JPH05504467A - Ａｂｏ遺伝子型 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ２９、組織−血液型Ｂグリコジルトランスフェラーゼを発現することができる組 換えプラスミドであって、前記プラスミドがプロモーター、その下流に組織−唾 液型ＢグリコジルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ配列、及びその下流に ポリアデニル化シグナルを含んで成る組換えプラスミド。

３０、組織−血液型ＢグリコジルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ配列を 含んで成る組換えプラスミドにより安定してトランスフェクトされた細胞であっ て、前記グリコツルトランスフェラーゼを回収できる量で生成することを特徴と する細胞。

３１、＆ｌｌｌｍ−血液型Ａグリコジルトランスフェラーゼを生成するための方 法であって： 組織−血液型Ａグリコジルトランスフェラーゼをコードする単離されたＤＮＡ分 子、又は組織−血液型ＡグリコジルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ配列 を含んで成るＤＮＡ構造体を宿主細胞中に導入し； 前記宿主細胞を適切な培地で増殖し；そして前記宿主細胞により生成される前記 ＤＮＡ構造体によりコードされるタンパク質生成物を単離することを含んで成る 方法。

３２、組織−血液型Ｂグリコジルトランスフェラーゼを生成するための方法であ って： 組織−血液型Ｂグリコジルトランスフェラーゼをコードする単離されたＤＮＡ分 子、又は組織−血液型ＢグリコジルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ配列 を含んで成るＤＮＡ構造体を宿主細胞中に導入し； 前記宿主細胞を適切な培地で増殖し；そして前記宿主細胞により生成される前記 ＤＮＡ構造体によりコードされるタンパク質生成物を単離することを含んで成る 方法。

３３、前記宿主細胞が哺乳類細胞である請求の範囲第３１又は３２項記載の方法 。

３４、前記哺乳類細胞がｃｏｓ−ｉ又はＨｅＬａである請求の範囲第３１又は３ ２項記載の方法。

３５、患者における腫瘍増殖を抑制するための方法に使用するための、組織−血 液型ＡグリコシルトランスフエラーゼをコードするＤＮＡ配列を含む非病原性細 菌性細胞。

３６．実質的に純粋な組織−血液型Ａグリコジルトランスフェラーゼ。

３７、前記タンパク質がヒト細胞由来する請求の範囲第３６項記載のタンパク質 。

３８、＆ｆｌ織−血液型Ａグリコジルトランスフェラーゼ上のタンパク質エピト ープに結合する抗体。

３９、前記抗体がモノクローナル抗体である請求の範囲第３８項記載の抗体。

４０、実質的に純粋な組織−血液型Ａグリコジルトランスフェラーゼにより前も って免疫化された動物からのｌ１ＩＩ！臓細胞及び骨髄腫系からの細胞の融合に より形成されるハイプリドーマにより生成されるモノクロ−ｆル抗体。

４１、ＡＴＣＣＮｏ、ＨＢ１０２０７とに寄託される細胞系ＷＫＨ−１゜ ４２、請求の範囲第４１項記載の細胞系により生成されるモノクローム抗体。

４３、請求の範囲第４２項記載の抗体と組織−血液型Ａトランスフェラーゼとの 間での免疫複合体の形成を競争的に阻害するモノクローナル抗体。

明細書 ＡＢＯ遺伝子型 技術分野 本発明は、ＡＢＯ組織−血液型に一般的に関する。本発明は、より詳しくは、Ａ ＢＯ組織−血液型、ＤＮＡ配列に対するプローブ、組織−血液型ＡＢＯ状態の固 定方法、腫瘍抑制のための方法、ＤＮＡ構造体、組換えプラスミド、組織−血液 グリコシルトランスフェラーゼを生成するための組換え方法、精製された組織− 血液グリコシルトランスフェラーゼ及びタンパク質エピトープに結合するそれら から生成された抗体に関する。

発明の背景 組織−血液型ＡＢ）Ｉ決定基は、ヒトの赤血球及び組織の両者における主な同種 抗原である。それらは一般的に、脂質（スフィンゴ糖脂ｆ）又はタンパク質（垢 タンパク質）に結合される塘接合体のオリコ糖鎖の末端部分を構成する。抗原決 定基の構造は、１９５０年代に、Ｗａｔｋｉｎｓ　ａｎｄ　Ｍｏｒｇａｎ　（ハ ｔｕｒｅ　１８０　：　１０３８〜１０４０．１９５７）及びＫａｂａｔなど、 （Ｂｌｏｏｄ　Ｇｒｏｕ　５ａｂｓｔｒａＬｅｓ　：Ｔｈｅｉｒ　Ｃｈｅ＋ｗｉ ｓｔｒ　ａｎｄ　Ｉ幇ｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　＋１９５６＋　Ａｃａｄｅｍ ｉｅｓ　Ｐｒｅｃｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）により確立された。続いて、Ｗａｔ ｋｉｎｓ　ａｎｄ　Ｍｏｒｇａｎ　（亘り鉢■、　４　：　９７〜１１９．１９ ５９）は、Ａ及び８表現型が、Ｈ抗原、すなわちＦｕｃα１→２Ｇａ　１β１→ Ｒへのαｌ→３−Ｎ−アセチルガラクトサミン又はα１→３−ガラクトシル残基 の付加を通して、０表現型に関連するＨ＠！ＩｆをそれぞれＡ及びＢに転換する グリコジルトランスフェラーゼに関連することを提案した。従って、組織−血液 型Ａ及びＢ遺伝子の主要生成物は、それぞれグリコジルトランスフェラーゼであ る。

現在、組織−血液型抗原の知識は、化学、免疫学、生合成及び遺伝的遺伝形質に 制限されている。ＡＢＯ遺伝子のためのＤＮＡ配列情報は、特に十分な量での哺 乳類グリコジルトランスフェラーゼの精製に関連する困難性のために利用されて いない、Ａ及びＢトランスフェラーゼタンパク質のアミノ酸配列情報に基づくヌ クレオチドプローブは、ＡＢＯ遺伝子のクローニング及び特徴化を可能にし、そ してそれによって、ＤＮＡ血液型を方向づけるための方法を可能にするであろう 。

従って、精製されたｍｍ−血液型Ａ又はＢグリコジルトランスフェラーゼ及びそ れらをコードする遺伝子の一次構造のための必要性が当業界において存在する。

本発明は、この必要性を満たし、そしてさらに、他の関連する利点を提供する。

慮叉旦■！拾 簡単には、本発明は、実質的に純粋な組織−血液型Ａグリコジルトランスフェラ ーゼを供給する。そのタンパク質はヒト細胞に由来することができる。

関連する観点においては、本発明は、組織−血液型Ａグリコジルトランスフェラ ーゼ上のタンパク譬エピトープに結合する抗体を開示する。特に好ましいモノク ローナル抗体は、ＡＴＣＣＮｅ、ＨＢ１０２０７により命名されたハイブリドー マにより生成されるＷＫＨ−１を包含する。

本発明のもう１つの観点においては、組織−血液型Ａグリコジルトランスフェラ ーゼをコードする単離されたＤＮＡ分子が開示される。１つの態様においては、 そのＤＮＡ配列は、アミノＭ番号５Ｘのアラニンからアミノ酸番号３５３のプロ リンまでの第３図に示されるアミノ酸配列をコードする。もう１つの態様におい ては、ＤＮＡ配列は、アミノ酸番号１のメチオニンからアミノ酸番号３５３のプ ロリンまでの第３図に示されるアミノ酸配列をコードする。また、組織−血液型 ＡグリコジルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ分子と特異的にハイブリダ イズすることができる単離されたＤＮＡ分子が開示される。

本発明の関連する観点においては、組織−血液型Ｂグリコジルトランスフェラー ゼをコードする単離されたＤＮＡ分子及び組織−血液型Ｂグリコジルトランスフ ェラーゼをコードするＤＮＡ分子と特異的にハイブリダイズすることができる単 離されたＤＮＡが開示される０本発明はまた、組織−血液型０遺伝子のタンパク 質をコードする単離されたＤＮＡ分子及び組織−血液型Ｏ遺伝子の生成物を含ん で成るタンパク質をコードするＤＮＡ分子と特異的にハイブリダイズすることが できる単離されたＤＮＡ分子の両者も開示する。

本発明のもう１つの観点においては、組織−血液型ＡＢ○状態を検出するための 方法が提供される。１つの！ａ様においては、本発明は、患者からＤＮＡを単離 し；ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で少なくとも３種のＤＮＡプロ ーブと共に前記ＤＮＡをインキュベートし、ここで前記プローブの１つは組織− 血液型ＡグリコジルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡに由来するヌクレオ チド配列又はその一部を含んで成り、そして他のプローブの１つは組織−血液型 ＢグリコジルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡに由来するヌクレオチド配 列又はその一部を含んで成り、そしてさらにもう１つのプローブは、組織−血液 型Ｏ遺伝子のＤＮＡに由来するヌクレオチド配列又はその一部を含んで成り；そ して前記ＤＮＡプローブによりＤＮＡのハイブリダイゼーションのパターンの存 在又は不在を検出し、そしてそれから組織−血液型ＡＢＯ状態を検出することを 含んで成る。もう１つの態様においては、本発明は、患者からＤＮＡを単離し： 組織−血液型ＡグリコジルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡに由来するヌ クレオチド配列又はその一部を含んで成るＤＮＡプローブと共にハイブリダイゼ ーションを可能にする条件下で前記ＤＮＡの第１アリコートをインキュベートし ；組織−血液型ＢグリコジルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡに由来する ヌクレオチド配列又はその一部を含んで成るＤＮＡプローブと共に前記ＤＮＡの 第二アリコートをハイブリダイゼーションを可能にする条件下でインキュベート し；＆ｌｌＩ＠−血液型０遺伝子に由来するヌクレオチド配列又はその一部を含 んで成るＤＮＡプローブと共に前記ＤＮＡの第３アリコートをハイブリダイゼー ションを可能にする条件下でインキュベートし；そしてハイブリダイゼーション のパターンの存在又は不在を検出し、そしてそれから組織−血液型ＡＢＯ状態を 検出することを含んで成る。さらにもう１つの態様においては、本発明は１．患 者からＤＮＡを単離し；複数のＤＡＮフラグメントを生成するために少なくとも １つの制限エンドヌクレアーゼにより前記Ｄ　Ｎ　Ａを切断し；前記ＤＮＡフラ グメントを大きさにより分離し；そして組織−Ａ又はＢ又はＯ状態に対してユニ ークなりＮＡフラグメントの存在を検出し、そしてそれから組織−血液型ＡＢＯ 状態を検出することを含んで成る。

関連する観点においては、組織−血液型Ａグリコジルトランスフェラーゼをコー ドするＤＮＡ配列を含んで成るＤＮＡ構造体及びそのＤＮＡ配列を含んで成るプ ラスミドが開示される。適切なプロモーター及び／又はポリアデニル化シグナル もまた開示される。さらに、ＤＮＡ構造体によりトランスフェクトされた細胞及 び適切なりＮＡ構造体によりトランスフェクトされ又は形質転換された宿主細胞 を用いて組織−血液型Ａグリコジルトランスフェラーゼを生成するための方法が また開示される。Ａグリコジルトランスフェラーゼを生成するための方法は、組 織−血液型Ａグリコジルトランスフェラーゼをコードする単離されたＤＮＡ分子 又は組織−血液型ＡグリコジルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ配列を含 んで成るＤＮＡ構造体を宿主細胞中に導入し；前記宿主細胞を適切な培地で増殖 し；そして前記宿主細胞により生成されるＤＮＡ構造体によりコードされるタン パク質生成物を単離することを含んで成る。同様に、組織−血液型Ｂグリコジル トランスフェラーゼをコードするＤＮＡ配列を含んで成るＤＮＡ構造体、それか らのプラスミド及び単離されたＤＮＡ分子又はＤＮＡ構造体からのＢグリコジル トランスフェラーゼの組換え生成方法が開示される。

本発明のさらにもう１つの観点においては、患者におけるＬｍ瘍増殖を抑制する ための方法が開示される。その方法は一般的に、ｍ織−血液型Ａグリコジルトラ ンスフェラーゼをコードするＤＮＡ配列を含む非病原性細菌細胞を確立し；そし て患者の腸管中に前記細菌性細胞を導入し、それによってＡ抗原に対する細菌相 を富化する（ここでその富化は、前記腫瘍に対する上腕骨免疫応答を刺激する） ことを含んで成る。

本発明のこれらの及び他の観点が次の詳細な記載及び添付図面から明らかになる であろう。

皿互至呈！星脱ユ 第１図は、Ａグリコジルトランスフェラーゼのクローニングを示す。

第１ａ図は、内部ペプチド（Ｋ−８）の一部のアミノ酸配列及びプライマー及び プローブとして使用される対応する縮重オリゴデオキシヌクレオチド配列を示す 。ＰＣＲ実験のために使用されるＮ−末端アミノ酸配列情報（４２ａ、ａ、）が 大文字で示されている。プライマーＦＹ−１及びＦＹ−２、並びにプローブＦＹ −３のオリゴヌクレオチド配列がそれぞれの領域のアミノ酸配列の下に示される 。縮重度を下げるために、めったに使用されないコドンがＦＹ−１及びＦＩ−２ の合成から排除された。これらの３個のオリゴの縮重は、それぞれ５７６　（Ｆ Ｙ−１）、１４４　（ＦＹ−２）及び２５８（ＦＹ−３）である。

第１ｂ図は、ＰＣＲ存在試験の結果を示す。ゲノムｃＤＮＡにおけるオリゴＦＹ −１及びＦＹ−２間のヌクレオチド配列がＰＣＲ方法により増強され、そしてポ リアクリルアミドゲル／エレクトロプロントにより分析された。放射性ラベルさ れたＦＹ−３オリゴプローブが、ハイブリダイゼーションのために使用された。

試験されたＤＮＡは、（１）血液型Ａ個人、（２）８個人、（３）０個人からの ゲノムＤＮＡ　（レーン１）及びランダムにプライムされたＭＫＮ４５　ｃＤＮ Ａであった。ｐｈｉＸ１７４／ＨａｅＩ［［からのマーカーフラグメント（１１ ８ｂｐ及び７２ｂｐ）の位買が矢印により示される。

第１ｃ図は、ＰＣＲ同定の結果を示す。６個のファージ候補体（レーン５〜１０ ）からのＤＮＡが、オリゴＦＹ−１及びＦＹ−２間のヌクレオチド配列の存在に ついて現試験により分析された。レーン１１においては、ＭＫＮ４５　ｃＤＮＡ の現試験からの９８ｂｐのフラグメントが、ゲル精製され、そして対照のサイズ マーカーとして使用された。

第２図は、ヒトＡトランスフェラーゼをコードするｃＤＮＡクローン（ＦＹ−５ ９−５）についての制限地図及び配列決定手段を示す。タンパク質コード領域は 、点線のボックスにより、及び非コード領域は閉じられたバーにより示される。

