JPH06504909A - 結核の診断及び抑制に用いるマイコバクテリウムポリペプチド及びそれをコードする核酸 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 結核の診断及び抑制に用いるマイコバクテリウムポリペプチド及びそれをコード する核酸本発明は、結核の診断に用いることの出来るポリペプチド及びペプチド 、特に組換えポリペプチド及びペプチドに関する。

又、本発明は、結核に対するワクチンの製造に於いて有効成分の一つとして用い ることの出来る生物学的純度状態にある上記ポリペプチド及びペプチドの製造法 に関する。

又、本発明は、当該ポリペプチド及びペプチドをコードする核酸に関する。

更に、本発明は、上記ポリペプチド及びペプチドを用いたインビトロ診断法及び キット及び、結核に対する有効成分として上記ポリペプチド及びペプチドを含有 するワクチンに関する。

“組換えポリペプチド及びペプチド”は、有効な細胞宿主内での適当な規制要素 の制御下、対応するＤＮＡ配列の転写及び翻訳を介する遺伝子工学により製造さ れ得るポリペプチド鎖を有する分子に関すると理解されたい。従って、本明細書 に於いて用いるような“組換えポリペプチド”という表現は、グリコジル化基の 如き他の基をも含むポリペプチドの可能性を排除しない。

“組換え”とは、ポリペプチドが遺伝子工学により製造された事実を意味し、詳 しくは、細胞宿主中に用いられる発現ベクター中に既に導入されている対応する 核酸配列の細胞宿主内での発現の結果生起することを意味する。

しかしながら、この表現は、異なる方法、例えば、蛋白質合成に於いて用いられ る方法による古典的化学合成又は、より大きい分子の蛋白質分解によって製造さ れるポリペプチドの可能性を排除しない。

“生物学的に純粋”又は“生物学的純度”とは、一方に於いて、組替えポリペプ チドをワクチン組成物の製造に用いることが出来るような等級の純度を意味し、 他方に於いて、夾雑物、更に詳しくは天然の夾雑物がないことを意味する。

結核は、開発途上国に於いて主要な疾病として残っている。

この状況は、ある地方、特にエイズ患者の中での結核の高い発生率がこの疾病の 新拡散源を示す地方に於いて劇的である。

結核は、細胞を介する免疫機構がこの疾病に対する防御及び抑制の両者に必須の 役割を果たす慢性伝染病である。

ＢＣＧワクチン及びいくつかの有効な薬剤にもかかわらず、結核は、主要な地球 全体の問題を残している。この疾病のスクリーニングに大量に用いられるツベル クリンＰＰＤ　（蛋白質精製誘導体）を用いる皮膚試験は、他の病原性マイコバ クテリア又は環境非病原性マイコバクテリアとの交叉反応性のために特異性が小 さい。

更に、ツベルクリンＰＰＤは、血清試験（ＥＬＩＳＡ）に用いる場合、ＢＣＧワ クチン接種を受けた患者及び既に感染したことのある患者から、進行性結核が現 れている及び、結核の初期の且つ迅速な診断が要求される患者を識別することが 不可能である。

分子量３２−ｋＤａを有する蛋白質は、既に亜鉛欠乏しＢＣＧの３２−ｋＤａ蛋 白質抗原の精製、部分的特徴付は及び同定”　Ｍｉｃｒｏｂ、　Ｐｒ１ｂｏｆｅ ＋＋、　２：３５１　）として同定された。そのＮｌ’１２−末端アミノ酸配列 （Ｐｈｅ−８ｅｒ−Ａｒｇ−１’ｔｏ−Ｇ１７−Ｌｅｔ）は、Ｍ、　ｂｏｗ’ｓ 凹（Ｗｉｋｅｒ、Ｈ，Ｇ、等、、　１９８６年、”ＭＰＢＳ９．　Ｍｙｃｏｂ口 ｃｌｅｒｉｉｓＢ）蛋白質について報告されたものと同一である。抗原８５−複 合体は、マイコバクテリアの種々の菌株中に存在する（Ｄｅｌｒｗ！Ｉ１．等、 、１９８９年、　ｍマイコバクテリアの培養濾液中の２種類の免疫優性蛋白質抗 原（３２−に、Ｄａ及び５５−　ｋＤａ）出現についての亜鉛欠乏の効果’　Ｊ 、　Ｇｅ＋＋　Ｍｉｅｔｏｂｉｏｌ、１３５ニア９１゜これは、通常のツートン 培養濾液中に主要蛋白質として生存細菌により分泌され、結核の血清学的診断（ Ｔｉｒｎｅｅｒ　Ｍ、等、。

１９８８年、′ヒト結核に於ける体液性免疫反応：　Ｍ７ｃｏｂ＊ｅｊｅｒ＋ａ ｍプリンＧ、Ａ及びＭ’　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　２６：１ ７１４）及びハシセン病の血清学的診断（Ｒｗｍｓｃｈｌ＊ＨＨ，Ｓ、等、、　 １ｕｌ１年、”Ｍ７ｃｏｂ＊ｃｌｅｒ＋ａｓ　Ｉａｂｅｒｃｗｌｏｓ口の３０キ ロダルトン、３１キロダルトン及び３２キロダルトン抗原に対するらい腫及び結 核ハシセン病患者の血清学的反応’　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、 　２６：２２０Ｇ）に有用である。更に、結核患者（ＨａＦｆｅ口に２等、、　 １９８８年、　°結核活動期患者に於ける特異的リンパ球増殖、γ−インターフ ェロン産生及び、３２−　ｋＤａマイコバクテリア性抗原（Ｐ　３２）に対する 血清免疫グロブリンＧ’　Ｓｃ＊ｎｄ、　Ｉ、ｌｍｍ１ｎｏ１．２７：Ｌ８７） 及びハシセン病患者及び、ＰＰＤ陽性及びレプロミン陽性の健康人由来の、末梢 血白血球に於ける３２−　ｋＤａ蛋白質に誘導される特異的リンパ球増殖及びイ ンターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）産生。最近の研究は、ＢＣＧ−感作マウスひ 鷹細胞中の３２ｋＤａ蛋白質誘導ＩＦＮ−γの量がおそら（Ｈ−２制御下にある ことを示している（ＦＩｓｌＨｅ＊　Ｋ、等、、１９１１９年。

”Ｍ７ｃｏｂ１ｃｌｅｒｉｍｍ　ｂｏｗｉｓ　ｂｓｃｉｌｌｉｔ　Ｃｔ１ｍｅ目 ｅ−Ｇｗｔｔｉｍの３２−キロダルトン抗原（Ｐ　３２）との反応の於けるイン ビトロγ−インターフェロン産生のＨ−２に関連した抑制”Ｉｔ）ｓｃｔ、Ｉｍ ｓ。

５６：３１９６）。最後に、マイコバクテリアのフィブロネクチンに対する高親 和性は、抗原８５−複合体の蛋白質に関連している（＾ｂｏｗ−Ｘｅｉｄ　Ｃ， 等、、１９８１１年、”Ｍｙｃｏｂｔｅｊｅｒ＋ｗｍ　１ｗｂｅｒｅ＋＋Ｉｏｓ ＋ｚ及びＭｙｃｏｂ＊ｅｌｅｒｉｗｍ　ｂｏｗｉｔ　ＢＣＧによって放出される フィブロネクチン結合性抗原の特徴付け”　１ａｌｅｃＬ　Ｉｔｓ、　５６：３ ｆ１４６）。

Ｗｉｋｅｒ等（Ｗｉｋｔｒ　Ｈ，Ｇ、等、、　１９９０年、′マイコバクテリア 性抗原８５複合体蛋白質をコードする３種類の別個の遺伝子の証拠”Ｉｎｆｅｃ ｔ　ｌｕｍｌ、　５８：２７２）は、最近、Ｍ、　ｂｏｖｉｔ　ＢＣＧ培養濾液 から分離した抗原８５Ａ、８５Ｂおよび８５Ｃが、それらのＮ　Ｈ２末端領域中 にいくつかのアミノ酸置換を有し、従ってこれらの蛋白質をコードする複数の遺 伝子の存在が強く示唆されることを示した。しかしながら、Ｍ、ｂｏマロＢＣＧ の抗原８５Ｃを示すデータは、その明確な同定及びその構造的要素及び機能的要 素の特徴付けを可能にするには不十分である。

α−抗原遺伝子（Ｍ、　ｂｏｗロＢＣＧ亜株Ｔｏｋ７ｏの８５Ｂ遺伝子、）（Ｍ ＊１ｔａｏ　Ｋ、　等、、　１９８８年、　“細胞外α−抗原のＭ７ｃｏｂ麿ｃ ｊｅｒｉｕｍ同性を示す５Ｍ７ｅｏｂｘｃｔｅｒｉａｓ　ｌｉｂｅｒｃａｌｏｇ ｉｓ由来の８５Ａ抗原をコードする遺伝子について述べられている（Ｂｏｔｒｅ ＋ｕａｓ　Ｌ、等、。

１９８９年、’１Ｊｙｃｏｂ１ｃｆｅｒｉｕｓ　１ａｂｃｒｅａｌｏｓ口の３２ −キロダルトン蛋白質遺伝子のクローニング、配列決定及び発現”Ｉｎｆｅｃｔ 。

白質ゲノムクローンが分離され配列決定された。この遺伝子の完全な配列は、ひ とつのサイレントヌクレオチド変換を除いてＭ７ｃｏｂ＊ｃｆｅ＋ｉｎ＋ａ　ｔ ｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの８５Ａ遺伝子由来のそれと同一である（Ｄｅ　ｗｉｔ 　Ｌ、等、、　１９９０年、”Ｍ７ｃｏｂｔｃｆｃｒｉｗｓ　ｂｏｙ目ＢＣＧの ３２ｋＤａ蛋白質遺伝子（抗原８５Ａ）のヌクレオチド配列”それぞれ抗原８５ Ａ及び８５Ｂをコードする少なくとも２種類の遺伝子を含有する可能性はあるが 証明されたわけではなかった。ｌ！７ｃｏｂ＊ｃｊｅ自ｕｓ　ｌ＋ｂｅｒｃ＋＋ Ｉｏｓ口及び１１．　ｂｏｗｉｓののゲノムに関して、それぞれ８５Ａ及び８５ Ｂをコードする遺伝子以外には新しい遺伝子の存在はなんら証明されなかった。

本発明の態様の一つは結核の検出及び抑制に用いることの出来る新規な蛋白質及 びポリペプチドをコードする新規な核酸群を提供することである。

本発明の別の態様は、大量調製が可能な生物学的に純粋な組換えポリペプチドの ペプチド鎖をコードする核酸を提供することである。

本発明の別の態様は、−結核のインビトロ迅速診断試験としての血清学的試験に 於いて又は、皮膚試験に於いて、−又はワクチンの免疫原性成分として用いるこ との出来る抗原を提供することである。

本発明の別の態様は、ＢＣＧに対するワクチン接種を受けた人又は既に感染して いる人と進行性結核にかかっている患者との識別を可能にする、結核用迅速イン ビトロ診断方法を提供することである。

本発明の別の態様は、結核用インビトロ診断試薬及び、Ｍ　１ｗｂｅｒｃｓｌｏ ｒ＋ｓを他のマイコバクテリア菌株から識別同定するインビトロ診断試薬として 用いることの出来る核酸プローブを提供することである。

本発明の核酸は、 中間１に示す１番目のヌクレオチドにより構成される末端から１４９番目のヌク レオチドにより構成される末端までの範囲のヌクレオチド配列を含有する、 ＊又は、次のペプチド又はポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のうち少 なくとも１つを含有するニー図１に示す一４６番目のアミノ酸により構成される 末端から一１番目のアミノ酸により構成される末端までの範囲のもの、又は 一図１に示す一２１番目のアミノ酸により構成される末端から一１番目のアミノ 酸により構成される末端までの範囲のもの、又は −５ＱＳＮＧＱＮＹ、又は　−ＰＭＶＱ　Ｉ　ＰＲＬＶＡ、　又［−ＧＬＴＬＲ ＴＮＱＴＦＲＤＴＹＡＡＤＧＧＲＮＧ、又は−ＰＰＡＡＰＡＡＰＡＡ。

＊又はニ ー上記ヌクレオチド配列又はその相補体とハイブリッド形成したヌクレオチド配 列、 一上記ヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列、又は−上記ヌクレオチド 配列のＴをＵで置き換えることの出来るヌクレオチド配列を含有する、 ＊又は上記ヌクレオチド配列により構成される。

５ＱＳＮＧＱＮＹは、図１に示す８ＳＣ配列の８４番目から９１番目までのそれ に対応する配列である。

ＰＭＶＱ　Ｉ　ＰＲＬＶＡは、図１に示す８ＳＣ配列の１９１番目から２００番 目までの配列に対応する配列である。

ＧＬＴＬＲＴＮＱＴＦＲＤＴＹＡＡＤＧＧＲＮＧは、図１に示す８ＳＣ配列の２ ２９番目から２５０番目までの配列に対応する配列である。

ＰＰＡＡＰＡＡＰＡＡは、図１に示す８ＳＣ配列の２８５番目から２９４番目ま での配列に対応する配列である。

ハイブリダイゼーションは、次の条件下で行うニーハイブリダイゼーション及び 洗浄培地：＊好ましいハイブリダイゼーション培地は、約３ｘＳＳＣ［５ＳＣ− ０，１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７］、約２ ５ｍＭの燐酸緩衝液ｐＨ７，１及び２０％脱イオンホルムアミド、０．０２％フ ィコール、０．０２％ＢＳＡ、０．０２％ポリビニルピロリドン及び約０．１ｍ ｇ／ｍｌ剪断変性サケ精子ＤＮＡを含有する、＊好ましい洗浄培地は、約３ｘＳ ＳＣ，約２５ｍＭの燐酸緩衝液ｐＨ７，１及び２０％脱イオンホルムアミドを含 有する一一ハイブリダイゼーシクン温度（ＨＴ）及び洗浄温度（ＷＴ）は、４５ ℃から６５℃であり； 一図１に示す１番目のヌクレオチドにより構成される末端から１４９番目のヌク レオチドにより構成される末端までの範囲のヌクレオチド配列のＨＴ＝ＷＴ＝６ ５℃であり、ポリペプチドｘ−ｙ　： ・図１に示すＸ番目のアミノ酸により構成される末端からＹ番目のアミノ酸によ り構成される末端までの範囲の配列；・図１に示す一４６番目のアミノ酸により 構成される末端から一１番目のアミノ酸により構成される末端までの範囲の配列 をコードすると定義した本発明の核酸のＨＴ＝ＷＴ＝６５℃であり、 ・図１に示す一２１番目のアミノ酸により構成される末端から一１番目のアミノ 酸により構成される末端までの範囲の配列をコードすると定義した本発明の核酸 のＨＴ＝ＷＴ＝６０℃であり、 ・次の配列により表されるポリペプチドをコードすると定義した核酸のＨＴ　＝ ＷＴは、 ・５ＱＳＮＧＱＮＹ　ＨＴ−ＷＴ−４５℃ニーＰＭＶＱＩＰＲＬＶＡ　ＨＴ−Ｗ Ｔ−５５℃；−ＧＬＴＬＲＴＮＱＴＦＲＤＴＹＡＡＤＧＧＲＮＧＨＴ＝ＷＴ＝６ ５℃； ・ＰＰＡＡＰＡＡＰＡＡ　ＨＴ＝ＷＴ＝６５℃である。

