JPH05502681A - 超音波エコグラフィーに適切な中空気体封入微小球の安定懸濁物の製造のための方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 超音波エコグラフイーに適切な中空気体封入微小球の安定懸ｉ物の製造のための 方法本発明は例えば超音波エコグラフイー及びその他の医療用途のための、生体 に投与するのに適切な水性液体中の空気もしくは気体封入微小球の安定な分散体 又は溶液の製造のための方法に関する。

更に本発明は以下の方法にかけることができうる組成物及び以下の方法を実施す ることにより得られる所望の安定微小球溶液又は懸濁物に関する。

液中に懸濁されている空気もしくは気体の微小体（マイクロボディー）又は微小 球体（マイクロバフル）、例えば微小気泡（マイクロバフル）又は微小中空球（ マイクロバルーン）はエコグラフイーのために特に有効な超音波反響体であるこ とがよく知られている。本明細書において１微小気泡」なる語は、分割状態にお いて空気又は気体を液体に導入することにより一般的に得られる、液体中におい て懸濁状態における空気又は気体の球体を特に表わし、該液体は好ましくはこの 気泡の表面特性及び安定性をコントロールするために界面活性剤（サーファクタ ント又はテンサイド）も含む。「微小カプセル」又は「微小中空球」なる語は好 ましくはＴｈ質的境界もしくは囲い、即ち、ポリマー膜壁を有する空気又は気体 を意味する。微小気泡及び微小中空球の両方共超音波造影剤として有用である。

例えば搬送液中の微小気泡又は微小中空球の懸／＠吻（０，５〜１０μｍに範囲 する）の生体の血流への導入は超音波エコグラフイーイメージングを強く助成す るであろう。従ってこのことは内臓の識別化に役立つ。血管及び内臓のイメージ ングは医療診断、例えば心臓血管及びその他の疾患の検査に大いに役立つことが できる。

エコグラフイーに適切な注射可能な液体キャリアー中の微小気泡の懸濁物の状態 の形成は、加圧のもとでこの液体中に溶解している気体の放出により、あるいは 気体性の生成物を発生せしめる化学反応により、あるいは空気もしくは気体を中 に取り込んでいる又は吸着して含む液体に可溶性又は不溶性な固形物の混合によ り提供されうる。

例えばＵＳ−Ａ−４，４４６，４’４２号（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ）において、無菌 注射可能液体キャリア中の気体微小気泡の懸濁物の調製に関する一連の異なる技 術であって、（ａ）搬送液（水性）中の界面活性剤の溶液と（ｂ）安定剤として の粘度上昇剤の溶液を利用する技術が開示されている。気泡を発生させるため、 これに開示されている技術には、小さな開口部に（ａ）。

（ｂ）及び空気の混合物を高速にて通すこと、又は（ａ）を（ｂ）の中に生理学 的に受け入れられている気体と一緒に利用する直前に、注入せしめること；ある いは（ａ）に酸を加えそして（ｂ）に炭酸塩を加え、両方の配合物を利用直前に 一緒に混合せしめることにより、酸が炭酸塩と反応してＣＯ２気泡を発生せしめ ること；あるいは（ａ）と（ｂ）の混合物の保存品の中に過剰加圧気体を加える ことにより、この混合物を注射のために利用する時にこの気体が微小気泡となっ て放出されることが含まれている。

ＥＰ−Ａ−１，３１、５４０号（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ）は、微小気泡の製造であっ て、安定注射可能搬送液、例えば塩の水溶液又はマルトース、デキトロース、ラ クトースもしくはガラクトースのような＊ｉの水溶液を、封入空気を含む同し糖 類の固形微粒子（０，１〜１μｍの範囲における）と混合せしめる方法を開示し ている。この液体キャリア中の気泡のｇ４物を作るため、この液体及び固形成分 の両者を数秒間無菌状態のもとて一緒に撹拌する。これが終了したなら、この懸 濁物を直ちに使用する、即ち、これはエコグラフイー検査のために５〜１０分以 内に注射しなければならない。実際にこれらは消失し易いため、この時間を過ぎ るとこの気泡濃度は実用的には低すぎるようになる。従って、注射のための微小 気泡？８液の利用に関する１つの重要な問題は、時間に伴う安定性の欠如である 。本発明の目的はこの欠点を解消することにある。