ｃＤＮＡの下の矢印は配列決定の方法及び程度を示す。

第３図は、ｃＤＮＡクローンＦＹ−５９−５のヌクレオチド配列から推定される ヒトＡトランスフェラーゼのアミノ酸配列を示す、可溶性酵素のＮ−末端部から のａ、ａ、５４でのアラニン及び可能なＮ−グリコジル化部位（ａ、ａ、１１２ でのＡｓ　ｎ）が大文字で示される。配列決定されたペプチドフラグメントの位 置及び名称が点線（たとえば＜−−に−１−一＞）により示される。推定される 、及び配列決定されたアミノ酸間のミスマツチが大文字により示される。小文字 は、不明瞭なアミノ酸を示し、そして×××印は未決定アミノ酸を示す、明らか なトランスメンブランドメインがまた示される。

第４図は、異なったＡＢＯ状態の５種の細胞系のためのクローンのヌクレオチド 配列の比較を示ｔ、ＦＹ−５９−５（配列が第３図に示されている代表的なＡ対 立遺伝子ｃＤＮＡクローン）が、種々の細胞超厚からの代表的なｃＤＮＡクロー ンと比較される。挿入が線上に示され、そして欠失が線の下に示される。種々の クローンにおけるヌクレオチド配列はＦＹ−５９−５に同一であるが、但し線上 に示されるものを除く。

第５図は、ＡＢ○対立遺伝子ｃＤＮＡからの推定されるアミノ酸配列を示す。星 印は、ＦＹ−５９−Ａに対して同一の残基を示す。疑問詞は、ｃＤＮＡにおける 対応するヌクレオチド配列の不在により未同定配列を示す、（−）印は、停止コ ドンを示す。

第６図は、診断制限酵素消化による遺伝子型決定の結果を示す。

第６ａ図は、ＡＢＯ対立遺伝子ｃＤＮＡのための対立遺伝子特異的制限部位を示 す。配列は一列に並べられ、そしてＦＹ−５９−５クローンをコードする配列に 対応するように数字を付けられた。

第６ｂ及び６０図は、ＰＣＲ増幅されたＤＮＡの診断酵素消化分析の結果を示す ０診断フラグメントの位Ｉは次のように矢印により示される：ｂ、レーン１〜５ 、Ｎａｒｌ（２０５及び２６２ｂｐ）；レーン６〜１０．８ｓｓＨＩ［（２０３ 及び２６４）；ｃ、レーン１〜５、Ａｌｕｒ　（１８９及び２８０）；レーン６ 〜１０、ＨｐａＵ　（１８６）、ゲノムＤＮＡは次のものであった：ＭＫＮ４５ （レーン１及び６Ｌｓｗ９４８（２及び７）、５Ｗ４８　（３及び８）、Ｃ０Ｌ Ｏ２０５（４及び９）及び５Ｗ１４１７（５及び１０）。

第６ｄ図は○対立遺伝子の１つの塩基欠失のサザンハイブリダイゼーション検出 の結果を示す、ゲノムＤＮＡがＢｓｔＥｌｌ（レーン１〜５）又はＫｐｎｌ（レ ーン６〜１０）により消化され、そして（ｂ）及び（Ｃ）と同しであった。

生尻旦毘史星起豊 本発明を示す前、本発明に使用される一定の用語の定義を示すことがその理解の ために好都合である。

！一本明細書に使用される場合、損なわれていない分子、そのフラグメント又は その機能的な同等物を包含し、そして遺伝子工学的に構築され得る。抗体フラグ メントの例は、Ｆ（ａ　ｂ’　）ｚ、Ｆａ　ｂ’　、Ｆａ　ｂ及びＦｖを包含す る。

、ＤＮＡ　はｃ　ＤＮＡ−ｍＲＮＡ鋳型に存在する配列から酵素学的に合成され たＤＮＡ分子又は配列、又はそのような分子のクローン。

ＤＮＡ１孟止−天然において他に存在しない態様で組合され、そして並置されて いるＤＮＡのセグメントを含むように変性されている一本鎖又は二本鎖のＤＮＡ 分子又はそのような分子のクローン。

プ立ス１上スぷ３ノー久ニー宿主細胞中に挿入される場合、その復製を提供する ことができる遺伝子情報を含むＤＮＡ構造体。プラスミドは一般的に、宿主細胞 に発現されるべき少なくとも１つの遺伝子配列及びそのような遺伝子の発現を促 進する配列、例えばプロモーター及び転写開始部位を含む。

それは、線状又は閉じられた環状分子であることができる。

本発明は、＆［ｌ織−血液型Ａグリコジルトランスフェラーゼを供給する。ＵＤ Ｐ−Ｇａ１．ＮＡｃ；Ｆｕｃ＋ｒｌ−＋２Ｇａ　ｌαｌ−３Ｇａ　］　ＮＡｃ　 トランスフェラーゼとしても知られるこのタンパク賓は、Ｓ質、たとえばＦｕｃ αＬ−＋２０ａｌβ１　→Ｒ（Ｈ抗原）へのα１→３Ｃ，ａ　ｌＮＡｃのトラン スファーを触媒する。

組織−血液型Ａグリコジルトランスフェラーゼは、抽出及びクロマトグラフィー 処理技法の組合せにより単離され得る。

簡単に言及すれば、１つの態様において、酵素活性が、均質化及び界面活性剤に よる可溶化により哺乳類細胞から抽出される。界面活性剤抽出物が、ゲル濾過カ ラム上に通される。

酵素活性を含む百分を、カチオン交換クロマトグラフィーによりさらに精製する 。最終精製が、逆相カラムクロマトグラフィーを用いて行なわれる。

種々の体液及び組織、たとえば血漿、腎臓及び肺が、＆１Ｉｌｌ＝血液型Ａトラ ンスフェラーゼの精製のために適切である。

そのような精製のための出発材料の好ましい源はヒト細胞である０代表的な単離 方法は次の通りである。界面活性剤、たとえばＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００を含む 緩衝溶液における組織の均質化は、一定のＡトランスフェラーゼ活性を有する溶 液を生成する。

その抽出物の可溶性上清液が５ｅｐｈａｒｏｓｅ　４　Ｂ上に吸着され、そして ＵＤＰにより溶離される。Ａトランスフェラーゼを吸着するＳｅ＋ｐｈａｒｏｓ ｅ　４　Ｂの能力、及びその酵素活性の溶離は、ロフト依存性であるように思え る。５ｅｐｈａｒｏｓｅへの結合性の選択性は、ＵＤＰ　（及びＧＤＰ、ＵＭＰ 又は０．２μのＮａＣ１ではない）による特異的溶離により示され得る。酵素の 追加の精製は、カチオン交換クロマトグラフィー処理により、たとえばモノ−５ ＨＲ５１５カラムへの希釈され、そしてｐＨｍＷｉされた５ｅｐｈａｒｏｓｅ　 ４　Ｂ溶出液の適用により達成される。

単一の酵素調製物を組合せ、そして濃縮することが所望される場合、第２カチオ ン交換クロマトグラフィー処理段階が利用され得る。組織−血液型Ａトランスフ ェラーゼの均質性への最終精製は、逆相クロマトグラフィー、たとえばｐｒｏＲ ＰＣＨ５／１０カラムへの希釈され、そしてｐｉ（ｙ４節されたカチオン交換ｆ ４離物の適用により達成される。

本発明の代表的な精製された組織−血液型Ａトランスフェラーゼは、次の特徴を 有する。ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−Ｐ ＡＣ，Ｅ）は、還元及び非還元条件下で約４０．０００の見掛の分子量（ＭＷ） を有する単一タンパク質ハンドを示す、　４０．ＯＯＯＭＷのバンドは、精製方 法における段階に関連する特異的活性の上昇と共に上昇する唯一のハンドであり 、そしてそのバンドは０個人からの組織の抽出物に不在である。Ｎ−グリカナー ゼによる液化は、約６，０００の分子量の低下をもたらしく５ＤＳ−ＰＡＧＥに より評価される場合）、これはＡトランスフェラーゼが少なくとも１つのＮ−結 合された炭水化物鎖を有する糖タンパク質である。そのアミノ酸組成及び一部の アミノ酸配列が、精製されたＡトランスフェラーゼのために決定された。

本発明はまた、組織−血液型Ａトランスフェラーゼに結合する抗体を供給する。

その抗体は、たとえば免疫−金（ｇｏｌｄ）電子顕微鏡によるグリコジルトラン スフェラーゼの細胞局在化のために及び細胞分化及び悪性形質転換においてそれ らの役割を誘発するために有用な手段である。上記の精製された生来の＆［ｌ織 −血液型Ａトランスフェラーゼタンパク質は、Ａトランスフェラーゼタンパク質 に結合するポリクローナル又はモノクローナル抗体を生成するために使用され得 る。Ａトランスフェラーゼのフラグメント又は損なわれていない変性されたＡト ランスフェラーゼに対する抗体がまた生成され得ることは当業者に明らかであろ う、後者のタイプの抗体は、たとえばホルムアルデヒド又はグルタルアルデヒド “固定された”細胞発現Ａトランスフェラーゼの検出のために特に有用である。

簡単に言及すれば、ポリクローナル抗体は、動物の免疫化及び続く、その血清の １集により生成され得る。血′ａ吸集の前、■又は複数回の追加免疫化を行なう ことが、一般的に好ましい。

モノクローナル抗体（ＭＡｂ）は一般的に、にｏｈｌｅｒ　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔ ｅｉｎ　（Ｎａｔｕｒｅ　２５６　：４９５〜４９７，１９７５　；　Ｅｕｒｊ 、ｌ５ｎｕｎｏｌ。

６：　５１１〜５１９．１９７６）の方法により生成され得る。Ｎ単に言及すれ ば、精製されたタンパク質により注射された動物のリンパ節及び／又は膵臓が、 ハイブリッド細胞系じハイブリドーマ”又は“クローン”）を形成するために骨 髄細胞と融合される０個々のハイブリドーマは、タンパク質に対して特異的な単 一タイプの免疫グロブリンを分泌し、そして骨髄細胞のように、無限の細胞分割 のための可能性を有する。

本発明のＭＡｂは、実質的に純粋な組織−血液型Ａトランスフェラーゼによる動 物の免疫化により生成される。肺臓細胞が骨髄細胞と融合され、そしてハイブリ ドーマが限界希釈法によりクローン化される。ハイブリドーマは、固相に結合さ れる精製された生来のＡトランスフェラーゼタンパク質との反応性、高いＡトラ ンスフェラーゼ活性を有する血液型Ａ細胞の染色及びトランスフェラーゼ活性の 免疫沈殿に基づいて選択され得る。ハイブリドーマをスクリーンするためのこの 手段は、トランスフェラーゼ活性を免疫沈殿し、そして阻害することができる” 機能的”な抗体の選択を可能にする。

血液型ＡＢＨ炭水化物決定基との反応性の不在についての追加のスクリーニング は、Ａトランスフェラーゼに関連するタンパク質エピトープに向けられるＭＡｂ を分泌するハイブリドーマの選択を可能にするが、しかしその免疫優性ＡＢＨ炭 水化物決定基に関しては可能にしない。

代表的なＭＡｂ、すすｂ　？＋Ｗ　Ｋ　Ｈ−１ハ、ＡＴＣＣＮＩＩ）Ｉ８１０２ ０７により命名されたハイブリドーマにより生成される。そのＭＡｂは、高いＡ トランスフェラーゼ活性を有する細胞と反応し、そしてそのＡトランスフェラー ゼ活性及びヨウ素化された４０．ＯＯＯＭＷのトランスフェラーゼタンパク質を 免疫沈殿する。ＭＡｂは、Ａ、及びＡ２のみならず、またＢトランスフェラーゼ 活性もまた免疫沈殿せしめ、そして一部阻害し、そしてＢ細胞発現性Ｂトランス フェラーゼと反応し、従って、Ｂトランスフェラーゼとの交差反応性を示す。対 照的に、ＭＡｂは０表現型を有する種々の細胞との反応性を示さなかった。ＷＫ Ｈ−１と組織−血液型Ａトランスフェラーゼとの間での免疫複合体の形成を競争 的に阻害する他のＭＡｂが生成され得ることが、当業者に明らかであろう。

本発明はまた、単離されたＤＮＡ分子、たえとば組織−血液型Ａトランスフェラ ーゼをコードするゲノムＤＮＡ及びＣＤＮＡを供給する。精製されたＡトランス フェラーゼの部分的アミノ酸配列に基づいて、このタンパク質をコードするＣＤ ＮＡがクローンされた。このクローニング手段は、次の通りに簡単に７約され得 る：１）アミノ酸配列から逆翻訳された縮重オリゴデオキシヌクレオチドの合成 ；２）ｃＤＮＡｉｌ製：３）ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）存在試験；４）増幅 されたフラグメントの調製；５）ｃＤＮＡライブラリー構成；６）増幅されたｃ ＤＮＡライブラリーのためのＰＣＲ存在試験（任意）ニア）増幅されたフラグメ ントプローブによるライブラリーのスクリーニング；及び８）ＰＣＲ同定試験、 より詳しくは、組織−血液型Ａグリコジルトランスフェラーゼをコードする代表 的なりＮＡ分子の単離のために、ヒト胃癌細胞系ＭＫＮ４５（高レベルのＡ−抗 原を発現する）からのポリＡ＋ＲＮＡが、λｇｔｌｏ　ｃＤＮＡライブラリーの 構成のために使用された。他方、ｃ　ＤＮＡライブラリーは、ヒト組織から構成 された。縮重合成オリゴデオキシヌクレオチドが、ｃＤＮＡにおける対象の配列 の存在を検出するために（存在試験）、及び放射性ラベルされたＰＣＲ増幅フラ グメントによりライブラリーをスクリーニングした後、正しいクローンを同定す るために（同定試験）、ポリマラーゼ鎖反応のために使用された。

Ａトランスフェラーゼタンパク質の一部のアミノ酸配列に基づくオリゴヌクレオ チドプローブを、第１ａ図に示されるようにして構成した。ｃＤＮＡをランダム −プライミングにより構成し、そしてＰＣＲ分析を用いて、対象の配列がｃＤＮ Ａに存在するかいづれかを確かめた（存在試験）。第１ｂ図に示されるように、 増幅されたフラグメントの内部配列のためのＦＹ−３オリゴマープローブにより 検出される場合、予測される大きさの９ａｂｐのフラグメントが得られた。続い て、このフラグメントを、ゲル精製し、そしてＰＣＲ反応における３Ｚｐ−ラベ リングの後、ｃＤＮＡライブラリー杏スクリーンするために使用した。緊縮ハイ ブリダイゼーション及び洗浄条件が使用された（たとえば、Ｓｕｇｇｓなど。＄ ｅｎｔａｌ　Ｂｉｏ！ｏ　Ｕｓｉｎ　Ｐｕｒｉｆｉｅｄ　Ｇｅｎｅ、　Ｄ、Ｂｒ ｏｗｎ　ａｎｄ　Ｃ，Ｆ、Ｆｏｘ。

６８３ページ、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎ、Ｙ、＋１９８１）ｅ候補 体クローンの同定を、ＰＣＲ（同定試験）により試験した。１０個のクローンの うち３個が、ｃＤＮＡ挿人体に９８ｂｐの配列を有した（第１ｃ図）。ＰＴ７Ｔ ３プラスミド中にサブクローンした後、この挿入体を、同しライブラリーを再ス クリーニングするための放射性プローブとして使用し、そして１５個のクローン を、ｃＤＮＡ挿入体を有するｌＯＯ万個の独立クローンのライブラリーから単離 した。