上記温度は、約±５℃として表される。

本発明の好ましい核酸は、少なくとも次のヌクレオチド配列を含有するニ ー図１の１５０番目のヌクレオチドにより構成される末端から２８７番目のヌク レオチドにより構成される末端までの範囲のヌクレオチド配列、 一図１の２２４番目のヌクレオチドにより構成される末端から２８７番目のヌク レオチドにより構成される末端までの範囲のヌクレオチド配列、 −図１の５３７番目のヌクレオチドにより構成される末端から５６０番目のヌク レオチドにより構成される末端までの範囲のヌクレオチド配列、 一図１の８５８番目のヌクレオチドにより構成される末端から８８７番目のヌク レオチドにより構成される末端までの範囲のヌクレオチド配列、 一図１の９７２番目のヌクレオチドにより構成される末端から１０３７番目のヌ クレオチドにより構成される末端までの範囲のヌクレオチド配列、 一図１の１１４０番目のヌクレオチドにより構成される末端から１１６９番目の ヌクレオチドにより構成される末端までの範囲のヌクレオチド配列、 又は次のヌクレオチド配列を含有するニー上記ヌクレオチド配列とハイブリッド 形成するヌクレオチド配列又は、 一上記ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又は、−上記ヌクレオチド 配列のＴをＵで置き換えることができる、又は上記ヌクレオチド配列により構成 されるヌクレオチド配列。

ハイブリダイゼーションは、次の条件下で行うニーハイブリダイゼーション及び 洗浄培地は、先に明確にした通りである； −ｘ−ｙ、即ち、図１に示すＸ番目のヌクレオチドにより構成される末端からＹ 番目のヌクレオチドにより構成される末端までの範囲のヌクレオチド配列により 定義した本発明の核酸のハイブリダイゼーション温度（ＨＴ）及び洗浄温度（Ｗ Ｔ）は：（１５０）−（２８７）ＨＴ＝ＷＴ＝６５℃（２２４）−（２８７）Ｈ Ｔ＝ＷＴ−８０℃（５３７）−（５６０）ＨＴ−ＷＴ＝４５℃（８５８）−（８ ８７）ＨＴ＝ＷＴ−５５℃（９７２）−（１０３７）ＨＴ＝ＷＴ＝８５℃（１１ ４０）−（１１６９）ＨＴ＝ＷＴ−６５℃。

本発明の核酸の好ましい群は、次のペプチド：５ＱＳＮＧＱＮＹ をコードするヌクレオチド配列を含有、あるいは次のペプチド：ＦＳＲＰＧＬＰ ＶＥＹＬＱＶＰ をコードするヌクレオチド配列を含有し、次のヌクレオチド配列： ＣＧＧＣＴＧＧＧＡＣ（又はＴ）ＡＴＣＡＡＣＡＣＣＣＣＧＧＣとハイブリッド 形成しやすく、 ＧＣＣＴＧＣＧＧＣＡＡＧＧＣＣＧＧＴＴＧＣＣＡＧ。

ＧＣＣＴＧＣＧＧＴＡＡＧＧＣＴＧＧＣＴＧＣＣＡＧ又は、ＧＣＣＴＧＣＧＧＣ ＡＡＧＧＣＣＧＧＣＴＧＣＡＣＧのいずれともハイブリッド形成しに（いか又は 上記のハイブリダイゼーションするヌクレオチド配列により構成される。

上記ハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーション及び洗浄培地が前記の 如くでありハイブリダイゼーション及び洗浄温度が５２℃の条件で行うことがで きる。“ハイブリッドしにくい”とは、本発明の核酸分子が、先に定義ダした３ 種のプローブと５２℃の上記培地中でハイブリッド形成するヌクレオチド部分を 含有しないことを意味する。

本発明の好ましい核酸は、上記ヌクレオチド配列の少なくとも一つを含有するか 又は、上記ヌクレオチド配列により構成され、更に次のポリペプチド番コードす るオーブンリーディングフレームを含有するニ ー結核患者特に進行性結核が現れている患者由来のヒト血清と選択的に反応し易 いポリペプチド、 −又は、図１に示す１番目のアミノ酸により構成される末端から２９４番目のア ミノ酸により構成される末端までの範囲のアミノ酸配列をも認識する抗体によっ て認識され易いポリペプチド、 −又は、図１に示す１番目のアミノ酸により構成される末端から２９４番目のア ミノ酸により構成される末端までの範囲のアミノ酸配列をも認識する抗体を生じ せしめ易いポリペプチド。

上記抗体による上記の２９４個のアミノ酸から成る配列（又は本発明のポリペプ チド）の認識は、上記配列が上記抗体の一つと複合体を形成することを意味する 。

抗原（即ち、２９４個のアミノ酸の配列又は本発明のポリペプチド）と抗体との 複合体形成及び、形成された複合体の存在の検出は、古典的技法（放射性同位元 素で標識したトレーサー又は酵素を用いたものの如き）により行うことが出来る 。

以下に、結核患者特に進行性結核が現れている患者から得たヒト血清と抗原との 選択的な反応を試験する方法について限定することなく説明する。

この試験は、本発明のポリペプチドが組換え技術により得られた場合イムノプロ ティング（ウェスタンブロッティング）法である。又、この試験は、異なる調製 法により得られる本発明のポリペプチドについても用いることが出来る。本発明 のポリペプチドは、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動 後、Ｔｏｖｂｉａ　Ｈ，等、１９７９年、　“ポリアクリルアミドゲルからニト ロセルロースシートへの蛋白質の電気泳動移動：手法と応用”Ｐｒｏｃ、　Ｎｕ ｌｌ、　Ａｃ１ｄ、　Ｓｅｉ、　ＵＳＡ　７６：４３５０−４３５４によβ−ガ ラクトシダーゼと融合した本発明のポリペプチドの発現は、ポリクローナルウサ ギ抗−抗原８５血清（１：　１．０００）の結合により又はモノクローナル抗− β−ガラクトシダーゼ抗体（プロメガ社）を用いることにより視覚化される。箪 二抗体（それぞれ、アルカリ７オスフアターゼ抗−ウサギイムノグロブリンＧ結 合体及び抗−マウスアルカリフォスファターゼイムノグロブリンＧ結合体）は、 発売元（プロメガ社）により推奨される如く希釈する。

本発明のポリペプチド及び本発明の融合蛋白質のヒト結核血清による選択的識別 同定の目的で、ニトロセルロースシートをこれらの血清（１：　５０）と共に一 晩インキユベートする（非特異的蛋白質結合部位をブロッキング後）。ニトロセ ルロースシート上の反応領域を、パーオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトイムノグロブ リンＧ抗体（Ｄｉｋｏｐｓ口Ｓ社、デンマーク、コペンハーゲン）（１：２００ ）と共に４時間インキュベートすることにより明らかにする。洗浄を繰り返した 後、パーオキシダーゼ及び過酸化水素の存在下、パーオキシダーゼ基買（α−ク ロロナフトール）　（Ｂｉｏ−Ｒｓｄ　ＬＩｂｏｒｔｆｏｒｉ＠ｔ、カリフォル ニア州、リッチモンド）を加えることによって発色させる。

本発明の好ましい核酸は、上記ヌクレオチド配列を含有するか又はそれによって 構成され、オーブンリーディングフレームを含有し、約３０ｋＤから約３５ｋＤ までの成熟ポリペプチドをコードし、シグナル配列をコードする配列を含有する 。

本発明の好ましい核酸は、次のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の少 な（とも一つを含有するニー図１に示す一４６番目のアミノ酸により構成される 末端から一１番目のアミノ酸により構成される末端までの範囲のポリペプチド、 又は 一図１に示す一２１番目のアミノ酸により構成される末端から一１番目のアミノ 酸により構成される末端までの範囲のポリペプチダ、又は 一図１に示す一４６番目のアミノ酸により構成される末端から２９４番目のアミ ノ酸により構成される末端までの範囲のポリペプチド、又は 一図１に示す一２１番目のアミノ酸により構成される末端から２９４番目のアミ ノ酸により構成される末端までの範囲のポリペプチド、又は 一図１に示す１番目のアミノ酸により構成される末端から２９４番目のアミノ酸 により構成される末端までの範囲のポリペプチド、 又は次のヌクレオチド配列を含有するニー上記ヌクレオチド配列とハイブリッド 形成するヌクレオチド配列又は、 一上記ヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列又は、−上記ヌクレオチド 配列のＴをＵに置き換えることが出来るか、又は上記ヌクレオチド配列により構 成されるヌクレオチド配列。

ハイブリダイゼーシヨンは、次の条件下で行うニーハイブリダイゼーション及び 洗浄培地は、先に明確にしたとおりである、 一コード化ポリペプチドＸ−Ｙ、即ち図１に示すＸ番目のアミノ酸により構成さ れる末端からＹ番目のアミノ酸により構成される末端までの範囲のコード化配列 により定義した本発明の核酸のハイブリダイゼーシタン温度（ＨＴ）及び洗浄温 度（ＷＴ）は： （−４６）−（−１）ＨＴ＝ＷＴ＝６５℃（−２１）−（−１）ＨＴ＝ＷＴ＝６ ０℃（−４６）−（２９４）ＨＴ＝ＷＴ＝７０℃（−２１）−（２９４）ＨＴ＝ ＷＴ＝７０℃（１）−（２９４）ＨＴ＝ＷＴ＝７０℃本発明の好ましい核酸は、 次のヌクレオチド配列の少なくとも一つを含有するニ ー図１に示す１５０番目のヌクレオチドにより構成される末端から２８７番目の ヌクレオチドにより構成される末端までの範囲のヌクレオチド配列、又は 一図１に示す２２４番目のヌクレオチドにより構成される末端から２８７番目の ヌクレオチドにより構成される末端までの範囲のヌクレオチド配列、又は 一図１に示す１番目のヌクレオチドにより構成される末端から１１６９１６９番 目レオチドにより構成される末端までの範囲のヌクレオチド配列、又は −図１に示す１５０番目のヌクレオチドにより構成される末端から１１６９番目 のヌクレオチドにより構成される末端までの範囲のヌクレオチド配列、又は 一図１に示す２２４番目のヌクレオチドにより構成される末端から１１６９番目 のヌクレオチドにより構成される末端までの範囲のヌクレオチド配列、又は 一図１に示す２８８番目のヌクレオチドにより構成される末端から１１６９番目 のヌクレオチドにより構成される末端までの範囲のヌクレオチド配列、又は 一図１に示す１番目のヌクレオチドにより構成される末端から１２１１番目のヌ クレオチドにより構成される末端までの範囲のヌクレオチド配列、又は 一図１に示す１５０番目のヌクレオチドにより構成される末端から１２１１番目 のヌクレオチドにより構成される末端までの範囲のヌクレオチド配列、又は 一図１に示す２２４番目のヌクレオチドにより構成される末端から１２１１番目 のヌクレオチドにより構成される末端までの範囲のヌクレオチド配列、又は 一図１に示す２８８番目のヌクレオチドにより構成される末端から１２１１番目 のヌクレオチドにより構成される末端までの範囲のヌクレオチド配列、 又は次のヌクレオチド配列を含有するニー上記ヌクレオチド配列とハイブリッド 形成するヌクレオチド配列又は、 一上記ヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列又は、−上記ヌクレオチド 配列のＴをＵに置き換えることが出来るか、又は上記ヌクレオチド配列の少なく とも一つにより構成されるヌクレオチド配列。

ハイブリダイゼーシ薔ンは、次の条件下で行う：−ハイプリダイゼーシ碧ン及び 洗浄培地は、先に明確にしたとおりである、 −ｘ−ｙ、即ち図１に示すＸ番目のヌクレオチドにより構成される末端からＹ番 目のヌクレオチドにより構成される末端までの範囲の配列により定義した本発明 の核酸のハイブリダイゼーシッン温度（ＨＴ）及び洗浄温度（ＷＴ）は：（１５ ０）−（２８７）ＨＴ＝ＷＴ＝６５℃（２２４）−（２８７）ＨＴ−ＷＴ＝６０ ℃（１５０）　−（１１６９）　ＨＴ＝ＷＴ−７０℃（１）−（１１６９）ＨＴ ＝ＷＴ＝７０℃（２２４）　−（１１６９）ＨＴ＝ＷＴ＝７０℃（２８８）　− （１１６９）ＨＴ＝ＷＴ＝７０℃。

又、本発明は、先に定義グした本発明の核酸によってコードされたポリペプチド に関する。

本発明の好ましいポリペプチドは、そのポリペプチド鎖中に次のアミノ酸配列の 少なくとも一つを含有するニー図１に示す一４６番目のアミノ酸により構成され る末端から一１番目のアミノ酸により構成される末端までの範囲のもの、又は 一図１に示す一２１番目のアミノ酸により構成される末端から一１番目のアミノ 酸により構成される末端までの範囲のもの、又は −５ＱＳＮＧＱＮＹ、又は −ＰＭＶＱ　Ｉ　ＰＲＬＶＡ、又は −ＧＬＴＬＲＴＮＱＴＦＲＤＴＹＡＡＤＧＧＲＮＧ、又は−ＰＰＡＡＰＡＡＰＡ Ａ、又は上記ポリペプチド配列により構成される。

又、本発明は、そのポリペプチド鎖中に、アミノ酸配列：５ＱＳＮＧＱＮＹ 或はアミノ酸配列： ＧＷＤ　Ｉ　ＮＴＰＡ 或はアミノ酸配列： ＦＳＲＰＧＬＰＶＥＹＬＱＶＰ を含をし且つ、 アミノ酸配列： ＡＣＧＫＡＧＣＱ 及びアミノ酸配列： ＡＣＧＫＡＧＣＴ を含有しないポリペプチドに関する。

本発明の好ましいポリペプチドは、そのポリペプチド鎖中に、次のアミノ酸配列 ： ５ＱＳＮＧＱＮＹ１ ＧＷＤＩＮＴＰＡ。

ＦＳＲＰＧＬＰＶＥＹＬＱＶＰ 及び、次のアミノ酸配列： ＰＭＶＱ　ｆ　ＰＲＬＶＡ。

ＧｔＴＬＲＴＮＱＴＦＲＤＴＹＡＡＤＧＧＲＮＧ。

ＰＰＡＡＰＡＡＰＡＡ の内生なくとも一つを含有し、 アミノ酸配列： ＡＣＧＫＡＧＣＱ 及びアミノ酸配列： ＡＣＧＫＡＧＣＴ を含有しない。

次のポリペプチドは、新規である： ５ＱＳＮＧＱＮＹ。

ＰＭＶＱ　Ｉ　ＰＲＬＶＡ。

ＧＬＴＬＲＴＮＱＴＦＲＤＴＹＡＡＤＧＧＲＮＧ。

ＰＰＡＡＰＡＡＰＡＡ。

本発明の好ましいポリペプチドは、結核患者特に進行性結核が現れている患者か ら得たヒト血清と選択的に反応し易いか又は、図１に示す１番目のアミノ酸によ り構成される末端から２９４番目のアミノ酸により構成される末端までの範囲の ポリペプチド配列をも認識する抗体によって認識され易いか又は、図１に示す１ 番目のアミノ酸により構成される末端から２９４番目のアミノ酸により構成され る末端までの範囲のポリペプチド配列を認識する抗体を生じせしめ易い。

