない。

生物によっては、程々の細菌の高特異性且つ高感度のプローブの開発のためにス ペーサー領域を利用できることが立証されている１０−ブは１又は２覆しか記載 されていない、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ　ｅｒｔｕｓｓｉｓのみが例外であり、ス ペーサー領域の唯一の特定領域（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ　ｅｒｔｕｓｓｉｓ配列 中のヌクレオチド２７１〜２９９、図２の上段）が特異的配列を有する。しがし ながら、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ　ｅｒｔｕｓｓｉｓのスペーサー領域配列から、 高度に関連するＢｏｒｄｅｔｅΣ以外のＢｏｒｄｅｔｅ　Ｉ　ＩａＮを検出する プローブも図２の配列から推定することができる。同様に、Ｍｏｒａｘｅ　ｖ　 ｔｉｕｓの潜在的に特異的なプローブも夫々図７及び８に示すスペーサー配列が ら推定することができる。

本発明は更に、生物学的サンプル中で１種以上のＮｅｉ−固体支持体に固定され たＮｅ１ｓｓｅｒｉａ　ＬＬＬＬｒｒｈｏｅａｅに特異的な本発明のプローブの いずれかから選択された少なくとも１種のプローブと、−該プローブの標的配列 を含むＤＮＡ及び／又はＲＮＡの酵素的増幅を適時実施するために必要なプライ マーと２−酵素的増幅が可能であり及び／又は前記プローブとＮｅ１ｓｓｅｒｉ ａ　ｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ株のＤＮＡ及び／又はＲＮＡとの間にハイブリダイゼ ーション反応を生じさせることが可能な緩衝液又は該緩衝液を生成するために必 要な成分と、 一雨記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブリッドを適時検出するた めの手段とを含む。

本発明は更に、生物学的サンプル中で１種以上のＮｅ１ｎ　１ｔｉｄｉｓに特異 的な本発明の１０−プのいずれかから選択された少なくとも１種のプローブと、 −該プローブの標的配列を含むＤＮＡ及び／又はＲＮＡの酵素的増幅を適時実施 するために必要なプライマーと、−酵素的増幅が可能であり及び／又は前記１０ −ブとＮｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎ　１ｔｉｄｉｓ株のＤＮＡ及び／又はＲ ＮＡとの間にハイブリダイゼーション反応を生じさせることが可能な緩衝液又は 該緩衝液を生成するために必要な成分と、 一前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブリ・・ドを適時検出する ための手段とを含む。

本発明は更に、生物学的サンプル中で１種以上のＨａｅｍｏ　ｈｉｌｕｓ　ｄｕ ｃｒｅ　ｉ株をｉｎ　ｖｉｔｒ。

検出するためのキットに係り、該キットは、一固体支持体に固定されたＨａｅｍ ｏ　ｈｉｌｕｓ　ｄｕＬＬＬＬＬに特異的な本発明のプローブのいずれかから選 択された少なくとも１種のプローブと、−該プローブの標的配列を含むＤＮＡ及 び／又はＲＮＡの酵素的増幅を適時実施するために必要なプライマーと、−酵素 的増幅が可能であり及び／又は前記プローブとＨａｅｍｏ　ｈｉｌｕｓ　ｄｕｃ ｒｅ　ｉ株のＤＮＡ及び／又はＲＮＡとの間にハイブリダイゼーション反応を生 じさせることが可能なＭＩ街液又は該＊Ｗ液を生成するために必要な成分と、 一前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブリッドを適時検出するた めの手段とを含む。

本発明は更に、生物学的サンプル中で１種以上のＢｒａｎｈａｍｅｌｌａ　ｃａ ｔａｒｒｈａｌｉｓ株をｉｎ　ｖｉｔｒｏ検出するためのキットに係り、該キッ トは、一固体支持体に固定されたＢｒａｎｈａｍｅｌｌａ　ｃａｔａｒｒｈａｌ 　ｉ　ｓに特異的な本発明の１０−ブのいずれかから選択された少なくとも１種 のプローブと、−該プローブの標的配列を含むＤＮＡ及び／又はＲＮＡの酵素的 増幅を適時実施するために必要なプライマーと、及び／又はＲＮＡとの間にハイ ブリダイゼーション反応を生じさせることが可能な緩衝液又は該Ｍ街液を生成す るために必要な成分と、 一前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブリッドを適時検出するた めの手段とを含む。

本発明は更に、生物学的サンプル中で１種以上のＢｏｒ−固体支持体に固定され たＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ　Ｌ先Ｌｔｕｓｓｉｓに特異的な本発明のプローブのＵ ）ずれ力）力）ら選択された少なくとも１種のプローブと、−該プローブの標的 配列を含むＤＮＡ及び／又番よＲＮＡの酵素的増幅を適時実施するために必要な プライマーと、−酵素的増幅が可能であり及び／又は前記プローブとＢ。

ｒｄｅｔｅｌｌａ　Ｌ１Ｌ旦ｕｓｓｉｓ株のＤＮＡ及び／又はＲＮＡとの間にハ イブリダイゼーション反応を生じさせることが可能な緩衝液又は該緩衝液を生成 するため（こ必要な成分と、 ドを適時検出するための手段とを含む。

本発明は更に、生物学的サンプル中で１種以上のＨａｅ−固体支持体に固定され たＨａｅｍｏ　ｈｉｌｕｓ　ｉｎから選択された少なくとも１稽のプローブと、 −該プローブの標的配列を含むＤＮＡ及び／又はＲＮＡの酵素的増幅を適時実施 するために必要なプライマーと、−酵素的増幅が可能であり及び／又は前記プロ ーブと±工ｅｍｏ　ｈｉｌｕｓ　１ｎｆｌｕｅｎｚａｅ株のＤＮＡ及び／又はＲ ＮＡとの間にハイブリダイゼーション反応を生じさせることが可能な緩衝液又は 該緩衝液を生成するために必要な成分と、 一前記ハイプリダイゼーションにより形′成されたハイブリッドを適時検出する ための手段とを含む。

本発明は更に、生物学的サンプル中で１種以上のＳｔｒ−固体支持体に固定され た５ｔｒｅ　ｔｏｃｏｃｃｕｓｎｅｕｍｏユｎ１ａｅユに特異的な本発明のプロ ーブのいずれかから選択された少なくとも１種のプローブと、−該プローブの標 的配列を含むＤＮＡ及び／又はＲＮＡの酵素的増幅を適時実施するために必要な プライマーと、−酵素的増幅が可能であり及び／又は前記プローブと５ｔｒｅ　 ｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｎｅｕｍｏｎｉａｅ株のＤＮＡ及び／又はＲＮＡとの間にハ イブリダイゼーション反応を生じさせることが可能なＷ１衝液又は該ＭＩＩ液を 生成するために必要な成分と、 一前記ハイプリダイゼーションにより形成されたハイブリッドを適時検出するた めの手段とを含む。

本発明は更に、生物学的サンプル中で１種以上のＳｔｒ−固体支持体に固定され た５ｔｒｅ　ｔｏｃｏｃｃｕｓａ　ａｌａｃｔ工１」Ｌ」−に特異的な本発明の プローブのいずれかから選択された少なくとも１種のプローブと、−該１０−ブ の標的配列を含むＤＮＡ及び／又はＲＮＡの酵素的増幅を適時実施するために必 要なプライマーと、−酵素的増幅が可能であり及び／又は前記プローブとＳｔＡ 及び／又はＲＮＡとの間にハイブリダイゼーション反応を生じさせることが可能 な緩衝液又は該ｙ１衝液を生成するために必要な成分と、 一前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブリッドを適時検出するた めの手段とを含む。

本発明は更に、生物学的サンプル中で１種以上のＣａｍめのキットに係り、該キ ットは、 一固体支持体に固定されたＣａｍ　Ｉｏｂａｃｔｅｒ゛ｅ　ｕｎｉに特異的な本 発明の１０−ブのいずれかから選択された少なくとも１種のプローブと及びＣａ ｍ　１ｏｂａｃｔｅｒ　ｃｏｌｉに特異的な本発明のプローブのいずれかから選 択された少なくとも１種のプローブと、−該プローブの標的配列を含むＤＮＡ及 び／又はＲＮＡの酵素的増幅を適時実施するために必要なプライマーと、−酵素 的増幅が可能であり及び／又は前記プローブとＣａの間にハイブリダイゼーショ ン反応を生じさせることが可能なＭ漬液又は該ｙ１衝液を生成するために必要な 成分と、−前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブリッドを適時検 出するための手段とを含む。

プローブの 本発明のプローブは標識すると有利である。任意の従来のラベルを使用すること ができる。プローブは、）２ｐ−ｆｆ５Ｓ、”５１．３Ｈ及び”Ｃのような放射 性トレーサーにより標識され得る。

放射性標識は、（標識すべき末端に応じて）放射性標識ヌクレオチド、（ホスフ ァターゼによる脱リン酸化を伴うか又は伴わない）ポリヌクレオチドキナーゼ、 末端転移酵素又はリガーゼを使用することにより、３′又は５′位の末端標識の ような任意の従来方法に従って実施され得る。

本発明のプローブの１種は、数種の放射性ヌクレオチド又は数種の放射性及び非 放射性ヌクレオチドから構成される鎖の合成用マトリックスであり得る。

本発明のプローブは、１又は数種の放射性ヌクレオチドを使用する化学的合成に より製造することもできる。別の放射性標識方法は本発明のプローブの化学的ヨ ウ素化であり、プローブに数個の１２５ｒ原子を結合させる。

本発明のプローブの１種が非放射性ＲＮＡ又はＤＮＡとのハイブリダイゼーショ ンに使用するように放射性標識される場合、ハイブリダイゼーションの検出方法 は、使用される放射性トレーサーに依存する。一般に、放射性トレーサーにより 発生される電離性放射線を検出することが可能なオートラジオグラフィー、液体 シンチレーション、γ計数又は他の任意の従来方法を使用することができる。

免疫特性（例えば抗原又は）１ブテン）、ある種の試薬Ｇこ対する特異的親和性 （例えばリガンド）、検出可能な酵素反応を提供する特性（例えば酵素、補酵素 、酵素基質又１よ酵素反応に関与する基質）、又は物理的特性（例え（ｆ任意の 波長の光の蛍光、発光又は吸収）を有する残基Ｇこ本発明のプローブを組み合わ せることにより非放射性標識を使用することもできる。プローブと標的とにより 形成されるノ＼イブリッドを特異的に検出する抗体も使用できる。

本発明のプローブを化学的に合成する場合には非放射性ラベルを使用することが でき、アデノシン、グアノシン、シチジン、チミジン及びウラシル残基は、プロ ーブ又はプローブと相補的ＤＮＡもしくはＲＮＡフラグメントとの間に形成され たハイブリッドを検出することが可能な他の化学的残基に結合し得る。

一方、１種以上のヌクレオチドを他の化学的残基に結合することにより修飾した 場合、プローブのヌクレオチド配列は本発明のプローブの１種のヌクレオチド配 列と同一である。

本発明は更に、上記のように標識され且つ検出可能な本発明のプローブを使用し てハイブリダイゼーションによりＲＮＡ及び／又はＤＮＡを検出するための方法 にも係る。

この点では、従来のハイブリダイゼーション方法を使用することができる。

生存生物起源の細胞又はそれ自体生存生物である細胞を検出するためには、化学 的又は物理的方法を使用して細胞の部分的又は全溶解によりこれらの細胞のＲＮ Ａ及び／又はＤＮＡに必要に応じてアクセスできるようにし、検出可能な本発明 の１又は数種のプローブと接触させる。この接触は、液体媒体又は溶液中でニト ロセルロース、セルロース又はナイロンフィルターのような適当な支持体上で実 施され得る。この接触は、次善、最適又は制限条件（即ち配列が所定の分子長で 完全に相同である場合のみにハイブリ・ｌド形成可能な条件）下で実施され得る 。このような条件は、温度、反応物質濃度、最適核酸対合温度を低下させる物質 の存在（例えばホルムアミド、ジメチルスルホキシド及び尿素）、及び反応容量 を外見上低下させるか及び／又はハイプリント形成を促進する物質の存在（例え ばデキストラン硫酸、ポリエチレングリコール又はフェノール）を含む。