注射後のエコグラフイーに関する微小気泡の伴う他の問題はサイズである。一般 に認められている通り、細い血管中にわたる移送を可能にする微小気泡の有用な サイズは約０．　５〜１０μｍに範囲し、大きい気泡は凝血及びその結果として の塞栓症の危険性を伴う。例えば、［１５−Ａ−４，４４６，４４２号（Ｓｃｈ ｅｒｉｎｇ）に開示されている気泡懸′１ｌｆｉＩ物であって、界面活性剤例え ばレシチン、脂肪酸のエステル及びエーテル、並びにポリオキシエチレン及びポ リオキシエチル化ポリオール例えばソルビトール、グリコールとグリセロール、 コレステロール又はポリオキシーエチレンーポリオキシブロビレンポリマーを有 する脂肪アルコールの水溶液を、粘度上昇化合物並びに安定化化合物、例えば単 −及び多糖類（グルコース、ラクトース、スクロース、デキストラン、ツルビー ル）、ポリオール例えばグリセロール、ポリグリコール；並びにポリペプチド例 えばタンパク質、ゼラチン、オキシポリゼラチン及び血漿タンパク質の溶液と強 く攪拌せしめたものにおいて、４０〜５０μｍより小さい微小中空球は約５０％ のみであり、従ってこのような懸濁物はあらゆるエコグラフイー用途に適してい ない。本発明はまた、この気泡のサイズを機械的に小さくすることによってこの 問題を解決することを可能にする。

上記のいくつかの欠点、特に消失性の問題を解決する試みにおいて、微小中空球 、即ち、物質的な壁を有する微小球が開発された。前述した通り、微小気泡は無 形又は消失性の囲いのみを有すが（即ち、それらは液状の壁であってその表面張 力は界面活性剤の存在により改質されているもののみに囲まれている）、微小中 空球又は微小カプセルは一定の機械的強度を有す′！＃質的な材料、例えばポリ マー膜により作られた有形な囲いを有する。言い換えるならば、それらは空気又 は気体が多かれ少なかれ強く封入されている物質の微小球である。

例えばＵＳ−Ａ−４，２７６，８８５号（Ｔｉｃｋｎｅｒら）は、超音波イメー ジを増強せしめるための気体を含む表面膜微小カプセルの利用を開示し、この膜 は複数の無毒及び非抗原性有機分子を含む。開示されている態様において、これ らの微小気泡は凝集を防ぐゼラチン膜を有し、そしてそれらの好ましいサイズは ５〜１０μｍである。これらの微小気泡の膜はエコグラフイー検査を行なうのに 十分に安定であると言われている。

しかしながら、一定の時間が経過したら、その中に封入されている気体は血流中 において溶解し、そしてこの気泡は徐々に消失するであろうということも言われ ており、こ孔はおそらくゼラチンのゆっくりとした溶解に起因するであろう。従 ってこの技術によってこの不安定性の問題は完全には解決されておらず、従って 利用する直前上この微小カプセルはそれらが保存安定性であるゼラチン溶液の中 に保存される。しかしこの懸濁物を注射物の作製のために利用する際、このゼラ チンは液状となるように加熱及び溶融される必要があり、これは不便である。

ゼラチンを伴わない改善された保存安定化微小球はＵＳ−＾−４，７１８，４３ ３号（Ｆｅｉｎｓｔｅｉｎ）に開示されている。これらの微小球はタンパク質溶 液例えば５％の血液アルブミンの高周波処理（ソニケーション）（５〜３０ＫＨ ｚ）により作られ、そして２〜２０μｍ、主として２〜４μｍの範囲における粒 径を有する。この微小球は高周波処理後の膜形成タンパク質の変性、例えば加熱 又は化学的手段、例えばホルムアルデヒドもしくはグルタルアルデヒドとの反応 を用いることにより安定化されている。この方法により得られる安定微小球の濃 度は２〜４μｍの範囲において約８Ｘ１０”／ｍｌであり、４〜５μｍの範囲に おいて約１０ｈ／ＩＩであり、そして５〜６μｍの範囲において５ＸＩＯ’以下 であると言われている。これらの微小球の安定な時間は４８時間又はそれより長 いものと言われており、そしてそれらは静脈内注射後に左心臓イメージングを好 適に可能とした。例えば、末梢血管の中に注入せしめた際のこの高周波処理アル ブミン微小気泡は経肺動脈通過（ｔｒａｎｓｐｕｌｍｏｎａｒｙ　ｐａｓｓａｇ ｅ）が可能である。このことは左心室及び心筋組織のエコーグラフ不透明化をも たらす。

最近、注射超音波エコグラフイーのだめの更に改良された微小中空球がＥＰ−Ａ −３２４，９３８号（Ｗｉｄｄｅｒ）において報告されている。この明細書にお いて、数ケ月又はそれより長い半減期を存する、１０μｍ以下の高濃度（１０８ 以上）空気封入タンパク質被覆化微小球が開示されている。これらの微小中空球 の水性懸濁物は熱変性しうるタンパク質、例えばヒト血清アルブミンの溶液の超 音波キャビテーションにより作られ、この操作は膜形成タンパク質のある程度の 発泡化及び加熱によるその後の硬化をももたらす。その他のタンパク質、例えば ヘモグロビン及びコラーゲンもこの文献の方法において好都合であると言われて いるが、我々の操作においてそのようではなかった。

ＥＰ−Ａ−３２４，９３８号に開示の微小中空球の懸濁物の高い保存安定性は、 即ち液体キャリア相と一緒にそれらが市販されることを可能とし、このことは使 用前の調製がもはや必要としなくなったために強い商業価値を有する。しかしな がら、この膜物質の掻端な強さ及び安定性はいくつかの欠点を有する。