又、本発明は、先に定義したポリペプチド及びペプチド中の１個又は数個のアミ ノ酸の置換及び／又は付加及び／又は欠失による改変によって次の性質、すなわ ち結核患者特に進行性結核が現れている患者から得たヒト血清との選択的反応性 、及び／又は図１に示す１番目のアミノ酸により構成される末端から２９４番目 のアミノ酸により構成される末端までの範囲のアミノ酸配列に対する抗体との反 応性が変らない限りこの改変から生じるペプチド配列をも含む。

本発明の好ましいポリペプチドは、上記ポリペプチド配列の一つを含有するか又 はそれにより構成され、約３０ｋＤから約３５ｋＤであり、シグナルペプチドに より先導される。

本発明の好ましいポリペプチドは、そのポリペプチド鎖中に次のアミノ酸配列の 少なくとも一つを含むか又はそのアミノ酸配列により構成されるニ 一部１に示す１番目のアミノ酸により構成される末端から２９４番目のアミノ酸 により構成される末端までの範囲のアミノ酸配列、 一部１に示す一４６番目のアミノ酸により構成される末端から２９４番目のアミ ノ酸により構成される末端までの範囲のアミノ酸配列、 一部１に示す一２１番目のアミノ酸により構成される末端から２９４番目のアミ ノ酸により構成される末端までの範囲のアミノ酸配列、 一部１に示す一４６番目のアミノ酸により構成される末端から一１番目のアミノ 酸により構成される末端までの範囲のアミノ酸配列、 一部１に示す一２１番目のアミノ酸により構成される末端から一１番目のアミノ 酸により構成される末端までの範囲のアミノ酸配列。

本発明のポリペプチドの構成の一部であるアミノ酸中に存在する遊離の反応性官 能基、竺に、一方はＧｌｕ又はＡｓｐ基により又はＣ−末端アミノ酸により保有 される遊離のカルボキシル基及び／又は、他方はＮ−末端アミノ酸により又はペ プチド鎖中のアミノ酸例えばＬｙｓにより保有される遊離のＮＨ２基は、改変に よってポリペプチドの上記性質が変わらない限り改変することが出来ることは言 うまでもない。

このように改変した分子は、当然本発明に含まれる。上記のカルボキシル基はア シル化又はエステル化することが出来る。

又、他の改変も本発明の一部である。詳しくは、アミン官能基又はエステル官能 基又は両末端アミノ酸は、他のアミノ酸との結合に関わることが出来る。例えば 、Ｎ−末端アミノ酸は、他のペプチドのＣ−末端領域の一部と対応する１個から 数個のアミノ酸から成る配列と結合することが出来る。

本発明によるポリペプチドは、Ａｓｎ−Ｘ−３ｅｒ又はＡｓ　ｎ−Ｘ−Ｔｈ　ｒ 　（Ｘはアミノ酸を表す）型のグリコジル化部位に於いてグリコジル化すること も出来るし又はグリコジル化しないことも出来る。

本発明の他の好ましいポリペプチドは、次のアミノ酸配列の一つに存するニ 一部１に示す一４６番目のアミノ酸により構成される末端から一１番目のアミノ 酸により構成される末端までの範囲のアミノ酸配列、 −又は図１に示す一２１番目のアミノ酸により構成される末端から一１番目のア ミノ酸により構成される末端までの範囲のアミノ酸配列。

これらのポリペプチドは、その合成部位から細胞膜まで蛋白質の転位を開始する 役割をにない転位中に切断されるシグナルペプチドとして用いることが出来る。

本発明の好ましいポリペプチドは、下記のものにより構成されるニ ー　５ＱＳＮＧＱＮＹ。

−ＰＭＶＱ　Ｉ　ＰＲＬＶＡ。

−ＧＬＴＬＲＴＮＱＴＦＲＤＴＹＡＡＤＧＧＲＮＧ。

−ＰＰＡＡＰＡＡＰＡＡ。

一部１に示す１番目のアミノ酸により構成される末端から２９４番目のアミノ酸 により構成される末端までの範囲のポリペプチド、 一部１に示す一４６番目のアミノ酸により構成される末端から２９４番目のアミ ノ酸により構成される末端までの範囲のポリペプチド、 一部１に示す一２１番目のアミノ酸により構成される末端から２９４番目のアミ ノ酸により構成される末端までの範囲のポリペプチド、 一部１に示す一４６番目のアミノ酸により構成される末端から一１番目のアミノ 酸により構成される末端までの範囲のポリペプチド、 一部１に示す一２１番目のアミノ酸により構成される末端から一１番目のアミノ 酸により構成される末端までの範囲のポリペプチド。

これら全てのポリペプチドは、新規である。

Ｍ、ｔｕｂｅ＋ｃａｌｏ＋ｉｓ　、　Ｍ、　ｂｏｗｉｓ及びＭ、ｋ＊ｎ５ｘｓｉ ｉの抗原８５Ａ１８５Ｂ及び８５Ｃの既に既知の配列に共通する他の好ましいポ リペプチド（図２Ａ参照）は、 ＧＷＤ［ＮＴＰＡ。

及び Ｆ　５ＲＰＧＬＰＶＥＹＬＱＶＰである。

上記ポリペプチドは、次の例で説明する如き、−Ｍ７ｅｏｂ＊ｃｌｅ＋ｉｕｍ　 ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓによって分泌される３３ｋＤａの蛋白質をコードする ヌクレオチド配列又は−Ｍ、ｂｏｖ口ＢＣＧによって分泌される３３ｋＤａの蛋 白質をコードする部分的ヌクレオチド配列又は −以下８５Ｃ遺伝子と称するところの、関連ヌクレオチド配列から誘導されるＤ ＮＡの発現産物り・ら誘ｑ７れる二と乙衿紀する。

又、本発明は、上記ポリペプチドにより構成されるアミノ酸配列及び蛋白質又は 当該ポリペプチドに関して異種配列に関する。ここで、当該蛋白質又は異種配列 は、例えば約１個から約１０００個のアミノ酸から成るものを言う。これらのア ミノ酸配列を融合蛋白質と称する。

本発明の好ましい融合蛋白質に於ける異種蛋白質は、β−ガラクトシダーゼであ る。

又、本発明は、異種核酸中に挿入された本発明の核酸の少なくとも一つを含有す る組換え核酸に関する。

更に詳しくは、本発明は、本発明のヌクレオチド配列が、当該ヌクレオチド配列 の転写を操作し易くするところのプロモーター（詳しくは誘導可能なプロモータ ー）によって先導され、必要に応じて転写終結シグナルをコードする配列によっ て随伴されるような組換え核酸に関する。

又、本発明は、本発明のポリペプチド及び必要に応じてのシグナルペプチドをも コードする核酸配列が次の抑制因子と共に組み込まれている組換え核酸に関し、 該抑制因子は、マイコバクテリアゲノム中で通常それらが関与しているものとの 関連に於いて異種であり、更に詳しくはそれらの生産のために選択された細胞宿 主中でのそれらの発現の調節に関わる抑制因子である。

又、本発明は、組換えベクターに関し、特にベクター配列、とりわけ常用のプラ スミド、コスミド、ファージＤＮＡ又はウィルスＤＮＡのようなベクター配列及 びその複製にとって非必須部位の一つに挿入された本発明の組換え核酸から成る ところのクローニング及び／又は発現のための組換えベクターに関する。

本発明の好ましい態様によれば、組換えベクターは、その複製にとって非必須部 位の一つに、細胞宿主中での本発明によるポリペプチドの発現を促進する必要因 子、特に細胞宿主のＲＮＡポリメラーゼにより認識されるプロモーター、なかん ずく誘導可能プロモーター、必要に応じての転写終結シグナルをコードする配列 、又はシグナル配列及び／又はアンカー配列を含有する。　本発明の別の態様に よれば、組換えベクターは、ベクター内に挿入された本発明の核酸のＥ、ｅｏｌ ｉによる発現を可能にする因子、特にβ−ガラクトシダーゼ遺伝子又はその一部 の発現を可能にする因子を含有する。

又、本発明は、本発明による組換えベクターによって形質転換される細胞宿主に 関し、この宿主は該宿主中での本発明のポリペブ′チドをコードするヌクレオチ ド配列の発現を可能にする抑制因子を含有する。

又、本発明は、Ｅ、ｃｏｌｉの如き細菌中から選択され先に定義した如きベクタ ーにより形質転換されるか又は、ＣＨＯ細胞又は昆虫細胞の如き真核生物中から 選択され先に定義した如きベクターにより形質転換される細胞宿主に関する。

本発明は、本発明による形質転換細胞宿主によって発現される核酸の発現産物に 関する。

又、本発明は、Ｍ７ｃｏｂｓｃｊｅｒｉｗｍ　ｂｏｙｉｚ　ＩＩＣＧワクチン菌 株中の外来エピトープ（本発明のポリペプチドに関して異種のポリペプチド配列 のエピトープ）のキャリア抗原としての、本発明の分泌ポリペプチドの使用に関 する。

用いるＭ７ｅｏｂ＊ｃｌｅｒｉｓｍ　ｂｏｔｉｓ　８ＣＧワクチン菌株は、Ｐｇ ｓｌｅａｒ研究所（パリ）から１１７３Ｐ２の名称で入手することが出来る。

本発明のポリペプチドをコードする核酸及び先に規定した如き外来エピトープを コードする核酸から成る組換えＤＮＡは、本発明の当該ポリペプチドのプロモー ター配列、当該ポリペプチドのシグナル配列、おそらくは当該ポリペプチドをコ ードする部分、及び外来エピトープをコードする核酸を含有することが出来、当 該外来エピトープの核酸は、例えば、−シグナル配列の後に位置するか又は、本 発明のポリペプチドをコードする部分が存在する場合、本発明のポリペプチドを コードする部分より上流に位置する、 −又は、本発明のポリペプチドをコードする部分より下流に位置する、 −又は、本発明のポリペプチドをコードする部分中に位置する。

先に明確にした如き組換えＤＮＡは、組換え蛋白質抗原の発現及び分泌をもたら すワクチン菌株ＢＣＧ中に形質転換することが出来る。

本発明の核酸からプローブ（即ち、クローン化又は合成オリゴヌクレオチド）を 推測することが出来る。

これらのプローブは、選択される核酸の１５個から最大数のヌクレオチドであっ ても良い。又、これらのオリゴヌクレオチドは、特異的酵素的に増幅した断片を 生じせしめるためのＰＣＲ技法（ＰＣＲ，ＭｓｌｌｉＩｓｆｉｄ　Ｆｌｌｏｏｎ ｓ、　１１ｅｊｂ＋ｄｔ　ｉ＠ＥｎｔＹ■ｏｌｏＢ、ｙｅｔ、１５５．　ｐ、３ ３５．　１９８７）に於ける増幅プライマーとして、及び／又は挟みこむオリゴ ヌクレオチドプライマー間で増幅された断片を検出するプローブとしてどちらに も用いることが出来る。

ＰＣＲを用いたハイブリダイゼーシジン分析の特異性は、異なる水準で抑制する ことが出来る。

増幅法又は検出法又はその両者は、特異的であっても良い。

高特異性である後者のケースが好ましい。

又、本発明は、次の工程から成る本発明によるポリペプチドの製造法に関するニ 一本発明の核酸を含有する好ましいベクターによって既に形質転換された細胞宿 主の好ましい培地中での培養、−上記形質転換細胞宿主により産生されたポリペ プチドの上記培養液からの回収、及び 一最後に固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（Ｉ　ＭＡ　Ｃ） の方法による産生じたポリペプチドの精製。

本発明のポリペプチドは、ペプチド合成分野に於ける古典的技法により製造する ことが出来る。

合成は、均−系溶液又は固相中で行うことが出来る。

例えば、用いることの出来る均一系溶液に於ける合成技法は、Ｈｏｗｂｅｎｖｓ ７１により記載（著書名’Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｄｅｒ　ｏｒＢｎｉｓｃｂｅａＣｈ ｅｍｉｓ”　（１１ｓｌＴｈｏｄ　ｏｆ　ｏｒｇａＩｌｉｃ　ｃｈｅｍｉｓ）ｒ ｒ）　Ｅ、　１ｅａｓｈ　ＩＩ、　ｗｅｔ。

１５−１　ｅｌ　ＩＩ、　ＴＨＩＥＭＥ、　５ｌｆｉ目！Ｉｒｔ１９７４）のも のである。

又、本発明のポリペプチドは、Ａｔｈｅｒ＋＋＋＋及び５ｈｅｐ＊＋ｄにより記 載（著書名“５ｏｌｉｄ　ｐｈ＊ｔＣｐｅｐｊｉｄ！５７ｆｉｌｈｅｓｉｓ”（ ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ。

０ｘｆｏｒｄ、　Ｎｓｖ　Ｗｏｒｋ、　Ｔｏｋ７ｏ、　１９８９１（Ｄ方法ニヨ ル固相中ニ於イテ製造することも出来る。

又、本発明は、本発明による核酸の製造方法に関する。

一本鎖核酸（本発明のヌクレオチドを多くて１００個含有）の化学的製造に好ま しい方法は、次の工程から成るニーＢｉｏｏＢ＊ｎｉｃ　ＣｈｅｓｉｓｔｒＹ４ ；　（０４−３２５，１０６）に記載のβ−シアノエチルホスホアミダイ自動合 成法を用いたＤＮＡ合成。

一本鎖ＤＮＡの場合、ＤＮＡ合成の終了時に得られる物質は、そのまま用いるこ とが出来る。

二本鎖核酸（本発明のヌクレオチドを多くて１００ｂｐ含有）の化学的製造に好 ましい方法は、次の工程から成るニーＢｉｏｏｒｇｇａｉｅ　Ｃｈｅｇ＋ｉｓ＋ ｒｙ　４；　（２７４−３２５，１９８６）に記載のβ−シアノエチルホスホア ミダイト自動合成法を用いた１個のセンスオリゴヌクレオチドのＤＮＡ合成、及 び上記β−シアノエチルホスホアミダイト自動合成法を用いた１個のアンチセン スオリゴヌクレオチドのＤＮＡ合成、 −ＤＮＡ二重鎖を形成するためのハイブリダイゼーションによるセンスオリゴヌ クレオチドとアンチセンスオリゴヌクレオチドの結合、 −得られたＤＮＡ二重鎖の好ましいプラスミドベクター中へのクローニング及び 、制限酵素消化及びアガロースゲル電気泳動の如き古典的方法によるＤＮＡの回 収。

鎖長１００個以上のヌクレオチド鎖の核酸（又は、二重鎖核酸の場合塩基対）の 化学的製造法は、次の工程から成るニーその末端に異なる制ｗｉ部位を備え、そ の配列が天然のペプチド中のアミノ酸配列と一致するところの化学的に合成した オリゴヌクレオチドの、Ｐ＋ｏｃ、　Ｎｉ１．　Ａｃ１ｄ、　Ｓｅｉ、　ＵＳＡ 　８０；　７４６１−７４６５、　１９０に記載の原則に従った組み立て、−斯 く得られたＤＮＡの好ましいプラスミド中へのクローニング及び、制限酵素消化 及びアガロースゲル電気泳動の如き古典的方法による好ましい核酸の回収。