ハイブリダイズしなかった本発明の１０−ブを除去するには、適切なイオン力価 及び適切な温度の緩衝溶液で洗浄し、場合により、Ｓ１ヌクレアーゼ又は一本１ ｉＤＮＡもしくはＲＮＡを消化するが、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドもしくは二 本１１ＤＮＡを消化しない他の任意の酵素で処理する。

液体媒体中で、細胞ＤＮＡ又はＲＮＡフラグメントに対合した本発明のプローブ のハイブリッドは種々の方法、例えばヒドロキシアパタイト上のクロマトグラフ ィーにより液体媒体の残余から分離することもできる。

次に、ハイブリダイズしたプローブをプローブ上のラベルにより検出する。

染色体ＤＮＡフラグメントｔｉ＋的にするためには、ＲＮＡを１又は数種の酵素 で処理し、ＤＮＡフラグメントを変性（即ち両Ｍｔ分離）した後、ハイブリダイ ゼーションを可能にする条件下で本発明のプローブの１種をＤＮＡフラグメント と接触させ、ハイブリダイゼーションの終了に達するために必要な時間後、ハイ ブリダイズしなかったフラグメントをハイブリダイズしたフラグメントから分離 し、細胞検出について上述したようにラベルと検出する。

一般に、異種Ｄ　Ｎ　Ａの存在が該当用途でプローブの特異性分損なわないなら ば、クローニングを可能にする組換ＤＮＡ中に本発明の種々のプローブを含むこ ともできる。

（以下余白） 図１〜図１０には、種々の微生物中で発見されたスペーサー領域のアライメント （全部または一部を配列したもの）が例として示されている。対（ｍａｔｃｈ） 及び空所（ｇａｐ）は各々、“：”及び“−°゛で表されている。総ての配列に 関して、非−コードストランドは、その５−３′配列で示されている。

５′末端は、１６Ｓ　ｒＲＮ＾遺伝子の近位であり、３°末端は、２３Ｓ　ｒＲ Ｎ＾遺伝子の近位である。

図１〜図１０に参照される各生体（Ｅ、　ｃｏｌｉの１種を除く）の１６Ｓと２ ３Ｓ　ｒＲＮ＾遺伝子との間のスペーサー領域の各核酸配列は、新規であること は指摘されねばらならない。

図１には、Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａ　７−株ＮＣＴＣ８３７５（上列）及びＩ丁Ｓ　 ４３６７（下列）の１６Ｓと２３Ｓ　ｒＲＮ＾遺伝子との閏のスペーサー領域の １６Ｓ　ｒＲＮ＾近位端の核酸配列アライメントが示されている。

図２には、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ　７−＾ＴＣＣ１０３８０（上列）及びＢｏｒ ｄｅｔｅｌｌａ　ｂｒｏｎｃｈｉｓｅ　ｔｉｃａ　ＮＣＴＣ４５２（下列）の１ ６５と２３ＳｒＲＮ＾との間のスペーサー領域の核酸配列アライメントが示され ている。

図３には、Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｗｈｅｎユＪ１」±劇」−ＮＣＴＣ１００２５ （上列）及びＮｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ　ＮＣＴＣ８３７５（ 下列）の１６５と２３５ｒＲＮ＾との間のスペーサー領域の核酸配列アライメン トが示されている。

図４には、Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ　ＮＣＴＣ８３７５（上 列）及びＢｏｒｄｅＬｅｌｌａ　ト狂↓旦１１」−ＡＴＣＣ１０３８０（下列） ノ１６Ｓと２３ＳｒＲＮ＾との間のスペーサー領域の核酸配列アライメントが示 されている。

図５には、Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌｉ　ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ　ＩＴＭ　４１９ ７（上列）及びＮｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ　ＮＣＴＣ８３７５ （下列）の１６Ｓと２３５ｒＲＮＡとの間のスペーサー領域の核酸配列アライメ ントが示されている。

図６には、シリヱ幻＋ｈｉｌ＋リー山仔工見ＬＬ　ＣＩＰ　５４２（上列）及び Ｅｓｅｈｅｒｉｃｈｉａ　ｅｏｌｉ（下列）の１６Ｓと２３Ｓ　ｒＲＮ＾とのゴ のスペーサー領域の核酸配列アライメントが示されている。

図７には、Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌａ　ｅａｔａｒｒｈａｌｉｓ　ＩＴＳ　４１９ ７（上列）及びＭｏｒａｘｅｌｌａ　ｎｏｎｌｉ　ｕｅｆａｃｉｅｎｓ＾ＴＣＣ １９９７５（下列）の１６Ｓと２３Ｓ　ｒＲＮ＾との間のスペーサー領域の核酸 配列アライメントが示されている。

図８には、ｈ叩」が±ｕｓ　１ｎｒｌｕｅｎｚａｅ（バイオグループ１ｎｆｌｕ ｅｎｚａｅ）ＮＣＴＣ８１４３（上列）及びｂ」工」壮ユＩｕｓ　１ｎｆｌｕｅ ｎｚａｅ（バイオグルー　７１１１１１バリー）　１７Ｍ８５９　（下列＞（１ ）　１６Ｓト２３ＳｒＲＮＡとの間のスペーサー領域の核酸配列アライメントが 示されている。

図９には、ジじ１且（弧旦１幻リーＬ阻駐り阻５９０−５１２２（上列）及び５ ｔｒｅ　ｔｏｃｏｅｅｕｓ　ａ３３上ａｅＬｉａｅ　Ｕ３Ｏ−２８１７（下列） ノ１６５ト２３Ｓ　ｒＲＮ＾との間のスペーサー領域の核酸配列アライメントが 示されている。

図１０には、す１１Ｌし→Ａ忘肋狂−ピ」工Ｉ−＾ＴＣＣ３３５６０（上列）及 びＣａｎ　１ｏｂａｃｔｅｒ　ｃｏｌｉ＾ＴＣＣ３３５５９（下列）の１ｆ５Ｓ と２３Ｓ　ｒＲＮ＾との間のスペーサー領域の２３Ｓ　ｒＲＮ＾近位端の核酸配 列アライメントが示されている。

使用した株は、各々培地コレクション；ＡＴＣＣ：　＾−ｅｒｉｃａｎ　丁ｙｐ ｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ。

ＵＳＡ。

ＣＩＰ　：　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｄｅ　ｌ’１ｎｓｔｉｔｕｔ　Ｐａ５ｔｅ ｕｒ、　Ｐａｒｉｓ、　Ｆｒａｎｃｅ。

ＩＴＭ：　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｒ　Ｔｒｏｐｉｃａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、 ＾ｎｔｗｅｒｐ、Ｂｅ１ｇｉｕｍ。

ＮＣＴＣ：　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　丁ｙｐｅ　Ｃｕ １ｔｕｒｅｓ、ＣｅｎｔｒａｌＰｕｂｌｉｃ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏ ｒｙ、　Ｌｏｎｄｏｎ、　Ｕｎｉｔｅｄ　Ｋｉｎｇｓｏｓ。

から入手し得る。

以下の実施例は、本発明の７０−ブの製造法及び種々のハイブリダイゼーション プロトコルを使用する１０−ブの特異性及び３度に関する実験結果に関する。臨 床に適当な以下の生体：　Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ−１Ｎｅ ｉｓｓｅｒｉａ　ｑした。

実施例は、種−特異性で感度の高いプローブが、研究した総ての生体のスペーサ ー領域に容易に知見されたことを示している。さらに、種−特異性で感度の高い プローブが１６Ｓ及び／または２３Ｓ　ｒＲＮ＾分子に知見されない生体のこの 領域から７０−ブが構築され得ることを示している。使用した方法は、他に記載 しない限り、ＲＯＳＳＡＵらのＪ、Ｇｅｎ、　Ｍｉｃｒ。

ｂｉｏｌ、　；　１３５　：　１７３５−１７４５．１９８９．ｔたは欧州特許 出願第８９４０１０４５．３に記載の方法と本質的に同一である。　ｒＲＮ＾遺 伝子フラグメントの酵素的増幅法及び逆ハイブリダイゼーションを除く総ての方 法は現在当業者に公知である。　１６Ｓ−２３ＳｒＲＮ＾スペーサー領域を広げ るｒＲＮＡ遺伝子フラグメントの酵素的増幅法は、Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　 Ｃｅｔｕｓの＋Ｇｅｎｅ＾−ｐ”キットに推薦される方法に従って実施したポリ メラーゼ原反応法＜ＰＣＲ）により得られた。　ｒＲＮ八分へ中に保存されたま たは半分保存された（ｓｅｍｉ−ｅｏｎｓｅｒｖｅｄ）領域に対応するヌクレオ チドをＰＣＲプライマーとして使用した。逆ドツトープロット法の原理及びプロ トコルは、５ａｉｋｉら（１９８９）により記載されている。

Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎ　１ｔｉｄｉｓ及びＮｅ１ｓｓｅｒｉａ　Ｏｎ Ｏ「「ｈＯｅａｅの両方は、各々髄膜炎及び淋疾に関連する重要なヒト病原体で ある。これらの生体は非常に密接に関連しており、互い及び他のＮｅｌｓｓｅｒ ｉａ種との差別化は閏違い易い、　Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａシ」ユ１１」±ｄｉｓ− 及びＮｅ１ｓｓｅｒｉａ　７−に特異的な［ｌＮ＾プローブは、両方のＮｅｌｓ ｓｅｒｉａ種の間の正しい差別化を速め且つ臨床サンプル中でこれらの種を直接 検出するなめに使用し得る。

Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａむと四エエ九幻１」−を検出するために多くのＤＮＡプロー ブについて記載されてきた（欧州特許出願第０２７２００９号及び同第０３３７ ８９６号、　ＵＲＤＥＡら、　Ｃｌ１ｏ、Ｃｈｅｍ、３５：１５７１−１５７５ ゜１９８９　、ＴｏＴＴＥＮら　、Ｊ、Ｉｎｆｅｅｔ、Ｄｉｓ、１４８　：　４ ６２−４７１．　１９８９　；　ＤＯＮＥＧＡＮら、　Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｐｒ ｏｂｅｓ　３　；　１３−２６．　１９８９　：　ＫＯＬ８ＥＲＧら。

Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｐｒｏｂｅｓ　３：　５９−７２．１９８９）、　Ｌかしな がら、これらのプローブの内の幾つかは、非−Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　７株と交差 するか、感度が高くないことが知見された。これらのグローブは総て１６Ｓ−２ ３Ｓ　ｒＲＮ＾スペーサー頭域由来ではなかった。

Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａシ」ユｆｆ土止り１株を検出するＤＮ＾プローブも報告され た（ＫＯＬＩ３ＥＲＧら、　Ｎｏ１．Ｃｅ１１．　Ｐｒｏｂｅｓ　３　：　５９ −７２．１９８９）。

Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａ　１１４す旦ｒｒｈｏ幻す−のビリン遺伝子から誘導された このプローブも、Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎユ１１」１吏０．に関して非常に 特異性でもなく感度も高くはなかった。

Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａ　む郵立す１幻」！及びＮｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｓｅｎ主譚１ １宣■Σ型株の１６Ｓと２３Ｓ　ｒＲＮ＾遺伝子との間のスペーサー領域の配列 を、スペーサー領域を広げるＰＣＲフラグメント由来のクローン化した物質を使 用して決定した０図３に示されている両方の列から、幾つかの潜在的な１０一プ 配列が明らかになった。

約６０塩基対の予想外の挿入配列を、Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｑ迂迂株のスペーサ ー領域中に検出した。以下の配列：（、ＧＴＣ＾＾ＧＴＧＴ　（、ＡＣ（、ＴＣ ＣＣＣＣＴＧ　Ｎ旧ＩＧＴＴＣＴＴ［；ＧＴＣ＾＾ＧＴＣＴＧＡＣＧ　ＴＣＮ旧 ２を有するオリゴヌクレオチドを、この挿入した配列から誘導した。

（図３のＮｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎ匡７−配列の塩基対３６５〜３８６由来の ）スペーサー領域のもう１つのエリアでも、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｍｅｎｉｎ　１ ｔｉｄｉｓとＮｅ１ｓｓｅｒｉａ　７−との間でがなりの度合いで食い違いが明 らかになった。このエリアから、２ｆｆｉｆｆのオリゴヌクレオチド１０−ブ（ Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　４ｄｉｓ及びＮｅ１ｓｓｅｒｉａ　７−の検出用のＮＭＩ ３及びＮ［ｌ、！１）にＣ［；ＴＴＣにＴＴＡ　ＴＡＧＣＴＡＴＣＴＡ　ＣＴＧ ＴにＣ８１４１３ＣＧＡＴＧＣＧＴＣＧ　ＴＴＡＴＴＣＴＡＣＴ　ＴＣＧＣＮＧ ＩＩが化学的に合成された。