例えばその硬さの理由により、この膜はこの微小球のさらされうる突然の圧力変 化に耐えることができない。この圧力変化は例えば血流を移動する際、心臓の脈 動に起因しうる。従って実際上の超音波検査のもとでは、一部の微小球は破裂す ることがあり、これはイメージングの再現性を悪くするであろう。更に、柔軟な 壁を有する微小球は、硬質の壁を有する対応の微小球よりも反響性であることも 知られている。

更に、注射の場合において、この微小球の壁を形成する材料の過剰な安定性は検 査される生体によるその生物分解を遅らせ、従って代謝の問題をもたらしうる。

従って、柔かく且つ弾性な膜により覆われている圧力耐久性微小中空球であって 種々の圧力のもとて一時的に変形でき、且つ高い反響性の付与されているものを 開発することがより好ましい。

ＥＰ−Ａ−３２４，９３８号に開示されている微小中空球懸濁物の調製の方法は ２段階のヒト血清アルブミン（Ｈ３Ａ）の高周波処理を包含する。第１段階にお いて、細いチューブ中における数ｍｌの該タンパク質の希釈溶液を、その中にソ ニケーター（高周波器）ヘッドを浸すことによって高周波処理にかける；第２段 階において、このソニケーターヘッドをこの溶液のレベルより高く持ち上げて高 周波処理をかけ、これにより発泡が起こりうる。次にこの高周波処理／８液をデ カント処理のために一夜放置し、そしてこの上層に集まっている微小中空球を集 める（フロート分離）。

この方法はやや複雑であり、時間がかかり、そして少量のインクレメントによる タンパク譬溶液の処理を更に採用している（ＥＰ−Ａ−３２４，９３８号の頁４ 、行９）。従ってこれは工業生産に必要とされる大量の微小中空球を得るには明 らかに不都合である。

タンパク質溶液の発泡及び所望のサイズへのこの発泡気泡の剪断の採用による機 械的な縮小が連続的又はほぼ同時に行なわれる本発明の方法並びに組成物は以上 の欠点を解決するであろう（請求の範囲を参照のこと）。以下に定義する条件の もとで、水性懸濁物の気泡のサイズは有意なる気泡の崩壊及び気泡計測値の損失 を伴うことなく所望の値の範囲に迄小さくされうろことは実際に非常に驚くべき ことであり且つ予想し得ないことである。

簡単に述べると、本方法は少なくとも１種の膜形成（ｆ　ｉ　Ｉｍｏｇｅｎｉｃ ）タンパク質の水溶液を任意的に発泡剤の存在下において泡へと変換せしめるこ と、即ち、該溶液に空気又は気体の気泡の分散体を付与し、そしてその後又は同 時に、摩擦又は振動によって該気泡のサイズ（通常はまず１００μｍ又はそれよ り大きい範囲である）を所望の値、通常は０．５〜１０μｍの範囲、好ましくは ４〜１０μｍの範囲迄機械的に小さくすることより成る。これはこの泡を強い剪 断にかけること、例えば機械的もしくは気体圧力のもとでこれを小さな開口部又 は通路に通すことにより成し遂げられる。該通路は任意的にこの剪断効果を高め るためのハンフル（ｂａｆｆｌｅ）手段を含む。これはホモジナイザー−乳化装 置によるか、又はハソフル化（遮断）されているもしくはねじれている通路のネ ットワークの施されている無機又は有機媒体に通すことによりもたらすことがで き、例えばこの材料は非常に粗い多孔性材料でありうる。多孔性無機媒体は種々 のサイズの無機粒子の層又はセラミックフィルターのような濾過助剤を含む。有 機媒体は当業者によく知られているフィルタースクリーンを含む。バッフル化通 路を通すことによる気泡のサイズ縮小の際、剪断効果は徐々に適用するべきであ る。即ち、この処理は連続的に少量づつの泡にのみ適用すべきである。同時に大 量の泡に剪断を適用すること、即ち、大量の部分に高すぎる圧力をかけることは 、単に圧縮による一時的な気泡サイズの縮小をもたらし、従って最終的にこの圧 力の解放に基づいてもとの気泡のサイズに復帰しうる。発−一乳化機を用いる場 合に同時に行うことができることが明らかである。我々は以降にこの装置の好ま しい機械的条件について示す。音波又は超音波振動も気泡サイズ縮小に有効であ りうる。