又、本発明は、本発明によるポリペプチドに対して形成される抗体自体に関する 。

この生産は、ポリクローナル抗体に限定されるものではないことは言うまでもな い。

又、本発明は、一方に於いて本発明の精製したポリペプチドに対して免疫した動 物、特にマウス又はラットのヒ臓細胞、また他方に於いて骨随腫細胞系の細胞か ら古典的方法により形成され易く、動物の免疫のために初めに用いられたポリペ プチドを認識してモノクローナル抗体を産生ずるその能力により選択され易いハ イブリドーマによって生産されるモノクローナル抗体に関する。

又、本発明は、酵素型、けい元型又は放射型の好ましい標識によって標識された 本発明の抗体に関する。

抗体、特にモノクローナル抗体の生産に好ましく用いられるペプチドは、表１に 示したものである（図１参照）：表１ ３８　１１２Ｎ−ＤＧＬｌｌＡＱ［ＩＤＹＮＧＷ［１ＩＮＴＩ’ＡＦＥ−ＣＯＯ Ｉｉ　５７７８　Ｈ２Ｎ−ＴＤＷＹＱＰＳＱＳＮＧＱｌｌＹＴＹｌ’１ＥＴ−Ｃ ｏｏｌ　９７１７４　Ｈ２Ｎ−ＡＮＳＭＷＧＰＳＳＤＰＡＷＫＲＮＤＰＭＶ−Ｃ ＯＯＩＩ　１９３２０４　！ｌ２Ｎ−ＲＩＷＶＹＣＧＮＧＴＰＳＤＬＧＧＤＮＩ Ｐ−Ｃｏｏｌ　２２３２３５　Ｈ２Ｎ−ＮＱＴＦＲＤＴＴＡＡＤＧＧＲＮＧＶＦ ＮＦ−ＣＯＯＨ２５４２５０Ｈ２Ｎ−ＧＶＦＮＦＰＰＮＧＴＩＩＳＷＰＹＷＮＥ ＱＬ−ＣＯＯＩＩ　２６９２１５Ｈ２Ｎ−ＤＩＱＩＩＶＬＮＧＡＴＰＰＡＡＰＡ ＡＰＡＡ−ＣＯＯＩＩ　２９４アミノ酸配列は、−文字記号で示す。

表１に示したペプチドは、その意図する用途により変形することが出来る。例え ば、ペプチドを抗血清調製に用いるつもりならば、ペプチドはシスティン残基を 更に追加して合成することが出来る。この追加するシスティン残基は、好ましく はアミノ末端に付加され、小さいペプチドを免疫原性にするために必要なキャリ ア蛋白へのペプチドのカップリングを容易にする。

ペプチドを、ラジオイムノアッセイに用いるために標識しようとする場合、沃素 化を容易にすべくアミノ末端又はカルボキシル末端のいずれかに結合したチロシ ンを有する蛋白質を合成するのが好ましい。従って、これらのペプチドは表１に 列挙したペプチドの一次配列をもつが、その唯一の機能がペプチドに好ましい化 学特性を賦与し、かつ蛋白質の一次配列中に見当らない付加的アミノ酸をも有す る。

又、本発明は、酵素型、けい元型又は放射型の好ましい標識によって標識された 本発明のポリペプチドに関する。

又、本発明は、結核に関連した抗体を含む可能性のあるヒト生物学的検体に於け る結核関連抗体をインビトロで検出する方法に関する。この方法は、 一ポリペプチドと生物学的検体中に存在する可能性のある抗体とのインビトロ免 疫学的反応が可能である条件下での生物学的検体と本発明によるポリペプチド又 はペプチドとの接触及び、−形成された可能性のある抗原／抗体複合体のインビ トロ検出から成る。

好ましくは生物学的培地はヒト血清によって構成される。

検出は、古典的方法によって行うことが出来る。

例えば、好ましい方法は、ＥＬＩＳＡおよび免疫蛍光法による免疫酵素学的方法 、放射免疫（ＲＩ　Ａ）法などを利用する。

結核に関連のある抗体をインビトロで検出するかかる方法は、例えば次の工程か ら成るニ ータイトレージョンマイクロプレートのウェルへの本発明のポリペプチド組成物 の一定量の付着、 −診断しようとする血清希釈物の当該ウェルへの導入、−マイクロプレートのイ ンキュベーシッン、−マイクロプレートの繰り返し洗浄、 −血液免疫グロブリンに対する標識抗体の、マイクロプレートのウェルへの導入 、 一少なくとも所定の波長で基質の放射の吸収を改変す石ことによって基質を加水 分解することの出来るものの中から選ばれる酵素の活性に基づくこれら抗体の標 識、−加水分解された基質の量の対照標準との比較による検出。

の検出同定方法に関する。この方法はニ一本発明の抗体と生物学的検体中に存在 する可能性のあるある条件下での生物学的検体と本発明の好ましい抗体との接触 及び、形成された可能性のある抗原／抗体複合体のインビトロ検出から成る。

好ましくは、生物学的培地は、たん、膨水、気管支肺胞洗浄液、尿、生検又は検 死物質によって構成される。

又、本発明は、１ｌＩ７ｃｏｂＩｃ＋ｃ＋＋ａｍ　ｊｎｂｅｔｃｍｌｏｓ口に感 染した可能性のある患者に於ける結核の更なるインビトロ診断法に関し、この方 法は、次の工程から成るニ ー先に定義した如きＤＮＡプライマーの方法による、当該患者から採取した生物 学的検体中に含まれると思われる本発明のヌクレオチド配列の量の前もっての増 幅、−当該プローブと当該ヌクレオチド配列とで形成されるハイブリダイゼーシ ョン複合体の産生が可能である条件下での、上記生物学的検体と本発明のヌクレ オチドプローブとの接触、−形成された可能性のある上記ハイブリダイゼーショ ン複合体の検出。

先に明確にした如＜　Ｍ７ｃｏｂｓｃｊｅｒｉｗｓ　１ｗｂｅｒｃｗｌｏｓｉ＋ に感染した可能性のある患者に於ける結核のインビトロ診断法を行うに当り、次 の必需品又はキットを用いることが出来、当該必需品又はキットはニ ー一定量の本発明のヌクレオチドプローブ、−好ましくは検出しようとする配列 と上記プローブとのハイブリダイゼーション反応の生起に好ましい培地、−好ま しくは、ハイブリダイゼーション反応中に、ヌクレオチド配列とプローブとで形 成されたハイブリダイゼーション複合体の検出が可能な試薬から成る。

又、本発明は、Ｍ７ｅｏｂ＊ｃｊｅｒｉａｓ　ｔＩｂｅｒｃＩｌｏｓｉｓに感染 したと思われる患者に於ける結核の更なるインビトロ診断法に関し、この方法は ニ 一本発明のポリペプチド又はペプチドと生物学的検体中に存在する可能性のある 抗体とのインビトロ免疫学的反応が可能である条件下での、患者から採取した生 物学的検体と本発明のポリペプチド又はペプチドとの接触及び、 −形成された可能性のある抗原／抗体複合体のインビトロ検出から成る。

Ｍ７ｃｏｂ＊ｃｔｅ＋ｉｗｓ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓに感染したと思われる 患者に於ける結核のインビトロ診断法を行うに当り、次の必需品又はキットを用 いることが出来、当該必需品又はキットはニ一本発明によるポリペプチド又はペ プチド、−免疫学的反応にとって好ましい培地調製のための試薬、−免疫学的反 応により産生された抗原／抗体複合体の検出を可能にする試薬、更に詳しくは上 記ポリペプチド又はペプチドが標識されていない場合当該試薬が標識を有するか 又は標識された別の試薬によって認識され易い試薬から成る。

又、本発明は、Ｍ、＋ａｂｅ＋ｅｗｌｏ＋ｉ＋に感染したと思われる患者に於け る結核の更なるインビトロ診断法に関し、この方法は次の工程から成るニ 一本発明の抗体と生物学的検体中に存在する可能性のあるある条件下での生物学 的検体と本発明の好ましい抗体との接触及び、形成された可能性のある抗原／抗 体複合体のインビトロ検出から成る。

Ｍ７ｃｏｂ＊ｅｊｅｒｉｅｍ　＋ｗｂｅｒｃｍｌｏｔｉｓに感染したと思われる 患者に於ける結核のインビトロ診断法を行うに当り、次の必需品又はキットを用 いることが出来、当該必需品又はキットはニ一本発明の抗体、 一免疫学的反応にとって好ましい培地調製のための試薬、−免疫学的反応により 産生された抗原／抗体複合体の検出を可能にする試薬、更に詳しくは上記抗体が 標識されていない場合当該試薬が標識を有するか又は標識された別の試薬によっ て認識され易い試薬から成る。

結核のインビトロ診断にとって好ましいキットはニー少なくとも適当な固相シス テム、例えば、インビトロ診断しようとする生物学的検体をその上に付着させる ためのマイクロタイタープレート、 一本発明のモノクローナル抗体の一つを含有する調製物、−当該セックローナル 抗体用特異的検出システム、−一方に於いて生物学的検体と当該モノクローナル 抗体との免疫学的反応、及び他方に於いて結合したモノクローナル抗体と検出シ ステムの反応を行うための好ましい緩衝溶液から成る。

又、本発明は、本発明のポリペプチド又はペプチドの内の１つの調製物をも含む 上記キットに関し、本発明の当該抗原は、競合投与法に用いるキット用にめられ る抗原に関して標準物質（求められるＭ　ｔｗｂｅ＋ｃｕｌｏｔ＋ｓの抗原の定 量分析用）又は競合物質のいずれかである。

又、本発明は、Ｍ、１ｌｂｅｒｃａｌｏｌｉｌに既に接触した被検者の診断用必 需品又はキットに関し、当該必需品又はキットは本発明のポリペプチド又はペプ チドの内の少なくとも一つの調製物を含有し、当該調製物は患者が既にＭ、ｌ＋ ＋ｂｅｒｃａｌｏｓ口に接触していた場合、患者に皮肉注射した後、注射部位に 遅延型過敏反応をインビボに導入することが出来る。

この必需品又はキットを皮膚試験と称する。

のポリペプチド又はペプチドを含有する免疫原性組成物に関する。

又、本発明は、他の免疫原性成分のうち、本発明のポリペプチド又はペプチド、 又は本発明の発現産物のいずれか一つを含有し、該ポリペプチド又はペプチド、 又は発現産物は、細胞を活性化することによるインビボでの細胞免疫応答を誘導 可能とする結合体とするために、好ましくは、天然蛋白質又は充分な分子量を持 つ合成ポリペプチドと結合していてもよいことを特徴とするワクチン組成物に関 する。

免疫原性成分として好ましく用いられる本発明のペプチドは、表１に記載のもの である。

以下に本発明の他の特性及び有利性を実施例及び図によって具体的に説明する。

図の説明 クレオチド配列及びアミノ酸配列を示す。

既に同定した成熟蛋白質の２８−残基ＮＨ２末端アミノ酸配列は、二重下線で示 す。１５０番目のＡＴＧの下流に位置する１個の更なるＡＴＧコドンは下線で示 す。シグナル配列の正確な長さを決定できなかったことから、ここでとった選択 はＡＴＧ１５ｏに対応する４６アミノ酸シグナルペプチドを示す。推定シグナル ペプチド配列をイタリック体の大文字で示す。初めの図は配列決定手順を示す。

矢印は、ブルースフリブ（Ｂｌｕｅ　５ｃｒｉｂｅ）　Ｍ　Ｈ＋中で二重鎖ＤＮ Ａとして又は、ｍ　ｐ　１８Ｍ　１３ベクター中で一本鎖ＤＮＡとしてサブクロ ーン化されたＤＮＡに於けるジデオキシ法による配列決定の方向を示す。

全体の配列は、図中で灰色四角で示した合成オリゴヌクレオチドを用いて決定し た。図２： 図２は、Ｍ、ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの抗原８５及び８５Ｃ抗原の既知のヌク レオチド配列及びアミノ酸配列間の相同性を示す：Ａ−抗原８５Ａ、Ｂ及びＣの ＤＮＡ配列の比較：ＤＮＡ配列は、複数の配列を視覚化する“整列（Ａ！ｉｇａ ｌ”プログラムによって一列に並べた。このプレゼンテーションに於いて配列の 相違を概説する： （・）は同一の残基を示し：（−）はギャップ（ｇｉｐ）を示し；（文字）は置 換を示す。

全ての配列を初めのライン（遺伝子８５Ａ）のそれと比較し整列させた。

８５　Ａ−Ｔ　Ｕ　Ｂ　：　Ｍ、　ｊａｂｅ＋ｃｗｌｏｔｉｓから得たＤＮＡ配 列（Ｉｌｏｒｒｅｍｓ＋ｓ　Ｌ、等、、　１９８９年、”Ｍ７ｃｏｂ＊ｃｌｅｒ ｉａｓ　ｌ＊ｂｅｒｃ＋＋Ｉｏｔｉｓの３２キロダルトン蛋白質遺伝子のクロー ニング、配列決定及び発現″Ｉａｆｅｃ１．　ｔｗａｉｎ、　５７：３１２３） 。

８５　Ｂ　−Ｂ　ＣＧ　：　ｌＪｙｅｏｂｓｃｔｅｒｉａｍ　ｂｏｙｉｔ　（菌 株Ｔｏｋ７ｏ　）のα−抗原から得たＤＮＡ配列（Ｍｓｊｓｓｏ　Ｋ、等、、１ ９８８年、　“細胞外α−抗原のＭ７ｃｏｂ＊ｃｌｅ＋ｉｍｍ　ｂｏｙｉＳＢＣ Ｇ遺伝子のクローニング及び発現”　Ｊ、　Ｂ慇ｅｌｅｒｉｏ１．　１７Ｌ３８ ４７）。

８５Ｃ−ＴＵＢ　：　（本発明の）　Ｍ７ｃｏｂ１ｃ＋ｅｔｉ＊ｍ　１ｍｂｅｔ ｃｗｌｏｇｉｓ由来の抗原８５Ｃから得たＤＮＡ配列。

Ｉｎｆｅｅｌ　１１１１１１１１．５８：５５Ｇ　）。

８５Ｃ−ＢＣＧ：　（本発明の）　Ｍｌｃｏｂｓｃｌｅｒｉｓｍ　ｂｏｙｉｔ　 ＢＣＧ菌株１１７３Ｐ２から得た部分的ＤＮＡ配列。この配列は、クローン化し たＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片から得た。

（↓）は、成熟蛋白質の初めのフェニルアラニン残基を示す。

（・）は、各遺伝子の終止コドンを示す。

Ｐ７８及びＰ７９は、ＰＣＲ増幅に用いたセンスプライマー及びアンチセンスプ ライマーである。

特異的合成オリゴヌクレオチドプローブの合成に用いた８５Ａ、８５Ｂ、８５Ｃ 配列をフレームで示す。

指示した制限部位は、３種の型特異的プローブの調製に用いた（図４Ａ参照）。

Ｂ−抗原８５Ａ、Ｂ及びＣのプレ蛋白質配列の比較：ＤＮＡ配列は、複数の配列 を視覚化する“整列°プログラムによって一列に並べた。このプレゼンテーシタ ンに於いて配列の相違を概説する： （・）は同一の残基を示し；（−）はギャップを示し；　（文字）は置換を示す 。