これらのヌクレオチドを、ポリヌクレオチドキナーゼを使用してその５′末端を ３２ｐラベルするか、またはターミナルトランスフェラーゼを使用してその３° 末端でジゴキシゲニン化したＵＴＰと結合して、ハイブリダイゼーションプロー ブとして使用した。ターゲットとして１種々の位置由来細菌（ｂａｃｔｅｒｉａ ｌ　ｔａｘａ）由来の幾つかの株を使用した。

ハイブリダイゼーション−混合物は、：（ｘｓｓｃ、２５−Ｍリン酸カリウムＨ １街液、９Ｈ７、脱イオン化ポルムアミド（２０１゜ｖ／ｖ）、Ｆｉｅｏｌｌ（ ０，０２Ｚ、　ｗ／ｖ）、ウシ血清アルブミ７　（０，ＯＺ＄。

−／Ｖ）、ポリビニルピロリドン（０，０２＄、　ｗ／’ｖ）及びシェア分かけ て変性したサゲ精液ＩＮＮ＾（Ｑ、１ｘｇ／ｌｌ）であるが、または５ＸＳＳＣ の代わりに３ｘ　５ＳＣ（ｌ　Ｘ　ＳＳＣ：　０．１５Ｍ　ＮａＣ１，０，０１ ５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＦＩ７．ｏ）を使用し且つホルムアミドを２ｏｚ（ ｖ／ｖ）まで添加した以外には、非−放射性ＯＮ＾ラベル及び検出キット（Ｂｏ ｅｈｒ：ｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉ−製）のプロトコルシートの溶液であった。

洗浄液は、３ｘＳＳＣ１２０１ホルムアミド及び２５ｗＭリン酸塩緩衝液ｐＨ７ ，１を含んでいた。

ハイブリダイゼーションの結果は、以下の表にまとめられている。各プローブ毎 のハイブリダイゼーション及び洗浄温度は、括弧内に示されている。試験した総 てのプローブは、Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（プローブＮｆ、 Ｉ　１　）または岨５ｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎ　１ｔｉｄｉｓ（プローブＮＭＩ　 １　、　ＮＭＩ　２及びＮＭＩ３）に対し非常に特異性で且つ感度が高かったこ とがＪ明された。１陽性株　／試駿 ＨＩ３及びＮＧＩ３で検出する特異性を、１６Ｓ　ｒＲＮ八遺へ子の３゛末端及 び２３Ｓ　ｒＲＮ八遺へ子の５′末端に各々配置している以下の増幅ズライマー ・ Ｔｆ；ＧＣＴＩ；＾＾ＧＴＣＧＴ＾＾Ｃ＾＾ＧＧＴ＾　＾Ｐ１６ＣＡＣＧＴＣＣ ＴＴＣＧＴＣＧＣＣＴ　ＡＰ２３とのスペーサー領域の酵素的増＠後においても チェックしＢｒａｎｈａｍｅｌｌａ　ｅａｔａｒｒｈａｌｉｓの株由来のゲノム Ｉ）Ｎ＾の１００ナノグラムをＰＣＲ反応に使用した。増幅後、収量の１７１０ をアガロースゲルに装填し、電気泳動させ、ナイロン膜上にプロットした。

続いてこの膜とプローブＮＧＩＩ及びＮＨＩ３でハイブリダイズした。

各々ＮＧｒｌまたはＮＨＩ３を７０−プとして使用したとき、Ｎｅ１ｓｓｅｒｉ ａ　ｏｎｏｒｒｈｏｅａｅまたはＮｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉ ｓ物質が存在するレーンだけにはつきりしたハイブリダイゼーションシグナルが 検出できた。

１１１よ りｏｒｄｅｔｅｌ　ｌａ旧：ｒｔｕｓｓｉｓ−は、百日咳の原因となる因子であ る。再度の予防接種キャンペーンにより、この病気は先進国では殆ど問題ではな い、しかしながら第３世界の国々に於いては、８ｏｒｄｅｔｅｌｌａ　Ｂ工至組 且聾−は、幼児の致死率のトラ非常に関連しているので（ＫＬＯＯ５ら、　Ｉｎ ｔ、Ｊ、５ｙｓｔ、Ｂａｅｔｅｒｉｏｌ。

３１：１７３−１７６．１９８１　、　ＤＥ　ＬＥＹら、Ｉｎｔｊ、５ｙｓｔ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、３６：４０５−４１４．１９８８）、ひとつの遺伝子種に 属するものとして考えるべきである。この遺伝子型の関係は、これらの細菌の他 の多くの特徴にも反映するので、その表現型の差別化が冗長となる。

百日咳の臨床兆候はたいてい非定型であり、検査室診断が必要である。感度が高 く、特異的で迅速な試験はまだ無い、培地には選択方法が残っているが、回収率 は低く且つ結果は通常、接種＠３〜７日しか有効でない（ＦＲＩＥＤＭ＾Ｎ。

Ｃｌ１ｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｒｅｖ、４：３６５−３７６．１９８８　； 　ＨＡＬＰＥＲＩＮら、Ｊ。

Ｃｌ１ｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、２７：７５２−７５７．１９８９）、　ＤＮ＾ プローブベースの分析は、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ　７−感染の診断を非常に改良 し得る。

Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ　ｐｅｒｔｕｓｓｉｓの検出用プローブは１文献＜ＰＡＲ Ｋら、ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｌｅｔ１５２：１９−２４，１９８８　 ；　ＭｃＰＨＥＡＴ及びＭｃＮ＾ＬＬＹ、Ｊ、［；ｅｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、 １３３：３２３−３３０．１９８７及びＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏ−ｂｉｏｌ、Ｌｅ ｔｔ、４］　：３５７−３６０，１９８７　；　ＭｃＬＡＦＦＥＲＴＹら７＾ｂ ｓｔｒａｃｔｓ　ｏｆｔｈｅ　Ａｎｎｕａｌ　Ｍｅｅｔｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　 ＾−ｅｒｉｃａｎ　５ｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　Ｍｉｃｒ。

ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｃ−１６８，１９８６及びＣ−３２２，１９８７）に記載され ている。

ＭｃＬＡＦＦＥＲＴＹら＜１９８１３及び１９８７）に記載のプローブは、特異 性が高くない、記載の他のプローブに関しては、示されたデータは特異性及び感 度の度合いを推論するには不十分である。

以下の株のリポソームＲＮへ遺伝子の一部を酵素的に増幅・し、プラスミドベク ター：　Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ　７＾ＴＣＣ１（１３８０，［１ｏｒｄｅｔｅｌ ｌａ　ａｒｍ　ｅｒｔｕｓｓｉｓ　ＮＣＴＣ５９５２（型株）及びＢｏｒｃｌｅ ｔｅｌｌａ　ｂｒｏｎｃｈユ１υユヱｅａ　ＮＣＴＣ４５２（型株）にクローン 化した１種々の種類のクローン化したフラグメントを、ジデオキシ値停止法を使 用して一部配列し、その配列を比較した。　１６Ｓ　ｒＲＮ＾遺伝子に拘わる配 列情報は、種−特異性プローブが与えられないことを示している（ＲＯＳＳＡｔ ｌら、未発表）。

しかしながら図２のアライメントに示されたように、相同でないエリア（２７１ 塩基対〜約３００）がＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ　７及びＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ　ｂ ｒｏｎｃｈｉｓｅ　ｔｉｅａ株の１６Ｓと２３Ｓ　ｒＲＮ＾遺伝子との間のスペ ーサー領域に知見された。

Ｂｏｒｄｅｔｅｌ　ｌａと■１且幻コニ互釣」−株のスペーサー領域の配列は、 Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ　ｂｒｏｎｃｈｉｓｅ　を上り、配列と大体同一である（ ＲＯＳＳＡＵら、未発表）。

Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａと狂」ユ５ｓｉｓ−のスペーサー領域のヌクレオチド２７ １と２９５との闇のエリアから、以下の配列：ＣＣＡＣＡＣＣＣＡＴ　ＣＣＴＣ ＴにＧＡＣＡ　ＧＧＣＴＴ　ＢＰＩＩを有するオリゴヌクレオチドプローブを誘 導した。

オリゴヌクレオチドプローブを化学合成し、ターミナルトランスフェラーゼを使 用してジゴキシゲニンーＵＴＰでラベルした。ターゲットとしてドツト−スポッ トし、変性したゲノムＤＮ＾で得られた結果を以下の表にまとめた。

分一部長５５℃に　けるＤＰＩＩとのハイブリダイゼーション陽性株数／試験株 数 使用条件下に於いて、プローブＢＰＩＩはＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ　トｎエハイプ リダイゼーション混合物は、５ｘＳＳＣの代わりに３ｘＳＳＣ（Ｉ　Ｘ５ＳＣ： ０．１５Ｍ　Ｎ１ｃ１．０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム。

ｐ）１７．０）を使用し、ホルムアミドと２０１（ｖ／ｖ）まで添加したことを 除いて、非−放射性ＤＮ＾ラベル及び検出キット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａ ｎｎｈｅｉ−製）のプロトコルシートに記載のものと同じであった。洗浄液は３ ｘＳＳＣ１２ｏｚホルムアミド及び２５■Ｈリン酸塩緩衝液ｐＨ７、１を含んで いた。ハイブリダイゼーション及び洗浄温度は５５℃であった。

逆ドツトープロット分析を利用すると、上記表に示されているのと本質的に同一 結果が得られた。この分析は以下のように実施した。

異なる細菌種から得られた種々の株からの細菌ＤＮ＾ｌｎｇを、ジオキシゲニン −１１−ｄＵＴＰ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉ閤）を増幅混合物に 添加して最終濃度４０μＨとした以外には、Ｇｅｎｅ−＾ｍｐキット（Ｐｅｒｋ ｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ）の製造業者により推奨されるように酵素的に増 幅した６プライマー＾Ｐ１６及び＾Ｐ２３（実施例１参照）を用いて全部で５０ ｕ１で３０サイクル（１分／９５℃。

１分７５０℃、１分／７２℃）実施し、その後各ＰＣＲ混合物の５μｌを膜の存 在下にハイブリダイゼーション混合物（上記定義通りの組成物）ｌｘｆに添加し 、これにプローブＢＰＩＩの０．２ｐｏｏｌ、０．０２Ｈｏｌ及び０．００２ｐ ｍｏｌを固定した。ハイブリダイゼーションを５５℃で１時開実施した。洗浄工 程を同一温度で１０分間実施した。非−放射性ＤＮ＾ラベル及び検出キット（Ｂ ｏｅｈｒｉｎＨｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｓ製）に記載の如く検出した。ゲル電気泳 動及び逆ドツトープロットプロトコルを使用する臭化エチジウム染色後に実験し た全サンプル中にはつきりしたバンドを検出したが、もっばらＢｏｒｄｅｔｅｌ ｌａ　７ＤＮ＾が存在するサンプルにはつきりした陽性シグナルが得られな。

犬」１殊ｊ− Ｍｏｒａｘｅｌｌａ　ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓまたはＮｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｃａ ｔａｒｒｈａｌｉｓとも知られるＢｒａｎｈａｍｅｌｌａ　ｃａｔａｒｒｈａｌ ｉｓは、特殊培養基を必要とする生化学的に不活性な細菌である。近年、その重 要な病原体としての潜在能力が認識された。

Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌａ　ｃａＬａｒｒｈａｌｉｓは１重い気道感染症によく含 まれる（ｌ（ＡにＥＲら、　Ｒｅｖ、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｄｉｓ、９：１１４０−１ １４９．１９８７＞。

Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌａ　ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓの診断には、特殊培養基を必 要としない微生物による異常増殖により阻止されるこの生体の培地と、この生体 と口腔内に存在する共動生物（例えば、Ｎｅｌｓｓｅｒｉａ種など）とを区別す るための一組の表現型試験器具とが必要である。