発泡にかけるべきタンパク質溶液は０．１〜１０重量％、好ましくは０．１〜５ 重量％、最も好ましくは０．２〜４゜９重量％の膜形成タンパク質、即ち、溶液 の中に存在している場合に泡の気泡の廻りに膜を形成せしめるのに役立つことが できるタンパク質を含んで成り、このような膜は気泡のサイズ縮小の際にわたる ホモジナイザーの機械的作用のもとで壊れることのないほど十分に安定であるべ きである。上記の条件を満足せしめるタンパク質は数多くあり、そしてヒト血清 アルブミン（Ｈ３Ａ）　、牛及び羊血清アルブミン（ＢＳＡ及び○ＳＡ）　、卵 アルブミン、ヘモグロビン、フィブリノーゲン、グロブリン、コラーゲン、ゼラ チン、発泡性タンパク質例えば加水分解野菜タンパク質、グルテンの加水分解画 分（ハイフォーマ：Ｈｙｆｏａｍａ）、加水分解カゼイン等が含まれる。タンパ ク質が本質的に発泡特性を有さない又はわずかにしか有さない場合、発泡剤例え ば生理学的に受け入れられる界面活性剤を任意的に加えることができる。広範囲 にわたる常用の界面活性剤が存在し、全てではないがその一部として「ツイーン Ｊ　（Ｔｗｅｅｎ：商標）、「スパンＪ　（Ｓｐａｎ：商標）が挙げられる。

該溶液は４０〜８０Ｍ量％の少なくとも１種の可溶性ポリオール粘度上昇剤も含 み、この量は１００〜６００の範囲のＣＰをこれに授けるのに十分である。この 粘度上昇剤は好ましくは一分子当り少なくとも４個のヒドロキシ基を有し、且つ 前記の濃度の値を満足せしめる水溶解度を有するポリオールを含む。低濃度で得 られる泡は一般に薄すぎてしまい、しかしながら高濃度では粘度は有効な均−化 及び気泡サイズ縮小のために高すぎてしまう。好ましい粘度上昇剤はデキストラ ン、ポリデキストロース、グルコース、フルクトース、マルトース、コーンシコ ンブ、糖分シロンブ（モノマー及びオリゴマー糖の混合＠Ｉｔ）、部分加水分解 炭水化物（例えばデンプン）、グルコース及びフルクトースのような糖の合成ポ リマー、ツルビール、マンニトール等のような還元糖、少なくとも４個のグリセ ロール単位を有すポリグリセロール、並びにその他の水に十分に可溶性の類似の ポリオールを含む。スクロースはその不十分な粘度の理由により単独では利用で きないことが分る。しかしながらこれはその他のより可溶性な糖、例えばグルコ ース又はフルクトースと組合せて利用できる。発泡すべき溶液の粘性パラメータ ーが単独でその気泡に保存安定性を授けるには不十分の場合、有効な粘度及び増 強剤の濃度の好ましい組合せは低Ｍｗ（〜１８０）と平均的な分子量（〜３００ から２０００）の炭水化物の混合物を利用することにより得られることが分る。

全ての範囲のデンプン加水分解物もこの範晴に入る。多糖類の中で本発明におい て好ましく、且つ市販されているものとして、米国又は英国におけるＰｆｉｚｅ ｒのポリデキストロースＮ；Ａｍｙｌｕｍ（ベルギー国）からミロース（Ｍｙｌ ｏｓｅ：商１）ｃＮ、ミロースＨＭ−４３−３８−２５０又はＲｏｑｕｅｔｔｅ 。

Ｌｅｓｔｒｅｍ（フランス国）からフロリス（Ｆｌｏｌｙｓ：商標）Ｂ−６０８ Ｏ３の名のもとで販売されているデンプン加水分解物；Ａｍｙｌｕｍからの５Ｏ ３−ＬＵもしくは５ｔＲ＝Ｏ−３ＷＩＴ（商標）の名のもとで販売されている高 フルクト−スコーンシロンブが挙げられる。

本方法において利用されるホモジナイザー装置は、気泡のサイズを約０．５〜１ ０μｍの所望のサイズＱこ迄小さくするのに十分な剪断力を提供する任意の市販 されているヘッドを有すものでありうる。発泡と気泡サイズ縮小を同時に行なう 、即ち１工程において行なう場合、好ましい乳化ヘッドは高速切断、空気又は気 体の吸引、及び気泡の最終サイズをコントロールすることを可能とするサイズの 開口部を通過する液体循環を同時に提供するものである。食品工業において有用 な多数の乳化機（例えばＰＯＬＹＴＲＯＮ）が適切である。軸流カッター（ａχ ｉａｌ　ｃｕｔｔｅｒ）及び約１．５１の幅の外周上のｆ４　（ｐｅｒｉｐｈｅ ｒａｌ　ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ　）スリットを有す管状乳化ヘッドが優れた 結果を提供する。