全ての配列を初めのライン（遺伝子８５Ａ）のそれと比較し整列させた。

８５　Ａ　：　Ｍ、１ｗｂｅｒｃａｌｏｓｉｓから得た蛋白質配列（Ｂｏｒｒｅ ｓｘａｓ　Ｌ、等、、１９１１９年、”Ｍ７ｃｏｂ＊ｃｊｅｒｉｗｓ　１ｗｂｅ ｒｃ＠ｌｏｓ■の３２キロダルトン蛋白質遺伝子のクローニング、配列決定及び 発現”Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｓｗ＋＋ｎ、　５７：３Ｌ２３）。

８５　Ｂ　：　Ｍｙｃｏｂｓｃｊｅｔｉｗｍ　ｂｏｗｉｓ　（菌株Ｔｏｋｙ・） のα−抗原から得た蛋白質配列（ＭＩＩｌ１６　Ｅ等、、　１９８８年、“細胞 外α−抗原の原８５Ｃから得た蛋白質配列。

１＊ｆｓｃ１．　１ｍ５ｗｍ、５１：ＳＳＯ）　。

８５Ｃ−ＢＣＧ：　（本発明の）　Ｍｙｃｏｂｔｃｊｚｔｉｗｍ　ｂａｓｉｓ　 ＢＣＧ菌株１１７３Ｐ２から得た部分的蛋白質配列。

“Ｃ”の特徴的モチーフをフレームで示す。

ｋＤａ　（抗原８５Ａ）、ＢＣＧのα−抗原（抗原８５Ｂ）及び抗原８５Ｃのア ミノ酸配列のヒトロバシー（ｂ７ｄｒＢｓｌｋｒ）パターンを示す： 三種のプレ蛋白質（推定されるシグナルペプチドシグナルを含む）の配列を、８ 個のアミノ酸のウィンドーを用いてカイト＆た。軸上の各棒線は５０個のアミノ 酸を表す。シグナル配列の長さは僅かに異なる（３種の蛋白質８５Ａ、８５Ｂ、 ８５Ｃのそれぞれ残基数４３．４０．４６）ので、パターンは、３種の成熟蛋白 質の初めの残基に合わせた。疎水性のピークを実線で示し、親水性のピークを破 線で示した。

図４Ａ及び４Ｂ： 図４Ａは、３種類の遺伝子８５Ａ、８５Ｂ及び８５Ｃの制限エンドヌクレアーゼ 地図を示す：型持異性プローブを＜−−−＞によって印を付けた。

遺伝子８５Ａの地図は、Ｂｏｒｒ等（Ｉｌｏｔｒｅｓ＊ｎｓ　Ｌ、等、、１９８ ９年。

３１２３）から引用した。８５Ｂの地図は、本発明者等のＭ７ｃｏｂｔｃｌｅｒ ｉｕｓ　ｂｏｗｉ＋　ＢＣＧ　１１７３Ｐ２　２ｇ１１組換えライブラリーから 誘導されるクローン５．１から得た（Ｄｅ　ＷＮ　Ｌ、　等、、　１９９０年。

“Ｍ７ｃｏｂ＊ｃｊｅｒｉｗｇ＋　ｂｏｗｉｓ　ＢＣＧの３２ｋＤａ蛋白質遺伝 子（抗原Ｔｏｋ７ｏ）の公表されたそれと同一である（Ｍｓｊｓｓｏ　Ｋ、　等 、、１ｉｓａＢ抗原のコード領域は、Ｍ［ｓｗｏ　［、等に従って位置決定され ている（Ｍ！ｊｚｉｏ　Ｋ、等、、１９８８年、′細胞外α−抗原のＭ７ｃｏｂ １ｃｊｔｒｕｍ　ｂｏｗｉｓ　ＢＣＧ遺伝子のクローニング及び発現′１゜Ｂｘ ｃｊｅｒｉｏｌ、　１７０：３８４７）。

８５Ｃの地図は、Ｒ，ＹｏｔＢから入手したＭ　、１ｗｂｅｒｃｗｌｏｓ＋ｓλ ｇｊｌ１組換えライブラリーから得たクローン１１．２の制限地図に対応する（ ＹｏｔＢ　Ｒ，Ａ、等、、　１９８５年、“組換えＤＮＡを用いたＭ７ｅｏｂ＊ ｃｊｅｒｉｗｓ　１Ｉｌｂｅ＋ｃ＋＋１ｏｓｉｓ抗原の詳細な検討”　Ｐｔｏｃ 、　Ｎ５ｊｌ。

Ａｃ１ｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８２：２５８３）　（材料及び方法）。サザン 分析に用いた特異的５’　ＤＮＡ制限断片の位置は、各地図上に両端矢印た全ゲ ノムＤＮＡのサザン分析を示す：１５μｇの消化したＤＮＡをレーン毎に供した 。材料及び方法に記載の条件下でオリゴヌクレオチドプローブＡ、Ｂ、Ｃとのハ イブリダイゼーションを行った（図２Ａに示す如く）。ハイブリダイゼーション したバンドの分子量は、標準との比較により算出した。

１１ｆｉ　４　Ｃハ、Ｍ、　ｂｏｙｉｓ　ＢＣＧ　１１７３　Ｐ２カら得た全ゲ ノムＤＮＡのサザン分析を示す。図４Ｂで説明した手法を用いた。

しかしながら、３種のプローブは、大きいＤＮＡ制限断片であった（図４Ａに示 した如く）。

８５Ａ及び８５μ部分は一つのフィルターから得たのに対し８５Ｃは別のものか ら得た。

図５： 図５は、Ｍ７ｃｏｂｔｃｊｅｔｉｗｍ　１ｗｂｓ＋ｅｗｌｏｔｉｓＤ　Ｎ　Ａの パルスフィールド電気泳動を示す： Ｍｙｃｏｂｓｃｌｅｔｉｗｍ　ｔｌｂｅｒｃＩｌｏｓｉｓの３種の菌株から得た ＤＮＡをＤｔｓｌで消化し、材料及び方法に記載の如くバクテリオファージλＤ ＮＡ　ｒラダー（１ａｄｄｅｒ）　Ｊと共にアガロースゲル上にパルスフィール ド電気泳動によって分離した。ナイロンフィルターに移した後、３種のプローブ ８５Ａ、８５Ｂ、８５Ｃとのハイブリダイゼーシヨンを、図４Ａに示す如く行っ た。ハイブリダイゼーションしたバンドの分子量は、λＤＮＡ　ｒラダー」のそ れと比較することにより算出した。

材料及び方法 １、ゲノムＤＮＡの調製（Ｔｈｏｌｅ　Ｊ、等、、　１９８５年。

３１１００）　： Ｍ、　ｂｏマｉｓ　ＢＣＧは、ツートン培地中で３７℃で培養し、対数増殖期の 終りに加えた１％グリシンの存在下で１８時間更なる培養をした後、回収した。

この細菌をリゾチーム及びプロティナーゼにで処理し、ドデシル硫酸ナトリウム で溶菌せしめ、フェノールで抽出してエタノールで沈澱せしめた。

２、ゲノムライブラリー二 Ｍ、ｊｗｂｅｒＣｗｌｏｓｉ＊　（Ｅ＋ｄｍｘａ菌株）のゲノムＤＮＡから構築 した１１１１１組換えライブラリーを、マｓｔａｇ等から入手した（マｏ＊Ｂ　 Ｒ，Ａ、等、、　１９８５年、”組換えＤＮＡを用い；／：Ｍ　ｂｏマｉｓ　Ｂ ＣＧから得たゲノムＤＮＡを用いて二番目のλＨｔｌ１組換えライブラリーを調 製した（Ｄｔ　ＷＮ　Ｌ、等、、　１９９０年。

”Ｍ７ｃｏｂｓｃｊｅｒｉａｍ　ｂｏｙｉｓ　ＢＣＧの３２ｋＤａ蛋白質遺伝子 （抗原８５Ａ）のヌクレオチド配列”　Ｎｗｅｌ、　Ａｅ、Ｒｅｓ、１８：３９ ９５）。

３、オリゴヌクレオチド： オリゴヌクレオチドを、アプライドバイオシステムズ社のＤＮＡシンセサイザー モデル３８１人上で合成し、ＯＰＣカートリッジ（アブライドバイオシステムズ ）上で精製し、凍結乾燥せしめ、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ）リス−ＨＣｌ、ｐＨ７ ，４）中に溶解せしめた。

オリゴヌクレオチドの３２Ｐ標識は、Ｓ＊ｍｂｒｏｏｋ　Ｊ、等、、　１９８９ 年、　′モレキュラークローニング：ラボラトリ−マニュアル”Ｃｏ１ｄ　５ｐ ｒｉａｌ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌ＊ｂｏ＋５ｊｏｒ７．　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｇ　Ｈ ａｒｂｏｒ、　Ｎ、　Ｙ。

に記載のとおりである。

４、ＰＣＲ： １ｘＰＣＲ緩衝液（アマジャム社）、２００μＭのｄ　ＮＴ　Ｐ。

センスＰ７８　（５’　−ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＧＣＣＧＴＧＡＣＡＴＣ ＡＡＧ）オリゴヌクレオチドプライマー及びアンＡＣＴＴＧＴＡＡＧＴ）オリゴ ヌクレオチドブライマー（これら２種類のプライマーの位置を図２Ａに示す。両 者のオリゴヌクレオチドに３個の更なるヌクレオチドによって先導されたＥｃｏ ＲＩ配列を加えた。）各１ｇＭ、及び２単位のＴａｑＤＮＡポリメラーゼを含む 反応混合液５０μｌ中でＭ７ｃｏｂ＊ｃｊｅｒｉ＊ｍｂｏｗｉＩＢＣＧのＤＮＡ ５Ｑｆｉｇを増幅した。９４℃で９０秒間の変性後、９３℃で１分間（変性）、 ５５℃で９０秒間（アニーリング）、７２℃で２分間（伸長）から成る４０サイ クルの反応、続いて７２℃で５分間の最後の伸長に供した。１５０μＩのクロロ ホルムで抽出した後、増幅したＤＮＡをＣｅａｌｒｉｃ＋＋ｎ−３０を用い、０ ．７５ｍ１のＪＯと混合して５ｏｒｖｓｌｌ　ＳＳ　３４　ｏ　−ター中でｆｉ ５００　ｔｐ−で６分間遠沈することにより３回洗浄した。

ＥｃｏＲＩで消化した後、このＤＮＡを、ＥｃｏＲＩで消化しフォスファターゼ 処理したＢ１５ｓｓｃｚｂ＊−ＭＵ＋ベクター中にライゲーシッンした。０１１ ５α　Ｅ、　ｃｏｌｉ　（ＧｉｂＣｏ−ＢＲＬ）を形質転換し、Ｈ７ｂ＋＋＋ｄ −Ｎフィルター上でプレート培養した。３２Ｐ標識したオリゴヌクレオチドプロ ーブーＡ　（５’　−ＴＣＧＣＣＣＧＣＣＣＴＧＴＡＣＣＴＧＩ及びオリゴヌク レオチドプローブーＢ　（５’　−ＴＣＡＣＣＴＧＣＧＧτＴＴＡＴＣＴＧ）を 用いたハイブリダイゼーションによりコロニーを選択した。オリボヌクレオチド のハイブリダイゼーシヨン及び洗浄条件は、Ｊｓｃｏｂ易等により記載の通りで ある（　Ｉｓｃ＋＋ｂｓ等、、　１９８８年、　゛オリゴヌクレオチド二重鎖の 熱安定性はテトラアルキルアンモニウム塩溶液中では配列非依存性である：組換 ＤＮＡクローン同定部換えＤＮＡライブラリーのスクリーニング：この二つのλ ｔｔｔ＋組換えライブラリーを、遺伝子８５Ａと８５Ｂとを区別しない（図２Ａ 及び４Ａ参照）前もってクローン化した遺伝子８５　Ａ　（ｌｌｏｒｒ＊ｍ＊ａ ｓ　Ｌ、等、、　１９１１９年。

“Ｍｙｃｏｂｓｃｊｅｚａｍ　ｌ＊ｂｅｒｅ＋Ｉｏｓ＋ｓの３２キロダルトン蛋 白質遺伝子ノクローニンク、配列決定及Ｃ１発１Ａ”　Ｉ＋＋ｅｃＬ　ｌ５ｍｗ ＋＋、　５７＋３１２３）　＋７）　８００　ｂ　ｐ　ｌ’１ｉｎｄｌｌｌ断片 を用イタコロニー１１イフリタイゼーシ１ン（Ｓ＊ｍｂｒｏｅｋ　Ｊ、等、、１ ９８９年、　′モレキュラークローニング：ラボラトリ−マニュアル＠Ｃｏ１ｄ 　５ｐｔｉＢ　ＨａｒｂｏｒＬｓｂｏ＋［ｅｒ７．　Ｃ＋ｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　 Ｈ＊ｒｂｏｒ、　Ｎ、　Ｙ、）によりスクリーニングした。１２個の陽性Ｍ、１ ａｂｅ＋ｃａｌｏｔｉｓ及び１２個のＭ７ｃ山山ｒｉ＋＋ｅ　ｂｏ山ＢＣＧプラ ークを保持し、上記の如＜３２Ｐ標識したオリゴヌクレオチドプローブーＣ（５ ’−ＴＣＧＣＡＧＡＧＣＡＡＣＧＧＣＣＡＧＡＡＣＴＡＣ）を用いたハイブリダ イゼーシＩンによりスクリーニングした。

し、その５ｋｂｐインサートをＢ１ｗ＠ｔＣｒ＋ｌ＋＊−ＭＵ＋中にサブクロー ン化した。１１２と命名されたこの組換えプラスミドから得たＬ５００ｂｐ　Ｂ ｒ１ｌｌｌ−ＥｃｏＲＩ断片をＭｕ−＋＋ｐ１ｇ及びＭＵ−ｍｐｌＧ中にサブク ローン化した（Ｓ＊ｍｂｔｏｏｋ　Ｊ、　等、、１９８９年、　ａモレキュラー クローニング：ラボラトリ−マニュアル”　Ｃ＋ｌｄ　５ｐｒｉＢ　Ｈａｒｂｏ ｒＬｉｂｏｔ＊１ｏｒｙ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｔ：Ｂ　Ｌｔｂａｒ、　Ｎ、　Ｔ、） 。

６、組換えＤＮＡ分析： これは、ＢｏｒｒｓｓｘｍＩＬ、等、、１９８９年、”Ｍ７ｃｏｂ畠ｃｌｅｒ＋ ｗｍｌａｂｅｒｃｗｌｏｇｉｓの３２キロダルトン蛋白質遺伝子のクローニング 、配列決定及び発現”　Ｉｎｆｅｃｔ、ｌ園−ｉｎ、　５７：３１２３に記載の 通りである。

