JPH099999A

JPH099999A - クラミジア・ニューモニエ遺伝子の測定用プローブ及びプライマー、該プローブ又はプライマーを用いるクラミジア・ニューモニエ遺伝子の測定法、並びに該プローブ又はプライマーを含有してなるクラミジア・ニューモニエ遺伝子の測定用試薬

Info

Publication number: JPH099999A
Application number: JP8058608A
Authority: JP
Inventors: Hiroshi Izutsu; 浩井筒; Akira Matsumoto; 明松本
Original assignee: Hitachi Chemical Co Ltd
Current assignee: Showa Denko Materials Co Ltd
Priority date: 1995-04-28
Filing date: 1996-03-15
Publication date: 1997-01-14
Anticipated expiration: 2016-03-15
Also published as: JP3711613B2

Abstract

(57)【要約】（修正有）【課題】クラミジア・ニューモニエ遺伝子の測定やク
ラミジア・ニューモニエ感染の診断に好適な測定法及び
クラミジア・ニューモニエ感染の診断に好適な測定用試
薬を提供する。【解決手段】配列番号１のＤＮＡの中の連続した少な
くとも１０塩基の塩基配列を有するＤＮＡ、上記のＤＮ
Ａに相補的なＤＮＡ、又は上記のＤＮＡと９０％以上の
相同性を有するＤＮＡ、のいずれかを含有するＤＮＡか
らなる、クラミジア・ニューモニエ遺伝子の測定用プロ
ーブ、とプライマーこのプローブとプライマーを用い
る、クラミジア・ニューモニエ遺伝子の測定法、とこの
プローブとプライマーを含有してなるクラミジア・ニュ
ーモニエ遺伝子の測定用試薬。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、クラミジア・ニュ
ーモニエ遺伝子の測定用プローブ及びプライマー、該プ
ローブ又はプライマーを用いるクラミジア・ニューモニ
エ遺伝子の測定法、並びに該プローブ又はプライマーを
含有してなるクラミジア・ニューモニエ遺伝子の測定用
試薬に関する。本発明は医薬品工業、特にクラミジア・
ニューモニエ感染症の診断薬の製造において有効に利用
される。

【０００２】

【従来の技術】クラミジア(Chlamydia)属に属する微生
物は、クラミジア・トラコマチス(Chlamydia trachomat
is)、クラミジア・シッタシ(Chlamydia psittaci)、ク
ラミジア・ペコラム(Chlamydia pecorum)、クラミジア
・ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)等の種（Specie
s）が知られている。クラミジア・ニューモニエは肺
炎、上気道炎などの呼吸器感染症の原因菌として広く蔓
延していることが知られており、クラミジア・ニューモ
ニエ感染症の治療には適切な抗生物質を投与することが
必要である。しかし、クラミジア・ニューモニエが引き
起こす呼吸器感染症の症状は、マイコプラズマ・ニュー
モニエやインフルエンザウイルスが原因で起こる感染症
の症状と類似しているので、しばしば誤診されやすい。
そのため、治療に際してはクラミジア・ニューモニエに
感染しているか否かを調べる必要がある。

【０００３】特定の微生物に感染しているか否かを調べ
る方法としては遺伝子検査法がある。これは、核酸プロ
ーブ等を用いて検体中に検出対象の微生物の遺伝子が存
在するか否かを調べる方法である。クラミジア・ニュー
モニエの遺伝子検査法としては、特表昭６４−５０００
８３号公報、米国特許第５，２８１，５１８号公報、及
びＷＯ９４／０４５４９号公報に記載された方法が知ら
れている。しかし、特表昭６４−５０００８３号公報及
び米国特許第５，２８１，５１８号公報には、クラミジ
ア・ニューモニエ染色体ＤＮＡそのもの又は染色体ＤＮ
Ａを制限酵素等で分解して得られるＤＮＡ断片をプロー
ブとして用いることが記載されているだけであり、これ
らのＤＮＡの塩基配列は明らかではなく、それゆえ、プ
ローブの特異性が定かではなく、また反応条件の設定も
困難である。

【０００４】一方、ＷＯ９４／０４５４９号公報に記載
された方法は、リボソームＲＮＡ又はそれをコードする
ＤＮＡにハイブリダイズするプローブを用いるものであ
るが、リボソームＲＮＡはすべての生物において比較的
相同性が高いため、このプローブの特異性も定かではな
い。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】請求項１記載の発明
は、クラミジア・ニューモニエ遺伝子の測定やクラミジ
ア・ニューモニエ感染の診断に好適なプローブを提供す
るものである。請求項２記載の発明は、請求項１記載の
発明の効果に加え、クラミジア・ニューモニエ感染の正
確な診断に好適なプローブを提供するものである。請求
項３記載の発明は、請求項１記載の発明の効果に加え、
クラミジア・ニューモニエ感染の正確な診断に好適なプ
ローブを提供するものである。請求項４記載の発明は、
クラミジア・ニューモニエ感染の診断に好適な測定法を
提供するものである。請求項５記載の発明は、クラミジ
ア・ニューモニエ感染の診断に好適な測定用試薬を提供
するものである。

【０００６】請求項６記載の発明は、クラミジア・ニュ
ーモニエ遺伝子の測定やクラミジア・ニューモニエ感染
の診断に好適なプライマーを提供するものである。請求
項７記載の発明は、請求項６記載の発明の効果に加え、
クラミジア・ニューモニエ感染の正確な診断に好適なプ
ライマーを提供するものである。請求項８記載の発明
は、請求項６記載の発明の効果に加え、クラミジア・ニ
ューモニエ感染の正確な診断に好適なプライマーを提供
するものである。請求項９記載の発明は、クラミジア・
ニューモニエ感染の診断に好適な測定法を提供するもの
である。請求項１０記載の発明は、クラミジア・ニュー
モニエ感染の診断に好適な測定用試薬を提供するもので
ある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、クラミジ
ア・ニューモニエのゲノムＤＮＡから、クラミジア・ニ
ューモニエに特異的な抗原ポリペプチドをコードするＤ
ＮＡを取得し、その塩基配列を解読・解析することによ
って本発明を完成した。

【０００８】すなわち、本発明は、下記（１）〜（１
０）に関するものである。（１）（ａ）配列番号１のＤＮＡの中の連続した少なく
とも１０塩基の塩基配列を有するＤＮＡ、（ｂ）上記
（ａ）のＤＮＡに相補的なＤＮＡ、又は（ｃ）上記
（ａ）若しくは（ｂ）のＤＮＡと９０％以上の相同性を
有するＤＮＡ、のいずれかを含有するＤＮＡからなる、
クラミジア・ニューモニエ遺伝子の測定用プローブ。（２）塩基配列が配列番号２の塩基配列である、上記
（１）記載のプローブ。（３）塩基配列が配列番号３の塩基配列である、上記
（１）記載のプローブ。（４）上記（１）〜（３）のいずれかに記載のプローブ
を用いる、クラミジア・ニューモニエ遺伝子の測定法。（５）上記（１）〜（３）のいずれかに記載のプローブ
を含有してなるクラミジア・ニューモニエ遺伝子の測定
用試薬。

【０００９】（６）（ａ）配列番号１のＤＮＡの中の連
続した少なくとも１０塩基の塩基配列を有するＤＮＡ、
（ｂ）上記（ａ）のＤＮＡに相補的なＤＮＡ、又は
（ｃ）上記（ａ）若しくは（ｂ）のＤＮＡと９０％以上
の相同性を有するＤＮＡ、のいずれかを含有するＤＮＡ
からなる、クラミジア・ニューモニエ遺伝子の測定用プ
ライマー。（７）塩基配列が配列番号２の塩基配列である、上記
（６）記載のプライマー。（８）塩基配列が配列番号３の塩基配列である、上記
（６）記載のプライマー。（９）上記（６）〜（８）のいずれかに記載のプライマ
ーを用いる、クラミジア・ニューモニエ遺伝子の測定
法。（１０）上記（６）〜（８）のいずれかに記載のプライ
マーを含有してなるクラミジア・ニューモニエ遺伝子の
測定用試薬。

【００１０】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本明細書において使用した略号の意味は以下の通りであ
る。ｄＡＴＰ：デオキシアデノシン−５′−三リン酸（deox
yadenosine 5′-triphosphate）ｄＣＴＰ：デオキシシチジン−５′−三リン酸（deoxyc
ytidine 5′-triphosphate）ｄＧＴＰ：デオキシグアノシン−５′−三リン酸（deox
yguanosine 5′-triphosphate）ｄＴＴＰ：デオキシチアミン−５′−三リン酸（deoxyt
hiamin 5′-triphosphate）

【００１１】クラミジア・ニューモニエ遺伝子本発明において、クラミジア・ニューモニエ遺伝子とし
ては、例えば、クラミジア・ニューモニエに特異的な遺
伝子が挙げられ、クラミジア・ニューモニエに特異的な
遺伝子としては、例えば、クラミジア・ニューモニエの
５３ＫＤａの抗原ポリペプチドの遺伝子が挙げられる。
クラミジア・ニューモニエの５３ＫＤａの抗原ポリペプ
チドの遺伝子は、配列番号１で示される塩基配列を有す
る。この抗原ポリペプチドは、配列番号１において併記
されるアミノ酸配列を有し、クラミジア・ニューモニエ
に特異的である。

【００１２】クラミジア・ニューモニエ遺伝子の測定用
プローブ及びプライマー本発明のプローブ及びプライマ
ーは、（ａ）配列番号１のＤＮＡの中の連続した少なく
とも１０塩基の塩基配列を有するＤＮＡ、（ｂ）上記
（ａ）のＤＮＡに相補的なＤＮＡ、又は（ｃ）上記
（ａ）若しくは（ｂ）のＤＮＡと９０％以上の相同性を
有するＤＮＡ、のいずれかを含有するＤＮＡからなる。
塩基配列の長さとしては、１０〜５０塩基が好ましく、
より好ましくは１５〜２０塩基である。本発明のプロー
ブ及びプライマーの具体例としては、例えば、配列番号
２の塩基配列からなるＤＮＡや配列番号３の塩基配列か
らなるＤＮＡが挙げられる。

【００１３】本発明のプローブ及びプライマーは市販の
ＤＮＡ合成装置を使用して容易に合成することができ
る。ＤＮＡ合成装置はアプライドバイオシステムズ（Ap
pliedBiosystems）社等で販売されている。また、予め
短いＤＮＡ断片を化学合成し、これをプライマーとして
後述のＰＣＲ法を行って長いＤＮＡ断片を作製すること
もできる。