時々、表現型が類似の細菌由来のＢｒａｎｈａｍｅｌｌａ　ｅａｔａｒｒｈａｌ ｉｓを差別化する試験は限られているので、表現型試験は、推定上のＢｒａｎｈ ａｍｅｌｌａ　ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ単離物の識別に関しては決定的ではない （ＲＩＯＵ及びＧＵＩＢＯＵＲＤＥＮＣＨＥ、　Ｄｒｕｇｓ　３１．［補遺３コ ・１−６．１９８６）。分析に基づいたＤＮ＾Ｎａ−ブを使用すると、Ｂｒａｎ ｈａａ＋ｅｌｌａ　ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓの検査室診断とかなり筒素化できる 。未特定ＤＮ＾フラグメントから誘導し、Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｃａｖｉａｅ由 来のＤＮＡで交差ハイブリダイズしたＢｒａｎｈａｍｅｌｌＲＯＹにより記載さ れている（＾ｂｓｔｒａｃｔｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｎｎｕａｌ　Ｍｅｅｔｉｎｇ 　ｏｆ　ｔｈｅ　＾−ｅｒｉｃａｎ　５ｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉ ｏｌｏｇｙ、Ａｂｓｔｒａｃｔ　Ｎｏ、Ｄ−２４９，１９８９＞。

Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌａ　ｃａｔａｒｒｈａｌｉＳＩＴＧ　４１９７のｒＲＮ＾ 遺伝子の一部を、ポリメラーゼ鎖反応法により酵素的に増幅させ、プラスミドベ クターにクローン化した。続いて１６Ｓ−２３５ｒＲＮ＾スペーサー領域と広げ るフラグメントをジデオキシ鎖停止法により配列した。この配列は図７に示され ている（上列）。

配列データより、以下のオリゴヌクレオチド：ＴＡＴＣＡＧ＾＾ＣＣ＾へＧＣＴ ＴＣＣＴ＾　＾ＣＴＴＣＧ丁Ｔ　ＢＣＩ　１を選択し、化学的に合成した。

このオリゴヌクレオチドをその５°末端でポリヌクレオチドキナーゼで３２ｐラ ベルし、ハイブリダイゼーションプローブとして使用した。ターゲットとして、 異なる位１の３１Ｂｒａｎｈａ＋５ｅｌｌａ　ｃａＬａｒｒｈａｌｉｓ株及び他 の細菌分類の１９株のド’７トースポツトした、変性ゲノムＤＮＡを使用した。

ハイブリダイゼーション−混合物は、３ｘ　５ＳＣ（ｌｘ　ＳＳＣ：０．１５Ｍ 　ＮａＣＺ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７，０）、２５−Ｍリン酸 カリウム縛漬液、　ｐＨ７、脱イオン化ボルムアミド＜２０Ｌｖ／ｖ）、Ｆｉｃ ｏｌｌ（０，０２＄、ｗ／ｖ）、ウシ血清アルブミン（０，０２＄、―／Ｖ）、 ポリビニルピロリドン（０，０２＄、ｗ／ｖ）及びシェアをかけた変性したサケ 精液［ＩＮ＾（０，Ｌｘｇ　ｍｌ−’）であった、洗浄液は、３ＸＳＳＣ１２０ ｇホルムアミド及び２５ＭＭ！、／ン６塩！！　ｌ　ＨｐＨ７，１を含んでいた 。ハイブリダイゼーション及び洗浄温度は、３０℃であった。

使用条件下で、１０−ブＢＣＩＩを総てのＢｒａｎｈａ＠ｅｌ　１ａｃａｔａｒ ｒｈａｌ　ｉｓ株にハイブリダイズした。他の細菌種に属する試験した株は総て 、このプローブに対し強いハイプリダイゼーシゴンシグナルと与えた。

試験した非−Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌａ　ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ株は：Ｘａｎｔ ｈｏｍｏｎａｓ　７　ＬＭＧ　５６８であった。

Ｋ藷」」工 （１１性下ｙｆｆ）原因となるＨｇｇｇｇｌ妙ユｂ任、も匹工見四−は、特殊培 養基を必要とするグラム陰性細菌である。この生体の培地は困難で且つ感度が無 いが、依然として、ｂヒ！囚壮ユおリエ←ビニｍ−感染の診断のための選択方法 である。特異性の高いプローブ含使用すると、培地が不要で且つ診断の感度が強 くなる。他のＨａｅｍ幻１ユ乃リー及びＰａ５ｔｅｕｒｅｌ　Ｉａ種と弱い交差 反応性を示し、蛋白質をコードする遺伝子をターゲットとｔ　るｈ」１」曲ユｌ ｕｓ工もビニ１がｍｍのクローン化したＤＮＡプローブは、ＰＡＲＳＯＮＳらに より記載されている（Ｊ、ＣＩ　ｉｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　。

２７：１４４１−１４４５．１９８９）。

Ｈａｅｍｏ　ｈｉｌｕｓ　モ匹工１ｂ−ＣＩＰ　５４２型株のｒＲＮ八遺へ子の 一部をポリメラーゼ研反応により酵素的に増幅し、プラスミドベクターにクロー ン化した。

１６Ｓと２３Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子との間のスペーサー領域の配列は、ジデオキシ 鎖停止法により得られた。核酸配列より、以下のオリゴヌクレオチド： ＣＡＣＣＣＴＴＴ＾＾　ＴＣＣＧ＾＾ＧＡＴＡ　ＴＴＡＣＧ　ＨＤ１１分選択し 、化学的に合成した。

オリゴヌクレオチドをその５゛末端で”Ｐラベルするが、またはターミナルトラ ンスフェラーゼを使用してジゴキシン化ｔｌＴＰとその３゛末端を結合し、ハイ ブリダイゼーションプローブとして使用した。

ターゲツトとして、種々の位置からの４１　ｂ」１逼ｌユ１ｕｓ−（社）ビニｍ −株及び他のバクテリア分類の幾つかの株の、ドツト−スポットした変性したゲ ノムＤＮ＾を使用した。総てのｈＪ上」ｌヱハ＋ｓ　ｄｔ恥工」づ−株にもっば らハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド７０−ブと試験した。

ハイブリダイゼーション−混合物は、５ＸＳＳＣの代わりに３Ｘ　５ＳＣ（Ｉ　 Ｘ　ＳＳＣ：　０．１５Ｍ　ＮａＣ１，０，０１５Ｍクエン酸ナトリウム。

ｐＨ７，０）を使用し、ホルムアミドを２０％（ｖ／ｖ）まで添加したことを除 いて、３ｘＳＳＣ２２５ｍＮリン酸カリウム［Ｉｒ液、ｐｉ（７、脱イオン化ホ ルムアミド（２０！、　Ｖ／Ｖ）、Ｆｉｅｏｌｌ（０，０：’！、　＋ｗ／ｖ） 、ウシ血清アルブミン＜０．０２ｇ、　ｗ／ｖ）、ポリビニルピロリドン（０， ０２！、　ｗ／ｖ）及びシェアをかけて変性したサケ精液ＤＮＡ（０，１ｚｇｚ ｌ−’＞または、非−放射性ＤＮＡラベル及び検出キット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅ ｒ　Ｍａｎｎｈｅｉ−製）のプロトコルシートの溶液であつた。洗浄液は、３Ｘ ＳＳＣ１２０１ホルムアミド及び２５＋＊Ｍ　リン酸塩緩衝液ｐＨ７，１を含ん でいた。ハイブリダイゼーション及び洗浄温度は、４０℃であった。

試験した非−ｂ」！」曲ユ暉捷、もぴ工且１−株は。

艮１１ｉ グラム陰性ｍ菌種！Ｉａｅｓｏ　ｈｉｌｕｓ　１ｎｆｌｕｅｎｚａｅは、２種類 のバイオグループ：　１ｎｆｌｕｅｎｚａｅ及びｍ土すエに分類することができ る（Ｃａｓｉｎら、＾ｎｎ、Ｉｎ５ｔ、Ｐａ５ｔｅｕｒ／Ｈｉｃｒｏｂｉｏ１． １３７Ｂ：１５５−１６３．１９８６）、　１ｎｆｌｕｅｎｚａｅバイオグルー プの生体は、重要な呼吸器道の病原体であり、子供の脳膜炎及び耳炎の原因でも ある。バイオグループ１」１且見１ｕｓ−単離物は、暑い気候では、細菌性結膜 炎の原因として作用する因子であり、ブラジル紫斑熱と関連しているらしい＜Ｂ ｒｅｎｎｅｒら、　Ｊ、Ｃｌ１ｎ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　２６　＋　１５２４−１５３４．１９８８）、分類可能 な及び非−分類可能なり１１幻曲ユυＪＳ　１ｎｆｌｕｅｎｚａｅは、核酸プロ ーブにより迅速に検出され得る。

この種のＤＮＡ１０−ブは、文献に記載されている（Ｔｅｒｐｓｔｒａら、　５ ｃａｎｄ、Ｊ、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｄｉｓ、１９：６４１−６４６．ｌ９８７　；　 Ｍａｌｏｕｉｎら。

Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、２８　：　２１３２−２１３８．１９８８ ）、これらのプローブは１６Ｓ−２３Ｓ　ｒＲＮ＾スペーサー領域から誘導され ているものではない。

）！ａｅｍｏ　ｈｉｌｕｓ　１ｎｆｌｕｅｎｚａｅ　ＮＣＴＣ８１４３型株のｒ ＲＮ＾遺伝子の一部を、ポリメラーゼ鎮反応により酵素的に増幅させ、次いでプ ラスミドベクターにクローン化した。

１６Ｓと２３Ｓ　ｒＲＮ＾遺伝子との間のスペーサー領域の配列がジデオキシ鎖 停止方法により得られた。核酸配列から、以下のオリゴヌクレオチド： ＡＣＧＣＡＴＣＡＡＡ　丁ＴＧＡＣＣＧＣＡＣＴＴ　Ｈｌｌ　１＾ＣＴ丁ＴＧ＾ ＾ＧＴ　Ｇ＾＾＾＾ＣＴＴ＾＾　＾Ｇ　ＩＩＩ　２を選択し、化学的に合成した 。

オリゴヌクレオチドをその５゛末端で”Ｐラベルし、ハイブリダイゼーシヨンプ ローブとして使用した。ターゲットとして、ａ菌の分ＭＮ位のドツト−スポット した。変性したゲノムＯＮ＾を使用した。

両方のプローブを使用したハイブリダイゼーション結果を以下の表にまとめた。

使用したハイブリダイゼーション及び洗浄温度では、１０−プＩ（ＩＩ　１はむ １見ぢ曲ユバ任−１ｎｆｌｕｅｎｚａｅバイオグループ駐ＩＬ■エロー株にハイ ブリダイズしなかった。プローブＩ１１２は、両方のバイオグループの株にハイ ブリダイズした０両方のグローブは、表示温度で、ｆｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｒ　Ｔ ｒｏｐｉｃａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、八ｎｔｗｅｒｐ、Ｂｅ１ｇｕｉｍから得た 他の１５種顛の１ｊユ幻壮より目−１ｎｆ　１ｕｅｎｚａｅバイオグル一プ国旦 弧」！の臨床単離物にもハイブリダイズした。

ハイブリダイゼーション混合物は、３ＸＳＳＣ１２５−Ｍリン酸カリウム緩衝液 、　ｐＨ７、脱イオン化ホルムアミド（２０！。

ｖ／ｖ）、Ｆｉｅｏｌｌ（０，０２ｇ、　ｗ〆Ｖ）、ウシ血清アルブミン（０， ０２ｇ。

−／Ｖ）、ポリビニルピロリドン（０，０２＄、　ｗ／ｖ）及びシェアをかけて 変性したサク精液ＤＮ＾＜０．１ｎｇ　ｘｉ−’）であった、洗浄液は、３ＸＳ ＳＣ１２０ｇホルムアミド及び２５ｍＭ　リン酸塩緩衝液ｐＦＩ７．１を含んで いた。