７、配列決定： Ｂｌｗｅｓｃｎｂｅ−Ｍ１３＋ベクター（Ｃｋｅａ　Ｅ、１．等、、１９１１５ 年、　′超らせん配列決定ニブラスミドＤＮＡを配列決定する迅速簡便法”異的 断片をサブクローン化した後、５ｅａ（ｅｒ等（Ｓ■ｇｅｒ　Ｆ、　等、。

！９７７年、　１チエインターミネーシタンインヒビターを用いた太き（妨害さ れる。従って、配列決定反応は、製造元の使用説明書により数種のＤＮＡポリメ ラーゼと共に行った。すなわち、Ｔ７　ＤＮＡポリメラーゼ（”５ｅｑｎｅｎ＊ ｓ＊　”　ＵＳＢ　）　、Ｔ７　ＤＮＡポリメラーゼ（ファルマシア社）、及び Ｔ畠ＱＤ　Ｎ　Ａポリメラーゼ（プロメガ社）　、ｄＧＴＰの代りに７−ｄｅ＊ ｔｓ−ｄＧＴＰを用いた。数種のオリゴデオキシヌクレオチドを合成し、配列の あいまいな領域に焦点を合わせるのに用いた。配列決定の手順を図１にまとめた 。

８、配列の比較と分析： 核酸配列及び推定されたアミノ酸配列の一般的なコンピューターを用いた分析を 、Ｂｔｌｌｏｎ　Ｂ、、１９８８年１　“核酸及び蛋白質配列分析用アップルマ ツキントラシュプログラム”Ｎｕｃｌｅｉｅ＾ｅｉｄ　Ｒｅｓ、１６：１８３７ から得たＬＧＢＣプログラムを用いて行った。

相同性の調査には、Ｐｅｘｔｓｏｎ　Ｗ、　Ｒ，等、、１９８８年、　“生物学 的配列の比較のための改善された手法”Ｉｓ口、＾ｃｏｄ、Ｓｅｉ、　ＵＳＡ　 ８５　：　。

２４４４から得たＦＡＳＴ＾プログラム、及びＥＭ！ＩＬ−＠ｅｒｔｓｒ施設か ら得た種々のＤＮＡ及び蛋白質データバンクを用いた。”Ａｌｉｅｍｌ、０１” 　（科学的教育的ソフトウェア−）を用いて複数の配列を得た。

９、サザンプロット分析： Ｍ７ｃｏｂ暑ｃｊｅｒｉ＋＋ｍ　ｂｏｗｉｓ　ＢＣＧから得たゲノムＤＮＡを　 ５ｐｈｌ、Ｅｃ、ｏＲＩ又は−Ｋｐａｌで完全に消化し、１％アガロースゲル上 に電気泳動せしめ、変性及び中和化した後、Ｈｙｋｏｕｄ−Ｎフィルター（アマ ジャム社）に移し、３２Ｐ標識したオリゴヌクレオチドプローブ（Ａ、Ｂ、Ｃ’ ）を用いＩｔｃｏｂｒ等、、１０８年、　“オリゴヌクレオチド二重鎖の熱安定 性はテトラアルキルアンモニウム塩溶液中では配列非依存性である二組換ＤＮＡ クローン同定への応用”　Ｎｗｃｌ、　Ａｃ１ｄ、　Ｒｅｓ、Ｌ６：４６３７に 記載の条件でハイブリダイゼーシッンを行うか、又は３種の遺伝子８５Ａ、８５ Ｂ及び８５Ｃを区別することが分かった３２Ｐ標識したＤＮＡ制限断片をランダ ムプライムした。

プローブ８５Ａは、プラスミドＢＴ−５から得た２３０ｂｐｊｓｂ＊ｔ’ｅｗｌ ｏｓｉｓの３２キロダルトン蛋白質遺伝子のクローニング、配列決定及び発現” 　Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｓｓｗａ、　５７：Ｈ２３及び図２Ａ）。

プローブ８５Ｂは、本発明者等のＭ７ｃｏｂ＊ｃｔｅｒｉａｓ　ｂｏｗｉｓ　Ｂ ＣＧλｇｉｌｌライブラリーから誘導された５、１と命名された８５Ｂ組換えプ ラスミドから得た４ｏｏｂｐｓ■息１−ＫｃａＲＶ断片であり、その地図を図４ Ａに示した（ｅｌＨ２Ａも参照のこと）。プａ　−ブ８５Ｃは、プラスミド１１ ．２から得た２８０ｂｐユと１−Ｋｔ１１断片である（図４Ａ及び２Ａも参照の こと）。

これらのＤＮＡ断片は、低融点アガロースゲル上の電気泳動、続いて製造元の使 用説明書に従ってＱｉｇＨｓ＊　（ＷＩｔｂｗＢ社製１オランダ）（チップ５） 上で迅速精製することにより調製し、α−”　Ｐ−ｄＣＴＰの存在下、標識した （ＦｅｒａｂｅｒＨＡ、　Ｐ、等、、　１９８３年。

”ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼ断片を高比活性に放射性標識する方法”＾ｎ＊ １．　Ｂｉｏｃｂｅｍ、１３２：６　）。

１０、パルスフィールド電気泳動によるＤＮＡ分離：ＤＮＡ調製、制限酵素消化 及びパルスフィールドゲル電気泳動をマ１ｎｃｅｅｊ　Ｌｅｖ７−Ｆｒｅｂ＊ｉ ｌｌ　’ｉ、等、、　１９９０年により記載の如く行つた（“フィールドインパ ージタンゲル電気泳動により分析したＭＩＣｏｂ＊ｅｌ！ｒ＋ａｅ　ｐ＆口ｔｕ ｂｅｒｃＩｌｌｏｓｉｓ、”モリバトマイコバクテリア”及び関連のマイコバク テリアに於けるＤＮＡ多形性“１゜Ｃ１１ａ、　Ｍｉｃ＋ｏｂｉｏ１．２７：２ ７２３　）　ｏ新たな培養液から得り細胞を１％低融点アガロース（Ｖ　／　Ｖ 　）と混合し、プロティナーゼＫ　（ＢｏｅｈｒｉａＨｒ　ＧｍｂＨ，Ｍｇｎｎ ｈｅｉｍ、　Ｇｅ＋ｉｉ＋＋ｙ）の存在下、チモラーゼ（生化学工業）、リゾチ ーム及びドデシル硫酸ナトリウムで連続的に処理せしめた。フッ化フェニルメチ ルスルホニル（Ｂｉｏ−Ｒｅｄ　Ｌ＊ｂ＋ｔｔｌ＋＋ｉｅｓ　）を用いてプロテ ィナーゼＫを失活させた後、アガロースブロックを５０ＵのＤｔ麿１（Ｂｉｏ− １１Ｊｄ　Ｌ麿ｂｏｒｓｒｏｒｉｅ＊）を用いて一晩消化した。しかる後、ブロ ックを、調製した１％アガロースゲルにのせ０．６６ＴＢＥ（トリス−硼酸−Ｅ ＤＴＡ）中で電気泳動を行った。Ｄａｇｓ（ｓｒＰｕｌｓｅ　（ＤＩｌｓ＊ｊＪ ｒ、　ＵＳＡ）の装置を用いてフィールドインパージタンゲル電気泳動を行った 。前進及び後進パルスは、泳動の初めには０．３３ｓｅｃ及び０．１１ｔｓｃに セットし、泳動の終りには展開しようとする分子量帯により６０　ｓｅｃ及び２ ０ｔｅｅ（又は３　Ｑ　ｔｅｃ及び１０　ｓｅｃ　）にセットした。泳動時間は ３６時間にセットし、用いた電圧は１００ｖで、約３２５ｍＡ、温度は１８℃を 維持した。ラムダコンカテマーを分子量マーカーとして用いた。Ｍ＊ａ＋ｓ目ｓ 　Ｔ、等、、１９８２年、　１モレキュラークローニング：ラボラトリ−マニュ アル’　Ｃｏ１ｄ　５ｐｒｔＢ　ＨａｒｂｏｒＬｇｂｏｒ＊ｔｏＢ、　Ｃｏ１ｄ 　Ｓｐｒｉｎｇ　［Ｉｔｒｂｏ＋、　Ｎ、　Ｙ、５４５ｐｐに従って、泳動の終 りに、ゲルをエチジュームブロマイドで染色し、Ｕｖ先光下写真をとりナイロン 膜上に移した。

結果 １、　Ｍ、１ｗｂｅｒｃｗｌｏｔｉｓの８５Ｃ遺伝子のクローニング：遺伝子８ ５Ａ及び遺伝子８５Ｂと広い相同関係を有すると思われる８５Ｃ又は関連の抗原 を特異的に検出するための特異的プローブ又はモノクローナル抗体が入手できな かったことから、このスクリーニングは、新しい手法の開発を要求された。用い た手順は、抗原Ａ及びＢの配列を一列に並べた（図２ＡのプライマーＰ７８及び Ｐ７９参照）場合高度に保存されたＤＮＡ配列によって両末端が囲まれているこ とから、選ばれた成熟抗原８５Ａのアミノ酸１８−９８をコードする２４５ｂｐ ＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅に基づく。斯くて、同じ領域中の抗原８５Ｃの配列との 同等の相同性が存在するであろうと思われる。

Ｍ７ｃｏｂｔｃｔｅｒｉｗｍ　ｂｏｗロＢＣＧゲノミックＤＮＡから２４５ｂｐ ＤＮＡ断片を容易に得た。この後者を精製し、ＥｃｏＲＩで消化した後、Ｂｌｗ ｓｔｃｒｉｂｅ　ＭＵ＋ベクター中にサブクローン化した。約８０個の組換えプ ラスミド含有コロニーをナイロンフィルター上に平板培養することにより試験し 、厳密な条件下で配列８５　Ａ　ｆ５’−ＴＣＧＣＣＣＧＣＣＣＴＧＴＡＣＣＴ Ｇ）又は配列８５Ｂ（５’−ＴＣＡＣＣ丁ＧＣＧＧＴＴＴＡＴＣＴＧ）のいずれ かを認識する標識された合成オリゴヌクレオチドと、ＰＣＲ増幅断片内でハイブ リダイゼーションせしめた（図２Ａ参照）。各オリゴヌクレオチドプローブとハ イブリダイゼーシロンしたいくつかのクローンを配列決定したところ、その配列 は、オリゴプローブＡとハイブリダイゼーションするクローン中の配列８５Ａ及 び、オリゴヌクレオチドプローブＢとパイプリダイゼーシロンするそれらの配列 ８５Ｂと同じであった。残ったクローンのいくつかを配列決定したところ、それ らは全て、配列Ａ及びＢと全体的に全く別個のものである２４−ヌクレオチド部 分に及ぶ８５Ａ及び８５Ｂとの明かな配列の相違点を示した（図２Ａ、四角印ｃ ）（この領域に於ける配列Ｂとの相同性は３３％にすぎない）。これらの挿入物 が８５Ｃ遺伝子の増幅された断片でありこの２４ヌクレオチド配列が推定される ８５Ｃ遺伝子に特有であると仮定して、この配列に基づくオリゴヌクレオチドプ ローブ（オリゴ８５Ｃ）を合成した。

後者のプローブを３２Ｐで標識し、前もってクローンした遺伝子８５Ａの８００ ｂｐ非特異的■１４１１１　Ｄ　Ｎ　Ａ断片とのハイブリダイゼーシ習ンにより 本発明者等のＭ　ｌｌｂｔｒｃｌｌＧｇｌｌ及びＭ７ｃｏｂ＊ｃｊｅ＋ｉｗｓ　 ｂｏｗｉｓ　ＢＣＧ　λ１目１ライブラリーに於イテ選ばれた２４個の１１１１ １組換えファージのコレクシランをスクリーニングするのに用いた。

１個のハイブリダイゼーシジンλＨｊｌ１Ｍ、１ｍｂｓｔｃｗｌｏｓ＋ｓ組換え 体を保有し、制限地図を作ることにより特徴づけ、配列決定種々の配列決定され た断片から誘導された１２１１ヌクレオチド配列を図１に示す。このＤＮＡ配列 は、１５０番目から始まり１１７０１７０番目Ａコドンで終る１、０２０−　ｔ ）ｐ−鎖長オープンリーディングフレームを含む。抗原８５蛋白質の通常のＮＨ ２末端アミノ酸配列、Ｐｌ＋ｅ−３ｅｒ−ＡｒＨ−Ｐｒｏ−Ｇ１７−Ｌｅｅ（Ｄ ｅ　ＢｒＢ＋＋　Ｊ、等、、　１９８７年、　“Ｍ７ｃｏｂｗｃｊｅｒｉｗｍ　 ｂｏｖ口ＢＣＧの３２ｋＤＩ蛋白質抗原の精製、部分的特徴付は及び同定”Ｍｉ ｃｒｏｂ。

Ｆ＠Ｉｌ＋ｏＩｅａ、　２：３Ｓｌ　）は、２８８番目のＴＴＣコドンで始まる ヌクレオチド配列由来のこのオープンリーディングフレーム内に位置することが 出来る（図１）。従って、この配列から上流のＤＮＡ領域は、この抗原の分泌に とって必要とされるシグナルペプチドをコードすると思われる。この完全な蛋白 質は、算定分子両３２，０２１に相当する２９４個のアミノ酸残基から成る。

興味深いことには、この完全な蛋白質のＮ−末端配列は、通常の８５Ｂ及び８５ Ａ配列との相違点が成熟蛋白質の１６番目のプロリンがアラニンであるにすぎな い、Ｗｉｋｅｒ　Ｈ，Ｇ、等、。

１９９０年１　°マイコバクテリア抗原８５複合体蛋白質をコードする３種類の 別個の遺伝子の証拠”ｌ＋Ｉｅｃｊ、Ｉ■ｍｗａ、Ｎ：２７２により記載の２６ アミノ酸配列（ｐｋｅ−ｓｅ　ｔ−＊Ｂ−Ｂ＋＋−（ｌｙ−１ｅ＊−ｐｒｏ−ｗ ｓ　１−１１　ｗｉｙｒ−ｆｅｗ−Ｈｌ　ｕ−ｗｘ　Ｉ−ｐｒｏ−ｓｅ　ｔ−ｔ 　Ｉ　ｔ−ｗｅ　ｔ−ａｔ　１−ＨＩ３−＊　ｒＨ−＊Ｂ| ｉｌｅ−１７ｓ−ｙｓｌ−Ｈ１ａ−ｐｈ＠）を含有する。二つのＡＴＧコドンが 、同じリーディングフレーム内の２８８番目のヌクレオチドの位置にあるＴＴＣ フェニルアラニンコドンを先導することが分かった（図１）。これら二つのＡＴ Ｇの使用により２１個又は４６個のアミノ酸残基のいずれかのシグナルペプチド の合成をもたらす（以下に示した理由により後者の状況を図１に示した）。

抗原８５Ｃ遺伝子の塩基組成は、６４．５７％の全体的なＧ−Ｃ組成及び３番目 のコドン内でのＧ又はＣに対する強い選択性（平均８５％）の点で８５Ａ遺伝子 のそれと同一である。