【００１４】本発明のプローブ及びプライマーには、上
記ＤＮＡを標識物で標識されたものも含まれる。標識物
としては、例えば、ビオチン（Biotin）、アビジン（Av
idin）、ストレプトアビジン（Streptoavidin）、ディ
ゴキシゲニン（Digoxigenin）等の化学物質、アルカリ
フォスファターゼ（Alkaline phosphatase）、ルシフェ
ラーゼ（Luciferase）、ペルオキシダーゼ（Peroxidas
e）、β−ガラクトシダーゼ（β-galactosidase）等の
酵素、フルオレセイン（Fluorescine）等の蛍光物質が
ある。プローブにビオチンを付加させるには、例えば、
ターミナルトランスフェラーゼ（Terminal transferas
e）存在下で、プローブにビオチン化されたデオキシウ
リジン−５′−三リン酸（deoxyuridine 5′-triphosph
ate）を添加する。ターミナルトランスフェラーゼやビ
オチン化されたデオキシウリジン−５′−三リン酸はキ
ットとしてベーリンガーマンハイム(Boehringer Mannhe
im)社から購入できる。ビオチン以外の標識物を付加す
る場合も市販のキットを使用することができ、このよう
なキットは宝酒造(株)や東洋紡(株)から購入できる。ま
た、「サムブロック他編集、モレキュラー・クローニン
グ第２版（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラト
リー）(1989年)」（J.Samblook et al., Molecular Clo
ning 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press
（1989）、以下、本文献を文献″モレキュラー・クロー
ニング″という）に記載されている方法に従って標識物
を付加させてもよい。

【００１５】また、標識物としては放射性同位元素を利
用することもでき、その場合は例えば、Ｔ４ポリヌクレ
オチドキナーゼ（T4 polynucleotide kinase）存在下、
これに（γ−³²Ｐ）ｄＡＴＰを添加する。放射性同位元
素で標識する一般的手法は文献”モレキュラー・クロー
ニング”に記載されている。Ｔ４ポリヌクレオチドキナ
ーゼは東洋紡(株)から、（γ−³²Ｐ）ｄＡＴＰは(株)ア
マシャムから購入できる。

【００１６】なお、構成成分がＤＮＡである本発明のプ
ローブやプライマーの代わりに、本発明のプローブやプ
ライマーの塩基配列に対応するＲＮＡ、即ち、塩基とし
てチミンがウラシルに置換され、糖としてデオキシリボ
ースがリボースに置換された核酸、も本発明のプローブ
やプライマーとして使用でき、これらの構成成分がＲＮ
Ａであるプローブやプライマーも本発明の測定法や測定
用試薬に使用することがてきる。

【００１７】クラミジア・ニューモニエ遺伝子の測定法本発明のプローブを用いるクラミジア・ニューモニエ遺
伝子の測定法としては、例えば、検体中のＤＮＡを電気
泳動して分子量で分離し、そのＤＮＡをニトロセルロー
スフィルターやナイロンメンブレン等に移して固定し、
標識化された本発明のプローブを添加し、標識を測定す
る方法を利用することができる。この方法は、一般にサ
ザンブロット法と呼ばれており、その一般的手法は文
献″モレキュラー・クローニング″に記載されている。
なお、本発明において、「測定」は定量的又は半定量的
な測定だけでなく、定性的な測定（検出等）も意味す
る。

【００１８】本発明のプライマーを用いるクラミジア・
ニューモニエ遺伝子の測定法としては、例えば、ＰＣＲ
法を利用することができる。ＰＣＲ法については後述す
るが、本発明のプライマーを用い、ＰＣＲ法を利用して
クラミジア・ニューモニエ遺伝子を測定する方法の具体
的な工程としては、例えば、下記の工程が挙げられる。（ア）ＤＮＡを含む検体に、本発明のプライマー、ＤＮ
Ａポリメラーゼ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄ
ＴＴＰを含む緩衝液を添加し、加熱する。（イ）冷却し、保温し、加熱する。（ウ）（イ）の操作を繰返す。（エ）反応液に含まれるＤＮＡを測定する。

【００１９】工程（ア）のＤＮＡを含む検体としては、
例えば、患者の咽頭部綿棒擦過材料等から核酸を抽出し
たものがある。工程（ア）のＤＮＡポリメラーゼとして
は、例えば、タック（Ｔａｑ）ポリメラーゼを使用する
ことができる。タックポリメラーゼは東洋紡(株)から購
入できる。工程（ア）の加熱は、例えば、９０℃〜１０
０℃で０．５〜１０分間静置する。工程（イ）の冷却
は、例えば、４５℃〜６５℃で０．５〜５分間静置し、
保温は、例えば、７０℃〜８０℃で１〜１０分間静置
し、加熱は、例えば、９０℃〜１００℃で０．５〜５分
間静置する。工程（ア）の加熱操作や工程（イ）の冷
却、保温及び加熱の操作は、ＤＮＡサーマルサイクラー
（DNA thermal cycler）(登録商標)（パーキン−エルマ
ーシータス（Perkin-elmer Cetus）製）を使用して行
うことができる。

【００２０】工程（ウ）の繰返し回数は特に限定されな
いが、通常、３０回程度繰り返す。工程（エ）の反応液
に含まれるＤＮＡを測定する方法としては、例えば、反
応液を臭化エチジウム含有アガロースゲルを用いて電気
泳動して反応液に含まれているＤＮＡを分子量で分離
し、紫外線を照射する方法を利用することができる。使
用した本発明のプライマーが標識物で標識されている場
合はその標識を利用してＤＮＡを測定することができ
る。なお、一度工程（ア）〜工程（ウ）を行った後、添
加する本発明のプライマーを別の塩基配列のものにし、
再度工程（ア）〜工程（ウ）を行ってから工程（エ）に
入ってもよい。

【００２１】クラミジア・ニューモニエ遺伝子の測定用
試薬本発明のクラミジア・ニューモニエ遺伝子の測定用試薬
としては、例えば、本発明のプローブ又はプライマーを
含む水溶液が凍結された状態でプラスチック製の容器に
納められているものがある。

【００２２】次に、クラミジア・ニューモニエからクラ
ミジア・ニューモニエ遺伝子をクローニングする方法に
ついて詳しく説明する。クラミジア・ニューモニエの培養培養したＨＬ細胞等に予めクラミジア・ニューモニエを
感染させておき、この細胞をＳＰＧ液（ショ糖７５．０
ｇ、リン酸１カリウム０．５２ｇ、リン酸２カリウム
１．２２ｇ及びグルタミン酸０．７２ｇを水１リットル
に溶解した水溶液、pH７．４〜７．６）に懸濁し、この
動物細胞を破砕又は溶解し、遠心分離して上清（クラミ
ジア・ニューモニエの浮遊液）を取得する。クラミジア
・ニューモニエとしては、例えば、クラミジア・ニュー
モニエＹＫ４１株(金本ら：ミクロバイオロジカル・イ
ムノロジー、37巻、495-498頁、1993年(Y.Kanamoto et
al.,Microbiol. Immunol., Vol.37, p.495-498, 1993))
が使用できる。培養したＨＬ細胞等から細胞浮遊液を調
製し、培養上清を除去した後に前記クラミジア・ニュー
モニエ浮遊液を添加して培養し、遠心分離し、細胞内で
クラミジア・ニューモニエが増殖したクラミジア・ニュ
ーモニエ感染ＨＬ細胞を取得する。

【００２３】クラミジア・ニューモニエの基本小体の精
製クラミジア・ニューモニエ感染ＨＬ細胞を破砕し、遠心
分離し、上清を回収する。ウログラフィン（シェーリン
グ社製）を用いた連続密度勾配液にこの上清を添加して
遠心分離する。予備実験で黄色味がかった白いバンドの
中にクラミジア・ニューモニエの基本小体が含有されて
いることを電子顕微鏡で確認しているので、このバンド
を回収する。

【００２４】クラミジア・ニューモニエのゲノムＤＮＡ
の調製クラミジア・ニューモニエの基本小体を、１ｍＭエチ
レンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む１０ｍＭトリス
−塩酸緩衝液（pH８．０）（以下、ＴＥ緩衝液とい
う。）に懸濁し、１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤ
Ｓ）水溶液及び１mg/mlプロテイナーゼＫ水溶液を加え
て保温し、基本小体を溶解させる。０．１Ｍトリス−塩
酸緩衝液（pH８．０）飽和フェノールを加えて撹拌し、
遠心分離し、水層を回収する。さらにＲＮＡ分解酵素
（ＲＮａｓｅ）処理をし、フェノール／クロロホルム／
イソアミルアルコール処理とエタノール沈殿処理をし、
クラミジア・ニューモニエのゲノムＤＮＡを取得する。

【００２５】ゲノムＤＮＡ発現ライブラリーの作製ゲノムＤＮＡを制限酵素ＡｃｃＩ、ＨａｅIII及びＡｌ
ｕＩで消化し、フェノール／クロロホルム／イソアミル
アルコール処理とエタノール沈殿処理をし、部分消化Ｄ
ＮＡを取得する。この部分消化ＤＮＡにリンカー、アデ
ノシン−５′−三リン酸（adenosine 5′-triphosphat
e、以下、ＡＴＰと略す。）及びＴ４リガーゼを添加し
て、部分消化ＤＮＡにリンカーを付加させる。これを、
０．１ＭＮａＣｌ及び１ｍＭＥＤＴＡ含有１０ｍＭ
トリス−塩酸緩衝液を移動相とするクロマ・スピン６０
００（Chroma spin 6000）カラムにかけ、溶出液を分取
し、１ｋｂｐから７ｋｂｐのＤＮＡ断片を含む分画を回
収する。得られた分画にＡＴＰ及びＴ４ポリヌクレオチ
ドキナーゼを加えて反応させ、ＤＮＡ断片の５′端をリ
ン酸化する。反応液をフェノール／クロロホルム／イソ
アミルアルコール処理及びエタノール沈殿処理し、５′
端がリン酸化されたＤＮＡ断片を取得する。

【００２６】このＤＮＡ断片に、予め制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉで切断しておいたλgt11ＤＮＡ、ＡＴＰ及びＴ４リガ
ーゼを加えて反応させ、市販のパッケージングキットを
用い、得られた組換えλgt11ＤＮＡをパッケージング
し、ゲノムＤＮＡ発現ライブラリーを作製する。

【００２７】クラミジア・ニューモニエの遺伝子のクロ
ーニング次に、クラミジア・ニューモニエに特異的である５３Ｋ
Ｄａの抗原ポリペプチドの遺伝子を例に挙げ、クラミジ
ア・ニューモニエの遺伝子のクローニング方法を説明す
る。