本発明の典型的な操作において、６５重量％のポリデキストロース（ＰＦ　Ｉ　 ＺＥＲ）を含み、２０°Ｃで約４００ｃＰの粘度を有し、約３ｏｓｎ＋ｏｌ　の 浸透圧を有する０、２〜１％のＨ３Ａ溶液を、ＰＯＬＹＴＲＯＮ２０ＴＳ乳化ヘ ツドにより、１０〜１５０００ｒｐｍにて０．２〜５分間にね・たり発泡且つホ モジナイズせしめる。これにより、連数間にわたり完全に安定（有意なる測定変 化が認められない）である、１ｍｌ当り約１０”〜１０９個の微小気泡（０，５ 〜５μｍ）の気泡又は泡の分散体が得られる。この分散体はエコグラフイー検査 のために直接注射せしめるには粘性が高すぎ、従っである時間（例えば１０〜２ ０時間）にわたり室温で任意的に放置せしめた後、これを０．０１〜０．１％の グルタルアルデヒド溶液によって１＝１０〜１；１５に希釈せしめる。希釈後、 この濃度は未だ１０７〜１０”個の範囲であるが、その粘度は数ｃＰのみとなり 、従ってこの溶液は注射及びエコグラフイー検査のために適する。この希釈溶液 も少なくとも数週間は安定であった。

他方、発泡させる前の出発組成物にグルタルアルデヒド（又はその他の任意の薬 学的に受け入れられている架橋剤）を利用することもできる。その他の架橋剤に は、システィン、アセチルシスティン、メルカプトエタノール、エタンスルフィ ドのような硫化物；カルボジイミド、ポリイソンア７−ト；多酸；及び無水マレ イン酸のような無水物；並びに低級脂肪酸とのスクロースもしくはグルコースの エステルのような炭水化物ポリエステル又は脂肪酸が含まれる。安定化は、希釈 のために１〜ｌＯ％のＢＳＡ又はＨ３Ａのン容液を用いることによっても成し遂 げられうる。通常、所望するならば、安定化は約６０〜１２０°、好ましくは約 ６５〜８０’の温度範囲において数秒から数分間にわたり注意深く加熱せしめる ことによっても行なわれることができ、その正確な温度は所望するタンパク質の 硬化の程度に依存する。

発泡工程において、この乳化ローターは管状ヘンドカハーの外周スリットに発泡 すべき溶液（又は縮小すべき気泡）を押し通し、そして同時に溶液の中心に渦を 形成せしめることによってその周辺から空気（又は気体）を取り込む。これによ って強力な液／空気混合作用及び泡の気泡のサイズを小さくせしめる強い剪断効 果が提供される。通常空気は任意の生理学的に受け入れられている気体、例えば Ｎｚ、Ａｒ及びその他の貴ガス、Ｎ２０、炭化水素蒸気、ＣＨ，等に代替されう る。

もし溶液をまず発泡させ、続いて泡の気泡のサイズを記載の通りに小さくする場 合、この発泡工程は任意の常用のブレンダー又は泡立て装置により行なわれる。

例えばある装置態様は、底部排出部を有すパイレンクス反応槽であって、温度コ ントロールのための冷却マントル、発泡する前及びしている際中にて組成物を撹 拌するためのブレード攪拌器、並びに剪断せしめ且つ発泡、ホモシネ−ジョン及 び気泡サイズの縮小を行なうためのカッタークランシャーヘッドの装備している ものを含んで成る。配合物の無菌化はこの反応槽にて直接行うことができる。通 常、上記の反応槽による操作は、以下の段階を好適に含む。

１）該反応槽の中にｔＲＲ液（例えばポリデキストロースはコーンシロップの溶 液）を入れる。

２）ブレードミキサーを作動させる。

３）該溶液を加熱することによって任意的に滅菌する。

４）アルブミン溶液（事前に滅菌したもの）を導入する。

７）発泡及び気泡サイズ縮小用ヘッドを作動させる。冷却マントルによって温度 を注意深くタンパク質の変性温度よりも低くコントロールする。

６）非常に少量の架橋剤を加える。

７）ゆっくり攪拌しながら冷却する。

８）周囲温度で一定時間放置する。

９）懸濁物を底部開口部から回収する。

発泡の際中、この操作温度は開始時では周囲温度とし、そしてホモシネ−ジョン における剪断により発生する熱に関しては、これはタンパク譬変性且つ微小球の 過剰な硬化を引き起こす値を超えることのないよう特に気泡縮小段階にてコント ロールすることが好ましい。通常、温度を５０°以下、好ましくは３５〜４０° 以下に保つことが好ましく、もし温度が変性の起こるレベル上置まると、収率は 非常に悪くなりうる。包括されるホモシネ−ジョン時間は数分間、即ち５〜１０ 分間であることができ、これは利用する材料の量に依存する。剪断エネルギーに 基づく高すぎる温度は発泡又は気泡サイズ縮小の際に有害でありうるにもかかわ らず、所望するならば微小気泡の完了懸濁物を有害な作用を伴わずに５０°Ｃよ り高く加熱せしめることがあることにも注目すべきである。

実際、希釈する前後の完了気泡懸濁物の加熱は気泡壁を成す膜形成タンパク質の 発展的硬化をもたらし、このことは気泡特性を多少変化せしめ、従って保存期間 のもとでの安定性に役立つ。事実、例えば６０〜１２０　”Ｃで数秒間から数分 間加熱することは、変性によるタンパク質の有用な特性範囲への硬化をもたらす であろう。