得られたｃＤＮＡクローンは、種々の５′及び３′末端の他に、種々の内部配列 を含んだ、そのクローンは、コードフレームにおける終結シグナルの存在に基づ いてイントロンとして同定される一定の配列の存在によりグループ分けされた。

これらのクローンは、スプライスされていない又は一部スプライスされたｍＲＮ Ａに由来することができる。反復配列がそのコード領域の下流に見出された。

ＥｃｏＲｌ　ｃＤＮＡ挿入体を、詳細な分析のためにＰＴＴＴ３プラスミド又は Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫのＥｃｏＲ１部位中にサブクローンした。クロー ンの１つ、すなわちＦｌ−５９−５の制限地図は、第２図に示される。いくつか の他のクローンは、種°々の５′−及び３′−末端の他に、イントロン配列の存 在による種々の地図を示す、いくつかの欠失構造体を、配列決定するために調製 した。配列決定を、全体のコード配列のための両鏡について行なった（第２図） 。

ｃＤＮＡりａ−７ＦＹ−５９−５は、ＭＷ４Ｌ、０００のタンパク質をコードす る１０６２ｂρの長いコード配列を有する（第３図）、第１のメチオニンコドン が、開始コドンであるように思える。Ａ）ランスフェラーゼの可溶形のアミノ酸 組成は、その対応するヌクレオチド配列から推定されるアミノ酸組成とひじょう に一致する。上記のように、Ｎ−グリカナーゼ処理されたＡトランスフェラーゼ のＭＷは、３４．０００であることが見出され、これは、そのヌクレオチド配列 から推定される値に一致する。精製されたＡトランスフェラーゼから配列決定さ れたすべてのペプチドが説明され、そして予測されたアミノ酸配列とほぼ同一で あった。従って、得られたｃ　ＤＮＡクローンは、組織−血液型Ａトランスフェ ラーゼとして上記に記載される４１．ＯＯＯＭＷのタンパク質をコードする。

可溶形の精製されたＡトランスフェラーゼのＮ−末端は、位置５４でアラニンか ら開始する。このＮ−末端の前に、２１個のアミノ酸を拡張する疎水性領域が存 在し、そして膜結合形のＡトランスフェラーゼのトランスメンプラン領域である と思われる。プロリン富化領域（６０個のうち９個）の後に、前記疎水性領域が 存在する、Ｎ−グリコジル化部位は、位置１１２　（Ｎ−Ｔ−Ｔ）で位置するよ うに思われる。残る長いＣ−末端部分は、適度な疎水性である。

疎水性フロント分析に基づけば、Ａトランスフェラーゼは３種のドメイン；短い Ｎ−末端、疎水性トランスメンブラン及び長いＣ−末端ドメインから成る。精製 された可溶性形のこの酵素は触媒的に活性であるが、１．かしＮ−末端及び疎水 性ドメインを欠くので、長いＣ−末端ドメインは触媒性ドメインを含むように思 われる。

サザンハイプリダイゼーションが、種々のＡＢＯ血液型抗原を有する源からＤＮ Ａ間での制限フラグメント長さの多型現１（ＲＦＬＰ）について分析するために 行なわれた。ＡトランスフェラーゼｍＲＮＡを検出するために、ノザンハイブリ ダイゼーション実験を行なった。？Ｊｊ数のハンドが、Ａ、Ｂ。

ＡＢ及びさらに０表現型の細胞系からのＲＮＡに検出された。

従って、ＡＢＯ遺伝子の配列は、実質的にひしようにｍｌ（Ｕするように思われ る。

本発明はまた、組織−血液型Ｂグリコジルトランスフェラーゼをコードし、そし てもしあるなら、組織−血液型Ｏ遺伝子のタンパク質生成物をコードする単離さ れたＤＮＡ分子、たとえばゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡを供給する。ＵＤＰ−Ｇａ 　ｌ　：　Ｆｕｃαｌ→２Ｇａ　ｌαＬ−４３Ｇａ　１としても知られる＆ｌＩ 織−血液型Ｂグリコシルトランスフヱラーゼは、基質、たとえばＦｕｃαｌ−＋ ２０ａｌβ１−Ｒ（Ｈ抗原）へのα１−３Ｇａｌのトランスファーを触媒する。

類似するトランスフェラーゼ活性は、０表現型に関係しない、このクローニング 手段及び上記の一部のアミノ酸配列に基づくオリゴヌクレオチドプローブを用い て、Ｂ対立遺伝子ｃＤＮＡクローン（たとえばヒト結腸腺癌細胞系、すなわちＡ ＴＣＣから入手できるＳＷＩ　４１７からの）及びＯ対立遺伝子ｃＤＮＡクロー ン（たとえばヒト結腸腺癌細胞系、すなわちＡＴＣＣから入手できるＣｏ１ｏ２ ０５からの）が調製された。これらのクローン及び本発明により供給される他の クローンの要約が下記表１に示される。

ＲＩｊＡの源　表現型　血液型　ｃＤＮＡクローン　遺伝子型１：個々のｃＤＮ Ａクローンを、そのライブラリーにより分類した。対立遺伝子ｃＤＮＡを、ヌク レオチド配列に基づいて分類した。細胞系の表現型、宿主の血液型及び遺伝子型 が示される。ＮＤは決定されなかったことを意味する。

表１に示されるように、２種のクローンＦＹ−５９−５及びＦＹ　５９　７　（ ＭＫＮ４５　ｃＤＮＡライブラリーからの）を、代表的なＡ−遺伝子対立遺伝子 として同定した。これらのクローンは、対応する領域のための同一配列、及び精 製されたＡトランスフェラーゼのクローンとマツチされるこれらのクローンの推 定されるアミノ酸配列を示した。しかしながら、それらは異なった５′及び３′ 末端並びに異なったスプライシングパターンを示した。５Ｗ９４８（表現型０、 遺伝子型００）のｃＤＮＡライブラリーから得られた４種のｃＤＮＡクロー７　 （ＦＹ−６５−１，ＦＹ−６５−１０，ＦＹ〜６５−１５．ＦＹ−６５−１８） は、同一のヌクレオチド配列を示し、そしてＯ遺伝子対立遺伝子を示すものとし て判断された。５Ｗ４Ｂ、すなわちＡＢ細胞系からのｃ　ＤＮＡクローンを２つ のグループに分割した：クローンＦＹ−６６−１，ＦＹ−６６−２、ＦＹ−６６ −３，ＦＹ−６６−７は同じグループに属し、ところがクローンＦＹ−６６−９ は４種のアミノ酸置換をもたらすいくつかの塩基１換により異なる。ＦＹ−６６ −１，ＦＹ−５９−５及びＦＹ−５９−７の間のヌクレオチド配列類似性に基づ けば、ＦＹ−６６−１により表わされるグループはＡ対立遺伝子であると思われ 、そして他のものはＡＢＯ遺伝子座でＢ対立遺伝子であると思われる。

異なったＡＢＯ状態の５種の細胞系からのクローンのヌクレオチド配列を比較し た（第４図）。この比較に基づけば、Ａ及びＢクローン間の７個の単一塩基置換 が同定される（ヌクレオチド位置２９４　、５２３　、６５４．７００．７９３ ．８００及び９２７）、４個の一致したヌクレオチド置換は、Ａ及びＢ対立遺伝 子ｃＤＮＡ間でアミノ酸変化を導く　（残基１７６、２３５．２６６及び２６８ ）（第５図）、本発明の開示は）ｔ、第３及び第４アミノ酸！換（ａ、ａ、２６ ６及び２６８）ｆＫ１ヌクレオチド特異性の決定におｃＤＮＡクローンはＡ対立 遺伝子に同一である（但し、単一塩基の欠失を除く；ヌクレオチド位置２５８で のＧ）、アミノ末端に隣接して位置するこの欠失は、読み取り枠のシフトをもた らしく第５図）、そしてたぶん酵素的に不活性なタンパク質の翻訳を導く。従っ て、０個人におけるトランスフェラーゼ活性の欠失は、その読み取り枠における シフトによる。

ＡＢＯ表現型の多層現象、たとえばＡｌ−Ａ２サブグループは存在することが知 られているので、ＡＢＯ遺伝子における変異体が、存在することが当業者に明ら かであろう、変異体は、代表的なＡＢ○遺伝子について本明細書に記載された方 法により単離され得、そして細胞により発現される抗原のタイプ、検出される特 異的酵素活性及び／又は他の方法論、たとえばハイブリダイゼーションを包含す る方法に基づいて同定され得る０本明細書で使用される場合、用語“単離された ＤＮＡ分子”とは、上記の代表的なＡＢＯ遺伝子及びこれらの遺伝子の変異体の 両者を包含する。Ａ、Ｂ及び０遺伝子のタンパク質生成物をコードしないが、し かしそれぞれＡ。

Ｂ、及び０遺伝子生成物をコードするＤＮＡ分子により特異的にハイブリダイズ することができるＤＮＡ分子がまた単離され得る。

上記ＡＢＯ配列情報及び材料に基づいて、ヌクレオチドプローブが、たとえばＰ ＣＲ増幅により生成され、そして組織−血液型グリコシルトランスフェラーゼを 包含するＤＮＡ又はＲＮ　Ａ　、を新方法（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎなど、　５ｃｌ ｅｎｃｅ２４２　：　２２９゜１９８８）のために使用され得る。本発明内に開 示されるよう二こ、Ａ、Ｂ及びＯ遺伝子の配列の差異は、これらの遺伝子のだめ の選択的プローブの調製を可能にする。そのプローブは、遺伝子生成物をコード するＤＮＡに由来するヌクレオチド配列又はそのようなりＮＡの一部を含むこと ができることｔｌ当業者に明らかであろう。オリゴデオキソヌクレオチドが合成 され得（Ｔａｎなど、、以杜±ｍ四Ｈ■知■−シ！Ｌ−り徂但二」Ｕ堕ユ。

第４７巻、３８３ページ）又はＤＮＡ合成機、たとえばＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｌｏ ｇｙｓｔｅｍｓのＤＮＡ合成機３８０Ｂにより調製され得る。

ヌクレオチドプローブ対抗体を用いる本発明の方法は、より高度の精度及び高め られた感度を可能にする。そのようなヌクレオチドプローブの適用は、血液輸血 、器官移植及び法医学のために有用であるＡＢ○血液型判定を包含する。法医学 的適用においては、数年間、貯蔵されたサンプル、たとえば髪の断片、体液又は 血液のしみ、又は組織断片が、組織−血液型の同定のために利用され得る。

ヌクレオチドプローブの使用によるＭｉ織−血液型ＡＢＯ状態を決定するための 適切な方法は、ＤＮＡハイプリダイゼーノヨンを包含する。たとえば、組織−血 液型ＡＢＯ状態を検出するためには、少なくとも３種のＤＮＡプローブを調製す る。１つの態様において、１つのプローブ（“Ａプローブ）は、組織−血液Ａグ リコトランスフェラーゼをコードするＤＮＡに由来するヌクレオチド配列を含ん で成り、もう１つのプローブＣＢプローブ″）は、組織−血液型Ｂトランスフェ ラーゼをコードするＤＮＡに由来するヌクレオチド配列を含んで成り、そしてさ らにもう１つのプローブ（”Ｏプローブ”）は、組織−血液型０遺伝子のＤＮＡ に由来するヌクレオチド配列を含んで成る。患者から単離されたＤＮＡによるプ ローブのハイブリダイゼーシヨンは、存在するプローブのすべて又は患者のＤＮ Ａの別々のアリコートと共にインキュベートされた個々のプローブにより行なわ れ得る。

たとえば、１つの！！様において、患者のＤ　Ｎ　Ａの１つのアリコートを、ハ イブリダイゼーションを可能にする条件下で上記３種のＤＮＡプローブと共にイ ンキュベートする。ハイブリダイゼーションが生じた場合、組織−血液型Ａ状態 、Ｂ状態又は０状態の存在について、診断的であるハイブリダイゼーションのパ ターンが検出される。検出の段階は、プローブ、プローブと反応する分子又は第 １分子と反応する第２分子に結合されるレポーターグループの使用により行なわ れ得る。適切なレポーターグループは、放射性同位体、螢光団、酵素、発光体及 び染色粒子を包含する。個々のＤＮＡプルーブは、異なったレポーターグループ を含むことができる。

ＤＮＡハイブリダイゼーションにより組織−血液型ＡＢＯ状態を決定するための もう１つのＢ様においては、上記プローブ（Ａ、Ｂ及び０１０−ブ）を、種々の アリコートの色者のＤＮＡと共に別々にインキュベートする。たとえば、ＤＮＡ の第１アリコートをＡプローブと共にインキュベートし、第２アリコートをＢプ ローブと共にインキュベートし、そして第３アリコートのＤＮＡをＯプローブと 共にインキュベートする。第１アリコートのハイブリダイゼーションのパターン は、組織−血液型Ａ状態の存在の診断に役立ち、第２アリコートのハイブリダイ ゼーションのパターンはＢ状態の存在の診断に役立ち、そして第３アリコートの ハイブリダイゼーションのパターンは０状態の存在の診断に役立つ。検出の段階 に関する上記論議がまた、ここで通用できる。

ＤＮＡフラグメントを生成するために患者がら単離されたＤＮＡを切断すること がハイブリダイゼーションを包含する方法のために所望される。そのような切断 は、少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼによるＤＮＡの消化により行なわ れ得る。さらに患者から単離されたＤ　Ｎ　Ａを増幅することがハイブリダイゼ ーションを包含する方法のために所望される。そのような増幅は、ＰＣＲ方法論 を用いて行なわれ得る。

オリゴデオキシヌクレオチドハイブリダイゼーション方法論及びＰＣＨの通用は 当業弄において良く知られている（たとえば、Ｍｉｙａｄａなど、、Ｍｅｔｈｏ ｄｓ　ｉシバＵμ状吐Ｌ　第１５４巻、９４ベージ；　Ｂｕｓなと、、Ｎａｔｕ ｒｅ　３２７　：２９３．１９８７）　。

組織−血液型ＡＢＯ状態を決定するためのもう１つの適切な方法は、ＤＮＡフラ グメントを大きさにより区別することを包含する。たとえば、Ｄ　Ｎ　Ａを患者 から単離し、そして少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼにより切断し、複 数のＤＮＡフラグメントを生成する。フラグメントを大きさにより分離し、そし て組織−血液型ＡＢＯ状態を、組織−血液型Ａ、又はＢ又は０状態に対してユニ ークなりＮＡフラグメントの存在の検出から決定する。たとえば、対立遺伝子特 異的制限部位はＮａｒｌ及びＡ　ｌ　ｕ、　Ｉを包含する。これらの制限酵素は 、ＰＣＲと共に組合される場合、対立遺伝子−特異的フラグメントを生成する。