【００２８】大腸菌Ｙ１０９０ｒ−株の培養液に上記ゲ
ノムＤＮＡ発現ライブラリーを感染させ、寒天培地上で
培養し、イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｉ
ＰＴＧ）水溶液に浸漬したニトロセルロースフィルター
を利用して、挿入ＤＮＡの発現により菌体内に産生され
たタンパク質をニトロセルロースフィルターに付着させ
る。このフィルターを牛血清アルブミンを用いてブロッ
キング反応させ、洗浄し、次いでフィルターをクラミジ
ア・ニューモニエ特異的モノクローナル抗体と反応させ
る。クラミジア・ニューモニエ特異的モノクローナル抗
体としては、例えば、ＡＹ６Ｅ２Ｅ８やＳＣＰ５３を使
用することができる。ＡＹ６Ｅ２Ｅ８を産生するハイブ
リドーマは工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番
号ＦＥＲＭＢＰ−５１５４として寄託されている。ま
た、ＳＣＰ５３を産生するハイブリドーマについてはジ
ャーナル・オブ・クリニカル・ミクロバイオロジー、13
2巻、583-588頁(1994)（J. Clin. Microbiol.,Vol.132,
p.583-588, 1994）に記載されている。反応後、フィル
ターを洗浄し、パーオキシダーゼ等の酵素で標識された
抗マウスＩｇＧ抗体を反応させる。反応後、フィルター
を洗浄し、発色基質液を添加して反応させる。発色基質
液としては、例えば、過酸化水素水溶液及び４−クロロ
−１−ナフトールのメタノール溶液を含む液を利用する
ことができる。反応後、フィルターを洗浄し、風乾させ
る。

【００２９】フィルターの発色スポットに対応する寒天
培地上のプラークを同定し、プラークに含まれるλファ
ージを取得する。プラークが全て上記モノクローナル抗
体と反応するようになるまで前記操作を繰り返し、抗原
ポリペプチドをコードするＤＮＡをクローン化し、クラ
ミジア・ニューモニエ特異的モノクローナル抗体反応性
の前記ポリペプチドを発現するλファージを取得する。

【００３０】抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡの取
得取得したλファージを大腸菌Ｙ１０９０ｒ−株に感染さ
せ、培養し、λファージを大量に生産する。市販のキッ
トを用いてλファージからＤＮＡを取得・精製する。こ
のＤＮＡにプライマー、タックポリメラーゼ（Taq Poly
merase）及びデオキシヌクレオチド類を添加し、加熱、
冷却、保温の工程を繰り返し、λgt11に挿入されたＤＮ
Ａを増幅させる。プライマーとしては、例えば、λgt11
・フォワード・プライマー（λgt11 forward primer）
及びλgt11・リバース・プライマー（λgt11 reverse p
rimer）（いずれも宝酒造株式会社製、商品名）が挙げ
られ、タックポリメラーゼとしては、例えば、アンプリ
タック・ＤＮＡ・ポリメラーゼ（AmpliTaq DNA Polymer
ase）（宝酒造株式会社製、商品名）がある。このＤＮ
Ａ増幅方法の一般的手法はＰＣＲ法として知られてお
り、詳細は文献″モレキュラー・クローニング″に記載
されている。

【００３１】増幅されたＤＮＡを取得し、塩基配列を決
定・解析する。ＤＮＡの取得には市販のキットを使用す
ることができ、例えばウイザード・ＰＣＲ・プレップキ
ット(Wizard PCR Prep kit)(プロメガ(Promega)社製、
商品名）を使用することができる。また、塩基配列を決
定はタックポリメラーゼを用いた蛍光標識ターミネータ
サイクルシークエンス法で行うことができ、この方法を
用いるには、パーキン・エルマー・ジャパン社から販売
されているキットを使用することができる。また、分析
にあたっては市販の機械、例えば、３７３Ａ型ＤＮＡシ
ークエンサ（アプライドバイオシステムズ社）を利用す
ることができる。

【００３２】塩基配列の決定後、得られたＤＮＡ塩基配
列を遺伝子配列分析ソフトで解析し、編集、連結、アミ
ノ酸翻訳領域の推定を行なう。遺伝子配列分析ソフトと
しては、「ＤＮＡＳＩＳ」（日立ソフトウェアエンジニ
アリング社）を用いることができる。解析の結果、完全
長の遺伝子が取得できていない場合は、既に取得されて
いるＤＮＡの前後のＤＮＡをゲノムウォーキングによっ
て取得する。ゲノムウォーキングを行うには、宝酒造
(株)から販売されているキットを使用することができ
る。一旦、抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡが取得
されると、遺伝子組換え法や前述したＰＣＲ法を利用す
ることによって、そのＤＮＡを複製させることができる
ので、クラミジア・ニューモニエの基本小体から抗原ポ
リペプチドをコードするＤＮＡを再度取得する操作は不
要である。

【００３３】遺伝子組換え法を用いる方法は、例えば、
次のようにして行うことができる。まず、取得された前
記ＤＮＡを上述したように既存のプラスミドベクターや
ファージベクター等に挿入して組換えベクターを作製
し、その組換えベクターを宿主に入れて形質転換体を作
製し、その形質転換体を培養する。この培養により形質
転換体内で組換えベクターが増幅されるので、その形質
転換体から増幅された組換えベクターを取得し、制限酵
素を用いて前記ＤＮＡを切り出す。形質転換体から増幅
された組換えベクターを取得する操作は、例えば、次の
ようにして行うことができる。組換えベクターがプラス
ミドである場合、その形質転換体を破砕し、フェノール
／クロロホルム処理とエタノール沈殿処理を行い、ＤＮ
Ａを取得する。臭化エチジウム含有塩化セシウムを用
い、取得したＤＮＡを超遠心分離し、組換えベクターを
プラスミドＤＮＡとして取得する。一方、組換えベクタ
ーがファージである場合、その形質転換体を破砕し、フ
ァージ粒子を取得し、ファージ粒子を溶解し、組換えベ
クターをファージＤＮＡとして取得する。

【００３４】ＰＣＲ法を利用する方法としては、例え
ば、増幅させようとするＤＮＡの両末端の塩基配列を基
にして化学合成法によりプライマーＤＮＡを作製し、抗
原ポリペプチドをコードするＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして
ＰＣＲを行えばよい。遺伝子組換え法やＰＣＲ法を用い
てＤＮＡを複製させる方法の一般的手法は文献″モレキ
ュラー・クローニング″に記載されている。

【００３５】

【実施例】以下、実施例により本発明を詳細に説明する
が、本発明はこれにより何ら制限されるものではない。
以下の実施例において、使用したモノクローナル抗体
は、ＳＣＰ５３及びＡＹ６Ｅ２Ｅ８である。ＳＣＰ５３
は、本発明者の一人の松本等がクラミジア・ニューモニ
エＫＫｐｎ−１株を抗原として、マウスを免疫し、その
脾臓細胞をミエローマ細胞と融合させて得られたハイブ
リドーマＳＣＰ５３が分泌する抗体であり、また、ＡＹ
６Ｅ２Ｅ８は、本発明者の一人の井筒等が、クラミジア
・ニューモニエＹＫ−４１株の基本小体を抗原として、
マウスを免疫し、その脾臓細胞をミエローマと細胞融合
させて得られたハイブリドーマＡＹ６Ｅ２Ｅ８が分泌す
る抗体ＡＹ６Ｅ２Ｅ８である。

【００３６】表１に示されるように、モノクローナル抗
体のＳＣＰ５３及びAY6E2E8は C.ニューモニエに特異的
である。

【００３７】

【表１】

【００３８】モノクローナル抗体の作製方法については
後述する。以下、クラミジア・ニューモニエの宿主細胞
の培養から、クラミジア・ニューモニエの抗原ポリペプ
チドの遺伝子ＤＮＡ配列とアミノ酸配列の決定まで、順
を追って説明する。

【００３９】実施例１クラミジア・ニューモニエ特異
的５３Ｋ抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡの作製（Ａ）宿主細胞（ＨＬ細胞）の培養予め、プラスチック製培養フラスコ（７５cm²）の底面
いっぱいに増殖させたＨＬ細胞をリン酸緩衝化生理食塩
液（以下、ＰＢＳという。）マグネシウム不含（−）液
５mlで洗浄し、０．１％（ｗ／ｖ）トリプシンを含むＰ
ＢＳを５ml加えて細胞表面全体に行き渡らせ、その液を
捨てた後、３７℃で１０分間保温し、１０％（ｖ／ｖ）
牛胎児血清を含むダルベッコＭＥＭ培地５mlを加え、ピ
ペッテイングによりＨＬ細胞を剥離して、細胞浮遊液を
調製した。この細胞浮遊液８mlと１０％牛胎児血清含有
ダルベッコＭＥＭ培地２９２mlとの混合液４mlずつを６
ウェルプラスチック製培養容器の各ウェルに加え、５％
（ｖ／ｖ）炭酸ガス雰囲気下で培養した。

【００４０】（Ｂ）クラミジア・ニューモニエＹＫ−４
１の培養クラミジアとして、クラミジア・ニューモニエＹＫ−４
１株（金本ら：Microbiol.Immunol.,Vol.37,P.495-498,
1993）を用いた。取得したＨＬ細胞に予めクラミジア・
ニューモニエＹＫ−４１株を感染させておき、この細胞
をＳＰＧ液に懸濁し、ポリプロピレン製遠心チューブに
入れ、これに１秒間隔で３０回超音波を照射し、遠心チ
ューブを１，５００×ｇで３分間遠心分離し、上清を取
得し、クラミジア・ニューモニエ浮遊液とした。６ウェ
ルプラスチック製培養容器（底面上）に増殖したＨＬ細
胞の培養上清をピペットで取り除き、これにクラミジア
・ニューモニエ浮遊液を１ウェルあたり２ml加えて、
２，０００rpmで１時間遠心吸着を行った。遠心吸着
後、クラミジア・ニューモニエ浮遊液を除き、１μg/ml
シクロヘキシミド及び１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清を含
むダルベッコＭＥＭ培地をウェルあたり４ml加え、５％
（ｖ／ｖ）炭酸ガス雰囲気下、３６℃で３日間培養し
た。培養後、滅菌したシリコン片で細胞を剥離し、細胞
を回収した。これを８，０００rpmで３０分間遠心分離
して、沈殿をＳＰＧに再懸濁し、−７０℃で保存した。