Ｆｉｇ、　１ Ｆｉｇ、　２ 一−−−−−人（ＪＣＣＡＧ−へＡＧＧＣＧＡＧＡＧＡＧＣＡＡＣＧＴＴＡＧＴ ＧＣＴＧＣＧ入Ｃ↑Ｃ入ＧＴＧ　−３４２Ｆｉｇ、　３ Ｆｉｇ、　４ Ｆｉｇ、　５ ＧＧ？’！’Ｇテ入丁　−４９８ Ｆｉｇ、　６ Ｃ＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− −−−−−−−−−−−−−−−１−−−−−−−−ＣＡＡＡＡＴＡＡ−−−− ＡＧ−−−一人Ｃ−−−−−−−−−−ＡＴＣＡＣ−−−−−−−−１８−一一 一一人ＡＧＴＡ−−−−−−−−−−−−−−−Ｃ？ＣＡＣＡＣＡＧＡＴＰ７− ７’ＧＡＴＴＧＴＴＴＴ　−４８ＡＧＡ＋＋−−ＣＡＡＧＴＣＧ−＋−−−−＋ −−−−−−−−＋−＋＋−−−−−−−＋ＧＡＡＴＡ−−＋＋　−６３ＣＡ’ ｌ’−−−Ｃ’ｍ’−−−−−−一−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− ＡＡＡπＴ−−−−−−−−７ローーーーーーーーーーーーーーーーーーーーＴ ＧＴＣＣＣＣＡＴＣＴＧＴＣ’ｌ’ＡＧＡＧＧＣＣＴＡＧＧＡＣＡＴ　−１０６ ＴＡ’！’　−３４６ Ｆｉｇ、　７ Ｆｉｇ、　８ Ｆｉｇ、　９ ＡＣＡＴＴＧＡＡＡＡＴＴＧＡＡＴＡＴＣＴＡＴＡＴＣＡＡＡＴ−−−−一−− −−−−−−−−−−−−−−−１７６Ｆｉｇ、　ｊＯ ！１一 本発明は、非ウィルス生物、特に原核生物、より特定的には細菌のｒＲＮＡ遺伝 子間のスペーサー領域の少なくとも約１５ヌクレオチド、好ましくは約１５ヌク レオチド〜スペーサー領域のほぼ最大数のヌクレオチド、より好ましくは約１５ 〜約１００ヌクレオチドから構成される非ウィルス微生物検出用プローブに係る 。

補正嘗の写しく翻訳文）提出書（特許法第１３４条の８）平成４年１０月１９不 〜

Claims (40)