Ａ及びＢトランスフェラーゼ遺伝子のクローニング及び特徴化に基づかれる本発 明のもう１つの観点は、ＤＮＡ構造体及び組換えプラスミドの調製である。上記 のように、本明細書で使用される場合、用語“ＤＮＡｌｉａ体は、天然において 存在しない態様で組合され、そして並１されているＤＮＡのセグメントを含んで 成る。より詳しくは、ＤＮＡ構造体は、“単離された”ＤＮＡ配列に関して、１ 又は複数の欠失、置換、付加及び／又は挿入が存在する、組織−血液型Ａ又はＢ をコードするＤＮＡ配列を含むことができる。Ｄ　Ｎ　Ａ配列の一部は、ゲノム またはｃＤＮＡクローンに由来することができる。本明細書に記載されるＤＮＡ は適切なプロモーターを含むことができる。

創造され得るＤＮＡ構造体の例は、キメラ、たとえばＡ及びＢトランスフェラー ゼ活性の両方を有するＡ−Ｂキメラを包含する。簡単には、上記のように、Ａ及 びＢ対立遺伝子のコード領域に４個のアミノ酸置換（ａ　、ａ　、　１７６、２ ３５．２６６及び２６８）が存在する。Ａ対立遺伝子にアルギニン、グリシン、 ロイシン及びグリシンが存在し、そしてＢ対立遺伝子にグリシン、セリン、メチ オニン及びアラニンが存在する。これらの置換部位は、５ｓｔＩｌ−Ａｖａｌフ ラグメントにすべて位！する。また、このフラグメントに、これらの４種の１換 を分離するＢｓｔＹＩ、Ｆｏｋｌ及びＭｂｏｌｌのための単一の制限酵素消化部 位が存在する。従って、これらの部位は構成のために使用され得る。５′及び３ ′の未翻訳領域の差異の影響を排除するために、ｐ５９−５／６６−７　（Ｓ） の５ｓｔｌｌ−Ａｖａｌヘクターフラグメントを用いて、５ｓＬＩＩ−Ａｖａｌ キメラ構造体を適合せしめることができる。構造体が創造された後、ＳｓｔＩｌ −ＢａｍＨＩ　（たとえばＳｔｒａｔａｇｅｎｅｌ　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　ＣＡ からのｐＳＧ−５ベクターにおける）フラグメントが、Ｓｓｔｌｌ−ＢａｍＨＩ フラグメントを置換するｐ６６−１　（Ｓ）中にトランスファーされ得る。

本発明の好ましい態様において、グリコジルトランスフェラーゼを発現すること ができる組換えプラスミドは、プロモーター、その下流にｍ織−血液型Ａ又はＢ トランスフェラーゼをコードするＤＮＡ配列、次にその下流にポリアデニル化シ グナルを含んで成る。前記ＤＮＡ配列は、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡであり得る 。前記プラスミドは、一時的又は安定して細胞をトランスフェクト（形質転換） し、そしてそれによって、グリコジルトランスフェラーゼを発現する細胞系を確 立するために使用され得る（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ １ｅｃｕｌａｒ４＋第１及び２巻、Ｗｉｌｅｙ　［ｎｔｅｒｓｉｅｎｃｅ）。組 織−血液型Ａ又はＢグリコツルトランスフェラーゼを生成するための方法の１つ の態様は、＆ｌｌ織−血液型Ａ又はＢグリコジルトランスフェラーゼをコードす る単離されたＤＮＡ分子又は組織−血液型Ａ又はＢグリコジルトランスフェラー ゼをコードするＤＮＡ配列を宿主細胞中に導入することを含んで成る。

宿主細胞が適切な培地で増殖せしめられ、そして単離されたＤＮＡ分子によりコ ードされるタンパク質生成物又は宿主細胞により生成されるＤＮＡ構造体が単離 される。好ましい宿主細胞は、哺乳類細胞を包含する。特に好ましい宿主細胞は 、ＨｅＬａ細胞及びＣ１，Ｊ　Ｓ　−１細胞を包含する。培養された哺乳類細胞 中にクローン化されたＤＮＡ配列を導入するための適切な方法は、リン酸カルシ ウム媒介のトランスフェクションを包含する（たとえば−１ｇ１ｅｒなど、、ム 旦１４　：　７２５．１９７８１Ｃａｒｓａｒｏ　ａｎｄ　Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｓ ｏ＊ａｔｉｃ　Ｃｅ１ｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　７　：　６０３゜１９８１　；　 ＧｒａｈａｖＩａｎｄ　Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ、　亘９違ＩＬ５２　：　４５６ ．１９７３）。

組換えＡ又はＢトランスフェラーゼタンパク質を生成する場合、完全な配列を使 用する必要がないことは当業者に明らかであろう。

本発明のもう１つの観点は、組織−血液型Ａグリコジルトランスフェラーゼをコ ードするＤＮＡ配列を含む非病原性細菌性細胞を確立することを含んで成る、患 者における［１瘍増殖を抑制するための方法を提供する０次に、前記細菌性細胞 が、患者に導入され、それによってＡ抗原に対する細菌株を富化する。この富化 は、患者の腫瘍に対する体液性免疫応答を刺激する。適切な非病原性細菌は、ラ クトバシラス（塁ｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株を包含する。Ａ抗原を発現する細菌性 細胞は、組織−血液型グリコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ配列を 導入することによって確立され得る。

次の例は、例示目的であって、本発明を制限するものではない。

実」１舅 例１ ヒトＵＤＰ−Ｇａ　１ＮＡｃの　：Ｆｕｃ＋ｒｌ−＋Ｇａｌα１→３−Ｎ−アセ チルガラクトサミニルトランスフエラー（１）１！脂質。α−Ｇａ　１ＮＡｃ　 ）ランスフェラーゼ活性は総量１００μＩにおいて、１０請阿のトリス緩衝液（ ｐＨ７。

４）、２５μｇのＨ３又はＨ２タイプ２鎖基質糖脂質、２μモルのＭｎＣＬ、ｏ 、５７７モルのＣＤＰ−コリン、４０μｇのカッカム（Ｃｕｔｓｃｕｍ）、ｌｌ ｎモルのＵＤＰ（”Ｃ〕−Ｇａ　ｌ　ＮＡｃ　（２２，８１６ｃｐｓ／ｎモル； 標識物はアマーソヤム（Ａｍｅ　ｒ　ｓ　ｈａｍ）由来そして未標ｇＪ物はシグ マケミカル社（ＳｉｇＩｌａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）由来）及び以下の通 りの酵素調製品を含む反応混合物において測定した。放射活性糖脂質生成物はオ ートラジオグラフィーにより示され、このプレートからかき出しそして液体シン チレーションカウンターを用いて計測した。この反応生成物の同定は、Ｃ１ａｕ ｓｅｎら（Ｊ、１ｍｍｕｎｏ１．１３６　：　３２６−３３０．１９８６）によ り既に詳細の通り、よく特徴付けられている特異性を有す抗＝Ａ　ＭＡｂを利用 する高性能薄層クロマトグラフィー（ＨＰＴＬＣ）免疫染色により評価した。

（２）２−フコシルラクトース。トランスフェラーゼ活性を糖脂質アッセイと同 様の反応混合物であるが但しカッカムの省略及び低比活性の糖ヌクレオチド（４ ，ＯＯＯｃｐｓ／ｎモル）を有すものにおいて測定した。受容基質２−フコシル ラクトース（２’　ＦＬ）を５〜１０ｍＭの濃度において用い、そしてその生成 物を、Ｄｏｗｅｘ−１ギ酸サイクルクロマトグラフイーの後のシンチレーション 計測により測定した。

Ｂ−奥！比二食車塁 緩衝液：ｐＨは室温で測定した。緩衝液Ａ：１００＋ＭのＮａＣ１，５０ｗＭ０ カコジル酸、２ｍＭのＭｎＣ１，，１ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ ）、１％のトリトンＸ−１００、ｐＨ６，７，Ｉｌ衝液Ｂ：１００５ＭのＮａＣ １，５０ｓ＋Ｍのカコジル酸、２０ｍＭのＭｎＣｌ！、１ｍＭのＥＤＴＡ、０゜ １％トリトンｘ−ｉｏｏ、ｐＨ６，５，ｌｉ衝液Ｃ：５０細門のカコジル酸、２ ０ｍＭのＭｎＣＩｚ、１−門のＥＤＴＡ、５０μＭのＵＤＰ、Ｏ，１％のトリト ンＸ−１００、ｐＨ７，５，緩衝液Ｄ：５０ｍＭのカコジル酸、２閣門のＭｎＣ １ｚ、１請阿のＥＤＴＡ。

ｐＨ６，５゜ 複数のヒト酵素起源を試験し、そして肺組織を選択した。

その理由は明らかなる高い比活性及びこの酵素活性が明らかに最も可溶性である 事実に基づく、粉砕（ｍｏｒｔｅｍ）後２４〜７２時間凍結（−８０°Ｃ）した 血液型Ａ及びＡＢ肺（Ａサブグループステータスに基つく情報は何ら得られなか った）を利用した。精製にわたり、１％のプロシル−２８（Ｔｈｏｍａｓ　５ｃ ｉｅｎｔｉｆｉｃ）によりシリコン化され、そして３０分加熱（１００°Ｃ）せ しめたガラス製試験管を用いた。精製の全ての段階は４°Ｃで行った。

段１土工段階４迄の抽出及び精製工程は一度に単一の肺（１−２ｋｇ）によって 実施した。融解せしめたｍｍを２容量の緩衝液Ａの中で、１ガロンウオーリング ブレンダーにおいてホモジナイズせしめた（３０秒の間隔を置きながら１０−２ ０秒のホモジナイゼーションを４回）。この粗ホモジネート品をヘノクマンＪＡ −１０ローターにおいて１０．００Ｏｒｐｍで１時間遠心せしめた。この上清液 を更にワットマン１号紙に濾過させた。

［セファローズ４Ｂクロマトグラフイー：４１の上清液抽出物のハツチを、予備 平衡化せしめた４０ｍ１のセファローズ４Ｂ（ロット番号５６ＦＯ３３３と５６ ＦＯ３７７、シグマより購入）の直径３０ｍ５のカラム（Ｂｉｏｒａｄ）に、流 速５３１１７分で通過させた。このカラムを２００■Ｉの緩衝液Ｂにより洗浄し 、そして１００ｍ１の緩衝液Ｃにより溶出させた。５０μＭのＧＤＰ又はＵＭＰ と同様に０．２ＭのＮａＣ１を含むことは酵素活性物は溶出させないが、しかし その他の夾雑タンパク質を除去せしめる。しかしながらこの高められた洗浄効果 は溶出物の収量を低める。酵素活性を有す両分（”３０ｍ１）をプールし、５０ ■阿のカコジル酸暖衝液（ｐＨ６，０）により最終容量５０１迄希釈し、そして ＩＭの遊離のカコジル酸によりｐＨ６，２に調整した。２５％のグリセロールを 添加したこの酵素は氷上において活性の有意な損失を伴うことなく数日間安定で あり、そして活性の損失を伴うことなく数ケ月−３０°Ｃで保存できる。

［第１陽イオン交換（モノ−５ＨＲ５１５）クロマトグラフィー：希釈且つｐＨ 調整せしめたセファローズ４Ｂ溶出物を、ファルマシア（Ｕｐｓａｌａ、Ｓｗｅ ｄｅｎ）高速加圧液体クロマトグラフィー　（ｆａｓｔ　ｐｒｅｓｓｕｒｅ　１ ｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｓａｔｏｇｒａｐｈｙ）　（Ｆ　Ｐ　Ｌ　Ｃ）システムと 連結している５０１のスーパーループを介してモノ−３ＨＲ５１５カラムに適用 した。

このカラムを緩衝液りにおいて平衡化せしめ、そしてこの緩衝液２０１により洗 浄した。溶出は流速１１／分により、２３ｍ１の緩衝液りにおけるＯ〜０．５Ｍ のＮａＣ１勾配により達成せしめた。酵素活性物を含む両分（’？５ｍ１）をプ ールし、そして２５％のグリセロールを加えた。この時点で、グリセロールを伴 わない酵素は非常に不安定であるが、グリセロールを伴う場合、氷の上で２４〜 ４８時間そして一３０°Ｃで数週間安定である。

掴」１Ａ」−第２イオン交換（七ノー５ＨＲ５１５）クロマトグラフィー：第１ モノ−５ＨＲ５１５力ラム段階（段階３）の後凍結保存した６〜８個の個々の肺 抽出物由来のプールせしめた両分をプールし、そして１００■ｌの緩衝液りによ り希釈し、そして２容量の５０１のスーパーループを介してこのモノ−Ｓカラム に再度通用せしめた。このクロマトグラフィーは段階３に詳細と同様である。こ の段階は濃縮及びグリセロールの除去、更にはＵＶ（２８０ｎｓ）溶出図により 確認される通り、ある程度の精製をもたらす。

、段ＩＬ旦ヨー逆相クロマトグラフィー（ｐｒｏＲＰＣＨ５／１０）クロマトグ ラフィー：有意な損失を伴わず、塩類及び緩衝剤も含まない均質なタンパク質を 得るため、第２モノ−Ｓクロマトグラフィー（段階４）の溶出物（夕５ｍ１）を 最終容量１０ｍ１迄０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）により希釈し、そし てＴＦＡによりｐＨを２．５に調整した。このサンプルをファルマシアＦＰＬＣ システムに連結したｐｒｏＲＰＣＨ５／１０カラムに、１０−１のスーパール− プを介して通用せしめた。このカラムを０．１％のＴＦＡｌｏｍｌにより洗浄し 、そして流速０．３ｍｌ／分にて、０．１％のＴＦ４０閣１における０〜８０％ のアセトニトリル勾酸により溶出させた−　ＵＶ　（２Ｂ　０ｎｅ）吸収及びド デシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）プ ロフィールに基づいて百分をブールＬｆ。

例２ アミノ　びＬ＝ＪＪ配置の 全部で６〜８個の肺（１０〜１２ｋｇの組織に相当）由来の、例１の段階５を介 して得られた酵素調製品を用いた。同一組織からのＡトランスフェラーゼタンパ ク質を含む画分をプールし、そしてシリコン化プラスチック製マイクロ遠沈管中 でスピー１’Ｖａｃ濃縮機において凍結乾燥せしめた。タンパク譬を真空のもと て６ＮのＨＣＩ中セ中種２４時間７４時間、１１０°Ｃにて加水分解せしめ、そ してアミノ酸分析器に適用せしめた（日立Ｌ−８５００）。

表２ アミノ酸組成（モル１モル酵素）ａ ａ、アミノ酸組成はＡトランスフェラーゼ（炭水化物成分を除き、ＭＷ３４．０ ００と推定）１モル当りの残基のモル数として表わした。

ｂ、不安定なアミノ酸、例えばＴｈｒ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ及びＭｅｔは２４時間の 加水分解値から得た。