【００４１】（Ｃ）クラミジア・ニューモニエＹＫ−４
１の基本小体の精製 −７０℃に保存しておいたクラミジア・ニューモニエＹ
Ｋ−４１感染凍結ＨＬ細胞浮遊液を融解し、テフロンホ
モジナイザーでホモジナイズした。２，５００rpmで１
０分間遠心分離し、上清を回収した。沈殿は再びＳＰＧ
に懸濁し、同様の操作を行い、上清を回収した。同様の
操作を更に２回行い、得られた上清は集めて合わせた。

【００４２】別途、遠心管に５０％（ｗ／ｖ）庶糖を含
む０．０３Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH７．４）、次い
で、ウログラフィン７６％（シェーリング社製）３容量
と０．０３Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH７．４）７容量と
の混合液を重層し、この上に先に回収した上清を注意深
く重層し、８，０００rpmで１時間遠心分離した。５０
％（ｗ／ｖ）庶糖を含む０．０３Ｍトリス−塩酸緩衝液
（pH７．４）層及び沈殿を回収し、この回収液に同容量
のＳＰＧ液を加え、１０，０００rpmで３０分間遠心分
離した。上清を捨て、沈殿をＳＰＧ液に懸濁した。遠心
分離管に、ウログラフィン７６％（シェーリング社製）
と０．０３Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH７．４）の３５％
から５０％（総量に対する前者の容量比）までの連続密
度勾配液を作製し、この上に懸濁液を重層し、８０００
rpmで１時間遠心分離した。クラミジア・ニューモニエ
ＹＫ４１の基本小体に相当する黄色味を帯びた白濁した
バンドを回収し、これをＳＰＧ液で２倍に希釈し、１０
０００rpmで３０分間遠心分離した。得られた沈殿をＳ
ＰＧ液に懸濁し、タンパク質濃度を測定（バイオラッド
社のタンパク測定キットを用い、牛血清アルブミンを標
準とした）後、−７０℃で保存した。

【００４３】（Ｄ）クラミジア・ニューモニエＹＫ−４
１株のゲノムＤＮＡの調製上記精製クラミジア・ニューモニエＹＫ−４１株の基本
小体の懸濁液３００μｌ（タンパク質濃度：１．３７mg
/ml）を４℃、１２，０００rpmで５分間遠心分離した。
沈殿に１ｍＭＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩
衝液pH８．０（以下、ＴＥ緩衝液という）５００μｌを
加えて懸濁した。同様の遠心分離を再度行い、沈殿を３
００μｌのＴＥ緩衝液に懸濁した。１％ＳＤＳ水溶液３
０μｌ及び１mg/mlプロテイナーゼＫ水溶液３０μｌを
加え、５６℃で３０分間インキュベートし、基本小体を
溶解させた。０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH８．０）
飽和フェノール３５０μｌを加え、ボルテックスミキサ
ーでよく混合後、４℃、１２，０００rpmで５分間遠心
分離し、水層を回収した（ＤＮＡの抽出）。この抽出操
作はもう一度繰り返した。１０mg/mlのＲＮａｓｅ溶液
を２μｌ加え、３７℃で２時間インキュベートし、ＲＮ
Ａを分解した。０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH８．
０）飽和フェノール、クロロホルム及びイソアミルアル
コールの２５：２４：１（容量比）の混合液（以下、Ｐ
ＣＩという。）３００μｌを加え、ボルテックスミキサ
ーでよく混合し、４℃、１２，０００rpmで５分間遠心
分離し、水層を回収した。この操作を合計５回繰り返し
た。

【００４４】得られた液にその１／１０容の１０Ｍ酢酸
アンモニウム水溶液及び２容のエタノールを加え、５分
間放置し、ＤＮＡを析出させた後、４℃、１２，０００
rpmで５分間遠心分離した。沈殿は７０％エタノール水
溶液６００μｌを加え、混合し、４℃、１２，０００rp
mで５分間遠心分離する洗浄を２回繰り返した。遠沈管
のふたを開けたまま１５分間放置して沈殿を乾燥させ、
これにＴＥ２００μｌを加えて溶かし、−２０℃に保存
した。

【００４５】（Ｅ）ゲノムＤＮＡ発現ライブラリーの作
製ゲノムＤＮＡ溶液１００μｌに、制限酵素用M-buffer１
０μｌ、制限酵素混合液（ＡｃｃＩ、ＨａｅIII及び１
／５０希釈のＡｌｕＩ各０．４μｌとＴＥ２０μｌを混
合）１０μｌを加え、３７℃で２０分間反応させた。な
お、上記２０分の反応時間は、ＤＮＡが１ｋｂｐ〜７ｋ
ｂｐの大きさの部分消化ＤＮＡに分解される時間で、予
め少量のゲノムＤＮＡを用いて試験した。上記反応液に
ＰＣＩを１００μｌ加え、ボルテックスミキサーでよく
混ぜ、４℃、１２，０００rpmで５分間遠心分離し、水
層を回収した。これに３Ｍ酢酸ナトリウム水溶液１０μ
ｌ及びエタノール２２０μｌを加え、−８０℃に１５分
間静置し、部分消化ＤＮＡを析出させた。４℃、１２，
０００rpmで５分間遠心分離し、上清液を捨てたのち、
沈殿に７０％エタノール水溶液５００μｌを加えて混
ぜ、再び、１２，０００rpmで５分間遠心分離した。上
清液を捨て、沈殿を減圧下に乾燥した。

【００４６】得られた部分消化ＤＮＡを精製水２０μｌ
に溶かし、その１９μｌをとり、これに下記化１で示す
リンカー（２０pmole/μl）１４μｌ、１０ｍＭＡＴ
Ｐ４．５μｌ、５０ｍＭＭｇＣｌ₂、５０ｍＭジチオ
スレイトール及び５００μg/ml牛血清アルブミン含有
０．２Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH７．６、以下、１０倍
濃度ライゲーション用緩衝液という）４．５μｌ、精製
水２μｌ及びＴ４リガーゼ１μｌを加え、１６℃で４時
間反応させ、リンカーを付加させた。

【化１】

【００４７】リンカーを付加させた部分消化ＤＮＡを、
０．１ＭＮａＣｌ及び１ｍＭＥＤＴＡ含有１０ｍＭト
リス−塩酸緩衝液を移動相とするChroma spin 6000カラ
ムにかけた。溶出液２滴ずつを分取し、各分画の一部を
０．８％アガロースゲル電気泳動で分析して、１ｋｂｐ
から７ｋｂｐのＤＮＡ断片を含む分画を回収した。得ら
れた分画１４４μｌに、精製水１３μｌ、１０ｍＭＡ
ＴＰ２０μｌ、０．１ＭＭｇＣｌ₂、５０ｍＭジチオ
スレイトール、１ｍＭスペルミジン塩酸塩及び１ｍＭ
ＥＤＴＡ含有０．５Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH７．６、
以下、１０倍濃度リン酸化反応用緩衝液という。）２０
μｌ、及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ３μｌを加
え、３７℃で３０分間反応させ、ＤＮＡ断片の５′端を
リン酸化した。ＰＣＩ２００μｌを加えてよく振り混
ぜた後、４℃、１２，０００rpmで５分間遠心分離し、
水層を回収した。２０mg/mlグリコーゲン水溶液１μ
ｌ、３Ｍ酢酸ナトリウム水溶液２０μｌ及びエタノール
４００μｌを加えてヌクレオチドを析出させた。４℃、
１２，０００rpmで１０分間遠心分離し、上清を捨て、
沈殿に７０％エタノール２００μｌを加え混ぜ、再び遠
心分離し、上清を捨て、沈殿を風乾し、精製水１μｌを
加え溶かした。

【００４８】この液０．６μｌに、予め制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩで切断したλgt11 ＤＮＡ（１μg/μl、ストラタジ
ーン（Stratagene）社）１μｌ、１０倍濃度ライゲーシ
ョン用緩衝液０．５μl、１０ｍＭＡＴＰ０．５μｌ、
Ｔ４リガーゼ０．４μｌ及び精製水２μｌを加え、４℃
で一晩反応させた。次いで、ギガパック（Gigapack）II
Goldパッケージングキット（ストラタジーン社）を用
い、得られた組換えλgt11ＤＮＡをパッケージングし
た。

【００４９】（Ｆ）クラミジア・ニューモニエ特異的モ
ノクローナル抗体の作製骨髄腫細胞株の培養及び継代モノクローナル抗体の作製に用いた骨髄腫細胞株は、Ｐ
３／ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１（ＡＴＣＣＴＩＢ−１
８）である。１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清を含むＲＰＭ
Ｉ１６４０培地で培養し、継代した。細胞融合に供する
２週間前に、０．１３ｍＭの８−アザグアニン、０．５
μg/mlのＭＣ−２１０（マイコプラズマ除去剤、大日本
製薬(株)製）及び１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清を含むＲ
ＰＭＩ１６４０培地で１週間培養し、その後の１週間は
通常の培地で培養した。

【００５０】マウスの免疫タンパク質の濃度が２７０μg/mlの上記基本小体の懸濁
液２００μｌを、１２０００rpmで１０分間遠心分離
し、沈殿に２００μｌのＰＢＳを加え、再懸濁した。こ
れに２００μｌのフロイントコンプリートアジュバント
を加え、エマルジョンとし、その１５０μｌをマウスの
背中の皮下に注射した（この日を０日目とする）。１４
日目、３４日目及び４９日目に、タンパク質の濃度が２
７０μg/mlの精製基本小体の懸濁液１００μｌをマウス
の腹腔内に注射した。更に、６９日目にタンパク質の濃
度が８００μg/mlの精製基本小体の懸濁液５０μｌ、９
２日目に同懸濁液１００μｌをマウスの腹腔内に注射
し、９５日目に脾臓を取りだし、細胞融合に供した。

【００５１】細胞融合免疫したマウスの脾臓から得られた脾細胞１０⁸個に対
して骨髄腫細胞１０⁷個を丸底ガラスチューブにとり、
よく混合し、１４００rpmで５分間遠心分離し、上清を
除去した後、細胞を更によく混合した。予め３７℃に保
温しておいた３０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール
を含むＲＰＭＩ１６４０培地０．４mlを加え、３０秒間
放置した。７００rpmで６分間遠心分離した後、ＲＰＭ
Ｉ１６４０培地１０mlを加え、ポリエチレングリコール
がよく混ざるようにガラスチューブをゆっくり回転さ
せ、１４００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を完全に
除去し、沈殿に５mlのＨＡＴ培地を加え、５分間放置し
た。更に１０〜２０mlのＨＡＴ培地を加え、３０分間放
置した後、骨髄腫細胞濃度が３．３×１０⁵/mlとなるよ
うにＨＡＴ培地を加えて細胞を懸濁させ、パスツールピ
ペットを用い９６ウェルプラスチック製培養容器のウェ
ルに２滴ずつ分注した。５％（ｖ／ｖ）炭酸ガス雰囲気
下、３６℃で培養し、１日後、７日後及び１４日後にウ
ェルにＨＡＴ培地を１〜２滴加えた。