希釈された、即時注射できる溶液は、常用の凍結乾燥技術によって乾燥したもろ い固形物へと乾燥されることができる。

この固形物は変化を伴うことなく乾燥条件のもとて無限の期間保存されることが でき、そしてもとの注射可能な懸濁物は単にこれに対応する量の水又は注射のた めに選ばれる生理学的に受け入れられる液体を加えることによって完全に再生す ることができる（気泡の損失を伴わず）。注射可能な微小球懸濁物を提供するた めに利用する水に関し、泡の安定性の欠如のため、完全に脱気せしめたタイプの もの（例えば蒸留水）は避けるべきであることが理解される。泡の希釈を及ぼす 好ましい種類の水は無菌であり且つ空気にさらされているものであるべきである ；通常、水道水又は天然のミ２ラル飲料水がより適切である。少量の溶解無機物 質は（家庭ラインから入手できる水の中に通常存在）、保存のもとでのこの懸濁 物における気泡の安定に役立つようである。

以下の実施例は本発明を詳細に例示する。これらの実施例において、粘度の値は ＨＡＡＫＥ回転式粘度計、ヘッドＭＥ−３０（回転速度に従って１〜１０００ｃ Ｐ）により２５°Ｃにて測定し；気泡濃度は格子付顕微鏡スライドを含んでなる ヘマトサイトメーターにより測定した（測定面積はｌＸ１ｍｍ、厚さ１００μｍ 、（０，１μｌ））。計測すべき溶液はこの計測面積中に約５０〜１００個の気 泡となるよう予め適当に希釈した。他方、常用のカルターカウンター（Ｃｏｕｌ ｕｅｒＣｏｕｎｔｅｒ）も用いた。

気泡のサイズ及びサイズ分布はＭ　Ａ　Ｌ　Ｖ　Ｅ　ＲＮマスターサイザー（Ｍ ａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ：商標）装置を用いて測定した；これは調べる懸ｉ物を保 持するためのセルに単色光の校正ビーム（レーザービール）を当て、そして回折 パターンのパラメーターを調べることに基づく。

実１号ロー 牛血清アルブミンを通常市販されている５％の溶液として入手し、そしてこれを 凍結乾燥させてさらさらとした炎黄色の粉末とした。

この固形ＢＳＡを水に溶解せしめ、２０重量％の溶液（ストック溶液）とした。

粘度上昇剤６５重量％を有する組成物を、７０重量％のポリテ＋ス）Ｏ−ス水’ Ｇ’ｅ　（Ｐ　Ｆ　Ｉ　ＺＥＲ）　３００　ｇ、水１８ｇ、上記のストックｍＨ ６ｇ及びグルタルアルデヒド０．　３ｇを一緒に混合せしめることにより作った 。２５°Ｃでの粘度は４６０ＣＰであった。幅１．５ｍｍのスリットを有するポ リトロンエマルションヘッドをこの組成物の中に浸し、そして発泡と乳化を冷却 を伴わずに室温（２０〜２５°Ｃ）にて約１／２〜１分間行った。この乳化エネ ルギーは温度を約３０〜３５°Ｃに高めた。これは約１０９個の気泡／ｍｌ（カ ルターカウンター）を含む微小気泡懸濁物をもたらし、はとんどの気泡は１．５ 〜２μｍの範囲（Ｍａｌｖｅｒｎ）にあった。この粘度は出発溶液のそれと実質 的に同一であり、従って水又は食塩水による希釈（１：１３）の実施は約７，７ Ｘ１０’個の気泡／立方１を有する容易に注射できる液体を提供する（粘度、約 ５〜１０ｃＰ）。

反響測定はプレキシグラス製の物体ホルダー（径３０ｍｍ）であって、厚さ２０ μｍのＭｙｌａｒ音響窓、恒温湯浴中に浸されているトランデューサーホルダー 、４０ｄＢの固定ゲインを有する外部プリアンプ及び−４０〜＋４０ｄＢの可変 ゲインを有する内臓アンプを有すパルサーレシーバ−（Ａｃｃｕｔｒｏｎ、Ｍ３ ０１０　ＪＳ）、並びに互変性の１３ｍｍの非集束式（ｕｎｆｏｃｕｓｅｄ）　 トランデューサーを有するものより成るパルス−エコーシステムによって行つっ た。１０Ｍ）Ｉｚの他職フィルターを受容部に挿入せしめて信号対雑音比を改善 せしめた。ＩＢＭ　ＰＣにおけるＡ／ＤボードはＳ。