見かけ上３０μｇのＡトランスフェラーゼを還元後にカルボキンメチル化せしめ 、そしてＴＳＫ　Ｃ２０００ＳＷカラムにより更に精製した。この組成物のＮ− 末端配列を７フーケンサーを利用して自動化エドマン分解により決定した。この Ａトランスフェラーゼをアクロモバクタ−（人工」ｒＯｍＯｂａｃｃｅｒ）Ｉン ドリシル（ｅｎｄｏｌｙｓｙｌ）ペプチダーゼによって分解し、そして切り離さ れたペプチドをＴＳＫＧ２００ＱＳＷ　ＳＸＬカラムによる高圧液体クロマトグ ラフィー（ＨＰＬＣ）において分画し、そして種々のペプチド（Ｋｌからに９） が分離された。各ペプチドは以下に詳細の通りに配列決定された。

表３ Ａトランスフェラーゼ１由来の、Ｎ−末端領域並びにアクロモバククー　エンド リンルベブチダーゼ及び臭化シアン切断により切り離された１１．ｖのペプチド のアミノ酸配列なわれていないＡ　Ｊ［（工！二友遺配泗入ＶＲＥＰＤ）［ＬＱ ＲＶＳＬＰＲＭＶＹＰＱＸＫＶＩ。

Ｋｌ　ＶＬＴＰＱＸＫ Ｋ４　ＡＶＲＥＰＤＨＬＱＲＶＳＬＰＲＭ’ｔＡＴＱＸＫＫ５　ＤＦＦｆＶＧｈ ＲＶＴＴＹＹＷＴＸＸアＡＡＶＰＲＶＴＬ−−に７　ＶＬＳＰＥＹＬＷ’ＤＱＸ ＬＬＧＷＰＡＶＬＸＫＫ　８　ｄ　ＥＧ　ｈ　Ｆ’Ｙ　Ｙ　ＬＧＧ　Ｆ　ＦＧ　 Ｇ　ＳＶＱ　ＥＶＱ　ＲＬＴＲＡＱ　／　ＣＸ　Ｑ）’ＪＱＩ￥Ｄ　ＱＡｎ　Ｇ 　w　ＥＡＶ　−− に９　ｒｖＬＶＶＴ−− １Ｘは同定不能な残基；小文字は収量の低がった残基であり、大文字で表示する 残基に相当する。

Ｍ６：　ＶＤＱＡＮＧ工ＥＡＶ−− Ｍ７：　ＶＧＨＲ■ＹＹＶ’ＦＴ’ＤＱＰＡＡＶＰＲ■−ＧτＺＲＱＬＳＶＬＥ ｖｒＡＹｙ−Ｍ８：　工５ＤＦＣＥＲＲＦＬＳＥＶＤＶＬＶｃＪ′Ｄ−−Ｍ９： 　ＡＶＲＨＰＤ）ＩＬＱＲＶＳＬＰＲＭムしたＮ−端装置 例３ ヒトＭｉ織−血液型Ａトランスフェラーゼに対するＭＡｂの調製及び特徴付け Ａ、　Ｍ人工■庄ｌ ヒト血液型Ａグリコジルトランスフェラーゼに対する二種の抗体ＷＫＨ−１，− ２及び−３の製造は、生後３ヶ日のＢＡ　Ｌ　Ｂ／Ｃマウスの免疫化により達成 せしめた。リビ（Ｒｉｂｉ）のアジュバント（１リン酸化脂ｆＡ＋Ｉ−レバロー スシミコール酸）中に乳化せしめたＡトランスフェラーゼ（別に記載の通りに調 製）によってマウスを、１回の旺射当り約３０μｇのトランスフェラーゼにて４ 回の複膜腔内注射（３ｓ間開隔）によって免疫せしめた。最後の免疫の３日後に 膵臓細胞をＮＳ−１ミエローマ細胞と融合させ、そしてハイブリドーマを少なく とも３回の限界希釈によってクローン化せしめた。ハイブリドーマは粒子濃縮蛍 光イムノアツセイ（ｐａｒｔｉｃｌｅ−ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ　ｆｌｕｏｒ ｅｓｃｅｎｃｅ　ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）　（Ｐ　ＣＦ　Ｉ　）、高Ａトラン スフェラーゼ活性を存す血液型Ａ細胞の免疫染色（ＭＫＮ−４５）及びトランス フェラーセ゛活性物質の免疫沈殿によってスクリーンした。コントロールは、Ａ 又はＢ活性トランスフェラーゼを伴わずに、種々のＡ糖脂質を含んだ（Ｃｏ　ｌ 　ｏ　２０５　）　（Ｃ１ａｕｓｅｎ　ら、ｈｙ洟叩遷工！Ｊ　２５　：　７０ ７５−７０８５、１９８６に従って調製）、アイソタイプ及びサブクラスは、ヤ ギ抗−マウス蛍光イソチオンアネート（ＦＩＴＣ）−複合化抗体を用いるＰＣＦ 　Ｉ及びウサギ抗−マウス抗体（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　Ｂ ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を用いるオクタロニ−（Ｏｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）法に より決定した。ＭＡｂは何ろかの記載がない限り、組織培養土清液として利用し ７た。抗体はプロティンＡセファローズ４Ｂカラム（ｐＨ９，０）において、１ ００ｍＭのクエン酸緩衝１ｆｆｌ（ｐＨ４，２）により溶出させて精製し、そし て２０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７，４）に対して３析およそ５０μｇの精製ト ランスフェラーゼ（例１に詳細の通りに調製した）を０．５％（Ｗ／Ｖ）のフル オリコンカルボキシルーポリスチレン　アッセイ粒子（０，８６μｍ、　Ｐａｎ ｄｅｘ）１ｍｌと混合せしめ、そして最終濃度１　曙ｇ／ｍｌとなるように固形 の１−エチル−３１３−ジメチル−アミノプロピル］カルボジイミドを加えるこ とによって共有結合させた。炭水化物との反応性のコントロールは唾液又は卵巣 嚢胞粘液によって同様に被覆されたビーズ（叶、Ｅｌｖｉｎ　Ｋａｂａｔから贈 ・坏−）及びＣ１ａｕｓｅｎ　ら、Ｍｏ１ｅｃ、Ｉｍｍｕｎ、　２５　：　１９ ９−２０４．１９８８により既に詳細の通り、Ａ−活性糖脂質により被覆された ビーズを含む、撹拌後、この混合物を室温で１−２時間インキュベートせしめた 。次に微粒子を遠心しく３．０００％ｇ、１０分）、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ ）により洗浄し、５％の牛血清アルブミン（ＢＳＡ）／ＰＢＳ又はヒト血清（１ ：１０希釈）のいづれかによりブロックし、そしてＰＢＳ中の０゜２５％ｗ　／ 　ｖの最終容量にした。抗原−被覆粒子を次にＢＳＡ−被覆粒子（同様の工程） において１：１０に希釈し、０゜２２５％のＢＳＡ粒子及び０．０２５％のトラ ンスフェラーゼ粒子の最終粒子濃度にした。２０μＩのＢＳＡ−１ランスフエラ ーゼ又はＢＳＡ−被覆粒子を、０．２μｍのフィルターの付いた９６穴エビコン アツセイプレート（Ｐａｎｄｅｘ）に分配せしめた。自動化粒子濃縮蛍光イムノ アンセイスクリーン装置（Ｐａ　ｎｄ　ｅ　ｘ）　（Ｊｏ　ｌｅ　＋、Ｊ、Ｉｍ ｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈ、　６７：２１−３５．１９８４に詳細の通り）は、各ウ ェルの底にある０、２μｍフィルターを介しての真空吸引及び８−チャンネルポ ンプを介しての緩衝液の分配により、以下の連続工程、即ち、５０μＩのＭＡｂ 培養上漬物との１０分間にわたるインキユベーシヨン、ＰＢＳによる洗浄、２５ μＩのアフィニティー精製ヤギ抗−マウスＩｇ　ＦＩＴＣ−複合化抗体Ｃ１：２ ００、Ｐａｎｄｅｘ）との１０分間にわたるインキユベーシヨン、ＰＢＳによる 洗浄、並びにウェルの底において抗原−被覆粒子のセンターリング及び濃縮する 最終吸引後の４８５■１５３５ｎｍでの測定、を可能にした。

Ｃ０柵目辰及塁Ｍ（」褒澹１− 細胞はアメリカンタイプ力ルチャーコレクンヨン（ＡＴＣＣ）の仕様に従った方 法で増殖せしめ、ゴム製ポリースマンにより集め、そして１０−穴マイクロスラ イド（Ｃａｒｂｏｎ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、　Ｐｅｏｋｏｎｅ　ＩＬ）上にお いて２時間にわたり空気乾燥せしめた。スライドを水冷アセトン中で１０分間「 固定化」せしめ、そして乾燥させた。細胞を第１抗体と３７゛Ｃで４５分間イン キュベート・シ、そして蛍光ＴｙＪ！複合化複合化ウサギラーマウス抗体ｋｏｐ ａｔｔｓ、Ｄｅｎｍａｒｋ）と３７°Ｃで３０分間インキュヘーヒトしめた。同 様にヒドロ内粘膜組織、唾液腺及び手術で得られたヒト腸をドライアイスで予め 冷やしたイソペンタン中で瞬間凍結させ、ティノノユーテク（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔ ｅｋ：商り（Ｍｉｌｅｓ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中に包理化せしめた後にクリ オスタノトによって切片化せじめ、そして直ちに免疫染色のために処理せしめた 。

切片を簡単に空気乾燥させ、そして前記した細胞系に関するアセトン中での「固 定化」及び免疫染色化と同様に、アセトン中で「固定化」及び免疫染色せしめた 。但し、第１抗体とは、４時間の代りに４°Ｃで一夜インキュヘートせしめた。

エビ−イルミ享−ションを利用したザイス（Ｚｅｉｓｓ）蛍光顕微鏡においてこ のスライドを調べた。この顕微鏡にはＦＩＴＣ干渉フィルター及び２００Ｗの水 銀灯が付いている。

染色のコントロールのためには、第１抗体をＰＢＳ又はＭＡｂであって他の特異 性を有すが、試験抗体と同一のアイソタイプであるものに宜き換えた。風乾スラ イド及びヌードマウスにおいて腫瘍として増殖した細胞であって固定化、パラフ ィン包理化及び切片化せしめたものに基づき、パラホルムアルアルデヒド又はグ ルタルアルデヒドにより「固定化」せしめた後に、ＭＡｂによる染色も行った。

結腸組織の場合においては、切片は０ｒｎｔｏｆｔら、Ｌａｂ、　Ｉｎｖｅｓｔ 、　５ｊ４　：　５７６−５８３．１９８８に詳細の通り、アビジン−ビオチン −ペルオキシダーゼ複合体により染色した。

Ｄ、活性Ａトランスフェラーゼの　′ ｌａＨのアフィニティー単離ヤギ抗−マウスｌ　ｇ　Ｇ　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅ ｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）をＰＢＳ中の１％のフルす りコンポリスチレンアンセイ粒子（０，８５μｍ、ＰａｎｄｅＸ）１０ｍｌに加 えた。室温で２時間経過後、この懸濁物を１０分間遠心（３，０００ｇ）Ｌ、Ｐ ＢＳ中の３％のＢＳＡによりブロックし、そして１％ｗ　／　ｖの最終濃度へと 再Ｍ濁せしめた。ヤギ抗−マウス粒子をＭＡｂハイブリドーマ上清液と１＝５の 比において混合し、４°Ｃで１５分間インキュベートし、そして２分間遠心せし めた（３．０００％ｇ）、これらのビーズを緩衝液Ａ（５０１１Ｍのトリス緩衝 液（ｐＨ７，４）、１００ｍＭのＮａＣ１，２０５ＭのＭｎＣｌｚ　、１ｓＭの エチレンジアミン四酢酸、０．１％のトリトンＸ−１００及び３％のＢＳＡ）に より洗浄し、そして１％の１度へと緩衝液Ａの中に再！＠濁せしめた。存在して いるＡトランスフェラーゼの２倍量を結合できる。ｆＡ度迄この粒子を酵素サン プルに加えた（５００μｍの濃縮血漿に対して約１００μｌの粒子）。４°Ｃで ３０分経過後、この粒子を３．０００Ｘｇで２分間遠心し、そしてこの上清液に 残っている酵素についてアッセイした。この沈殿粒子を緩衝液Ａにより２回洗浄 し、５０μｌの洗浄緩衝液の中に再懸濁させ、そして酵素活性についてアッセイ した。利用したトランスフェラーゼは、ヒト血液型Ａ肺又は血液型Ａ＋　、Ａｘ 　、Ｂもしくは０血漿のいづれかがら精製あるいは手積製せしめた、３０％−５ ０％の硫酸アンモニウム沈殿及びその後のアミコン撹拌セルメンプラン濃縮器に おける濃縮によって１０倍濃縮せしめたものである。フコシルトランスフェラー ゼは、１００．ＯＯＯＸｇで１時間遠心せしめたＣｏ１ｏ　２０５細胞のトリト ンＣＦ−５４ホモジ−ネートに由来する。

Ｅ、ＭＡｂによるトランスフェラーゼ活性の阻害精製抗−Ａトランスフェラーゼ ＭＡｂ、同一のアイソタイプの無間係ＭＡｂ、商業的入手したＩｇＧ、ミエロー マ標準品又は２０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７，４）をトランスフェラーゼ調製 物に加え、そして４°Ｃで３０分間インキュベートした０次にこの混合物の酵素 活性を反応混合物と３７°Ｃにて１０分又は３０分間インキュベートすることに よって測定した。

例４ −　゛　ＡトランスフェラーゼｍＲＮＡに　のＤＮＡのクローンヒ　び　・ Ａ、皿と１ユノ　１データーに　ってのム　オリゴデオキシヌクレオチドプロー ブのｉ アクロモバクタ−エンドリシルペプチダーゼ処理又は臭化シアン切断に基づいて 切り離されたいくつかのペプチドのアミノ酸配列（例２に詳細）に基づいて、ア プライドバイオシステムＤＮＡ合成装置３８０Ｂを用いて合成オリゴヌクレオチ ドを作った。

録：　７５７５−７５７９．１９８５）により調製した。簡潔に述べると、細胞 ベレントをグアニジン−ＨＣ１溶液中でホモジナイズし、そして２回エタノール 沈殿せしめた０食塩水／ＳＤＳ混合物の中に再懸濁させた後、ＲＮＡをフェノー ル及びシーバグ（Ｓｅａｖａｇ）混合物（クロロホルム／イソアミルアルコール 、２４　：　１）により抽出せしめ、その後エタノール沈殿せしめた。ポリＡ″ 画分をオリゴ−ｄＴセルロースカラムク０７トグラ７　イー　（Ｍａｎｉａｔｉ ｓら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍ ａｎｕａｌ、　１９８２．　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇｓ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒｙ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）により選別した。ゲノムＤＮＡを、組織をＳＤＳ及びＥＤＴ Ａの存在下においてプロテイナーゼＫにより消化せしめ、その後シーバグ混合物 による抽出及びエタノール沈殿（同上）することにより精製せしめた。