【特許請求の範囲】
1. １．非ウイルス生物、特に原核生物、より特定的には細菌のｒＲＮＡ遺伝子間の スペーサー領域の少なくとも約１５ヌクレオチド、好ましくは約１５ヌクレオチ ド〜スペーサー領域のほぼ最大数のヌクレオチド、より好ましくは約１５〜約１ ００ヌクレオチドから構成されるプローブ。
2. ２．検出すべき非ウイルス生物、特に原核生物、より特定的には細菌に固有であ るように選択されたｒＲＮＡ遺伝子間のスペーサー領域、特に１６ＳｒＲＮＡ遺 伝子及び２３ＳｒＲＮＡ遺伝子間のスペーサー領域の配列にハイブリダイズする ために十分相補的なオリゴヌクレオチドを構築する段階を含む方法で得られるよ うなハイブリダイゼーションアッセイ用プローブであって、ｒＲＮＡ遺伝子間の スペーサー領域の前記配列が、 −＊目的生物のｒＲＮＡ遺伝子間のスペーサー領域のヌクレオチド配列を、最近 隣種のｒＲＮＡ遺伝子間のスペーサー領域のヌクレオチド配列と比較し、 ＊最近隣種のうちの少なくとも１種のｒＲＮＡ遺伝子間のスペーサー領域との間 に少なくとも１つのミスマッチを有する目的生物のｒＲＮＡ遺伝子間のスペーサ ー領域の少なくとも約１５ヌクレオチド、好ましくは約１５〜ほぼ最大数のヌク レオチド、より好ましくは約１５〜約１００ヌクレオチドの配列を選択すること により、又は−＊短縮スペーサー領域を得るように、目的生物のｒＲＮＡ遺伝子 間のスペーサー領域からｔＲＮＡ遺伝子及び場合によりシグナル配列を欠失させ 、 ＊少なくとも約１５ヌクレオチド、好ましくは約１５〜スペーサー領域のほぼ最 大数のヌクレオチド、より好ましくは約１５〜約１００ヌクレオチドから構成さ れ且つ目的生物の核酸（ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ｝と特異的にハイブリダイズす ることが可能な特異的ヌクレオチド配列を試行錯誤により決定することにより、 選択されることを特徴とする請求項１に記載のプローブ。
3. ３．−核酸グループ： グループＮＧＩ１： 【配列があります】 グループＮＧＩ２： 【配列があります】 【配列があります】 グループＮＭＩ１： 【配列があります】 グループＮＭＩ２： 【配列があります】 グループＮＭＩ３： 【配列があります】 グループＮＭＩ４： 【配列があります】 グループＮＭＩ５： 【配列があります】 グループＮＭＩ６： 【配列があります】 グループＮＭＩ１： 【配列があります】 グループＢＣＩ１： 【配列があります】 グループＢＣＩ２： 【配列があります】 グループＢＰＩ１： 【配列があります】 グループＨＩＩ１： 【配列があります】 グループＨＩＩ２： 【配列があります】 グループＳＡＩ１： 【配列があります】 グループＳＡＩ２： 【配列があります】 グループＳＡＩ３： 【配列があります】 【配列があります】 グループＳＡＩ４： 【配列があります】 グループＳＰＩ１： 【配列があります】 グループＳＰＩ２： 【配列があります】 グループＳＰＩ３： 【配列があります】 から選択される核酸に属しており且つ１５〜選択された核酸の最大数のヌクレオ チドを含む配列、又は下記の場合のいずれにおいてもプローブが対応する非修飾 配列と同一のＲＮＡ又はＤＮＡ標的とハイブリダイズするという条件下で、 −・夫々の末端のいずれかに１又は数個のヌクレオチドが付加もしくは除去され ているか、 前記配列のいずれかで１個以上のヌクレオチドが置換されているか、 その両方により前記配列のいずれかと異なる変異配列を含むことを特徴とする請 求項１又は２に記載のプローブ。
4. ４．１種以上のＮｅｉｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ株を検出するため のプローブてあって、−核酸グループ： グループＮＧＩ１： 【配列があります】 グループＮＧＩ２： 【配列があります】 から選択される核酸に属しており且つ１５〜選択された核酸の最大数のヌクレオ チドを含む配列、又は下記の場合のいずれにおいてもプローブが対応する非修飾 配列と同一のＲＮＡ又はＤＮＡ標的とハイブリダイズするという条件下で、 −．夫々の末端のいずれかに１又は数個のヌクレオチドが付加もしくは除去され ているか、 前記配列のいずれかで１個以上のヌクレオチドが置換されているか、 その両方により前記配列のいずれかと異なる変異配列を含むことを特徴とするプ ローブ。
5. ５．生物字的サンプル中でＮｅｉｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ株を検 出するための方法であって、場合によりプローブの標的配列を夾叉する（ｆｌａ ｎｋｉｎｇ）２種のプライマー、より好ましくは進化的に高保存性の２種のプラ イマーを介するポリメラーゼ鎖反応を使用して増幅させた検出すべき株の核酸（ ＤＮＡ又はＲＮＡ）を必要に応じて適切な変性条件下でハイブリダイゼーション できるようにしておいた前記生物字的サンプルを、プローブとサンプル中に存在 し得るＮｅｉｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ株の相補的核酸との間のハ イブリダイゼーションを可能にする条件下で請求項４に記載のプローブと接触さ せる段階と、特にサンプル中に存在し得るＮｅｉｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈ ｏｅａｃ株のＤＮＡ及びＲＮＡの両方とハイブリダイズするプローブとの間でハ イブリッドが形成された場合にこれを検出する段階とを含むことを特徴とする方 法。
6. ６．ハイブリダイゼーション媒体が、約３×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ　 ＮａＣｌ，０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、約２５ｍＭのリン 酸緩衝液ｐＨ７．１、２０％脱イオン化ホルムアミド、０．０２％Ｆｉｃｏｌｌ 、０．０２％ウシ血溝アルブミン、０．０２％ポリビニルピロリドン及び約０． １ｍｇ／ｍｌの剪断変性サケ精子ＤＮＡを含有しており、及び／又は洗浄媒体が 、約３×ＳＳＣ、２５ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．１及び２０％脱イオン化ホルム アミドを含有しており、使用されるプローブが請求項４に記載のプローブのいず れかであり、ハイブリダイゼーション温度が約５０℃の範囲及び／又は洗浄温度 が約５０℃の範囲に適宜調節され、特に、前記標的配列と対応する該当ハイブリ ダイゼーション温度（ＨＴ）及び洗浄温度（ＷＴ）が夫々、 【配列があります】 ＨＴ及び／又はＷＴ：５０℃、 【配列があります】 ＨＴ及び／又はＷＴ：５０℃であることを特徴とする請求項５に記載の生物学的 サンプル中でＮｅｉｓｓｅｒｉａｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅを検出するための方法 。
7. ７．生物学的サンプル中で多数、好ましくは全Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒ ｒｈｏｅａｅ株をｉｎ　ｖｉｔｒｏ検出するためのキットであって、 −請求項４に記載のプローブのいずれかから選択された少なくとも１種のプロー ブと、 −これらのプローブと多数、好ましくは全Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈ ｏｅａｅ株のＤＮＡ及び／又はＲＮＡとの間にハイブリダイゼーション反応を生 じさせることが可能な緩衝液又は該緩衝液を生成するために必要な成分と、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブリッドを適時検出するた めの手段とを含むか、又は−同一核酸分子を標的にし、少なくとも１種がＮｅｉ ｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅに対して特異的であり且つ請求項４に記 載のプローブのいずれか１種から選択された少なくとも２種のプローブと、 −これらのプローブとＮｅｉｓｓｅｒｉｌａ　ｇｏｎｏｒｒｈｏｃａｅ株のＤＮ Ａ及び／又はＲＮＡとの間にハイブリダイゼーション反応を生じさせることが可 能な緩衝液又は該緩衝液を生成するために必要な成分と、−前記ハイブリダイゼ ーションにより形成されたハイブリッドを適時検出するための手段とを含むか、 又は−固体支持体に固定された請求項４に記載のプローブのいずれかから選択さ れた少なくとも１種のプローブと、−該プローブの標的配列を含むＤＮＡ及び／ 又はＲＮＡの酵素的増幅を適時実施するために必要なプライマーと、−酵素的増 幅が可能であり及び／又はこれらのプローブとＮｅｉｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒ ｒｈｏｅａｅ株のＤＮＡ及び／又はＲＮＡとの間にハイブリダイゼーション反応 を生じさせることが可能な緩衝液又は該緩衝液を生成するために必要な成分と、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブリッドを適時検出するた めの手段とを含むことを特徴とするキット。
8. ８．１種以上のＮｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｌｓ株を検出するた めのプローブであって、−核酸グループ： グループＮＭＩ１： 【配列があります】 グループＮＭＩ２： 【配列があります】 グループＮＭＩ３： 【配列があります】 グループＮＭＩ４： 【配列があります】 グループＮＭＩ５： 【配列があります】 グループＮＭＩ６： 【配列があります】 から選択される核酸に属しており且つ１５〜選択された核酸の最大数のヌクレオ チドを含む配列、又は下記の場合のいずれにおいてもプローブが対応する非修飾 配列と同一のＲＮＡ又はＤＮＡ標的とハイブリダイズするという条件下で、 −・夫々の末端のいずれかに１又は数個のヌクレオチドが付加もしくは除去され ているか、 前記配列のいずれかで１個以上のヌクレオチドが置換されているか、 その両方により前記配列のいずれかと異なる変異配列を含むことを特徴とするプ ローブ。
9. ９．生物字的サンプル中でＮｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株を 検出するための方法てあって、場合によりプローブの標的配列を夾叉する２種の プライマー、より好ましくは進化的に高保存性の２種のプライマーを介するポリ メラーゼ鎖反応を使用して増幅させた検出すべき株の核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ） を必要に応じて適切な変性条件下でハイブリダイゼーションできるようにしてお いた前記生物学的サンプルを、プローブとサンプル中に存在し得るＮｅｉｓｓｅ ｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｓ株の相補的核酸との間のハイブリダイゼーショ ンを可能にする条件下で請求項８に記載のプローブと接触させる段階と、特にサ ンプル中に存在し得るＮｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株のＤＮ Ａ及びＲＮＡの両方とハイブリダイズするプローブとの間でハイブリッドが形成 された場合にこれを検出する段階とを含むことを特徴とする方法。
10. １０．ハイブリダイゼーション媒体が、約３×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ 　ＮａＣ１，０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、約２５ｍＭのリ ン酸緩衝液ｐＨ７．１、２０％脱イオン化ホルムアミド、０．０２％Ｆｉｃｏｌ ｌ、０．０２％ウシ血清アルブミン、０．０２％ポリビニルピロリドン及び約０ ．１ｍｇ／ｍｌの剪断変性サケ精子ＤＮＡを含有しており、及び／又は洗浄媒体 が、約３×ＳＳＣ、２５ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．１及び２０％脱イオン化ホル ムアミドを含有しており、使用されるプローブが請求項８に記載のプローブのい ずれかであり、ハイブリダイゼーション温度が約４０〜５８℃の範囲及び／又は 洗浄温度が約４０〜５８℃の範囲に適宜調節され、特に、前記標的配列と対応す る該当ハイブリダイゼーション温度（ＨＴ）及び洗浄温度（ＷＴ）が夫々、【配 列があります】 ＨＴ及び／又はＷＴ：４５℃、 【配列があります】 ＨＴ及び／又はＷＴ：４５℃、 【配列があります】 ＨＴ及び／又はＷＴ：４０℃、 【配列があります】 ＨＴ及び／又はＷＴ：４８℃、 【配列があります】 ＨＴ及び／又はＷＴ：５８℃、 【配列があります】 ＨＴ及び／又はＷＴ：５０℃であることを特徴とする請求項５に記載の生物学的 サンプル中でＮｅｉｓｓｅｒｉａｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓを検出するための方 法。
11. １１．生物学的サンプル中で多数、好ましくは全Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉ ｎｇｉｔｉｄｉｓ株をｉｎ　Ｖｉｔｒｏ検出するためのキットであっと、 −請求項８に記載のプローブのいずれかから選択された少なくとも１種のプロー ブと、 −これらのプローブと多数、好ましくは全Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉ ｔｉｄｉｓ株のＤＮＡ及び／又はＲＮＡとの間にハイブリダイゼーション反応を 生じさせることが可能な緩衝液又は該緩衝液を生成するために必要な成分と、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブリッドを適時検出するた めの手段とを含むか、又は−同一核酸分子を標的にし、少なくとも１種がＮｅｉ ｓｓｅｒｉｌａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに対して特異的であり且つ請求項８ に記載のプローブのいずれか１種から選択された少なくとも２種のプローブと、 −これらのプローブとＮｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株のＤＮ Ａ及び／又はＲＮＡとの間にハイブリダイゼーション反応を生じさせることが可 能な緩衝液又は該緩衝液を生成するために必要な成分と、−前記ハイブリダイゼ ーションにより形成されたハイブリッドを適時検出するための手段とを含むか、 又は−固体支持体に固定された請求項４に記載のプローブのいずれかから選択さ れた少なくとも１種のプローブと、−該プローブの標的配列を含むＤＮＡ及び／ 又はＲＮＡの酵素的増幅を適時実施するために必要なプライマーと、−酵素的増 幅が可能であり及び／又はこれらのプローブとＮｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎ ｇｉｔｉｄｉｓ株のＤＮＡ及び／又はＲＮＡとの間にハイブリダイゼーション反 応を生じさせることが可能な緩衝液又は該緩衝液を生成するために必要な成分と 、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブリッドを適時検出するた めの手段とを含むことを特徴とするキット。
12. １２．１種以上のＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｄｕｃｒｅｖｉ株を検出するための プローブであって、−核酸グループ： グループＨＤＩ１： 【配列があります】 から選択される核酸に属しており且つ１５〜選択された核酸の最大数のヌクレオ チドを含む配列、又は下記の場合のいずれにおいてもプローブが対応する非修飾 配列と同一のＲＮＡ又はＤＮＡ標的とハイブリダイズするという条件下で、 −・夫々の末端のいずれかに１又は数個のヌクレオチドが付加もしくは除去され ているか、 前記配列のいずれかで１個以上のヌクレオチドが置換されているか、 その両方により前記配列のいずれかと異なる変異配列を含むことを特徴とするプ ローブ。
13. １３．生物学的サンプル中でＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｄｕｃｒｅｙｉ株を検出す るための方法てあって、場合によりプローブの標的配列を夾叉する２種のプライ マー、より好ましくは進化的に高保存性の２種のプライマーを介するポリメラー ゼ鎖反応を使用して増幅させた検出すべき株の核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を必要 に応じて適切な変性条件下でハイブリダイゼーションできるようにしておいた前 記生物学的サンプルを、プローブとサンプル中に存在し得るＨａｅｍｏｐｈｉｌ ｕｓ　ｄｕｃｒｅｙｉ株の相補的核酸との間のハイブリダイゼーションを可能に する条件下で請求項１２に記載のプローブと接触させる段階と、特にサンプル中 に存在し得るＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｄｕｃｒｅｙｉ株のＤＮＡ及びＲＮＡの 両方とハイブリダイズするプローブとの間でハイブリッドが形成された場合にこ れを検出する段階とを含むことを特徴とする方法。
14. １４．ハイブリダイゼーション媒体が、約３×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ 　ＮａＣｌ，０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、約２５ｍＭのリ ン酸緩衝液ｐＨ７．１、２０％脱イオン化ホルムアミド、０．０２％Ｆｉｃｏｌ ｌ、０．０２％ウシ血清アルブミン、０．０２％ポリビニルピロリドン及び約０ ．１ｍｇ／ｍｌの剪断変性サケ精子ＤＮＡを含有しており、及び／又は洗浄媒体 が、約３×ＳＳＣ、２５ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．１及び２０％脱イオン化ホル ムアミドを含有しており、使用されるプローブが請求項１２に記載のプローブの いずれかであり、ハイブリダイゼーション温度が約４０℃の範囲及び／又は洗浄 温度が約４０℃の範囲に適宜調節され、特に、前記標的配列と対応する該当ハイ ブリダイゼーション温度（ＨＴ）及び洗浄温度（ＷＴ）が夫々、 【配列があります】 ＨＴ及び／又はＷＴ：４０℃であることを特徴とする請求項１３に記載の生物学 的サンプル中でＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｄｕｃｒｅｙｉを検出するための方法 。