ｎｏｔｅｋ　ＳＴＲ８３２であった。測定は７．５ＭＨｚで行った。

０．０２のレンジにおける反響値を上記の希釈により得た。

約１０−２〜１０−３の比率における更なる希釈により、０．０４〜０．０６の レンジにおける反響値が観察された。

以上の実施例において生血清アルブミン（ＢＳＡ）の代りに同量のヒト血清アル ブミン（Ｈ３Ａ）を代用しても同一の結果が得られた。

叉施拠叉 ７０重量％の糖分を有するＡＭＹＬＵＭ社、ベルギー国由来の改質コーンシロッ プ３００ｇ（ＳＩＲ−○−３ＷＩＴＬＵ；主としてグルコース、フルクトース、 マルトース及び微量のその他の糖より成る）（密度−約１．４５）を２０％２０ ｃＰであった。この溶液窒素の雰囲気下でＰＯＬＶＴＲＯＮ乳化ヘノドシこより ３分間発泡且つ乳化せしめ、その温度は硬化、及び変性によるタンパク質の水へ の不溶性化を防くために４０°Ｃ以下に保った。

ホモシネ−ジョンの後、この懸′Ｉ＠物を０．０７％のホルムアルデヒドを含む 水により約１／１０に希釈し、そして気泡濃度について計測した（約５Ｘ１０７ 個／ｍｌ、の希釈懸濁物であった）。この気泡サイズ分布は、０．５〜３μｍの 範囲において８０％であった（粘度は数ｃＰであった）。この濃しＡずに少なく とも４週間安定であった。

裏施勇ユ 以上の実施例の工程を、タンパク質として２０重世％の水性Ｈ３Ａ及び粘性上昇 成分として４２重量％のデキストロースを用いて繰り返した（粘度は２５゛Ｃに て５１８ｃＰ）。発泡及びホモシネ−ジョンは３５°Ｃ以下の温度にて１分間行 った。

この微小気泡懸濁物（約１０９／ｍｌ）は少なくとも１５日間安定であった。５ ％のＨ３Ａ溶液による希釈の後（１／１．０）、その粘度は約１５〜２ＯｃＰ迄 落ち、そしてこれは注射及びエコグラフイー検査に適していた。時間に伴う安定 性は７０〜７５°Ｃで２分間加熱することにより更に高まった。

尖隻開↓ 実施例１の工程を、ＢＳＡをその他のタンパク質により代用することで繰り返し た。その他のパラメーターは実施例１と同様とした。以下の表に、未希釈懸濁物 の微小気泡濃度の結果を報告する。食塩水（０，９％のＮａｃｌ水？８液）又は その他の薬学的に受け入れられる水性希釈剤のいづれか、及び安定剤による希釈 の後、反響検査に適する微小気泡の注射可能な懸濁物が得られた。

ヘモグロビン１　ハイフォーマ７７−　牛血子″１１安定性　〉２４時間　〉１ 週間　□ ”　ＦＬＵＫＡ　ＡＧ、　Ｂｕｃｈｓ　、スイス国由来””　Ｈｅｒｍａｎ　Ｌ ＡＵＥ　ＡＧ、　ＣＨ−６０５５Ａｌｐｒａｃｈ　、スイス国由来実」ｌ壓ｉ （前記した）１リンドルの反応槽に、３０ｍ１の水及び５％水性ヒト血清アルブ ミン（Ｈ３Ａ）３６ｇを順に加えた。攪拌機を作動させ（２５ｒｐｍ）そして温 度を２０°Ｃにコントロールした。次にポリトロン（商標）ヘッド（スリット３ ｍｍ）を１１．　ＯＯＯｒｐｍにて作動させ、その間ゆっくりとした攪拌をし続 け、そしてこの反応を２５分間行い、その間この温度は４０°Ｃを超えないよう にコントロールした。次に５０％の水性グルタルアルデヒド１．２９ｍ１を加え 、そしてホモジ名−ションを数分間続け、ここでこの温度は４５°Ｃ以下に保っ た。このカッターヘッドを停止させ、そしてこの混合物を室温で約１０分間冷却 した。この気泡懸濁物をこの反応槽において約１２時間放置し、その後これを底 から回収せしめ（反応槽上部の泡は除去した）、そしてガラス容器に保存した。

この気泡濃度は１０８〜１０’／１ｍｌの範囲にあり、そして９０％以上の気泡 は１〜１０μｍのサイズの範囲にあった。

濃い気泡懸濁物のサンプル１ｏ１１を１２■１の水道水により希釈し、そして冷 い囲いの中で−２０〜−４０℃で瞬間凍結させた。次にこれを室温にゆっくり戻 しながら減圧した（１０−３〜１０−’ｍｓ）　（真空フラスコとポンプの間に 位置するコンデンサーは約−４０°Ｃに保った）。完全な蒸発の後に薄く且つも ろい固形の塊が残り、これは有意なる変化を伴わずに乾燥条件（吸湿性）のもと て無期限的に保存できる。長期間保存後（数週間）、この固形物に］、２ｎ＋Ｉ の水を加え、これはもとの気泡計測値（約１０’／ｍｌ）を伴う気泡懸濁物を再 生せしめた。