Ｃ，ｃＤＮＡＤＮＡライブ ラリーＡ合成のための全ての試薬及び酵素はブロンがｃＤＮＡ合成キットに由来 し、そしてその製造者の仕様書に従って利用した。プライマーとしてオリゴｄＴ の代りにランダムヘキサマーを用いるＣｙｕｂｌｅｒ及びＨｏｆｆｍａｎの方法 （Ｇｅｎｅ　２５：２６３−２６９．１９８３）により、ＣＤＮＡをＭＫＮ４５ ポリＡ″ＲＮＡにより合成した。二〇〇ＤＮＡをリン酸化ＥｃｏＲＩリンカ−と りゲートせしめ、ＥｃｏＲＩにより消化させ、そして１％のアガロースゲル上に 電気泳動させた。このｃＤＮＡをサイズ選別しく＞１．３ｂｋｂ）、そしてＰＩ 法（■０１ｇＢ１５ｔｅｉｎ及びＧ１１ｌｅｓｐｉｅ、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７６　：　６１５．１９７９）によってゲルから回 収し、次いでλｇｔｌＯベクターの脱リン酸化ＥｃｏＲＩアームにリゲヒトせし めた。このリゲヒトＤＮＡをインビトロでストラタジーンギガパノクゴールド（ Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ’ｓ　Ｇｉｇａ　Ｐａｃｋ　Ｇｏｌｄ）パンケージング抽 出物によりパッケージ化せしめた。

アージクローン　来のＤＮＡ プライマーとしてＴＡｑ　ＤＮＡポリメラーゼを用い、２種の縮重合成オリゴＦ Ｙ−１及びＦＹ−２（図１）を利用しを行った。この試薬及び酵素はバーキンス エルマーシータスより購入した。変性（９４°Ｃ；２分）、アニール化（５０° Ｃ；２分）、及びＤＮＡ重合（７２°Ｃ；３分）の３５周期を、ＭＫＮ４５ポリ Ａ″ＲＮＡに基づいて行った。最後の７２℃のインキュベーションは１０分間に わたり行った。この生成物を５％のポリアクリルアミドゲル上で電気泳動させ、 そしてナイロンｉｌｌ　（Ａｍｅ　ｒ　ｓ　ｈ　ａｍ）上にエレクトロトランス ファーせしめた。この膜を真空のもとで８０°Ｃで加熱し、そして向配列のため に３２Ｐ−キナーゼ−標識オリゴデオキシヌクレオチドプローブ（ＦＹ−３）に よりプローブせしめた。予測される長さのハイブリダイズバンドの存在は陽性の 結果とＰＣＲ存在試験由来の増幅フラグメント（９８ｂｐ）をゲル精製し、そし てｃ　ＤＮＡライブラリーをスクリーンするために利用した。このスクリーニン グの後の陽性ブラックをクローン化し、そしてＤＮＡを調製してＰＣＲ同定試験 によって５０μｇのＲＮＡ又は５ｄｇのポリＡ　＋　ＲＮ　Ａを変性ホルムアル デヒド−アガロースゲルに電気泳動させ、そしてナイロン膜に移した。８０μｇ のゲノムＤＮＡを適切な制限エンドヌクレアーゼにより一夜消化し、そして１％ のアガロースゲルに載せた。を気泳動後、このゲルを０．５ＮのＮａＯＨ及び１ ．５ＭのＮ　ａ　ＣＩ中で変性させ（３０分）、０．５Ｍのトリス−ＨＣｌ　（ ｐ）１７．５）、３ＭのＮａＣ１中で中和させ、そしてこのＤＮＡを毛管現象に よってナイロン膜上に移した（Ｍａｎｉａｔｉｓら、ル杜ｙ胆お■」ａμｍ工り 二（±ゴ副り匹ヅ１２鍾μジ計、　１９Ｂ２．　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａ ｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）、ノーザン及びサザン フィルターの両方を、ＦＹ−５９−５インサート由来の３２Ｐランダムプライム 化−標試化（Ｆｅｉｎｂｅｒｇ及びνｏｇｅｌｓｔｅｉｎ、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃ ｈｅｍ　１３２　：　６．　１９８３　；　Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｗ、　１３ ７　：　２６６、１９８４）プローブにより、５０％ノホルムアルデヒド、５Ｘ の５ＳＰＥ、５Ｘのデンハーヅ（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’　ｓ）及び０．１％のＳＤ Ｓ溶液中で４２°Ｃにて２時間予備ハイブリダイズ化せしめ、その後４２°Ｃに て一夜ハイブリダイズ化せしめた。これらのフィルターを２Ｘの５ｓＣ１０，１ ％のＳＤＳ中において室温で３回洗浄し、その後ＩＸの５ＳＣ２０，１％のＳＤ Ｓ中で６８°ｃにて１時間洗浄した。！［の洗浄はＯ，ＩＸの５ＳＣ１０，１％ （７）ＳＤＳ中において６８°Ｃで１時間とした。

Ｆ、サフ゛クローニング　び　、土−ヒファージクローン由来のＤＮＡをＥｃｏ ＲＩにより消化し、そしてＰＴ７Ｔ３プラスミド（ファルマシア）又はファージ スクリプトＳＫ（ストラタジーン）の脱リン酸化ＥｃｏＲＩアームとリゲヒトさ せた。ＸＬ−１青変病細菌のＤＮＡ形質転換後、このクローンをＩＰＴＧ及びＸ −ｇａｌによる色選別によってスクリーンした。制限酵素はＢＲＬ又はニューイ ングランドバイオラブから入手した。

Ｇ、旦Ｎ人Ｅ月迭Ｚ ジデオキシヌクレオチド終結配列決定反応（Ｓａｎｇｅｒ　ｅ、Ｐｒｏｃ、　Ｎ ａ目、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７４　：　５４６３−５４６７、１９７７） を、ヘルパーファージによる重感染によって得られるファージスクリプトクロー ン又はｐＴ７Ｔ３クローンの一本ｔｊｌＤＮＡによって行った０Ｍ１３ユニバー サルプライマー及び複数の合成オリゴデオキシヌクレオチドブライマーを用いた 。この配列決定方法は図２において示す。ＤＮＡ配列決定は、シーケナーゼ（Ｕ ｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐ、）、フレノウ 酵素（ＢＲＬ　Ｋ１１ｏｂａｓｅ　ｓｙｓｔｅｍ）及び不明瞭な領域のためのＴ ａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて行った。ＩＢＩパステル （Ｐｕｓｔｅｌｌ）配列決定分析ソフトウェア−（ＭＳ−ＤＯＳバージョン）を 配列分析のために用いた。

例５ Ａ　びＢトランスフェラーゼｃＤＮＡ　ｉ告　のｃＤＡ　（ＦＹ−６６−１及び ＦＹ−６９−３）をＰＴ７Ｔ３プラミド（Ｐｈａｒ＋５ａｃｉａ　ＬＫＢ　Ｂｉ ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；　Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、　ＮＪ）構造体から切り出 した。ｐＴ７Ｔ３プラスミドにおけるＦＹ−６６−７のコード領域のＮ−末端部 分を含むＨｉｎｄｌＩ［（ポリリンカ一部位における）−３ｓｔｎフラグメント をＦＹ−５９−５のそれと交換し、ＦＹ−５９−５及び短めの３′非翻訳配の完 全コード領域を有ｃＤＮＡを作ることによってＦＹ−５９−５／６６−７を作製 した。これらのｃＤＮＡインサートをＥｃ　ｏＲＩ消化によって切り出し、ゲル 精製し、そしてｐＳＧ−５ベクターの脱リン酸化ＥｃｏＲＩ部の中に、いづれか の方向において挿入せしめた。

Ｓｓ　ｔ　Ｕ−Ａｖａ　Ｉヘクターフラグメントを、ｐ５９−５／６ロー７フラ グメントを５ｓｔＩＩ、Ａｖａｌ及びＢｓ　ｓＨ■により消化せしめ、そしてＶ ｏｇｅｌｓｔｅｉｎ及びＧ１１１ｅｓｐｉｅに従うヨウ素化カリウム法（Ｐｒｏ ｃ、Ｎａ目、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７６　：　６１５．１９７９）により、１％のアガロース電気 泳動せしめたゲルフラグメントからＤＮＡを抽出することによって精製した。全 ての５ｓｔｌＩ−ＡｖａｌインサートはＳｓｔ■及びＡｖａ　Ｉによる消化、並 びに前記の方法による抽出によって調整した。キメラ体の作製のため、これらの インサートを更に消化せしめて２％のアガロースゲルに電気泳動させた。ゲルフ ラグメントを切り出して混合し、ＤＮＡを抽出し、そして２つフラグメントのこ の混合物を精製５ｓｔＩＩ−Ａｖａ＋ベクタ一部分とリゲヒトさせた０次にこの ＤＮＡを旦。

］　ＩＪ　Ｘ　Ｌ　−１青変病コンピテント細菌の形質転換のために用いた。こ の形質転換体からＤＮＡを小スケールにおいて精製し、そして診断制限酵素分解 によって分析した。候補のクローン体を大量スケールにおいて培養してＤＮＡを 精製し、そして置換について分析した（第１、第２及び第３置換に関するＢｓ　 ５ＨＩＩ、Ａｌｕｌ及びＢｓｔＮ１部位）、第４の１換のため、２種類の対立遺 伝子−特異的オリゴヌクレオチド（Ａ対立遺伝子に対し７　ハｆ　）’　−６７ ：　ＣＣＣＧＡＡＡＧＡＡＣＣＣＣＣＣＣＡ、そしてＢ対立遺伝子に対してはｆ 　、ｙ　−６８：　ＣＣＣＧＡＡＧＡＡＣＧＣＣＣＣＣＡ）を合成し、そしてプ ラスミドＤＮＡのドソトブロノトスクリーングのために用いた。これらキメラＳ ｓｔ■−ＢａｍＨＩベクターフラグメントをｐ６６−１のそれらにより交換して イントロンを導入せしめた。この構造棒金てを配列決定により更に確認した。

最終的な構造体は特定のヌクレオチドにおける相違、即ちそれらのうちいくつか は４ケ所にて推定されるアミノ酸配列における相違（アミノ酸１７６、２３５． ２６６及び２６８）をもたらすこと、以外は同一の配列を有していた。その他の ヌクレオチド置換は保存的変化（即ち、アミノ酸の置換をもたらさない）ことに より、全てのキメラ構造体はその四ケ所の状態に基づいて命名した。構造体の名 称及びそれらの５ｓｔＩ［−Ａｖａｌの起源を表４に示す。発現構造体ｐＡＡＡ ＡはＡトランスフェラーゼの予測されるアミノ酸配列（アルギニン、グリシン、 ロイシン、グリシン）をそれらの位置にて有する構造体である。同様にＰＢＢＢ ＢはＢトランスフェラーゼの予測されるアミノ酸配列（グリシン、セリン、メチ オニン、アラニン）をその部位にて有す。ＭｂｏＩＩの明らかなる部分消化の問 題のため２、三種の構造体（ｐＡＡＢＡ、ｐＢＡＢＡ及びｐ　Ｂ　Ｂ　ＢＡ）を 、各５ｓｔｎ−Ｆｏｋｌフラグメントを先に作った構造体（ｐＡＢＢＡ）のＦｏ ｋｌ−Ａｖａ＋フラグメントとリゲヒトさせることによって調整した。

表４ Ａ−Ｂ　）ランスフェラーゼｃＤＮＡキメラ体ｐ６９−３　ＳｓｔＩＩ−Ｂ−（ ＢｓｔＹＩ）−Ｂ−（ＦｏｋＩ）−Ｂ−（ＭｂｏＩｒ）−Ｂ−ＡｖａｌｐＡＡＡ Ａ　５ｓｔｆＩ−Ａ−Ａ−Ａ−ＡｍＡｖａｌ　（ｐ５９−５／６６−７）ｐＢＢ ＥＢ　５ｓｔＩＩ−Ｂ−Ｂ−Ｂ−Ｂ−Ａｖａｌ　（ｐ６９−３）ｐＡＡＢＢ　Ｓ ｓ田−Ａ−Ａ−ＦｏｋＩ　（ｐんＶｖ’、）　Ｆｏｋｌ−Ｅ−Ｂ−Ａｖａｌ　（ ｐＢＢＢＢ）ｐＢＢＡＡ　Ｓｓ田−Ｂ−Ｂ−ＦｏｋＩ　（ｐＢＢＢＢ）　Ｆｏｋ ｌ−Ａ−Ａ−ＡｖａＪ　（ｐん０λ）ｐＡＪ３ＢＢ　Ｓｓ田−Ａ−ＢｓｔＹＩ　 （ｐＡＡＡＡ）　ＢｓｔＹＴ−Ｂ−Ｂ−Ｂ−ＡｖａＩ　（ｐＢＢＢＢ）ｐＢＡＡ Ａ　Ｓｓ訂−Ｂ−ＢｓｔＹＴωＢＢＢＢ）　ＢｓｔＹＩ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａｖａｉ 　（ｐんＶ訊）ｐＡＢＡＢ　５ｓＬＩＩ−Ａ−Ｂ−Ａ−１ｖ［ｂｏ［Ｉ（ｐＡＢ ＡＡ）　ＭｂｏＩＩ−Ｂ−Ａｖａｌ（ｐＢＡＢＢ）ｐ　Ｂ　ＡＡＢ　Ｓｓ　ｔＩ Ｉ　−Ｂ−八−Ａ−ＭｂｏＩＩ（ｐＢん（へ）　Ｍｂｏｌｌ−Ｂ−ＡｖａＩ（ｐ ＡＪ３ＢＢ）ｐＢＢＡＪ３　ＳｓｔＩＩ−Ｂ−Ｂ−Ａ−Ｍｂｏｌｌ　（ｐＢＢん 〜）　ＭｂｏＩＩ−Ｂ−ＡｖａＩ　（ｐＢＢＢＢ）ｐＡＩ３ＢＡ　５ｓｔＨ−Ａ −Ｂ−Ｂ−１ｖｉｂｏＩＩ　（ｐＡＪ３ＢＢ）　Ｍｂｏ［Ｉ−Ａ−ＡｙａＩ　（ ｐＢん執）ｐＡＡＢＡ　５ｓｔＩＩ−Ａ−Ａ−ＦｏｋＩ　（ｐＡＡ１３Ｂ）　Ｆ ｏｋＩ−Ｂ−Ａ−Ａｖａｌ　（ｐＡＢＢＡ）ｐＢＡＥＡ　Ｓｓｔ［Ｉ−Ｂ−Ａ− ＦｏｋＩ　（ｐＢ、ＡＪ３Ｂ）　ＦｏｋＩ−Ｂ−Ａ−Ａｖａｆ　（ｐＡＩ３ＢＡ ）ｐＢＩ３ＢＡ　５ｓｔＩＩ−Ｂ−Ｂ−ＦｏｋＩ　（ｐＢＢＢＢ）　ＦｏｋＩ− Ｂ−Ａ−ＡｖａＪ　（ｐＡＥＢＡ）例６ 旦凡Δ厚入上」」ヨロ町巡に上刃」山ソ辷因旦上う」≦（乙Ｌｉ二竺蛇−呉 Ａ、ＤＮＡｌ−ランス２王ノンヨン プラスミドＤＮＡを、５ＤＳ−アルカリ変性法団ａｎｉａｔｉｓら、動セ狙ｕｌ ａｒ　（■制力１ニＬあ康ど彰旦吐」μ琲峠、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａ ｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９８２）、その後 のポリエチレングリコール吸着（ＰＥＧ法）（にｒｉｅｇ　及びＭｅｌｔｏｎ、 　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、　１２　：　７０５７．１９８４）によ り調整した。このＤＮＡを培養細胞にとって毒性であるＰＥＧ及び残留旦、２１ Ｊタンパク質を除去するために、フェノール−３ＥＡＶＡＧ混合物による抽出並 びにエタノール沈澱によって更に精製した。