【００５２】抗体生産細胞のスクリーニング精製したクラミジアニューモニエＹＫ４１の基本小体を
１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳで可溶化し、０．０２％アジ化ソ
ーダ含有０．０５Ｍ重炭酸ソーダ緩衝液（pH９．６）に
対して透析したのち、タンパク質濃度が１μg/mlとなる
ように希釈した液を、塩化ビニル製９６ウェルＥＩＡ用
プレートのウェルに５０μｌとり、４℃で一晩放置し、
抗原を吸着させた。上澄みを除去し、ウェルに０．０２
％（ｗ／ｖ）ツィーン２０を含むＰＢＳ１５０μｌを加
え、３分間放置し、その後除去・洗浄した。洗浄操作を
更に１回行なった後、ウェルに１％（ｖ／ｖ）牛血清ア
ルブミンを含むＰＢＳ１００μｌを加え、４℃で一晩放
置し、ブロッキングを行なった。牛血清アルブミンを含
むＰＢＳを除いた後、０．０２％（ｗ／ｖ）ツィーン２
０を含むＰＢＳで同様に２回洗浄後、ウェルに融合細胞
の培養上清を５０μｌ加え、室温で２時間放置した。
０．０２％（ｗ／ｖ）ツィーン２０を含むＰＢＳで同様
に３回洗浄後、ウェルに２５ng/mlのペルオキシダーゼ
標識化ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を５０μｌ加え、室温で
２時間放置した。０．０２％（ｗ／ｖ）ツィーン２０を
含むＰＢＳで同様に３回洗浄後、ウェルにＡＢＴＳ溶液
（ＫＰＬ社製）を５０μｌ加え、室温で１５分〜１時間
放置して発色反応させた後、９６ウエルＥＩＡプレート
用光度計で４０５nmの吸光度を測定した。

【００５３】この結果、陽性のウエルが見出され、その
培養上清中には基本小体と反応する抗体が含まれている
ことが分かった。このウェル中の細胞をそれぞれパスツ
ールピペットで回収し、２４ウェルプラスチック製培養
容器に移し、ＨＡＴ培地１〜２ｍｌを加え、同様に培養
した。

【００５４】限界希釈法によるクローニング２４ウェルプラスチック製培養容器で増殖させた融合細
胞の細胞濃度を測定し、細胞数が２０個／mlとなるよう
それぞれをＨＴ培地で希釈した。別にＨＴ培地に懸濁し
た４〜６週齢のマウス胸腺細胞を９６ウェルプラスチッ
ク製培養容器に２×１０⁵個／ウェルとり、これに上記
の融合細胞（細胞濃度が２０個／ml）を５０μｌ／ウェ
ルずつ加え、５％（ｖ／ｖ）炭酸ガス雰囲気下、３６℃
で培養し、その１日後、７日後及び１４日後にＨＴ培地
を１〜２滴／ウェル加えた。細胞の増殖が見られたウェ
ルの培養上清を５０μｌ回収し、上記と同様の方法で抗
体の生産を確認した。ウェル中に単一の細胞コロニーし
か存在せず、基本小体と反応する抗体を生産するもの
で、かつ増殖が早い細胞をウェルから回収し、引き続き
２４ウェルプラスチック製培養容器で増殖させた。更
に、同様のクローニング操作を繰り返し、最終的にハイ
ブリドーマＡＹ６Ｅ２Ｅ８を得た。

【００５５】モノクローナル抗体の生産ハイブリドーマＡＹ６Ｅ２Ｅ８を、１０％（ｖ／ｖ）牛
胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地２０mlを入れた７５
cm²プラスチック製細胞培養用フラスコで増殖させ、３
〜４日ごとにその培養液から１６〜１８mlを抜き取り、
代わりに新鮮な１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清含有ＲＰＭ
Ｉ１６４０培地を総量で２０mlとなるように補い、継代
培養を続けた。抜き取って回収した細胞培養液は、１２
００rpmで５分間遠心分離し、上清（モノクローナル抗
体含有培養上清）を回収した。また、予め２週間前にプ
リスタン０．５mlを腹腔内に注射しておいたＢａｌｂ／
ｃマウスのその腹腔内に、１×１０⁶個／mlとなるよう
ＰＢＳで懸濁したハイブリドーマ株を１ml注射した。３
週間後、ｂａｌｂ／ｃマウスの腹水を回収し、１２００
rpmで５分間遠心分離し、上清（モノクローナル抗体含
有腹水）を回収した。

【００５６】モノクローナル抗体の精製ハイブリドーマＡＹ６Ｅ２Ｅ８が生産するモノクローナ
ル抗体は以下のようにして精製した。ハイブリドーマＡ
Ｙ６Ｅ２Ｅ８をマウス腹腔内に注射して得られたモノク
ローナル抗体含有腹水１容に３容のＰＢＳを加えて混合
し、３０００rpmで１０分間遠心分離し、その上清をポ
アサイズ０．２２μｍのフィルタで濾過後、これをクロ
マトップスーパープロテインＡカラム（径４．６mm×１
００mm、日本ガイシ(株)製）を用いるＨＰＬＣで精製し
た。カラムは予め、ＰＢＳで平衡化しておいた。０．２
２μｍフィルタで濾過後のサンプル１ｍｌをカラムに注
入後、ＰＢＳを１ml/minで３分間流し、次いで、５ml/m
inで４分間流してカラムを洗浄した後、精製水１ＬにＮ
ａＣｌ８．７７ｇ、クエン酸（一水和物）１６．７ｇ
及びＮａ₂ＨＰＯ₄・１２Ｈ₂Ｏ１４．７２ｇを溶かした
液を２ml/minで５分間流してモノクローナル抗体を溶出
した。モノクローナル抗体の溶出画分を集め、ＴＴＢＳ
溶液で希釈した。

【００５７】クラミジア・ニューモニエの基本小体を溶
解し、基本小体に含有されているペプチドを取得した。
このペプチドと上記モノクローナル抗体を用いてウェス
タンブロットを行い、取得したモノクローナル抗体の特
異性を確認した。その結果、取得したモノクローナル抗
体はクラミジア・ニューモニエ５３ＫＤａ抗原ポリペプ
チドを認識することがわかった。ハイブリドーマＡＹ
６Ｅ２Ｅ８と同様にして、ハイブリドーマＳＣＰ５３を
取得した。上記の方法と同様にしてハイブリドーマＳＣ
Ｐ５３が産生するモノクローナル抗体の特異性を調べた
結果、このモノクローナル抗体は、クラミジア・ニュー
モニエの５３ＫＤａ抗原ポリペプチドを認識することが
わかった。また、ハイブリドーマＡＹ６Ｅ２Ｅ８及び
ハイブリドーマＳＣＰ５３が産生するモノクローナル抗
体のサブクラスを調べた結果、これらの抗体のサブクラ
スは、それぞれ、ＩｇＧ₂b及びＩｇＧ₁であった。

【００５８】（Ｇ）抗原ポリペプチドをコードするＤＮ
Ａのクローニング大腸菌Ｙ１０９０ｒ−株の一白金耳を１０ｍＭＭｇＳ
Ｏ₄３ml、０．２％マルトース及び５０μg/mlアンピシ
リン含有のＬＢ（水１Ｌ中にＮａＣｌ５ｇ、ポリペプ
トン１０ｇ及び酵母エキス５ｇを含む）培地に接種し、
３７℃で一晩振とう培養した後、これを２，０００rpm
で１０分間遠心分離した。沈殿（大腸菌）に１０ｍＭ
ＭｇＳＯ₄水溶液９mlを加えて混ぜ、この大腸菌懸濁液
の０．３５mlを採り、これにλgt11（ＤＮＡライブラリ
ー）懸濁液を０．１μｌ加え、３７℃で２０分間インキ
ューベートし、大腸菌にλgt11を感染させた。予め４７
℃に保温した液状ＬＢ寒天培地２．５mlに、上記λgt11
感染大腸菌を加え、これを直ちにＬＢ寒天培地上に撒い
た。上層寒天培地が固化した後、４２℃で３〜４時間培
養し、プラークが観察された時点で１０ｍＭＩＰＴＧ
水溶液に浸漬したニトロセルロースフィルター（φ８２
mm）を上層寒天培地に乗せ、３７℃で１２時間培養し
た。黒インクをつけた注射針で非対称に３ヵ所突き刺し
てフィルターに目印をつけた後、フィルターを寒天培地
からとり出し、１５０ｍＭＮａＣｌ及び０．１％ツィ
ーン２０含有２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（pH７．５）
（以下、ＴＴＢＳ緩衝液という）で３回洗浄した。寒天
培地は冷蔵庫中に保存した。

【００５９】フィルターを１５０ｍＭＮａＣｌ含有２
０ｍＭトリス−塩酸緩衝液(pH７．５）（以下、ＴＢＳ
緩衝液という）の０．１％牛血清アルブミン含有液に浸
し、３７℃で１時間振とうし、ブロッキング反応を行っ
た。次いで、フィルターをＴＴＢＳ緩衝液で２回洗浄し
たのち、５μg/mlのクラミジア・ニューモニエ特異的モ
ノクローナル抗体（ＡＹ６Ｅ２Ｅ８又はＳＣＰ５３）の
ＴＴＢＳ溶液に浸し、３７℃、１時間振とうした。フィ
ルターをＴＴＢＳ緩衝液で３回洗浄した後、パーオキシ
ダーゼ標識の（５０ng/ml）抗マウスＩｇＧ抗体溶液
（ＴＴＢＳ緩衝液）中、３７℃で１時間振とうした。フ
ィルターをＴＴＢＳ緩衝液で３回、及びＴＢＳ緩衝液で
３回洗浄した後、発色基質液（ＴＢＳ緩衝液１００mlに
３０％過酸化水素水溶液６０μｌと０．３％４−クロ
ロ−１−ナフトールのメタノール溶液２０mlを加えて調
製）に浸漬し、室温で約３０分間放置した。十分発色し
た時点でフィルターをとり出し、精製水で洗浄し、風乾
した。