３個のシスティンを含む抗原８５Ａ及び８５Ｂと対照的に抗原８５Ｃの配列は、 ２５４番目に唯一のシスティン残基を示す。

事実、この２個の置換されたシスティンは、最も大きいダイバージエンド配列ブ ロックを含む完全な８５Ｃ蛋白質の領域内に位置する（図２　Ｂ　）（ＳＱＳＮ ＧＱＮＹ）　（対応するＤＮＡ配列をオリゴヌクレオチドプローブＣ”を合成す るのに用いた（上記参照））。驚くには当らないが、３種の抗原のヒトロバシー プロットを比較した場合この親水性領域が最もダイバージエンドであり、従って 全ての８５−抗原の種々の“エピトープ及び／又はＭ、ｂ＋ｗｉｓ　ＢＣＧ由来 の抗原８５Ｃ中にもそれが見い出されたことから抗原８５Ｃに特有のエピトープ のいずれであってもよい（図２Ｂ１５行目）。

抗原８５Ｃに特有の他の特徴は、分子のカルボキシ末端の希な疎水性反復プロリ ンアラニンモチーフＰＰＡＡＰＡＡＰＡＡの存在である。

３、ヒトロバシーパターン： イト＆ドーリットル法（Ｋｉｔｅ　Ｊ、等、、１９０年、　“蛋白質のヒトロバ シーパターンを示す簡単な方法”　Ｊ、　Ｍａｔ、　Ｒｉａｌ、１５７：１０５ ）により測定した。このオクタペプチドのプロフィールを抗原８５Ａ及び８５Ｂ と比較した（図３）。アミノ酸配列から予想した如く、３種の抗原のパターンは 、領域８４−９２に於ける又この３種の蛋白質のカルボキシ末端部分に於けるい くつかの主な違いを除いて大まかな点で類似している。

４、配列相同性： 抗原８５　Ａ　（Ｂｏｔｒｅｍｓａｓ　Ｌ、等、、　１９８９年、”Ｍ７ｃｏｂ ＊ｃｔ＠ｔＩｓｓｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの３２キロダルトン蛋白質遺伝子の クローニング、配列決定及び発現″Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｓ＋＋ｎ、　５７：３１ ２３；Ｄｅ　Ｗｉｔ　Ｌｌ等、。

１９９０年、　“Ｍ７ｅｏｂ亀ｃｊｅｒｉｗｓ　ｂｏｗｉｔ　ＢＣＧの３２ｋＤ ｓ蛋白質遺伝子（抗原８５Ａ）ヌクレオチド配列”　Ｎ＊ｃ１．　Ａｃ、　Ｒｔ ＠、１８　：３９９５）　、８５　Ｂ　（Ｍ＠＋ｓｗ＋＋　Ｋ、等、、　１９８ ８年、“細胞外α−抗原のＭ７ｃｏｂｓｃｊｅｒｉａｓ　ｂｏｗｉ＠ＢＣＧ遺伝 子のクローニング及び発現”Ｊ、Ｂｇｃｆｅｒｉｏｌ、１７０：３８４７　；　 Ｍ＊ｔｓｗｏ　Ｋ、等、、１９０年、“（配列を直線的に配置した。３種のＤＮ Ａ配列の直線配列を図２Ａ’ｌ：示す。ＤＮＡレベルに於いて、３種の完全な蛋 白質をコードする領域間の相同性は最大である。この領域に於けるＡ及び８間の 相同性は７７．５％であるのに対して、それぞれ、遺伝子Ａ及びＣをコードする 領域間では７０．８％、Ｂ及び０間では７１．９％にすぎない。配列８５Ａのヌ クレオチド１３６９を超える領域、及び４７５番目のヌクレオチドより上流の領 域（即ち、シグナル配列及びプロモーター領域内）には、３種の配列間に実質的 相同性はない。Ｇ！ａＢ＊ｎｋＥＭＢＬの最も最近のライブラリー中に存在する 他のＤＮＡ配列との顕著な相同性は検出されなかった。

アミノ酸レベルの相同性は、図２Ｂの配列中に存在し、再度、配列Ａ及び８間（ ８０，４％）の方がＢ／Ｃ間、又はＡ／Ｃ間よりも高い相同性を示している。

８５Ｃ抗原及び全５ｖｉｓｓＰｒｏｔ−ＮＢＩＩＦデータバンク間の他の比較は 、８５Ｃ抗原アミノ酸配列との顕著な相同性を検出できなかった。８５Ａ抗原に 関しては、８５Ｃ配列は、フィブロネクチン結合蛋白のＲＧＤモチーフを含まな いし、既知のフィブロネクチン受容体との相同性又はＨｘｐｈ７１＋ｃｏｃｃ１ ＊ｗ＋ｅａｔ由来のフィブロネクチン結合蛋白との相同性もない。

Ｍ、　ｋ＋ｗｉｓ　ＢＣＧ　１１７３　Ｐ２の８５Ｃ遺伝子の部分的ＰＣｉｌ誘 導ＤＮＡ配列とＭ７ｃｅｂｓｃｊｅｒ＋＋＋ｍ　ｊｗｂｅｒｃｓｌｏｓ口のそれ との比較は、合成オリゴヌクレオチドＣに対応する特徴的領域を含む完全な一致 を示す（図２Ａ参照）。

５、ゲノム特性： 抗原８５複合体をコードする異なる遺伝子の存在を確認すＣ）プローブとのハイ ブリダイゼーション後、放射性シグナルの分布をサザンプロットに於いて試験し た（材料及び方法及び図２Ａ参照）。３種の明かに異なるパターンが得られ、こ れらのプローブの特異性を確認した。類似の型特異性プロフィールを、三種のＤ ＮＡのプロモーターシグナル配列内に選択される三種のランダムブライミングす る標識したＤＮＡ制限断片（プローブ８５Ａ、２３０ｂｐ　；　８５Ｂ、４００ ｂｐ　；　８５Ｃ。

２８０ｂｐ）によって得ることが出来る（図２Ａ及び４Ａ）。

これらの三種のＤＮＡ制限断片によって、明らかに他の２種の遺伝子に対するプ ローブのクロスハイブリダイゼーションに対応する更なる弱い結合も観察される 。プローブ８５Ｃとによって、Ｃ−オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイ ゼーと考えられる。更に、この観察された制限断片のサイズは、必ずしも対応す るクローンした遺伝子の制限地図から予想されるものとは限らない。これらの不 一致は、それぞれＭ、　ｂｅマロト巧−株、Ｍ、　ｂｏｙｉｓ　ＢＣＧ　（菌株 Ｔｏｋ７ｏ）及びＭ　ｊｗｂｓｒｃａｌｏｓ＋ｓの菌株間の非コードＤＮＡ領域 （抗原８５をコードするＤＮＡの外側）に於ける何らかの少数配列の相違（制限 多形性）に相当する可能性がある。

６、　Ｍ、１ｔｂｅｒｃａｌｏｔｉｔゲノムＤＮＡのパルスフィールド分析：入 手し得る最も大きい８５ＡクローンＢＹ−５をオリゴヌクレオチドプローブＢと ハイブリダイゼーションした（図４Ａ）際に、陽性のシグナルは検出されなかっ たのに対し、オリゴヌクレオチドプローブＡは陽性のハイブリダイゼーションを 示した（図示していない）。これは、遺伝子Ｂが遺伝子Ａの５′の２−２．５ｋ ｂ及び３′端の４．Ｏｋｂ内に位置していないことを示している（図４Ａ）。こ の結果を確認し増長するために、パルスフ厳密な条件下で更にプローブ（８５Ａ 、８５Ｂ及び８５Ｃ）として三種の特異的ＤＮＡ制限断片とハイブリダイゼーシ ョンさるパターンを示した。その内の三つを図５に示す。試験したほとんどの菌 株では、三種のプローブは異なるサイズの断片にハイブリダイゼーションした。

例えば、Ｍ、１ｗｂｓ＋ｃｗｌｏｔｉｓ　Ｈ３７Ｒｓに於いて、プローブ８５Ａ 、Ｂ及びＣとハイブリダイゼーションする一Ｄｒｔｌ断片の各サイズは、菌株Ｈ ３７１１ｓでは約２４２　ｋｂ。

０２ｋｌ＋及び２２５ｋｂ　、菌株１１３７１マでは４０３ｋｂ　、　Ｈ２ｋｂ 及び１０４ｋｂ　。

・　菌株“１０２５”では３５５ｋｂ　、　１０４ｋｂ及び１５３ｋｂである。

種々の菌株は制限エンドヌクレアーゼート」１で切断した制限断片鎖長多形性を 示すが、これらの結果の最も簡単な解釈は、三種の抗原８５遺伝子はマイコバク テリアのゲノム内に隔たって位置する（＞１００ｋｂ）ということである。

ＡＧＧＴＧＴＣＣＧＧ　ＧＣＣＧＡＣＧＣＴＧ　ＡＡＴＣＧＴＴＡＧＣＣＡＡＣ ＣＧＣＧＡＴ　４０ＣＴＣＧＣＧＣＴＧＣＧＧＣＣＡＣＧＡＣＡ　ＴＴＣＧＡＡ ＣＴＧＡ　ＧＣＧＴＣＣＴＣＧＧ　８０ＴＧＴＧＴＴＴＣＡＣＴＣＧＣＣＣＡＧ ＡＡ　ＣＡＧＡＴＴＣＧＡＣＣＧＣＧＴＣＧＴＧＣ１２０ＧＣＡＧＡＴＧＡＧＡ 　ＧＴＴＧＧＧＡＴＴＧ　ＧＴＡＧＴＡＧＣＴ　ＡＴＧ　ＡＣＧ　ＴＴＣ１５８ ａｔ　Ｉ／ｌｒβを ＴＴＣＧＡＡ　ＣＡＧ　ＧＴＧ　ＣＧＡ　ＡＧＧ　ＴＴＧ　ＣＧＧ　ＡＧＣＧＣ Ａ　ＧＣＧ１９１ＡＣＡ　ＡＣＣＣＴＧ　ＣＣＧ　ＣＧＣＣＧＣＧＴＧ　ＧＣＴ 　ＡＴＣＧＣＧ　ＧＣＴ　２２４ＡＣＣＴＴＣＧＧＣＧＧＧ　ＣＣＧ　ＧＣＣＡ ＣＣＧＣＧ　ＧＧＣＧＣＡ　ＴＴＣ２９０ＧＴＧ　ＣＣＡ　ＴＣＣＧＣＧ　ＴＣ Ｇ　ＡＴＧ　ＧＧＣＣＧＣＧＡＣＡＴＣＡＡＧ　３５６ＧＴＣＣＡＧ　ＴＴＣＣ ＡＧ　ＧＧＣＧＧＣＧＧＡ　ＣＣＧ　ＣＡＣＧＣＧ　ＧＴＣ３８９ＴＡＣＣＴＧ 　ＣＴＣＧＡＣＧＧＴ　ＣＴＧ　ＣＧＧ　ＧＣＣＣＡＧ　ＧＡＴ　ＧＡＣ４２２ ＴＡＣＡＡＣＧＧＣＴＧＧ　ＧＡＣＡＴＣＡＡＣＡＣＣＣＣＧ　ＧＣＣＴＴＣ４ ５５ＧＡＧ　ＧＡＧ　ＴＡＣＴＡＣＣＡＧ　ＴＣＡ　ＧＧＧ　ＴＴＧ　ＴＣＧ　 ＧＴＧ　ＡＴＣ４８８ＡＴＧ　ＣＣＣＧＴＧ　ＧＧＣＧＧＣＣＡＡ　ＴＣＣＡＧ Ｔ　ＴＴＣＴＡＣＡＣＣ５２１ＧＡＣＴＧＧ　ＴＡＴ　ＣＡＧ　ＣＣＣＴＣＧ　 ＣＡＧ　ＡＧＣＡＡＣＧＧＣＣＡＧ　５５４Ｆｉｇｕｒｅ　１　（続　き２） ＡＡＣＴＡＣＡＣＣＴＡＣＡＡＧ　ＴＧＧ　ＧＡＧ　ＡＣＣＴＴＣＣＴＴ　ＡＣ Ｃ５８７ＡＧＡ　ＧＡＧ　ＡＴＧ　ＣＣＣＧＣＣＴＧＧ　ＣＴＡ　ＣＡＧ　ＧＣ ＣＡＡＣＡＡＧ　６２０ＧＧＣＧＴＧ　ＴＣＣＣＣＧ　ＡＣＡ　ＧＧＣＡＡＣＧ ＣＧ　ＧＣＧ　ＧＴＧ　ＧＧＴ　６５３Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｔｈ ｒ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｇｌｙｌｌｏ　１２０ ＣＴＴ　ＴＣＧ　ＡＴＧ　ＴＣＧ　ＧＧＣＧＧＴ　ＴＣＣＧＣＧ　ＣＴＧ　ＡＴ ＣＣＴＧ　６８６ＧＣＣＧＣＧ　ＴＡＣＴＡＣＣＣＧ　ＣＡＧ　ＣＡＧ　ＴＴＣ ＣＣＧ　ＴＡＣＧＣＣ７１９ＧＣＧ　ＴＣＧ　ＴＴＧ　ＴＣＧ　ＧＧＣＴＴＣＣ ＴＣＡＡＣＣＣＧ　ＴＣＣＧＡＧ　７５２ＧＧＣＴＧＧ　ＴＧＧ　ＣＣＧ　ＡＣ Ｇ　ＣＴＧ　ＡＴＣＧＧＣＣＴＧ　ＧＣＧ　ＡＴＧ　７８５Ｆｉｇｕｒｅ　１　 （続き４） ＴＧＧ　ＧＧＴ　ＣＣＧ　ＴＣＣＡＧＣＧＡＣＣＣＧ　ＧＣＣＴＧＧ　ＡＡＧ　 ＣＧＣ８５１ＡＡＣＧＡＣＣＣＡ　ＡＴＧ　ＧＴＴ　ＣＡＧ　ＡＴＴ　ＣＣＣＣ ＧＣＣＴＧ　ＧＴＣ８８４Ａｓｎ　Ａｓｐρｒｏ　Ｍｅｔ　Ｖａｌ　Ｇｌｎ　Ｉ ｌｅ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｖａ１ＧＣＣＡＡＣＡＡＣＡＣＣＣＧＧ　ＡＴ ＣＴＧＧ　ＧＴＧ　ＴＡＣＴＧＣＧＧＴ　９１７Ａｌａ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｔｈ ｒ　Ａｒｇ　Ｉｌｅ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　ＧｌｙＡＡＣＧＧＣＡ ＣＡ　ＣＣＣＡＧＣＧＡＣＣＴＣＧＧＣＧＧＣＧＡＣＡＡＣ９５０Ａｓｎ　Ｇｌ ｙ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ａｓ ｎＡＴＡ　ＣＣＧ　ＧＣＧ　ＡＡＧ　ＴＴＣＣＴＧ　ＧＡＡ　ＧＧＣＣＴＣＡＣ ＣＣＴＧ　９８３１１ｅ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　 Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　ＬｅｕＣＧＣＡＣＣＡＡＣＣＡＧ　ＡＣＣＴＴＣＣＧ Ｇ　ＧＡＣＡＣＣＴＡＣＧＣＧ　１１０１６Ａｒ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｇｌｎ　Ｔ ｈｒ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　ＡｌａＧＣＣＧＡＣＧＧＴ　 ＧＧＡ　ＣＧＣＡＡＣＧＧＧ　ＧＴＧ　ＴＴＴ　ＡＡＣＴＴＣ１０４９Ａｌａ　 Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　 ＰｈｅＣＣＧ　ＣＣＣＡＡＣＧＧＡ　ＡＣＡ　ＣＡＣＴＣＧ　ＴＧＧ　ＣＣＣＴ ＡＣＴＧＧ　１０８２ＡＡＣＧＡＧ　ＣＡＧ　ＣＴＧ　ＧＴＣＧＣＣＡＴＧ　Ａ ＡＧ　ＧＣＣＧＡＴ　ＡＴＣ１１１５Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ 　Ａｌａ　Ｍｅｔ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ａｓｐ　ｌ１ｅＣＡＧ　ＣＡＴ　ＧＴＧ　 ＣＴＣＡＡＣＧＧＣＧＣＧ　ＡＣＡ　ＣＣＣＣＣＧ　ＧＣＣ１１４８Ｇｌｎ　Ｈ ｉｓ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ａ ｌａＧＣＣＣＣＴ　ＧＣＴ　ＧＣＧ　ＣＣＧ　ＧＣＣＧＣＣＴＧＡ　ＧＣＣＡＧ ＣＡＡＧＣ１１Ｂ２Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ａｌａ 　ＴＥＲＦｉｇｕｒｅ　１　（続　き５） 疎水性 親水性 Ｆｉｇｕｒｅ　３ ８５−Ａ　８５−８　８５−Ｃ 国際調査報告　。Ｉ−Ｙ／ＣＤ。、７カ、え。