この方法において調整したＤＮＡはＤＮＡ−導入細胞の中において機能するため に十分清浄であることが示されている（Ｙａｍａｍｏｔｏ及びＰｅｒｕｃｈｏ、 　０ｎｃｏ　ｅｎｅ　Ｒｅｓ、　３　：　１２５．１９８８）、　ＤＮＡ）ラン スフエクションはストラタジーンからのＤＮＡ）ランスフエクションキットを用 いてＣｈｅｎ及び０ｋａｙａ■ａによる詳細（Ｍｏｄ、Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、１ 　：　２７４５．１９８７）に従って行った。簡潔に述べると、ＨｅＬａ細胞を プレート当り２〜３Ｘ１００゜０００個細胞密度にてＤＭＥＭと１０％のＦＣ３ 中において感染せしめ、そして−夜培養せしめた。ＤＮＡを加える８時間前に培 地を交換した。２０μｇのプラスミドＤＮＡを４５０μｇの除菌Ｈ，Ｏの中に再 懸濁せしめ、そして２．５ＭのＣａＣ１□溶液５０μｇと混合せしめた。５００ μｌの２×のＢＢＳ　（Ｎ、Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエ タンスルホン酸及び緩衝化食塩水）（ｐＨ６，９５）を加え、そして室温で２０ 分間放置せしめた。この混合物を培養培地に滴下せしめた。細胞を３％のＣＯ２ を伴って３５°Ｃで一夜感染せしめ、翌日、培地を交換した後に５％ＣＯ□を有 す３７℃のインキュベーターに移して更に７２時間培養せしめ、そしてトリブノ ンーＥＤＴＡ処理によって回収した。

トリブノンを１０％のＦｅ２の添加されたＤＭＥＭにより不活性化せしめ、そし てＦｅ２をＰＢＳ食塩水による洗浄によって除去した。最後に、この細胞をＰＢ Ｓ中の１．５％のパラホルムアルデヒドにより固定し、そして５％のＦｅ２及び ０．０５％のＮ　ａ　Ｎ　ｘを含むＰＢ３６００μ＋の中に再懸濁させた。

Ｂ、免１針亀 該細胞（２００μｌの細胞懸濁物）をまず氷の上で１時間にわたり、１００μｍ の抗Ａ又は抗ＢネズミＭＡｂ混合物（Ｏｒｔｈｏ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　Ｉ ｎｃ、＋Ｉ？ｅｒｉｔａｎ、　ＮＪ）により免疫染色せしめた。ＰＢＳによる洗 浄の後、この細胞を氷の上で１時間にわたり、ウサギ及びヤギＦＩＴＣ複合化抗 −マウスイムノグロブリン（Ｉ　ｇ）抗体の混合物（ＰＢＳ中における１００希 釈物１００　ｕ　ｌ　；　Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、Ｓｔ、Ｌｏ ｕｉｓ、　ＭＯ）により染色せしめた。この細胞をＰＢＳにより洗浄し、そして 前記と同し緩衝液の中に再懸濁せしめ、そしてＥＰ　Ｉ　ＣＳプロフィール装置 ｊ（Ｃｏｕｒｉｅｒ　；　Ｈｉａｌｅａｈ、　ＰＬ）を用いてＦＡＣＳ分析した 。

Ｃ，ＤＮＡ　ＨｅＬａ　におけるＡ　びＢトランスフニーｉ二Ｉ濯辻しλ危里 ３通りの独立した実験結果を表５に示す。数値はＦＡＣ５分析により測定された 陽性細胞のパーセンテージを示す。Ａ又はＢ抗原を誘発できるアンチ−センス構 造体（’ａｓｈ）は存在しなかった。ｐ５９−５／６６−７　ＤＮＡのトランス フェクションはある程度のＡ抗原陽性細胞を示したが、しかしｐ６６−１の方が より効率的であった。ＨｅＬａ細胞の両対立遺伝子は０型対立遺伝子の間で共通 の単一塩基欠損を有すことが見い出され、従ってこのＡＢＯ型遺伝子座でのＨｅ Ｌａ細胞の遺伝子型は００型である。

表５ ｃＤＮＡ　ＤＮＡの　されたＨｅＬａ　胞におけるｍ　びＢｉ′　りは 実験１　実験２　実験３ プラスミド　ＤＮＡ　ＡＢ　ＡＢ　ＡＢ　活性ｐ５９−５７６６−７（ｓ）　０ ．９　０．０　０．６　０．１　５．７　０．０　Ａｐ５９−５７６６−７（ａ ｓ）　０．０　０．０　０．０　０．１　０．０　０．０ｐ６６−１（ｓ）　１ ．４　０．０　３．９　０，１　１４．８　０．ＯＡｐ６６−１（ａｓ）　０． ０　０．０　０．０　０−０　０．０　０．０なしＤＮＡ　Ｏ，００，００，０ ０，００，００，０３通りの独立したＤＮＡ、）ランスフエクション実験の結果 を表６に示す、数値は前記の抗体によって陽性染色された細胞集団のパーセンテ ージを示す、ＮＴは試験しなかったことを示す、その数値は実験の間で変化して いるが、全体的な結果は類似している。第１の群（ｐＡＡＡＡ、ｐＡＡＡＢ。

ｐＡＢＡＡ、ｐＢＡＡＡ、ｐＢＡＡＢ及びｐＢＢＡＡ）における構造体はＡトラ ンスフェラーゼ活性を有すタンノぐり質をコードする。第２の群（ＰＡＡＢＢ、 ＰＡＢＢＢ、ＰＢＡＢＢ＆びｐＢＢＢＢ）はＢトランスフェラーゼ活性を有すタ ンパク質をコードする。第３の群（ｐＡ、ＡＢＡ、ｐＡＢＡＢ。

ｐＡＢＢＡ、ｐＢＡＢＡ、ｐＢＢＡＢ及びｐＢＢＢＡ）における構造体はＡ並び にＢトランスフェラーゼ活性を有す酵素をコードする。

表６ Ａ−Ｂ　）ランスフェラーゼｃＤＮΔ−キメラ構造体のＤＮＡによりトランスフ ェクトされたＨ　ｅ　Ｌ　ａ細胞に基づく組織−血液型Ａ及びＢ抗原の発現 ｐＡＡＡＡ　４１ｊ　Ｏ，０３，８０，０１４，００，Ｉ　ＡｐＡＡＡＢ　１１ ３　０３　１ユ　０．０　７．４０．１　ＡｐＡＡＥＡ　ＮＴ　逮　１．０　０ ．６　２．４　１．１　超０．９　０．６ ｐＡＡＪ３Ｂ　Ｏ−！　２６３０．１　１．４　０．１　５．６　ＢｐＡＢＡＡ 　２１３　０．２５．７’０．ｌ　１１．６　０．１　Ａｐ／１Ｊ３ＡＪ３　２ １ｊ　３．ＯＬ、Ｓ　Ｏ，１５，８０，，２Ａ（Ｂ）ｐＡＢＢＡ　１７．０　ユ ｌ　Ｏ，８１，４２，１２，９ＡＥＯ，６０，９ ｐ、ＡＪ３ＢＢ　０．１３１．１　０．１　１．６　０．１　５．５　ＢｐＢＡ ＡＡ　２９．１　０．１　２．９　０．１　１０３　０．ＯＡｐＢん冒　１０． ０　０．１　Ｏ５Ｏ，０４，８０，１ＡｐＢＡ１３Ａ　ＮＴ　ＮＴ　Ｏｊ　Ｏ， ４３，１１３ＡＢＯ，４０３ ｐＢＡＢＢ　Ｏ，１２０，７０，０１，００，０５，４ＢｐＢＢＡＡｌ：Ｌ７　 ０．１　４．８　０．０　１７ｊ　Ｏ，ＯＡｐＢＢ、ＡＪ３　２９ｊ　２．９　 １．４　０．０　８．０　０．４　Ａ（Ｂ）ｐＢＢＥＡ　ＮＴ　ＮＴ　１．０　 ０．６　３．２　２．ＯＡＢＯ，７０，４ ｐＢＢＢＢ　Ｏ，１３０，６０，０と　０．１　３．３　ＢなしＤＮＡ　Ｏ，０ ０，１０，００，００，００，０例７ 鉢　、′　による゛　− Ａ、　・−云　・　都立の６ ゲノムＤＮＡをプロティナーゼに一３ＤＳ法（Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓら、對艮姐 垣り並坦組ＬＬ堕且■包■」並用ｈ　第２版、Ｃ。

Ｉｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｔ（ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ＋　ＮＹ、　１９ ８９）により調整した。

ｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列分析は、ＡとＢ型対立遺伝子ｃＤＮＡの間 の４つの１ｌｌＦ換のうち３ケ所での対立遺伝子特異的制限酵素切断部位並びに ０型対立遺伝子ｃＤＮＡにおける単一塩基欠損（図６ａ）を同定した。予測され る０型対立遺伝子に関する単一塩基欠損（位２２５８　）はＫｐｎ１部位（○型 対立遺伝子）を作り出し、そしてＢｓｔＥｎ部位（Ａ／Ｂ型対立遺伝子）を排除 する。ＡとＢ型対立遺伝子ＣＤＮＡの間の４つのヌクレオチド置換のうち３つは 、診断制限酵素によっても決定されうる０位夏５２３での置換はＢｓ５Ｈｎ（Ａ 型対立遺伝子）を、Ｎａｒｌ（Ｂ型対立遺伝子）に、位！７００ではＨｐａＩＩ （Ａ型対立遺伝子）をＡｌｕｌ（Ｂ型対立遺伝子）に、位置７９３ではＢｓｔＮ Ｉ（Ａ型対立遺伝子）をＮ１ａｌｌ［（Ｂ型対立遺伝子）に変化させる。

Ｂ、且旦Ｒ−−ＤＮＡの ＰＣＲ反応は、ＤＮＡサーマルサイクラ−（Ｐｅｒｋｉｎ　ＥｌｍｅｒＣｅｔｕ ｓ、　Ｎｏｒｗａｌｋ＋　Ｃ丁）により、ＴａｇＤＮＡポリメラーゼを伴い１μ ｇのＤＮＡによって行った。利用した合成オリゴデオキシヌクレオチドは：　ｆ 　ｙ−２９，５’　−ＣＧＴ丁ＣＴＧＣＴＡＡＡＡＣＣＡＡＧ；　ｆ　ｙ−３１ ，５’　−ＧＡＡＡＴＣＧＣＣＣＴＣＧＴＣＣＴＴ；　ｆ　ｙ　４３゜５　’　 −ＧＧＡＴＣＣＡＧＧＧＧＴＧＣＡＣＧＧＣＣＧＧＣＧＣＧ　、　ｆ　ｙ−４３ 、ＴＧＴＴＧＧＡＧＧＴＧＣＧＣＧＣＣＴＡＣテアル。ブライ？−ｒｙ−４３及 びｆｙ−３１は（ｂ）における増幅のため、そしてｆｙ−２９及びｆｙ−４７は （Ｃ）における増幅のために利用した。　反応の周期は３５回とした（各周期に ついては９４°Ｃで９０秒の変性、５０゛Ｃで２分間のアニール化及び７２°Ｃ で３分間のインキュベーション、並びに５秒間の伸長である）。このサンプルを フェノール−（クロロホルム：イソアミルアルコール、２４：１）により抽出せ しめ、そして１ｍＭのトリス（ｐＨ７，５）、１■ＨのＥＤＴＡ２０μｍ中に再 懸濁させた。次に、５μｍのこのＤＮＡを制限酵素により消化せしめ、そして１ ２％のＰＡＧＥにかけた。このゲルを臭化エチジウムにより染色し、そして写真 撮影した。

前記の２＆ｌｌの１対プライマー（ｆｙ−４３と−３１、及びｆ　ｙ−４７と− ２９）は、ＡとＢ型遺伝子間の重要な塩基置換をカバーするフラグメント（それ ぞれ４６７及び６２１塩蟇対）のＰＣＲ増幅を満足せしめる０診断制限酵素に対 して感受性な切断部位は、ＡとＢ型対立遺伝子間の第１（図６ｂ）及び第２（図 ６ｃ）の相違を検出するための、臭化エチジウムによって染色せしめた１２％の ポリアクリルアミドゲルにおけるフラグメントの存在により検出される。２０５ 及び２６２塩基対（ｂｐ）のＮａｒｌフラグメントが、ＳＷ４８（レーン３）及 び５Ｗ１４１７（ビーン５、図６）由来のＤＮＡから得られた。２０３−及び２ ６４−ｂｐのフラグメントが試験した全ての細胞系由来のＤＮＡのＢｓ５Ｈ■に よる消化後に得られたが、しかし５Ｗ４８（レーン８）及び５Ｗ１４１７　（レ ーン１０、図６ｂ）に関しては４６７−１）ｐのフラグメントが残り、Ｂｓ５Ｈ Ｉ［（Ａ型対立遺伝子）及びＮａｒｌ（Ｂ型対立遺伝子）に関するこれらの細胞 のこの位置でのへテロ接合性を示唆した。その他の細胞系、ＭＫＮ４５（レーン ６）、５Ｗ９４Ｂ　（レーア７）及びＣ０ＬＯ２０５（レーン９）はＢｓ５ＨＩ ［（Ａ型対立遺伝子）に関してホモ接合性であった。同様に図６０において示さ れている通り、ＳＷ４　Ｂと５Ｗ１４１７はＨａｐＩＩ（Ａ型対立遺伝子；レー ン８と１０）及びＡｌｕＩ（Ｂ型対立遺伝子；レーン３と５）に関してヘテロ接 合性があることが見出された。その他の細胞系はＨｐａＩｌに間するこの第２の 部位にてホモ接合性であった。これらの結果はゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡにおけ るこのようなヌクレオチドの相違の存在を立証せしめた。