【００６０】フィルターの発色スポットに対応する寒天
培地上のプラークを捜して同定し、この部分の寒天をパ
スツールピペットでつき刺し、プラークを回収した。回
収したプラークはクロロホルム１滴を加えた０．１Ｍ
ＮａＣｌ、８ｍＭ硫酸マグネシウム及び０．０１％ゼラ
チン含有５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（pH７．５）（以
下、ＳＭ緩衝液という）中に採り、４℃で一晩放置しプ
ラーク中のλファージを抽出した。プラークが全て上記
モノクローナル抗体と反応するようになるまで、前記操
作を繰り返し、抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡを
クローン化した。このようにして、クラミジア・ニュー
モニエ特異的モノクローナル抗体反応性のクラミジア・
ニューモニエ特異的抗原ポリペプチドを発現するλファ
ージが得られ、これを５３−３Ｓλファージと命名し
た。

【００６１】（Ｈ）５３−３Ｓλファージの培養とＤＮ
Ａ精製前記（Ｇ）で述べた方法と同様にしてプラークを形成さ
せ、一つのプラークを回収し、１００μｌのＳＭ緩衝液
に入れ、４℃で一晩放置しλファージを抽出した。ＬＢ
培養液で一晩培養した大腸菌Ｙ１０９０ｒ−株２５０μ
ｌに、λファージ液５μｌを加え、３７℃で２０分間放
置し、大腸菌にλファージを感染させた。予め３７℃に
温めておいた１０ｍＭ硫酸マグネシウムを含むＬＢ培地
５０mlに接種し、λファージによる大腸菌の溶菌が起こ
るまで３７℃で５時間振とう培養した。２５０μｌのク
ロロホルムを加え、３，０００rpmで１０分間遠心分離
し大腸菌細胞残渣を除き、λファージ懸濁液を得た。λ
ファージＤＮＡは、Wizardλ preps キット（プロメガ
社、商品名）を用いて精製した。

【００６２】（Ｉ）クラミジア・ニューモニエ抗原ポリ
ペプチドをコードするＤＮＡの増幅６００μｌ用のマイクロチューブに、精製水６１．５μ
ｌ、１０倍濃度反応用緩衝液（５００ｍＭＫＣｌ、
１５ｍＭＭｇＣｌ₂、０．０１％ゼラチンを含むトリ
ス−塩酸緩衝液pH８．３）１０μｌ、２０ｍＭｄＮＴ
Ｐ１μｌ、５３−３ＳλファージＤＮＡ溶液０．１μ
ｌ、２０ｎＭ λgt11 forward primer（宝酒造(株)
製、商品名）１μｌ、２０ｎＭ λgt11 reverse prime
r（宝酒造(株)製、商品名）１μｌ、AmpliTaq DNA Poly
merase（宝酒造(株)製、商品名）０．５μｌを入れ、ミ
ネラルオイルを２滴重層した。９４℃ ３０秒、５５℃
３０秒、７３℃ ２分のサイクルのインキュベーション
を３０回繰返し、ＤＮＡを増幅した。反応後、１．２％
低温融解アガロースゲル電気泳動を行い、増幅されたＤ
ＮＡを切り出して Wizard PCR Prep キット（プロメガ
社製、商品名）で精製した。

【００６３】（Ｊ）ＤＮＡ塩基配列分析ＤＮＡ塩基配列分析は、ＰＣＲで増幅したＤＮＡを鋳型
として、Taq DNA ポリメラーゼを用いた蛍光標識ターミ
ネータサイクルシークエンス法でシークエンス反応を行
い、３７３Ａ型ＤＮＡシークエンサ（アプライドバイオ
システムズ社製、商品名）で分析を行った。得られたＤ
ＮＡ塩基配列を遺伝子配列分析ソフト「ＤＮＡＳＩＳ」
（日立ソフトウェアエンジニアリング(株)製、商品名）
を用いて、編集、連結、アミノ酸翻訳領域の推定を行な
い、配列番号４の配列を得た。配列番号４の配列の解析
結果から、５３ＫＤａ抗原ポリペプチドについて、その
Ｎ末端からＣ末端に向けて約６０％のアミノ酸配列が解
明されたことが分かった。

【００６４】上記クラミジア・ニューモニエ抗原ポリペ
プチドをコードするＤＮＡは、クラミジア・ニューモニ
エに特異的で、かつ、５３ＫＤａ抗原ポリペプチドを認
識するモノクローナル抗体を利用してクローニングされ
たので、このＤＮＡは、明らかに５３ＫＤａ抗原ポリペ
プチドをコードしている。配列番号４の塩基配列及びア
ミノ酸配列の相同性検索をＧｅｎＢａｎｋデータベース
で行なった結果、高い相同性を示す既知の配列は無かっ
た。

【００６５】実施例２クラミジア・ニューモニエの５
３ＫＤａ抗原ポリペプチド全体をコードするＤＮＡの取
得配列番号４の塩基配列を元に、配列番号５及び６の塩基
配列を有するＤＮＡを、ＤＮＡ合成機を用いて合成し
た。実施例１で得たクラミジア・ニューモニエＹＫ４１
株のゲノムＤＮＡの水溶液１０μｌ（ＤＮＡ含有量：約
１μｇ）に、１０倍濃縮Ｋバッファ５μｌ、精製水３５
μｌ及び制限酵素ＨｉｎｄIII（１９Ｕ／μｌ）５μｌ
を添加し、３７℃で３時間保温した。得られた反応液を
フェノールで抽出し、エタノールを添加し、遠心分離し
て沈殿を取得した。この沈殿に、ＰＣＲ in vitro Clon
ing Kit(宝酒造(株)製、商品名)中のＨｉｎｄIIIカセッ
トＤＮＡ（２０ng/μl）５μｌ、ライゲーション溶液１
５μｌを添加し、１６℃で３０分間保温した。

【００６６】取得した反応液をフェノールで抽出し、エ
タノールを添加し、遠心分離して沈殿を取得し、これを
１０μｌの精製水に溶解した。得られた溶液１μｌに、
精製水７８．５μｌ、１０倍濃縮ＰＣＲ用バッファ１０
μｌ、２．５ｍＭｄＮＴＰ８μｌ及びＴａｑポリメラー
ゼ０．５μｌ（５Ｕ／μｌ）を添加し、さらに、プライ
マーＤＮＡとして、配列番号５の塩基配列を有するＤＮ
Ａ（２０pmol/μl）１μｌ及び配列番号７の塩基配列を
有するＤＮＡ（２０pmol/μl）（上記キットにおいて、
プライマーＣ１として同封されていたもの）１μｌを添
加して、これらを０．６ｍｌのマイクロチューブに入
れ、ミネラルオイル２滴を重層し、９４℃３０秒、５５
℃２分、７２℃３分の温度サイクルを３０回繰り返し
た。以上の工程をＰＣＲ工程という。ＰＣＲ工程後の反
応液１μｌに、プライマーＤＮＡとして、配列番号６の
塩基配列を有するＤＮＡ（２０pmol/μl）１μｌ及び配
列番号８の塩基配列を有するＤＮＡ（２０pmol/μl）
（上記キットにおいて、プライマーＣ２として同封され
ていたもの）１μｌを用い、再度ＰＣＲ工程を行った。

【００６７】２番目のＰＣＲ工程後の反応液を１．２％
低融点アガロースゲル電気泳動させ、約１．４ｋｂｐの
大きさのＤＮＡが含有されているアガロースゲルを切り
出した。ＤＮＡの精製には Wizard PCR Prep キット
（プロメガ社製、商品名）を用いた。即ち、切り出した
アガロースゲルにキットに同封されている緩衝液を添加
し、加熱してアガロースゲルを溶解し、キットに同封さ
れている精製用樹脂を添加してＤＮＡを樹脂に吸着さ
せ、遠心分離して精製用樹脂を沈殿として取得した。沈
殿をプロパノールで洗浄し、再度遠心分離して沈殿を取
得した。沈殿に精製水を添加し、精製用樹脂からＤＮＡ
を溶出して、遠心分離し、上清（ＤＮＡ水溶液）を得
た。以上の工程をＤＮＡ精製工程という。

【００６８】取得したＤＮＡ水溶液を用い、含まれるＤ
ＮＡを鋳型とするTaq DNA ポリメラーゼを用いた蛍光標
識ターミネータサイクルシークエンス法でシークエンス
反応を行い、３７３Ａ型ＤＮＡシークエンサ（アプライ
ドバイオシステムズ社製、商品名）でそのＤＮＡの塩基
配列を分析した。得られたＤＮＡ塩基配列を遺伝子配列
分析ソフト「ＤＮＡＳＩＳ」（日立ソフトウェアエンジ
ニアリング(株)製、商品名）を用いて、編集、連結、ア
ミノ酸翻訳領域の推定を行なった。以上の工程を塩基配
列解析工程という。

【００６９】取得したＤＮＡの塩基配列を解析した結
果、このＤＮＡは実施例１で取得したクラミジア・ニュ
ーモニエの５３ＫＤａ抗原ポリペプチドをコードするＤ
ＮＡの中の３′末端側の約５０ｂｐの塩基配列を有して
いた。さらに、その塩基配列の下流には、終始コドンを
含有する約０．７ｋｂのコード領域が存在していること
がわかった。配列番号４の塩基配列を元に、クラミジア
・ニューモニエの５３ＫＤａ抗原ポリペプチドをコード
するＤＮＡの上流部分に相当するプライマーとして、配
列番号９の塩基配列を有するＤＮＡを、また、上記の約
０．７ｋｂのコード領域を含む塩基配列を元に、クラミ
ジア・ニューモニエの５３ＫＤａ抗原ポリペプチドをコ
ードするＤＮＡの下流部分に相当するプライマーとし
て、配列番号１０の塩基配列を有するＤＮＡを、それぞ
れ、ＤＮＡ合成機を用いて合成した。

【００７０】実施例１で得たクラミジア・ニューモニエ
ＹＫ−４１株のゲノムＤＮＡの水溶液１μｌを用い、プ
ライマーＤＮＡとして配列番号９の塩基配列を有するＤ
ＮＡ（２０pmol/μl）１μｌ及び配列番号１０の塩基配
列を有するＤＮＡ（２０pmol/μl）１μｌを用いてＰＣ
Ｒ工程を行った。３番目のＰＣＲ工程後の反応液を用
い、上記ＤＮＡ精製工程を行い、約１．５ｋｂｐのＤＮ
Ａを取得した。取得したＤＮＡ水溶液を用い、上記塩基
配列解析工程を行った。取得したＤＮＡの塩基配列を解
析した結果、このＤＮＡは配列番号１の塩基配列を有し
ていることがわかった。また、５３−３Ｓλファージの
ＤＮＡと前述のλgt11のＤＮＡライブラリーを用いてゲ
ノムウォーキングを行い、クラミジア・ニューモニエの
５３ＫＤａ抗原ポリペプチド全体をコードするＤＮＡを
取得した。