フロントページの続き （５１）Ｉｎｔ、Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ａ６１Ｋ　３９／３９５　Ｒ ９２８４−４ＣＣＯ７Ｋ　７１０６　Ｚ　８３１８−４ＨＣ１２Ｎ　１／２１　 ７２３６−４８ Ｃ１２Ｐ　２１１０２　Ｃ８２１４−４ＢＣ１２Ｑ　１／６８　Ａ　７８２３− ４ＢＧＯＩＮ　３３１５３　Ｄ　８３１０−２Ｊ３３１５６９　Ｆ　９０１５− ２Ｊ ／／（Ｃ１２Ｎ　１／２１ Ｃ１２Ｒ１：１９） （Ｃｌ３Ｆ　２１１０２ Ｃ１２Ｒ１：１９） ＣＯ７Ｋ　９９：００ （７２）発明者　ドウ・ブリュン、ジャクリーヌベルギー国、ベー・１６５０・ ベールセル、リュ・ドウ・オングリ−・１９２ Ｉ

Claims (31)

【特許請求の範囲】
1. １．＊図１に示す１番目のヌクレオチドにより構成される末端から１４９番目の ヌクレオチドにより構成される末端までの範囲のヌクレオチド配列を含有する、 ＊又は、次のペプチド又はポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のうち少 なくとも１つを含有する：−図１に示す−４６番目のアミノ酸により構成される 末端から−１番目のアミノ酸により構成される末端までの範囲のもの、又は −図１に示す−２１番目のアミノ酸により構成される末端から−１番目のアミノ 酸により構成される末端までの範囲のもの、又は −ＳＱＳＮＧＱＮＹ、又は −ＰＭＶＱＩＰＲＬＶＡ、又は −ＧＬＴＬＲＴＮＱＴＦＲＤＴＹＡＡＤＧＧＲＮＧ、又は−ＰＰＡＡＰＡＡＰＡ Ａ、 ＊又は： −上記ヌクレオチド配列又はその相補体とハイブリッド形成するヌクレオチド配 列、 −上記ヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列、又は−上記ヌクレオチド 配列のＴをＵで置き換えることの出来るヌクレオチド配列を含有する ことを特徴とする核酸。
2. ２．次のペプチド： 【配列があります】 をコードするヌクレオチド配列を含有し、及び必要に応じて次のペプチド： 【配列があります】 をコードするヌクレオチド配列を含有し、次のヌクレオチド配列： ＣＧＧＣＴＧＧＧＡＣ（又はＴ）ＡＴＣＡＡＣＡＣＣＣＣＧＧＣとハイブリッド 形成しやすく、かつ、【配列があります】又は、 【配列があります】又は、 【配列があります】のいずれ ともハイブリッド形成しにくい、請求項１に記載の核酸。
3. ３．次のポリペプチド： −結核患者特に進行性結核を発症している患者由来のヒト血清と選択的に反応し 易いポリペプチド、 −又は、図１に示す１番目のアミノ酸により構成される末端から２９４番目のア ミノ酸により構成される末端までの範囲のアミノ酸配列をも認識する抗体によっ て認識され易いポリペプチド、 −又は、図１に示す１番目のアミノ酸により構成される末端から２９４番目のア ミノ酸により構成される末端までの範囲のアミノ酸配列をも認識する抗体を生じ せしめ易いポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含有する 、請求項１又は２に記載の核酸。
4. ４．オープンリーディングフレームを含有し、約３０ｋＤａから約３５ｋＤａの 成熟ポリペプチドをコードし、シグナル配列をコードする配列を含有する、請求 項１から３のいずれか一項に記載の核酸。
5. ５．次のポリペプチド： −図１に示す−４６番目のアミノ酸により構成される末端から−１番目のアミノ 酸により構成される末端までの範囲のポリペプチド、又は −図１に示す−２１番目のアミノ酸により構成される末端から−１番目のアミノ 酸により構成される末端までの範囲のポリペプチド、又は −図１に示す−４６番目のアミノ酸により構成される末端から２９４番目のアミ ノ酸により構成される末端までの範囲のポリペプチド、又は −図１に示す−２１番目のアミノ酸により構成される末端から２９４番目のアミ ノ酸により構成される末端までの範囲のポリペプチド、又は −図１に示す１番目のアミノ酸により構成される末端から２９４番目のアミノ酸 により構成される末端までの範囲のポリペプチド をコードする核酸を含有する、請求項１に記載の核酸。
6. ６．請求項１から５のいずれか一項に記載の核酸によってコードされるポリペプ チド。
7. ７．そのポリペプチド鎖中に次のアミノ酸配列：−図１に示す−４６番目のアミ ノ酸により構成される末端から−１番目のアミノ酸により構成される末端までの 範囲のもの、又は −図１に示す−２１番目のアミノ酸により構成される末端から−１番目のアミノ 酸により構成される末端までの範囲のもの、又は −ＳＱＳＮＧＱＮＹ、又は −ＰＭＶＱＩＰＲＬＶＡ、又は −ＧＬＴＬＲＴＮＱＴＦＲＤＴＹＡＡＤＧＧＲＮＧ、又は−ＰＰＡＡＰＡＡＰＡ Ａ の少なくとも一つを含有する、請求項６に記載のポリペプチド。
8. ８．そのポリペプチド鎖中に、次のアミノ酸配列：ＳＱＳＮＧＱＮＹ 及び必要に応じてアミノ酸配列： ＧＷＤＩＮＴＰＡ 及び必要に応じてアミノ酸配列： 【配列があります】 を含有し、且つ、 アミノ酸配列ＡＣＧＫＡＧＣＱ及びアミノ酸配列ＡＣＧＫＡＧＣＴを含有しない 、 請求項７に記載のポリペプチド。
9. ９．結核患者特に進行性結核を発症している患者から得たヒト血清と選択的に反 応し易いか又は、図１に示す１番目のアミノ酸により構成される末端から２９４ 番目のアミノ酸により構成される末端までの範囲のポリペプチド配列をも認識す る抗体によって認識され易いか又は、図１に示す１番目のアミノ酸により構成さ れる末端から２９４番目のアミノ酸により構成される末端までの範囲のポリペプ チド配列を認識する抗体を生じせしめ易い、請求項７又は８に記載のポリペプチ ド。
10. １０．シグナルペプチドによって先導され且つ約３０ｋＤａから約３５ｋＤａで ある、請求項７から９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
11. １１．そのポリペプチド鎖中に次のアミノ酸配列：−図１に示す１番目のアミノ 酸により構成される末端から２９４番目のアミノ酸により構成される末端までの 範囲のアミノ酸配列、 −図１に示す−４６番目のアミノ酸により構成される末端から２９４番目のアミ ノ酸により構成される末端までの範囲のアミノ酸配列、 −図１に示す−２１番目のアミノ酸により構成される末端から２９４番目のアミ ノ酸により構成される末端までの範囲のアミノ酸配列、 −図１に示す−４６番目のアミノ酸により構成される末端から−１番目のアミノ 酸により構成される末端までの範囲のアミノ酸配列、 −図１に示す−２１番目のアミノ酸により構成される末端から−１番目のアミノ 酸により構成される末端までの範囲のアミノ酸配列 の少なくとも一つを含む、請求項７に記載のポリペプチド。
12. １２．請求項６から１１のいずれか一項に記載のポリペプチドと、蛋白質又は該 ポリペプチドに関して異種の配列とによって構成されるアミノ酸配列であって、 該蛋白質又は異種配列は約１個から約１，０００個のアミノ酸から成り、該異種 蛋白質は好ましくはβ−ガラクトシダーゼである、ことを特徴とするアミノ酸配 列。
13. １３．異種核酸中に挿入される、請求項１から５のいずれか一項に記載のヌクレ オチド配列の少なくとも一つを含有する組換え核酸。
14. １４．組換えベクターであって、特にベクター配列、とりわけ常用のプラスミド 、コスミド、ファージＤＮＡ又はウィルスＤＮＡのようなベクター配列及び、そ の複製にとって非必須部位の一つに挿入された請求項１から５のいずれか一項に 記載の組換え核酸を含有する、クローニング及び／又は発現のための組換えベク ター。
15. １５．その複製にとって非必須部位の一つに、細胞宿主中での請求項６から１１ のいずれか一項に記載のポリペプチドの発現を促進する必要要素、とりわけ細胞 宿主のＲＮＡポリメラーゼにより認識されるプロモーター、特に誘導可能プロモ ーター、及び必要に応じての転写終結シグナルをコードする配列、及び必要に応 じてのシグナル配列及び／又はアンカー配列を含有する、請求項１４に記載の組 換えベクター。
16. １６．ベクター内に挿入された請求項１から５のいずれか一項に記載の核酸のＥ ．ｃｏｌｉによる発現を可能にする要素、特にβ−ガラクトシダーゼ遺伝子又は その一部の発現を可能にする要素を含有する、請求項１５に記載の組換えベクタ ー。
17. １７．請求項１４から１６のいずれか一項に記載の組換えベクターによって形質 転換され、且つ、宿主中で請求項６から１１のいずれか一項に記載のポリペプチ ドをコードするヌクレオチド配列の発現を可能にする制御要素を含有する細胞宿 主。
18. １８．Ｅ．ｃｏｌｉの如き細菌中から選択され、請求項１４から１６のいずれか 一項に記載のベクターにより形質転換されるか又は真核生物中から選択され、請 求項１４又は１５に記載のベクターにより形質導入される、請求項１７に記載の 細胞宿主。
19. １９．請求項１７又は１８に記載の形質転換細胞宿主によって発現される核酸の 発現産物。
20. ２０．請求項６から１１のいずれか一項に記載の組換えポリペプチドに対して向 けられる事実によって特徴付けられる抗体。
21. ２１．請求項１から５のいずれか一項に記載の核酸の一つと、又はそれらの相補 的配列とハイブリダイズするヌクレオチド性プローブ。
22. ２２．次の工程： −請求項１から５のいずれか一項に記載の核酸を含有する適切なベクターによっ て予め形質転換された細胞宿主の適切な培地中での培養、 −上記形質転換細胞宿主により産生されたポリペプチドの上記培養液からの回収 を包含する請求項６から１１のいずれか一項に記載の組換えポリペプチドの製造 法。
23. ２３．Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓに感染した可能 性のある患者に於ける結核のインビトロ診断法であって、−請求項６から１１の いずれか一項に記載のポリペプチドと生物学的検体中に存在する可能性のある抗 体とのインビトロ免疫学的反応が可能である条件下での、患者から採取した生物 学的検体と当該ポリペプチドとの接触及び、−形成された可能性のある抗原／抗 体複合体のインビトロ検出を包含することを特徴とする方法。
24. ２４．Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓに感染した可能性のある患者に於ける結核 のインビトロ診断法であって、次の工程：−請求項２０に記載の適切な抗体と生 物学的検体中に存在する可能性のあるＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの抗原との インビトロ免疫学的反応が可能である条件下での、生物学的検体と該抗体との接 触及び、 −形成された可能性のある抗原／抗体複合体のインビトロ検出を包含することを 特徴とする方法。
25. ２５．請求項２３に記載のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓ ｉｓに感染したと思われる患者に於ける結核のインビトロ診断法のための必需品 又はキットであって、 −請求項６から１１のいずれか一項に記載のポリペプチド、−免疫学的反応にと って好ましい培地調製のための試薬、−免疫学的反応により産生された抗原／抗 体複合体の検出を可能にする試薬、特に上記ポリペプチドが標識されていない場 合該試薬が必要により標識を有するか又は標識された別の試薬によって認識され 易い試薬 から成ることを特徴とする必需品又はキット。
26. ２６．請求項２４に記載のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓ ｉｓに感染したと思われる患者に於ける結核のインビトロ診断法のための必需品 又はキットであって、 −請求項２０に記載の抗体、 −免疫学的反応にとって好ましい培地調製のための試薬、−免疫学的反応により 産生された抗原／抗体複合体の検出を可能にする試薬、特に上記抗体が標識され ていない場合該試薬が必要により標識を有するか又は標識された別の試薬によっ て認識され易い試薬 から成ることを特徴とする必需品又はキット。
27. ２７．請求項６から１１のいずれか一項に記載のポリペプチドを、医薬上許容し 得る担体と組み合わせて含むことを特徴とする免疫原性組成物。
28. ２８．他の免疫原性成分のうち、請求項６から１１のいずれか一項に記載のポリ ペプチド又は請求項１９に記載の発現産物のいずれか一つを含有し、該ポリペプ チド又はペプチド、又は発現産物は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒ ｃｕｌｏｓｉｓを中和する抗体のインビボでの産生を誘導可能にするか、又はＭ ｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ抗原に応答するＴ細胞を 活性化することによるインビボでの細胞免疫応答を誘導可能にする結合体とする ために、必要により、天然蛋白質又は充分な分子量を持つ合成ポリペプチドと結 合している、ことを特徴とするワクチン組成物。
29. ２９．好ましくは次のアミノ酸配列（図１参照）：【配列があります】 を有することを特徴とする、抗体、特にモノクローナル抗体の産生に好ましく用 いられる請求項６に記載のペプチド。
30. ３０．請求項６から１１のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする組換 えＤＮＡ配列であって、必要により、該ポリペプチドのプロモーター配列、及び 、該ポリペプチドに関して異種のポリペプチド配列のエピトープを含む組換えＤ ＮＡ配列によって形質転換されたＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂｏｖｉｓ　Ｂ ＣＧワクチン菌株。
31. ３１．Ｍ．ｔｍｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓに既に接触した患者の診断用必需品又はキ ットであって、該必需品又はキットは請求項６から１２のいずれか一項に記載の ポリペプチド又はペプチドの内の少なくとも一つの調製物を含有し、該調製物は 患者が既にＭ．ｔｍｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓに接触していた場合、患者に皮内注射 した後、注射部位に遅延型過敏反応をインビボに導入することが出来ることを特 徴とする必需品又はキット。