15. １５．生物学的サンプル中で多数、好ましくは全Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｄｕ ｃｒｅｙｉ株をｉｎ　Ｖｉｔｒｏ検出するためのキットであって、 −請求項１２に記載のプローブのいずれかから選択された少なくとも１種のプロ ーブと、 −これらのプローブと多数、好ましくは全Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｄｕｃｒｅ ｙｉ株のＤＮＡ及び／又はＲＮＡとの間にハイブリダイゼーション反応を生じさ せることが可能な緩衝液又は該緩衝液を生成するために必要な成分と、−前記ハ イブリダイゼーションにより形成されたハイブリッドを適時検出するための手段 とを含むか、又は−同一核酸分子を標的にし、少なくとも１種がＨａｅｍｏｐｈ ｉｌｕｓ　ｄｕｃｒｅｙｉに対して特異的であり且つ請求項１２に記載のプロー ブのいずれか１種から選択された少なくとも２種のプローブと、 −これらのプローブとＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｄｕｃｒｅｙｉ株のＤＮＡ及び ／又はＲＮＡとの間にハイブリダイゼーション反応を生じさせることが可能な緩 衝液又は該緩衝液を生成するために必要な成分と、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブリッドを適時検出するた めの手段とを含むか、又は−固体支持体に固定された請求項１２に記載のプロー ブのいずれかから選択された少なくとも１種のプローブと、−該プローブの標的 配列を含むＤＮＡ及び／又はＲＮＡの酵素的増幅を適時実施するために必要なプ ライマーと、−酵素的増幅が可能であり及び／又はこれらのプローブとＨａｅｍ ｏｐｈｉｌｕｓ　ｄｕｃｒｄｙｉ株のＤＮＡ及び／又はＲＮＡとの間にハイブリ ダイゼーション反応を生じさせることが可能な緩衝液又は該緩衝液を生成するた めに必要な成分と、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブリッドを適時検出するた めの手段とを含むことを特徴とするキット。
16. １６．１種以上のＢｒａｎｈａｍｅｌｌａ　ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ株を検出す るためのプローブであって、−核酸グループ： グループＢＣＩ１： 【配列があります】 グループＢＣＩ２： 【配列があります】 から選択される核酸に属しており且つ１５〜選択された核酸の最大数のヌクレオ チドを含む配列、又は下記の場合のいずれにおいてもプローブが対応する非修飾 配列と同一のＲＮＡ又はＤＮＡ標的とハイブリダイズするという条件下で、 −．夫々の末端のいずれかに１又は数個のヌクレオチドが付加もしくは除去され ているか、 前記配列のいずれかで１個以上のヌクレオチドが置換されているか、 その両方により前記配列のいずれかと異なる変異配列を含むことを特徴とするプ ローブ。
17. １７．生物学的サンプル中でＢｒａｎｈａｍｅｌｌａ　ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ 株を検出するための方法てあって、場合によりプローブの標的配列を夾叉する２ 種のプライマー、より好ましくは進化的に高保存性の２種のプライマーを介する ポリメラーゼ鎖反応を使用して増幅させた検出すべき株の核酸（ＤＮＡ又はＲＮ Ａ）を必要に応じて適切な変性条件下でハイブリダイゼーションできるようにし ておいた前記生物学的サンプルを、プローブとサンプル中に存在し得るＢｒａｎ ｈａｍｅｌｌａ　ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ株の相補的核酸との間のハイブリダイ ゼーションを可能にする条件下で請求項１６に記載のプローブと接触させる段階 と、特にサンプル中に存在し得るＢｒａｎｈａｍｅｌｌａ　ｃａｔａｒｒｈａｌ ｉｓ株のＤＮＡ及びＲＮＡの両方とハイブリダイズするプローブとの間でハイブ リッドが形成された場合にこれを検出する段階とを含むことを特徴とする方法。
18. １８．ハイブリダイゼーション媒体が、約３×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ 　ＮａＣ１，０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７，０）、約２５ｍＭのリ ン酸緩衝液ｐＨ７．１、２０％脱イオン化ホルムアミド、０．０２％Ｆｉｃｏｌ ｌ、０．０２％ウシ血清アルブミン、０．０２％ポリビニルピロリドン及び約０ ．１ｍｇ／ｍｌの剪断変性サケ精子ＤＮＡを含有しており、及び／又は洗浄媒体 が、約３×ＳＳＣ、２５ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．１及び２０％脱イオン化ホル ムアミドを含有しており、使用されるプローブが請求項１６に記載のプローブの いずれかであり、ハイブリダイゼーション温度が約３０〜４２℃の範囲及び／又 は洗浄温度が約３０〜４２℃の範囲に適宜調節され、特に、前記標的配列と対応 する該当ハイブリダイゼーション温度（ＨＴ）及び洗浄温度（ＷＴ）が夫々、【 配列があります】 ＨＴ及び／又はＷＴ：３０℃ 【配列があります】 ＨＴ及び／又はＷＴ：４２℃であることを特徴とする請求項１７に記載の生物学 的サンプル中でＢｒａｎｈａｍｅｌｌａ　ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓを検出するた めの方法。
19. １９．生物学的サンプル中で多数、好ましくは全Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌａ　ｃａ ｔａｒｒｈａｌｉｓ株をｉｎ　ｖｉｔｒｏ検出するためのキットであって、−請 求項１６に記載のプローブのいずれかから選択された少なくとも１種のプローブ と、 −これらのプローブと多数、好ましくは全Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌａ　ｃａｔａｒ ｒｈａｌｉｓ株のＤＮＡ及び／又はＲＮＡとの間にハイブリダイゼーション反応 を生じさせることが可能な緩衝液又は該緩衝液を生成するために必要な成分と、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブリッドを適時検出するた めの手段とを含むか、又は−同一核酸分子を標的にし、少なくとも１種がＢｒａ ｎｈａｍｅｌｌａ　ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓに対して特異的であり且つ請求項１ ６に記載のプローブのいずれか１種から選択された少なくとも２種のプローブと 、−これらのプローブとＢｒａｎｈａｍｅｌｌａ　ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ株の ＤＮＡ及び／又はＲＮＡとの間にハイブリダイゼーション反応を生じさせること が可能な緩衝液又は該緩衝液を生成するために必要な成分と、−前記ハイブリダ イゼーションにより形成されたハイブリッドを適時検出するための手段とを含む か、又は−固体支持体に固定された請求項１６に記載のプローブのいずれかから 選択された少なくとも１種のプローブと、−該プローブの標的配列を含むＤＮＡ 及び／又はＲＮＡの酵素的増幅を適時実施するために必要なプライマーと、−酵 素的増幅が可能であり及び／又はこれらのプローブとＢｒａｎｈａｍｅｌｌａ　 ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ株のＤＮＡ及び／又はＲＮＡとの間にハイブリダイゼー ション反応を生じさせることが可能な緩衝液又は該緩衝液を生成するために必要 な成分と、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブリッドを適時検出するた めの手段とを含むことを特徴とするキット。
20. ２０．１種以上のＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ　ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ株を検出するため のプローブてあって、−核酸グループ： グループＢＰＩ１： 【配列があります】 から選択される核酸に属しており且つ１５〜選択された核酸の最大数のヌクレオ チドを含む配列、又は下記の場合のいずれにおいてもプローブが対応する非修飾 配列と同一のＲＮＡ又はＤＮＡ標的とハイプリダイズするという条件下で、 −．夫々の末端のいずれかに１又は数個のヌクレオチドが付加もしくは除去され ているか、 前記配列のいずれかで１個以上のヌクレオチドが置換されているか、 その両方により前記配列のいずれかと異なる変異配列を含むことを特徴とするプ ローブ。
21. ２１．生物学的サンプル中でＢｏｒｄｅｔｅｌｉａ　ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ株を検 出するための方法であって、場合によりプローブの標的配列を夾叉する２種のプ ライマー、より好ましくは進化的に高保存性の２種のプライマーを介するポリメ ラーゼ鎖反応を使用して増幅させた検出すべき株の核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を 必要に応じて適切な変性条件下でハイブリダイゼーションできるようにしておい た前記生物学的サンプルを、プローブとサンプル中に存在し得るＢｏｒｄｅｔｅ ｌｌａ　ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ株の相補的核酸との間のハイブリダイゼーションを 可能にする条件下で請求項２０に記載のプローブと接触させる段階と、特にサン プル中に存在し得るＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ　ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ株のＤＮＡ及び ＲＮＡの両方とハイブリダイズするプローブとの間でハイブリッドが形成された 場合にこれを検出する段階とを含むことを特徴とする方法。
22. ２２．ハイブリダイゼーション媒体が、約３×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ 　ＮａＣｌ，０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、約２５ｍＭのリ ン酸緩衝液ｐＨ７．１、２０％脱イオン化ホルムアミド、０．０２％Ｆｉｃｏｌ ｌ、０．０２％ウシ血清アルブミン、０．０２％ポリビニルピロリドン及び約０ ．１ｍｇ／ｍｌの剪断変性サケ精子ＤＮＡを含有しており、及び／又は洗浄媒体 が、約３×ＳＳＣ、２５ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．１及び２０％脱イオン化ホル ムアミドを含有しており、使用されるプローブが請求項２０に記載のプローブの いずれかであり、ハイブリダイゼーション温度が約５５℃の範囲及び／又は洗浄 温度が約５５℃の範囲に適宜調節され、待に、前記標的配列と対応する該当ハイ ブリダイゼーション温度（ＨＴ）及び洗浄温度（ＷＴ）が夫々、 【配列があります】 ＨＴ及び／又はＷＴ：５５℃であることを特徴とする請求項２１に記載の生物学 的サンプル中でＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ　ｐｅｒｔｕｓｓｉｓを検出するための方 法。
23. ２３．生物学的サンプル中で多数、好ましくは全Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ　ｐｅｒ ｔｕｓｓｉｓ株をｉｎ　ｖｉｔｒｏ検出するためのキットであって、 −請求項２０に記載のプローブのいずれかから選択された少なくとも１種のプロ ーブと、 −これらのプローブと多数、好ましくは全Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ　ｐｅｒｔｕｓ ｓｉｓ株のＤＮＡ及び／又はＲＮＡとの間にハイブリダイゼーション反応を生じ させることが可能な緩衝液又は該緩衝液を生成するために必要な成分と、−前記 ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブリッドを適時検出するための手 段とを含むか、又は−同一核酸分子を標的にし、少なくとも１種がＢｏｒｄｅｔ ｅｌｌａ　ｐｅｒｔｕｓｓｉｓに対して特異的であり且つ請求項２０に記載のプ ローブのいずれか１種から選択された少なくとも２種のプローブと、 −これらのプローブとＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ　ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ株のＤＮＡ及 び／又はＲＮＡとの間にハイブリダイゼーション反応を生じさせることが可能な 緩衝液又は該緩衝液を生成するために必要な成分と、−前記ハイブリダイゼーシ ョンにより形成されたハイブリッドを適時検出するための手段とを含むか、又は −固体支持体に固定された請求項２０に記載のプローブのいずれかから選択され た少なくとも１種のプローブと、−該プローブの標的配列を含むＤＮＡ及び／又 はＲＮＡの酵素的増幅を適時実施するために必要なプライマーと、−酵素的増幅 が可能であり及び／又はこれらのプローブとＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ　ｐｅｒｔｕ ｓｓｉｓ株のＤＮＡ及び／又はＲＮＡとの間にハイブリダイゼーション反応を生 じさせることが可能な緩衝液又は該緩衝液を生成するために必要な成分と、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブリッドを適時検出するた めの手段とを含むことを特徴とするキット。
24. ２４．１種以上のＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ株を検出する ためのプローブであって、一核酸グループ： グループＨＩＩ１： 【配列があります】 グループＨＩＩ２： 【配列があります】 から選択される核酸に属しており且つ１５〜選択された核酸の最大数のヌクレオ チドを含む配列、又は下記の場合のいずれにおいてもプローブが対応する非修飾 配列と同一のＲＮＡ又はＤＮＡ標的とハイブリダイズするという条件下で、 −・夫々の末端のいずれかに１又は数個のヌクレオチドが付加もしくは除去され ているか、 前記配列のいずれかで１個以上のヌクレオチドが置換されているか、 その両方により前記配列のいずれかと異なる変異配列を含むことを特徴とするプ ローブ。
25. ２５．生物学的サンプル中でＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ株 を検出するための方法であって、場合によりプローブの標的配列を夾叉する２種 のプライマー、より好ましくは進化的に高保存性の２種のプライマーを介するポ リメラーゼ鎖反応を使用して増幅させた検出すべき株の核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ ）を必要に応じて適切な変性条件下でハイブリダイゼーションできるようにして おいた前記生物学的サンプルを、プローブとサンプル中に存在し得るＨａｅｍｏ ｐｈｉｌｕｓ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ株の相補的核酸との間のハイブリダイゼー ションを可能にする条件下で請求項２４に記載のプローブと接触させる段階と、 特にサンプル中に存在し得るＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ株 のＤＮＡ及びＲＮＡの両方とハイブリダイズするプローブとの間でハイブリッド が形成された場合にこれを検出する段階とを含むことを特徴とする方法。
26. ２６．ハイブリダイゼーション媒体が、約３×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ 　ＮａＣｌ，０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、約２５ｍＭのリ ン酸緩衝液ｐＨ７．１、２０％脱イオン化ホルムアミド、０．０２％Ｆｉｃｏｌ ｌ、０．０２％ウシ血清アルブミン、０．０２％ポリビニルピロリドン及び約０ ．１ｍｇ／ｍｌの剪断変性サケ精子ＤＮＡを含有しており、及び／又は洗浄媒体 が、約３×ＳＳＣ、２５ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．１及び２０％脱イオン化ホル ムアミドを含有しており、使用されるプローブが請求項２４に記載のプローブの いずれかであり、ハイブリダイゼーション温度が約３５〜５５℃の範囲及び／又 は洗浄温度が約３５〜５５℃の範囲に適宜調節され、特に、前記標的配列と対応 する該当ハイブリダイゼーション温度（ＨＴ）及び洗浄温度（ＷＴ）が夫々、【 配列があります】 ＨＴ及び／又はＷＴ：５５℃、 【配列があります】 ＨＴ及び／又はＷＴ：３５℃であることを特徴とする請求項２５に記載の生物学 的サンプル中でＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅを検出するため の方法。
27. ２７．生物学的サンプル中で多数、好ましくは全Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｉｎ ｆｌｕｅｎｚａｅ株をｉｎ　ｖｌｔｒｏ検出するためのキットであって、 −請求項２４に記載のプローブのいずれかから選択された少なくとも１種のプロ ーブと、 −これらのプローブと多数、好ましくは全Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｉｎｆｌｕ ｅｎｚａｅ株のＤＮＡ及び／又はＲＮＡとの間にハイブリダイゼーション反応を 生じさせることが可能な緩衝液又は該緩衝液を生成するために必要な成分と、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブリッドを適時検出するた めの手段とを含むか、又は−同一核酸分子を標的にし、少なくとも１種がＨａｅ ｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅに対して特異的であり且つ請求項２４ に記載のプローブのいずれか１種から選択された少なくとも２種のプローブと、 −これらのプローブとＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ株のＤＮ Ａ及び／又はＲＮＡとの間にハイブリダイゼーション反応を生じさせることが可 能な緩衝液又は該緩衝液を生成するために必要な成分と、−前記ハイブリダイゼ ーションにより形成されたハイブリッドを適時検出するための手段とを含むか、 又は−固体支持体に固定された請求項２４に記載のプローブのいずれかから選択 された少なくとも１種のプローブと、−該プローブの標的配列を含むＤＮＡ及び ／又はＲＮＡの酵素的増幅を適時実施するために必要なプライマーと、−酵素的 増幅が可能であり及び／又はこれらのプローブとＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｉｎ ｆｌｕｅｎｚａｅ株のＤＮＡ及び／又はＲＮＡとの間にハイブリダイゼーション 反応を生しさせることが可能な緩衝液又は該緩衝液を生成するために必要な成分 と、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブリッドを適時検出するた めの手段とを含むことを特徴とするキット。