【００７１】実施例３ＰＣＲ法によるクラミジア・ニ
ューモニエ遺伝子の検出配列番号２の塩基配列からなるＤＮＡと配列番号３の塩
基配列からなるＤＮＡをアプライドバイオシステムズ社
製のＤＮＡ合成機で化学合成し、それぞれプライマー５
３Ｆ２、プライマー５３Ｒ２と名付けた。クラミジア・
ニューモニエＹＫ４１株、またはクラミジア・トラコマ
チスＬ２株、又はクラミジア・シッタシＢｕｇｄ．１７
−ＳＬ株を感染させた細胞を遠心分離で回収し、ＫＣｌ
５０ｍＭ、ＭｇＣｌ₂ ２．５ｍＭ、ゼラチン０．
１mg/ml、ノニデットＰ４０(Nonidet P40) ０．４５％
トゥイーン２０(Tween 20)０．４５％、プロテイネース
Ｋ０．１mg/mlを含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（p
H８．３）０．１mlを加え、５６℃で１時間保温した
後、９５℃で１０分間加熱してプロテイネースＫを失活
させ、各クラミジアの遺伝子を含む試料とした。

【００７２】各試料１μｌに、精製水７８．５μｌ、
２．５ｍＭｄＮＴＰ水溶液８μｌ、５００ｍＭＫＣ
ｌ及び１５ｍＭＭｇＣｌ₂を含む１００ｍＭトリス−
塩酸緩衝液（pH８．３）１０μｌ、３０μＭの上記プラ
イマー５３Ｆ２及びプライマー５３Ｒ２の水溶液各１μ
ｌ、並びに５Ｕ／μｌタックポリメラーゼ０．５μ
ｌを添加し、ミネラルオイル５０μｌを重層した後、９
４℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃６０秒の加熱、冷
却、保温のサイクルを３０回繰り返した。反応終了後、
反応液２μｌを取得し、アガロースゲル電気泳動を行
い、ゲルを０．５μ/mlの臭化エチジウムに浸し、紫外
線照射下でＤＮＡのバンドを観察した。その結果、クラ
ミジア・ニューモニエＹＫ４１株から得た試料につい
て、配列番号１の塩基配列のうち、プライマー５３Ｆ２
の塩基配列とプライマー５３Ｒ２の塩基配列に相補的な
塩基配列で挾まれた領域に相当する３６０ｂｐの大きさ
のＤＮＡのバンドが観察された。しかし、他の株から得
た試料についてはバンドが観察されなかった。

【００７３】

【発明の効果】請求項１記載のプローブは、クラミジア
・ニューモニエ遺伝子の測定やクラミジア・ニューモニ
エ感染の診断に好適である。請求項２記載のプローブ
は、請求項１記載のプローブの効果を奏し、さらに、ク
ラミジア・ニューモニエに特異的な塩基配列を有するの
で、クラミジア・ニューモニエ感染の正確な診断に利用
できる。請求項３記載のプローブは、請求項１記載のプ
ローブの効果を奏し、さらに、クラミジア・ニューモニ
エに特異的な塩基配列を有するので、クラミジア・ニュ
ーモニエ感染の正確な診断に利用できる。請求項４記載
の測定法は、クラミジア・ニューモニエ感染の診断に好
適である。請求項５記載の測定用試薬は、クラミジア・
ニューモニエ感染の診断に好適である。

【００７４】請求項６記載のプライマーは、クラミジア
・ニューモニエ遺伝子の測定やクラミジア・ニューモニ
エ感染の診断に好適である。請求項７記載のプライマー
は、請求項６記載のプライマーの効果を奏し、さらに、
クラミジア・ニューモニエに特異的な塩基配列を有する
ので、クラミジア・ニューモニエ感染の正確な診断に利
用できる。請求項８記載のプライマーは、請求項６記載
のプライマーの効果を奏し、さらに、クラミジア・ニュ
ーモニエに特異的な塩基配列を有するので、クラミジア
・ニューモニエ感染の正確な診断に利用できる。請求項
９記載の測定法は、クラミジア・ニューモニエ感染の診
断に好適である。請求項１０記載の測定用試薬は、クラ
ミジア・ニューモニエ感染の診断に好適である。

【００７５】

【配列表】

配列番号：1 配列の長さ：1464 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖配列の種類：Genomic DNA 配列 ATG TCT ATT TCA TCT TCT TCA GGA CCT GAC AAT CAA AAA AAT ATC ATG 48 Met Ser Ile Ser Ser Ser Ser Gly Pro Asp Asn Gln Lys Asn Ile Met 1 5 10 15 TCT CAA GTT CTG ACA TCG ACA CCC CAG GGC GTG CCC CAA CAA GAT AAG 96 Ser Gln Val Leu Thr Ser Thr Pro Gln Gly Val Pro Gln Gln Asp Lys 20 25 30 CTG TCT GGC AAC GAA ACG AAG CAA ATA CAG CAA ACA CGT CAG GGT AAA 144 Leu Ser Gly Asn Glu Thr Lys Gln Ile Gln Gln Thr Arg Gln Gly Lys 35 40 45 AAC ACT GAG ATG GAA AGC GAT GCC ACT ATT GCT GGT GCT TCT GGA AAA 192 Asn Thr Glu Met Glu Ser Asp Ala Thr Ile Ala Gly Ala Ser Gly Lys 50 55 60 GAC AAA ACT TCC TCG ACT ACA AAA ACA GAA ACA GCT CCA CAA CAG GGA 240 Asp Lys Thr Ser Ser Thr Thr Lys Thr Glu Thr Ala Pro Gln Gln Gly 65 70 75 80 GTT GCT GCT GGG AAA GAA TCC TCA GAA AGT CAA AAG GCA GGT GCT GAT 288 Val Ala Ala Gly Lys Glu Ser Ser Glu Ser Gln Lys Ala Gly Ala Asp 85 90 95 ACT GGA GTA TCA GGA GCG GCT GCT ACT ACA GCA TCA AAT ACT GCA ACA 336 Thr Gly Val Ser Gly Ala Ala Ala Thr Thr Ala Ser Asn Thr Ala Thr 100 105 110 AAA ATT GCT ATG CAG ACC TCT ATT GAA GAG GCG AGC AAA AGT ATG GAG 384 Lys Ile Ala Met Gln Thr Ser Ile Glu Glu Ala Ser Lys Ser Met Glu 115 120 125 TCT ACC TTA GAG TCA CTT CAA AGC CTC AGT GCC GCG CAA ATG AAA GAA 432 Ser Thr Leu Glu Ser Leu Gln Ser Leu Ser Ala Ala Gln Met Lys Glu 130 135 140 GTC GAA GCG GTT GTT GTT GCT GCC CTC TCA GGG AAA AGT TCG GGT TCC 480 Val Glu Ala Val Val Val Ala Ala Leu Ser Gly Lys Ser Ser Gly Ser 145 150 155 160 GCA AAA TTG GAA ACA CCT GAG CTC CCC AAG CCC GGG GTG ACA CCA AGA 528 Ala Lys Leu Glu Thr Pro Glu Leu Pro Lys Pro Gly Val Thr Pro Arg 165 170 175 TCA GAG GTT ATC GAA ATC GGA CTC GCG CTT GCT AAA GCA ATT CAG ACA 576 Ser Glu Val Ile Glu Ile Gly Leu Ala Leu Ala Lys Ala Ile Gln Thr 180 185 190 TTG GGA GAA GCC ACA AAA TCT GCC TTA TCT AAC TAT GCA AGT ACA CAA 624 Leu Gly Glu Ala Thr Lys Ser Ala Leu Ser Asn Tyr Ala Ser Thr Gln 195 200 205 GCA CAA GCA GAC CAA ACA AAT AAA CTA GGT CTA GAA AAG CAA GCG ATA 672 Ala Gln Ala Asp Gln Thr Asn Lys Leu Gly Leu Glu Lys Gln Ala Ile 210 215 220 AAA ATC GAT AAA GAA CGA GAA GAA TAC CAA GAG ATG AAG GCT GCC GAA 720 Lys Ile Asp Lys Glu Arg Glu Glu Tyr Gln Glu Met Lys Ala Ala Glu 225 230 235 240 CAG AAG TCT AAA GAT CTC GAA GGA ACA ATG GAT ACT GTC AAT ACT GTG 768 Gln Lys Ser Lys Asp Leu Glu Gly Thr Met Asp Thr Val Asn Thr Val 245 250 255 ATG ATC GCG GTT TCT GTT GCC ATT ACA GTT ATT TCT ATT GTT GCT GCT 816 Met Ile Ala Val Ser Val Ala Ile Thr Val Ile Ser Ile Val Ala Ala 260 265 270 ATT TTT ACA TGC GGA GCT GGA CTC GCT GGA CTC GCT GCG GGA GCT GCT 864 Ile Phe Thr Cys Gly Ala Gly Leu Ala Gly Leu Ala Ala Gly Ala Ala 275 280 285 GTA GGT GCA GCG GCA GCT GGA GGT GCA GCA GGA GCT GCT GCC GCA ACC 912 Val Gly Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala Ala Gly Ala Ala Ala Ala Thr 290 295 300 ACG GTA GCA ACA CAA ATT ACA GTT CAA GCT GTT GTC CAA GCG GTG AAA 960 Thr Val Ala Thr Gln Ile Thr Val Gln Ala Val Val Gln Ala Val Lys 305 310 315 320 CAA GCT GTT ATC ACA GCT GTC AGA CAA GCG ATC ACC GCG GCT ATA AAA 1008 Gln Ala Val Ile Thr Ala Val Arg Gln Ala Ile Thr Ala Ala Ile Lys 325 330 335 GCG GCT GTC AAA TCT GGA ATA AAA GCA TTT ATC AAA ACT TTA GTC AAA 1056 Ala Ala Val Lys Ser Gly Ile Lys Ala Phe Ile Lys Thr Leu Val Lys 340 345 350 GCG ATT GCC AAA GCC ATT TCT AAA GGA ATC TCT AAG GTT TTC GCT AAG 1104 Ala Ile Ala Lys Ala Ile Ser Lys Gly Ile Ser Lys Val Phe Ala Lys 355 360 365 GGA ACT CAA ATG ATT GCG AAG AAC TTC CCC AAG CTC TCG AAA GTC ATC 1152 Gly Thr Gln Met Ile Ala Lys Asn Phe Pro Lys Leu Ser Lys Val Ile 370 375 380 TCG TCT CTT ACC AGT AAA TGG GTC ACG GTT GGG GTT GGG GTT GTA GTT 1200 Ser Ser Leu Thr Ser Lys Trp Val Thr Val Gly Val Gly Val Val Val 385 390 395 400 GCG GCG CCT GCT CTC GGT AAA GGG ATT ATG CAA ATG CAG CTC TCG GAG 1248 Ala Ala Pro Ala Leu Gly Lys Gly Ile Met Gln Met Gln Leu Ser Glu 405 410 415 ATG CAA CAA AAC GTC GCT CAA TTT CAG AAA GAA GTC GGA AAA CTG CAG 1296 Met Gln Gln Asn Val Ala Gln Phe Gln Lys Glu Val Gly Lys Leu Gln 420 425 430 GCT GCG GCT GAT ATG ATT TCT ATG TTC ACT CAA TTT TGG CAA CAG GCA 1344 Ala Ala Ala Asp Met Ile Ser Met Phe Thr Gln Phe Trp Gln Gln Ala 435 440 445 AGT AAA ATT GCC TCA AAA CAA ACA GGC GAG TCT AAT GAA ATG ACT CAA 1392 Ser Lys Ile Ala Ser Lys Gln Thr Gly Glu Ser Asn Glu Met Thr Gln 450 455 460 AAA GCT ACC AAG CTG GGC GCT CAA ATC CTT AAA GCG TAT GCC GCA ATC 1440 Lys Ala Thr Lys Leu Gly Ala Gln Ile Leu Lys Ala Tyr Ala Ala Ile 465 470 475 480 AGC GGA GCC ATC GCT GGC GCA GCA 1464 Ser Gly Ala Ile Ala Gly Ala Ala 485 488