Ｃ，サザンハイプリダイゼーシゴン サザンハイプリダイゼーシゴンを１０μｇのＤＮＡによって行った。ＢｓｔＥＵ 又はＫｐｎｌによる消化の後、ＤＮＡを１％のアガロースゲルに電気泳動させ、 そしてナイロン膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｃｏｒｐ、、ＡｒｌｉＡｒｌｌｎ　Ｈｅ ｉｇｈｔｓ、　ＩＬ）上に移した。このフィルターを加熱し、そしてＦＹ−５９ −５インサート由来のＩ””Ｐ〕シランムプライム−放射性標識化プローブと、 ５０％のホルムアルデヒド、５×の５ＳＰＥ、５×のデンハーツ及び０．１％の ５ＤＳｆ４液中にて４２°Ｃ（２時間）で予備ハイブリダイズし、その後４２° Ｃで一夜ハイブリダイズせしめた。このフィルターを２×のＳＳＣ，０，１％の ＳＤＳ中で室温にて３回洗浄し、０．１ｘＳＳＣ，０，１％のＳＤＳ中で６８℃ （１時間）にて洗浄した。最終的な洗浄は０．　１×の５ＳＣ１ｏ、＋％のｓＤ ｓ中で６８°ｃにて行った。ＤＮＡマーカーはｐｈｉ−Ｘ／Ｈａｅｍ　（ｐｈｉ ）及びｐＢＲ３２２／Ｍｓ　ｐ　Ｉ　（ｐ　ＢＲ）とした。０型対立遺伝子ｃＤ ＮＡにおいて見い出せた単一塩基欠損を、サザンプロット分析によりゲノムＤＮ Ａにおいて検出された（図６ｄ）、５種の細胞系由来のゲノムＤＮＡのＢｓｔＥ Ｉ［（レーン１−５）及びＫｐｎｌ（レーン６〜１０）による制限酵素消化、そ の後のサザントランスファー及びＦＹ−５９−５インサートプローブとのハイブ リダイゼーションは、ゲノムＤＮＡにおける単一塩基欠損の本発明の発見を立証 した。更に、この欠損に関するホモ接合性が２種のＯ壁細胞系において検出され た０ＭＫＮ４５細胞系（レーン１と６）はＢｓｔＥＩ［部位に関してホモ接合性 であるか又は欠損を有さながった。５Ｗ９４Ｂ（レーア　２と７）及びＣ０ＬＯ ２０５（レーア４と９）ハＫｐｎ１部位に関してホモ接合性であった。５Ｗ１４ １７細胞系（レーン５と１０）はへテロ接合体であった。

Ｄ、血液サンプル由来のゲノムＤＮＡの異なるＡＢＯ型の血液サンプル（軟膜） 由来のゲノムＤＮＡも分析した。完全に定義されているＡＢＯ型を有す血液サン プルの軟膜画分由来のＤＮＡを上記のＢ節及びＣ節と同様に分析した。状態は各 対立遺伝子に対して特異的な診断制限酵素切断部位によって表わされている。位 置１での状態は、ＢｓｔＥＩ［又はＫｐｎｌ消化の後のサザンブロ７ト分析にょ る、単一塩基欠損の存在について検定している。位置２及び３での状態は、位ｉ ｎ！２及び３それぞれに関するＰＣＲ並びに制限酵素消化（Ｎａｒｌ／Ｂｓ５Ｈ ＩＩ及びＡｌｕｍ／Ｈｐａ■）により検定した。遺伝子型はこのような位置及び 表現型から推定した。表７に示す通り、４種の全ての０型サンプルは両対立遺伝 子において単一の塩基欠損（位置１にて）を有した。Ａ及びＢ型のサンプル全て は少なくとも１つの機能的な対立遺伝子を示し、単一の塩基欠損を有さなかった 。ＡＢ型サンプルは２つの機能的な対立遺伝子を示した。試験した全てのＢ型及 びＡＢ型サンプルはＮａｒＩ及びＡｌｕ１部位の存在を示した（それぞれ位置２ 及び３にて）。

表７ ＡＢＯｉｌｌ伝子座での、ｎＬ　？ｒｔザンブル由来のゲノムＤＮＡの遺伝子型 決定９ 、状態１ １　Ａ　−／−Ａ／Ａ　、Ａ／Ａ　ＡＡ２　Ａ　ｏ／−Ａ／Ａ　Ａ／入　へ〇 コＡＯ／−Ａ／ＡＡ／ＡＡ○ ４　ＢＯ／−Ａ／Ｂ　Ａ／Ｂ　ＢＯ ５人　０／−八／Ａ　Ａ／Ａ　ＡＯ ６ｏ　Ｏｌｏ　Ａ／Ａ　Ａ／Ａ　００ ７　０　０１０　Ａ／Ａ　Ａ／Ａ　００８　０　０１０　Ａ／Ａ　Ａ／Ａ　００ ９　０　０１０　Ａ／Ａ　Ａ／八　〇〇１０　ＡＢ　−／−Ａ／Ｂ　’Ａ／Ｂ　 ＡＢｌｌ　Ｂ　Ｏ／−Ａ／Ｂ　Ａ／Ｂ　ＢＯ１２Ｂ　Ｏ／−Ａ／Ｂ　Ａ／Ｂ　Ｂ Ｏ １コ　Ｂ　Ｏ／−Ａ／Ｂ　Ａ／Ｂ　ＢＯ１４ＡＥ　−／−Ａ／Ｂ　Ａ／Ｂ　ＡＪ ３ａ、線（−）はその位置での非−〇型（ＢｓＬＥ［［−切断部、Ｋｐｎｌ＝切 断不可）対立遺伝子を示す。０／−は、Ｋｐｎ■切断可能なＯ型対立遺伝子と非 Ｏ型対立遺伝子の組合せを示す、Ａは、位置２でのＢ　ｓ　ｓ　１４　［１切断 可能対立Ｊｉ伝子又は位置３でのＨｐａ［切断可能対立遺伝子を示す、Ｂは、位 置２でのＮａｒ＋切断可能な対立遺伝子又は位置３でのＡｌｕＩ−切断可能な対 立遺伝子を示す。Ａ／Ａ及びＡ／Ｂは、各位１での対立遺伝子の組合せを示す。

以上により本発明の特定の実施態様を例示の目的で説明してきたが、種々の改良 は本発明の範囲に属するものと考えられる。

ＦＩＧ。３ＣＱＮ？ ＦＩＣ，６ ２３，１− 国際調査報告

Claims (43)

【特許請求の範囲】
1. １．組織−血液型Ａグリコシルトランスフェラーゼをコードする単離されたＤＮ Ａ分子。
2. ２．前記グリコシルトランスフェラーゼが、アミノ酸５４のアラニンからアミノ 酸３５３のプロリンまでの、第３図に示されるアミノ酸配列を含んで成る請求の 範囲第１項記載のＤＮＡ分子。
3. ３．前記グリコシルトランスフェラーゼが、ヌクレオチド１６０からヌクレオチ ド１０５９までの、第３図に示されるようなヌクレオチドの配列を含んで成る請 求の範囲第１項記載のＤＮＡ分子。
4. ４．前記グリコシルトランスフェラーゼが、アミノ酸１のメチオニンからアミノ 酸３５３のプロリンまでの、第３図に示されるアミノ酸配列を含んで成る請求の 範囲第１項記載のＤＮＡ分子。
5. ５．前記グリコシルトランスフェラーゼが、ヌクレオチド１からヌクレオチド１ ０５９までの、第３図に示されるようなヌクレオチドの配列を含んで成る請求の 範囲第１項記載のＤＮＡ分子。
6. ６．組織−血液型ＡグリコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ分子と特 異的にハイブリダイズすることができる単離されたＤＮＡ分子。
7. ７．組織−血液型Ｂグリコシルトランスフェラーゼをコードする単離されたＤＮ Ａ分子。
8. ８．組織−血液型ＢグリコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ分子と特 異的にハイブリダイズすることができる単離されたＤＮＡ分子。
9. ９．組織−血液型Ｏ遺伝子の生成物を含んで成るタンパク質をコードする単離さ れたＤＮＡ分子。
10. １０．組織−血液型Ｏ遺伝子の生成物を含んで成るタンパク質をコードするＤＮ Ａ分子と特異的にハイブリダイズすることができる単離されたＤＮＡ分子。
11. １１．請求の範囲第１．７又は９項記載のｃＤＮＡ分子。
12. １２．請求の範囲第１．７又は９項記載のゲノムＤＮＡ分子。
13. １３．組織−血液型ＡＢＯ状態を検出するための方法であって： 患者から単離されたＤＮＡを少なくとも３種のＤＮＡプローブと共にハイブリダ イゼーションを可能にする条件下でインキュベートし、ここで前記プローブの１ つは、組織−血液型ＡグリコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡに由来 するヌクレオチド配列又はその一部を含んで成り、前記プローブのもう１つは、 組織−血液型ＢグリコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡに由来するヌ クレオチド配列又はその一部を含んで成り、そして前記プローブのさらにもう１ つは、組織−血液型Ｏ遺伝子のＤＮＡに由来するヌクレオチド配列又はその一部 を含んで成り；そして前記ＤＮＡプローブと前記ＤＮＡとのハイブリダイゼーシ ョンのパターンの存在又は不在を検出し、そしてそれから組織−血液型ＡＢＯ状 態を決定することを含んで成る方法。
14. １４．組織−血液型ＡＢＯ状態を検出するための方法であって： 患者から単離されたＤＮＡの第１アリコートを、組織−血液型Ａグリコシルトラ ンスフェラーゼをコードするＤＮＡに由来するヌクレオチド配列又はその１部を 含んで成るＤＮＡプローブと共にハイブリダイゼーションを可能にする条件下で インキュベートし； 前記ＤＮＡの第２アリコートを、組織−血液型Ｂグリコシルトランスフェラーゼ をコードするＤＮＡに由来するヌクレオチド配列又はその一部を含んで成るＤＮ Ａプローブと共にハイブリダイゼーションを可能にする条件下でインキュベート し； 前記ＤＮＡの第３アリコートを、組織−血液型Ｏ遺伝子のＤＮＡに由来するヌク レオチド配列又はその一部を含んで成るＤＮＡプローブと共にハイブリダイゼー ションを可能にする条件下でインキュベートし；そして ハイブリダイゼーションのパターンの存在又は不在を検出し、そしてそれから組 織−血液型ＡＢＯ状態を決定することを含んで成る方法。
15. １５．前記ＤＮＡプローブのそれぞれが異なったレポーターグループを含む請求 の範囲第１３又は１４項記載の方法。
16. １６．検出の段階の前、前記ＤＮＡを増幅することをさらに含んで成る請求の範 囲第１３又は１４項記載の方法。
17. １７．検出の段階の前、ＤＮＡフラグメントを生成するために少なくとも１つの 制限エンドヌクレアーゼにより前記ＤＮＡを切断することをさらに含んで成る請 求の範囲第１３又は１４項記載の方法。
18. １８．組織−血液型ＡＢＯ状態を検出するための方法であって： 複数のＤＮＡフラグメントを生成するために、患者から単離されたＤＮＡを少な くとも１つの制限エンドヌクレアーゼにより切断し； 前記ＤＮＡフラグメントを大きさにより分離し；そして組織−血液型Ａ又はＢ又 はＯ状態に対して特異的なＤＮＡフラグメントの存在を検出し、そしてそれから 、組織−血液型ＡＢＯ状態を決定することを含んで成る方法。
19. １９．組織−血液型ＡグリコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ配列を 含んで成るＤＮＡ構造体。
20. ２０．組織−血液型ＢグリコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ配列を 含んで成るＤＮＡ構造体。
21. ２１．前記ＤＮＡ配列の少なくとも一部がｃＤＮＡクローンに由来する請求の範 囲第１９又は２０項記載のＤＮＡ構造体。
22. ２２．前記ＤＮＡ配列の少なくとも一部がケノムクローンに由来する請求の範囲 第１９又は２０項記載のＤＮＡ構造体。
23. ２３．組織−血液型ＡグリコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ配列を 含んで成る組換えプラスミド。
24. ２４．組織−血液型ＢグリコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ配列を 含んで成る組換えプラスミド。
25. ２５．前記ＤＮＡ配列がｃＤＮＡを含んで成る請求の範囲第２３又は２４項記載 の組換えプラスミド。
26. ２６．前記ＤＮＡ配列がケノムＤＮＡを含んで成る請求の範囲第２３又は２４項 記載の組換えプラスミド。
27. ２７．組織−血液型Ａグリコシルトランスフェラーゼを発現することができる組 換えプラスミドであって、前記プラスミドがプロモーター、その下流に組織−血 液型ＡグリコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ配列、及びその下流に ポリアデニル化シグナルを含んで成る組換えプラスミド。
28. ２８．組織−血液型ＡグリコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ配列を 含んで成る組換えプラスミドにより安定してトランスフェクトされた細胞であっ て、前記グリコシルトランスフェラーゼを回収できる量で生成することを特徴と する細胞。
29. ２９．組織−血液型Ｂグリコシルトランスフェラーゼを発現することができる組 換えプラスミドであって、前記プラスミドがプロモーター、その下流に組織−血 液型ＢグリコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ配列、及びその下流に ポリアデニル化シグナルを含んで成る組換えプラスミド。
30. ３０．組織−血液型ＢグリコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ配列を 含んで成る組換えプラスミドにより安定してトランスフェクトされた細胞であっ て、前記グリコシルトランスフェラーゼを回収できる量で生成することを特徴と する細胞。
31. ３１．組織−血液型Ａグリコシルトランスフェラーゼを生成するための方法であ って： 組織−血液型Ａグリコシルトランスフェラーゼをコードする単離されたＤＮＡ分 子、又は組織−血液型ＡグリコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ配列 を含んで成るＤＮＡ構造体を宿主細胞中に導入し； 前記宿主細胞を適切な培地で増殖し；そして前記宿主細胞により生成される前記 ＤＮＡ構造体によりコードされるタンパク質生成物を単離することを含んで成る 方法。
32. ３２．組織−血液型Ｂグリコシルトランスフェラーゼを生成するための方法であ って： 組織−血液型Ｂグリコシルトランスフェラーゼをコードする単離されたＤＮＡ分 子、又は組織−血液型ＢグリコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ配列 を含んで成るＤＮＡ構造体を宿主細胞中に導入し； 前記宿主細胞を適切な培地で増殖し；そして前記宿主細胞により生成される前記 ＤＮＡ構造体によりコードされるタンパク質生成物を単離することを含んで成る 方法。
33. ３３．前記宿主細胞が哺乳類細胞である請求の範囲第３１又は３２項記載の方法 。
34. ３４．前記哺乳類細胞がＣＯＳ−１又はＨｅＬａである請求の範囲第３１又は３ ２項記載の方法。
35. ３５．患者における種瘍増殖を抑制するための方法に使用するための、組織−血 液型ＡグリコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ配列を含む非病原性細 菌性細胞。
36. ３６．実質的に純粋な組織−血液型Ａグリコシルトランスフェラーゼ。
37. ３７．前記タンパク質がヒト細胞由来する請求の範囲第３６項記載のタンパク質 。
38. ３８．組織−血液型Ａグリコシルトランスフェラーゼ上のタンパク質エピトープ に結合する抗体。
39. ３９．前記抗体がモノクローナル抗体である請求の範囲第３８項記載の抗体。
40. ４０．実質的に純粋な組織−血液型Ａグリコシルトランスフェラーゼにより前も って免疫化された動物からの脾臓細胞及び骨髄種系からの細胞の融合により形成 されるハイブリドーマにより生成されるモノクローナル抗体。
41. ４１．ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＨＢ／０２０７とに寄託される細胞系ＷＫＨ−１。
42. ４２．請求の範囲第４１項記載の細胞系により生成されるモノクローム抗体。
43. ４３．請求の範囲第４２項記載の抗体と組織−血液型Ａトランスフェラーゼとの 間での免疫複合体の形成を競争的に阻害するモノクローナル抗体。