28. ２８．１種以上のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ株を検出 するためのプローブであって、−核酸グループ： グループＳＰＩ１： 【配列があります】 グループＳＰＩ２： 【配列があります】 グループＳＰＩ３： 【配列があります】 から選択される核酸に属しており且つ１５〜選択された核酸の最大数のヌクレオ チドを含む配列、又は下記の場合のいずれにおいてもプローブが対応する非修飾 配列と同一のＲＮＡ又はＤＮＡ標的とハイブリダイズするという条件下で、 −・夫々の末端のいずれかに１又は数個のヌクレオチドが付加もしくは除去され ているか、 前記配列のいずれかで１個以上のヌクレオチドが置換されているか、 その両方により前記配列のいずれかと異なる変異配列を含むことを特徴とするプ ローブ。
29. ２９．生物学的サンプル中でＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ 株を検出するための方法であって、場合によりプローブの標的配列を夾叉する２ 種のプライマー、より好ましくは進化的に高保存性の２種のプライマーを介する ポリメラーゼ鎖反応を使用して増幅させた検出すべき株の核酸（ＤＮＡ又はＲＮ Ａ）を必要に応じて適切な変性条件下でハイブリダイゼーションできるようにし ておいた前記生物学的サンプルを、プローブとサンプル中に存在し得るＳｔｒｅ ｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ株の相補的核酸との間のハイブリダ イゼーシヨンを可能にする条件下で請求項２８に記載のプローブと接触させる段 階と、特にサンププル中に存在し得るＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍ ｏｎｉａｅ株のＤＮＡ及びＲＮＡの両方とハイブリダイズするプローブとの間で ハイブリッドが形成された場合にこれを検出する段階とを含むことを特徴とする 方法。
30. ３０．ハイブリダイゼーション媒体が、約３×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ 　ＮａＣｌ，０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、約２５ｍＭのリ ン酸緩衝液ｐＨ７．１、２０％脱イオン化ホルムアミド、０．０２％Ｆｉｃｏｌ ｌ、０．０２％ウシ血清アルブミン、０．０２％ポリビニルピロリドン及び約０ ．１ｍｇ／ｍｌの剪断変性サケ精子ＤＮＡを含有しており、及び／又は洗浄媒体 が、約３×ＳＳＣ、２５ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．１及び２０％脱イオン化ホル ムアミドを含有しており、使用されるプローブが請求項２４に記載のプローブの いずれかであり、ハイブリダイゼーション温度が約４５℃の範囲及び／又は洗浄 温度が約４５℃の範囲に適宜調節され、特に、前記標的配列と対応する該当ハイ ブリダイゼーション温度（ＨＴ）及び洗浄温度（ＷＴ）が夫々、 【配列があります】 ＨＴ及び／又はＷＴ：４５℃、 【配列があります】 ＨＴ及び／又はＷＴ：４５℃、 【配列があります】 ＨＴ及び／又はＷＴ：４５℃であることを特徴とする請求項２９に記載の生物学 的サンプル中でＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを検出する ための方法。
31. ３１．生物学的サンプル中で多数、好ましくは全Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　 ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ株をｉｎ　ｖｉｔｒｏ検出するためのキットであって、− 請求項２８に記載のプローブのいずれかから選択された少なくとも１種のプロー ブと、 −これらのプローブと多数、好ましくは全Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅ ｕｍｏｎｉａｅ株のＤＮＡ及び／又はＲＮＡとの間にハイブリダイゼーション反 応を生じさせることが可能な緩衝液又は該緩衝液を生成するために必要な成分と 、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブリッドを適時検出するた めの手段とを含むか、又は−同一核酸分子を標的にし、少なくとも１修がＳｔｒ ｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対して特異的であり且つ請求項 ２８に記載のプローブのいずれか１種から選択された少なくとも２種のプローブ と、−これらのプローブとＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ 株のＤＮＡ及び／又はＲＮＡとの間にハイブリダイゼーション反応を生じさせる ことが可能な緩衝液又は該緩衝液を生成するために必要な成分と、−前記ハイブ リダイゼーションにより形成されたハイブリッドを適時検出するための手段とを 含むか、又は−固体支持体に固定された請求項２８に記載のプローブのいずれか から選択された少なくとも１種のプローブと、−該プローブの標的配列を含むＤ ＮＡ及び／又はＲＮＡの酵素的増幅を適時実施するために必要なプライマーと、 −酵素的増幅が可能であり及び／又はこれらのプローブとＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃ ｃｕｓｐｎｕｅｍｏｎｉａｅ株のＤＮＡ及び／又はＲＮＡとの間にハイブリダイ ゼーション反応を生じさせることが可能な緩衝液又は該緩衝液を生成するために 必要な成分と、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブリッドを適時検出するた めの手段とを含むことを特徴とするキット。
32. ３２．１種以上のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｇａｌａｃｔｉａｅ株を検出 するためのプローブてあって、−核酸グループ： グループＳＡＩ１： 【配列があります】 グループＳＡＩ２： 【配列があります】 グループＳＡＩ３： 【配列があります】 クループＳＡＩ４： 【配列があります】 から選択される核酸に属しており且つ１５〜選択された核酸の最大数のヌクレオ チドを含む配列、又は下記の場合のいずれにおいてもプローブが対応する非修飾 配列と同一のＲＮＡ又はＤＮＡ標的とハイブリダイズするという条件下で、 −．夫々の末端のいずれかに１又は数個のヌクレオチドが付加もしくは除去され ているか、 前記配列のいずれかで１個以上のヌクレオチドが置換されているか、 その両方により前記配列のいずれかと異なる変異配列を含むことを特徴とするプ ローブ。
33. ３３．生物学的サンプル中でＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｇａｌａｃｔｉａ ｅ株を検出するための方法であって、場合によりプローブの標的配列を夾叉する ２種のプライマー、より好ましくは進化的に高保存性の２種のプライマーを介す るポリメラーゼ鎖反応を使用して増幅させた検出すべき株の核酸（ＤＮＡ又はＲ ＮＡ）を必要に応じて適切な変性条件下でハイブリダイゼーションできるように しておいた前記生物学的サンプルを、プローブとサンプル中に存在し得るＳｔｒ ｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｇａｌａｃｔｉａｅ株の相補的核酸との間のハイブリ ダイゼーシヨンを可能にする条件下で請求項３２に記載のプローブと接触させる 段階と、特にサンプル中に存在し得るＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｇａｌａ ｃｔｉａｅ株のＤＮＡ及びＲＮＡの両方とハイブリダイズするプローブとの間で ハイブリッドが形成された場合にこれを検出する段階とを含むことを特徴とする 方法。
34. ３４．ハイブリダイゼーション媒体が、約３×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ 　ＮａＣｌ，０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、約２５ｍＭのリ ン酸緩衝液ｐＨ７．１、２０％脱イオン化ホルムアミド、０．０２％Ｆｉｃｏｌ ｌ、０．０２％ウシ血清アルブミン、０．０２％ポリビニルピロリドン及び約０ ．１ｍｇ／ｍｌの剪断変性サケ精子ＤＮＡを含有しており、及び／又は洗浄媒体 が、約３×ＳＳＣ、２５ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．１及び２０％脱イオン化ホル ムアミドを含有しており、使用されるプローブが請求項３２に記載のプローブの いずれかであり、ハイブリダイゼーション温度が約３５〜４５℃の範囲及び／又 は洗浄温度が約３５〜４５℃の範囲に適宜調節され、特に、前記標的配列と対応 する該当ハイブリダイゼーション温度（ＨＴ）及び洗浄温度（ＷＴ）が夫々、【 配列があります】 ＨＴ及び／又はＷＴ：３５℃、 【配列があります】 ＨＴ及び／又はＷＴ：４５℃、 【配列があります】 ＨＴ及び／又はＷＴ：４５℃、 【配列があります】 ＨＴ及び／又はＷＴ：３７であることを特徴とする請求項３３に記載の生物字的 サンププル中でＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｇａｌａｃｔｉａｅを検出する ための方法。
35. ３５．生物字的サンプル中で多数、好ましくは全Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　 ａｇａｌａｃｔｉａｅ株をｉｎ　ｖｉｔｒｏ検出するためのキットであって、− 請求項３２に記載のプローブのいずれかから選択された少なくとも１種のプロー ブと、 −これらのプローブと多数、好ましくは全Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｇａ ｌａｃｔｉａｅ株のＤＮＡ及び／又はＲＮＡとの間にハイブリダイゼーション反 応を生じさせることが可能な緩衝液又は該緩衝液を生成するために必要な成分と 、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブリッドを適時検出するた めの手段とを含むか、又は−同一核酸分子を標的にし、少なくとも１種がＳｔｒ ｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｇａｌａｃｔｉａｅに対して特異的であり且つ請求項 ３２に記載のプローブのいずれか１種から選択された少なくとも２種のプローブ と、−これらのプローブとＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｇａｌａｃｔｉａｅ 株のＤＮＡ及び／又はＲＮＡとの間にハイブリダイゼーション反応を生じさせる ことが可能な緩衝液又は該緩衝液を生成するために必要な成分と、−前記ハイブ リダイゼーションにより形成されたハイブリッドを適時検出するための手段とを 含むか、又は−固体支持体に固定された請求項３２に記載のプローブのいずれか から選択された少なくとも１種のプローブと、−該プローブの標的配列を含むＤ ＮＡ及び／又はＲＮＡの酵素的増幅を適時実施するために必要なプライマーと、 −酵素的増幅が可能であり及び／又はこれらのプローブとＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃ ｃｕｓ　ａｇａｌａｃｔｉａｅ株のＤＮＡ及び／又はＲＮＡとの間にハイブリダ イゼーション反応を生じさせることが可能な緩衝液又は該緩衝液を生成するため に必要な成分と、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブリッドを適時検出するた めの手段とを含むことを特徴とするキット。
36. ３６．１種以上のＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕｎｉ及びＣａｍｐｙｌ ｏｂａｃｔｅｒ　ｃｏｌｉ株を検出するためのプローブであって、プローブが適 切な条件でＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕｎｉ及びＣａｍｐｙｌｏｂａ ｃｔｅｒ　ｃｏｌｉ由来のＤＮＡ及び／又はＲＮＡのみとハイブリダイズし、他 の生物由来のＤＮＡ及び／又はＲＮＡとはハイブリダイズしないという条件下で 、図１０に示す１６Ｓ−２３ＳｒＲＮＡスペーサー配列から誘導される１５〜最 大数のヌクレオチドの配列又はその相補配列を含むことを特徴とするプローブ。
37. ３７．生物学的サンプル中でＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉ及びＣａ ｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｃｏｌｉ株を検出するための方法であって、場合によ りプローブの標的配列を夾叉する２種のプライマー、より好ましくは進化的に高 保存性の２種のプライマーを介するポリメラーゼ鎖反応を使用して増幅させた検 出すべき株の核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を必要に応じて適切な変性条件下でハイ ブリダイゼーションできるようにしておいた前記生物学的サンプルを、プローブ とサンプル中に存在し得るＣａｍｐｙｉｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕｎｉ及びＣａ ｍｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｃｏｌｉ株の相補的核酸との間のハイブリダイゼーショ ンを可能にする条件下で請求項３６に記載のプローブと接触させる段階と、特に サンプル中に存在し得るＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕｎｉ及びＣａｍ ｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｃｏｌｉ株のＤＮＡ及びＲＮＡの両方とハイブリダイズ するプローブとの間でハイブリッドが形成された場合にこれを検出する段階とを 含むことを特徴とする方法。
38. ３８．生物学的サンプル中で多数、好ましくは全Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　 ｊｅｊｕｎｉ及びＣａｍｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｃｏｌｉ株をｉｎ　ｖｉｔｒｏ検 出するためのキットであって、 −請求項３６に記載のプローブのいずれかから選択された少なくとも１種のプロ ーブと、 −これらのプローブと多数、好ましくは全Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊ ｕｎｉ及びＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｃｏｌｉ株のＤＮＡ及び／又はＲＮＡ との間にハイブリダイゼーション反応を生じさせることが可能な緩衝液又は該緩 衝液を生成するために必要な成分と、−前記ハイブリダイゼーションにより形成 されたハイブリッドを適時検出するための手段とを含むか、又は−同一核酸分子 を標的にし、少なくとも１種がＣａｍｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕｎｉ及びＣ ｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｃｏｌｉに対して特異的てあり且つ請求項３６に記載 のプローブのいずれか１種から選択された少なくとも２種のプローブと、 −これらのプローブとＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕｎｉ及びＣａｍｐ ｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｃｏｌｉ株のＤＮＡ及び／又はＲＮＡとの間にハイブリダ イゼーション反応を生じさせることが可能な緩衝液又は該緩衝液を生成するため に必要な成分と、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブリッドを適時検出するた めの手段とを含むか、又は−固体支持体に固定された請求項３６に記載のプロー ブのいずれかから選択された少なくとも１種のプローブと、−該プローブの標的 配列を含むＤＮＡ及び／又はＲＮＡの酵素的増幅を適時実施するために必要なプ ライマーと、−酵素的増幅が可能であり及び／又はこれらのプローブとＣａｍｐ ｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕｎｉ及びＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｃｏｌｉ 株のＤＮＡ及び／又はＲＮＡとの間にハイブリダイゼーション反応を生じさせる ことが可能な緩衝液又は該緩衝液を生成するために必要な成分と、 −前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブリッドを適時検出するた めの手段とを含むことを特徴とするキット。
39. ３９．検出すべき微生物に特異的な請求項１から４、８、１２、１６、２０、２ ４、２８、３２及び３６のいずれか一項に記載のプローブを使用して生物学的サ ンプル中に含まれる１種の微生物又は数種の微生物を同時にｉｎ　ｖｉｔｒｏ検 出するための方法であって、好ましくはプローブ領域を夾叉する少なくとも１組 のプライマーによる酵素的増幅を使用して、生物学的サンプル中に存在する（標 的配列を含む）ＤＮＡ及び／又はＲＮＡを標識し、増幅した標的配列と膜上のプ ローブとの特異的ハイブリダイゼーションを可能にする媒体中で、１種以上のオ リゴヌクレオチドプローブを既知の位置にドットスポットした膜に前記生物学的 サンプルを接触させ、ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブリッドを 適切な手段により検出することを特徴とする方法。
40. ４０．生物学的サンプル中に含まれる１種の微生物又は数種の微生物を同時にｉ ｎ　ｖｉｔｒｏ検出するためのキットであって、 −検出すべき微生物に特異的であり、膜にドットスポットした請求項１から４、 ８、１２、１６、２０、２４、２８、３２及び３６のいずれか一項に記載のプロ ーブの少なくとも１種と、 −該プローブの標的配列を含むＤＮＡ及び／又はＲＮＡの酵素的増幅を適時実施 するために必要なプライマーと、−酵素的増幅が可能であり及び／又はこれらの プローブと検出すべき微生物のＤＮＡ及び／又はＲＮＡとの間にハイブリダイゼ ーション反応を生じさせることが可能な緩衝液又は該緩衝液を生成するために必 要な成分と、−前記ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブリッドを適 時検出するための手段とを含むことを特徴とするキット。