【００７６】配列番号：2 配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 AGCTGTCTGG CAACGAAACG 20

【００７７】配列番号：3 配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 GCAGCAACAA CAACCGCTTC 20

【００７８】配列番号：4 配列の長さ：1048 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 起源生物名：C. ニューモニエ株名：YK-41 直接の起源クローン：53-3S 配列の特徴特徴を表す記号：CDS 存在位置：236..1012 特徴を決定した方法：P 配列 TCAGTATCGG CGGAATTCGA ACCCCTTCGC GGCTCTTTCT GGAACTCTAG AATCTTTACA 60 TCTCGAAGAG TTAACTCAAG GATTATTCCC TTCTGCCCAA GAAGATGCCA ACTTCGCAAA 120 GGAGTTATCT TCAGTAGTAC ACGGATTAAA AAACCTAACC ACTGTAGTTA ATAAACAAAT 180 GGTTAAAGGC GCTGAGTAAA GCCCTTTGCA GAATCAAACC CCTTAGGATA CAAAC ATG 238 Met 1 TCT ATT TCA TCT TCT TCA GGA CCT GAC AAT CAA AAA AAT ATC ATG TCT 286 Ser Ile Ser Ser Ser Ser Gly Pro Asp Asn Gln Lys Asn Ile Met Ser 5 10 15 CAA GTT CTG ACA TCG ACA CCC CAG GGC GTG CCC CAA CAA GAT AAG CTG 334 Gln Val Leu Thr Ser Thr Pro Gln Gly Val Pro Gln Gln Asp Lys Leu 20 25 30 TCT GGC AAC GAA ACG AAG CAA ATA CAG CAA ACA CGT CAG GGT AAA AAC 382 Ser Gly Asn Glu Thr Lys Gln Ile Gln Gln Thr Arg Gln Gly Lys Asn 35 40 45 ACT GAG ATG GAA AGC GAT GCC ACT ATT GCT GGT GCT TCT GGA AAA GAC 430 Thr Glu Met Glu Ser Asp Ala Thr Ile Ala Gly Ala Ser Gly Lys Asp 50 55 60 65 AAA ACT TCC TCG ACT ACA AAA ACA GAA ACA GCT CCA CAA CAG GGA GTT 478 Lys Thr Ser Ser Thr Thr Lys Thr Glu Thr Ala Pro Gln Gln Gly Val 70 75 80 GCT GCT GGG AAA GAA TCC TCA GAA AGT CAA AAG GCA GGT GCT GAT ACT 526 Ala Ala Gly Lys Glu Ser Ser Glu Ser Gln Lys Ala Gly Ala Asp Thr 85 90 95 GGA GTA TCA GGA GCG GCT GCT ACT ACA GCA TCA AAT ACT GCA ACA AAA 574 Gly Val Ser Gly Ala Ala Ala Thr Thr Ala Ser Asn Thr Ala Thr Lys 100 105 110 ATT GCT ATG CAG ACC TCT ATT GAA GAG GCG AGC AAA AGT ATG GAG TCT 622 Ile Ala Met Gln Thr Ser Ile Glu Glu Ala Ser Lys Ser Met Glu Ser 115 120 125 ACC TTA GAG TCA CTT CAA AGC CTC AGT GCC GCG CAA ATG AAA GAA GTC 670 Thr Leu Glu Ser Leu Gln Ser Leu Ser Ala Ala Gln Met Lys Glu Val 130 135 140 145 GAA GCG GTT GTT GTT GCT GCC CTC TCA GGG AAA AGT TCG GGT TCC GCA 718 Glu Ala Val Val Val Ala Ala Leu Ser Gly Lys Ser Ser Gly Ser Ala 150 155 160 AAA TTG GAA ACA CCT GAG CTC CCC AAG CCC GGG GTG ACA CCA AGA TCA 766 Lys Leu Glu Thr Pro Glu Leu Pro Lys Pro Gly Val Thr Pro Arg Ser 165 170 175 GAG GTT ATC GAA ATC GGA CTC GCG CTT GCT AAA GCA ATT CAG ACA TTG 814 Glu Val Ile Glu Ile Gly Leu Ala Leu Ala Lys Ala Ile Gln Thr Leu 180 185 190 GGA GAA GCC ACA AAA TCT GCC TTA TCT AAC TAT GCA AGT ACA CAA GCA 862 Gly Glu Ala Thr Lys Ser Ala Leu Ser Asn Tyr Ala Ser Thr Gln Ala 195 200 205 CAA GCA GAC CAA ACA AAT AAA CTA GGT CTA GAA AAG CAA GCG ATA AAA 910 Gln Ala Asp Gln Thr Asn Lys Leu Gly Leu Glu Lys Gln Ala Ile Lys 210 215 220 225 ATC GAT AAA GAA CGA GAA GAA TAC CAA GAG ATG AAG GCT GCC GAA CAG 958 Ile Asp Lys Glu Arg Glu Glu Tyr Gln Glu Met Lys Ala Ala Glu Gln 230 235 240 AAG TCT AAA GAT CTC GAA GGA ACA ATG GAT ACT GTC AAT ACT GTG ATG 1006 Lys Ser Lys Asp Leu Glu Gly Thr Met Asp Thr Val Asn Thr Val Met 245 250 255 ATC GCG AAGGGGTTCG AATTCCAGCT GAGCGCCGGT CGCTAC 1048 Ile Ala 259

【００７９】配列番号：5 配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 GCTGCCGAAC AGAAGTCTAA 20

【００８０】配列番号：6 配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 CTCGAAGGAA CAATGGATAC
２０

【００８１】配列番号：７配列の長さ：23 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 GTACATATTG TCGTTAGAAC GCG 23

【００８２】配列番号：8 配列の長さ：23 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 TAATACGACT CACTATAGGG AGA 23

【００８３】配列番号：9 配列の長さ：28 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 GCGGATCCTG ATGTCTATTT CATCTTCT 28

【００８４】配列番号：10 配列の長さ：30 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 ATCTCGAGTT TTATGCTGCT GCGCCAGCGA ３
０

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/569 ＦＧ０１Ｎ 33/566 33/571 33/569 Ａ６１Ｋ 49/00 Ａ 33/571 8517−4ＨＣ０７Ｋ 14/295 // Ａ６１Ｋ 49/00 7823−4ＢＣ１２Ｑ 1/04 Ｃ０７Ｋ 14/295 9162−4ＢＣ１２Ｎ 15/00 ＣＣ１２Ｑ 1/04 9162−4ＢＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (54)【発明の名称】クラミジア・ニューモニエ遺伝子の測定用プローブ及びプライマー、該プローブ又はプライマーを用いるクラミジア・ニューモニエ遺伝子の測定法、並びに該プローブ又はプライマーを含有してなるクラミジア・ニューモニエ遺伝子の測定用試薬

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】（ａ）配列番号１のＤＮＡの中の連続し
た少なくとも１０塩基の塩基配列を有するＤＮＡ、
（ｂ）上記（ａ）のＤＮＡに相補的なＤＮＡ、又は
（ｃ）上記（ａ）若しくは（ｂ）のＤＮＡと９０％以上
の相同性を有するＤＮＡ、のいずれかを含有するＤＮＡ
からなる、クラミジア・ニューモニエ遺伝子の測定用プ
ローブ。
【請求項２】塩基配列が配列番号２の塩基配列であ
る、請求項１記載のプローブ。
【請求項３】塩基配列が配列番号３の塩基配列であ
る、請求項１記載のプローブ。
【請求項４】請求項１〜３のいずれかに記載のプロー
ブを用いる、クラミジア・ニューモニエ遺伝子の測定
法。
【請求項５】請求項１〜３のいずれかに記載のプロー
ブを含有してなるクラミジア・ニューモニエ遺伝子の測
定用試薬。
【請求項６】（ａ）配列番号１のＤＮＡの中の連続し
た少なくとも１０塩基の塩基配列を有するＤＮＡ、
（ｂ）上記（ａ）のＤＮＡに相補的なＤＮＡ、又は
（ｃ）上記（ａ）若しくは（ｂ）のＤＮＡと９０％以上
の相同性を有するＤＮＡ、のいずれかを含有するＤＮＡ
からなる、クラミジア・ニューモニエ遺伝子の測定用プ
ライマー。
【請求項７】塩基配列が配列番号２の塩基配列であ
る、請求項６記載のプライマー。
【請求項８】塩基配列が配列番号３の塩基配列であ
る、請求項６記載のプライマー。
【請求項９】請求項６〜８のいずれかに記載のプライ
マーを用いる、クラミジア・ニューモニエ遺伝子の測定
法。
【請求項１０】請求項６〜８のいずれかに記載のプラ
イマーを含有してなるクラミジア・ニューモニエ遺伝子
の測定用試薬。