ス新ｌ粗は 一連の調製物（１０３−１２７と表示）を実施例５に記載の主たる方法に従って 行った。但し、いくつかの操作パラメーターは発展的に改良した。操作条件及び 結果を添付した表にまとめた。この表において、頭にある一連の縦の列は以下の パラメーターについて記した。即ち、サンプル番号；粘度上昇のための糖溶液の 種類；溶解糖の重量％（乾燥体として計算）；処理にかける混合物のｐＨ；その 中に用いているアルブミンの重量％；架橋剤の重量％を示す。次の４つの縦列に ついては更なるコメントは必要ないであろう。それに続く残りの縦列（１１列目 より）は以下のパラメーターに関する；ポリトロンカッターヘッドにおけるスロ ットの幅；回収の前にこの調製物が放置される温度（及び任意的に時間）；ヘマ トサイトメーターにより確認される、濃い懸濁物中の気泡の濃度；希釈懸濁物の サンプルの吸光度（希釈は水における固形分１０％に調製）；微小気泡の「容量 」平均サイズ；前記の気泡の「数」平均サイズ（両者ともマスターサイザーによ り測定）；そして最後に長所の数値化である「分散性」パラメーターであって、 数値が小さいほど明らかにサイズ分布が狭いパラメーターを示す。

−表一 −表一＠ｉり 膜形成タンパク質の粘性溶液を攪拌して発泡せしめ、そしてその泡をエコグラフ イーのために適切な範囲の泡の気泡のサイズ（約０．５〜１０μｍ）へと縮小せ しめるために剪断にかける。このタンパク質には発泡特性を有する動物及び野菜 タンパク質又はその部分加水分解物が含まれる。微小球の懸濁物は加熱又は架橋 剤によって安定となりうる。

国際調査報告 ＋自＋―ｒ−自＋１ｍ伽１１ｆｍ＋４ａｅＮｏ口ｒ丁／ｃｏｏ＋／ｎ＋７ｎＥ国 際調査報告 ＥＰ　９１０１７０６ ＳＡ　５０７６７

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. １．生体における超音波適用のために適切な空気もしくは気体封入微小球又は微 小中空球（該微小球は少なくとも１種類の膜形成タンパク質により覆われている ）の安定なる水性懸濁物を調製するための方法であって、該タンパク質の粘性水 溶液を空気又は薬学的に受け入れられる気体と撹拌せしめることにより空気又は 気体か封入されている気泡の泡へと変換せしめ、そして同時に又はその後、該泡 における該気泡のサイズを注射に適切な約０．５〜１０μｍの範囲の値へと小さ くするために該発泡溶液を十分な時間をかけて、バッフル手段を任意的に含む狭 い開口部又は通路に押し通すことによって強い勇断にかけることを特徴とする方 法。
2. ２．請求項１に記載の方法であって、外周上に平行に軸方向に並んでいるスリッ ト及び中央部に軸回転するカッターを有する管状ヘッドを含んで成るホモジナイ ザー並びに乳化装置において、前記の泡を強い剪断にかける方法（この作用は、 周辺の空気がこの液体と混合されること及びこの空気−液体混合物が該スリット に軸方向に押し通されることを引き起こし、これによって該泡は強い剪断作用に かけられる）。
3. ３．請求項２に記載の方法であって、前記のホモジナイザー−乳化装置により発 生する熱によるタンパク質変性を回避するため、前記の発泡及び気泡サイズ縮小 の際の温度を５０℃以下に保ち続ける方法。
4. ４．請求項１に記載の方法であって、得られる前記の懸濁物が１０８〜１０９個 ／ｍｌの範囲における微小気泡の濃度を有す方法。
5. ５．請求項１に記載の方法であって、前記の得られる懸濁を、生体の血流に直接 注射することを可能とするようなわずかなｃＰへとその粘度を下げるために水又 は生理学的に受け入れられる液体により更に希釈せしめる方法。
6. ６．請求項５に記載の方法であって、前記の希釈溶液を、乾燥状態において無期 限にわたり変化することがなく且つ対応する量の水又は注射のために適切な生理 学的に受け入れられている液体と混合せしめることにより微小中空球の懸濁物を 再生せしめる固形物へと凍結乾燥せしめる方法。
7. ７．請求項５に記載の方法であって、前記の希釈液が前記の希釈懸濁物の保存安 定性を高める物質、例えば有機アルデヒドを含んで成る方法。
8. ８．請求項５に記載の方法であって、変性による膜タンパク質の硬化を及ぼすた めに前記の希釈溶液を数秒から数分間６０〜１２０℃の温度に加熱することを含 んで成る方法。
9. ９．請求項１に記載の方法であって、前記の泡に摩擦作用を提供する媒体、即ち 、多数のバッフル化通路を有す無機又は有機材料に該泡を押し通すことにより、 該泡を強い剪断にかける方法。
10. １０．請求項４に記載の方法であって、タンパク質で覆れている前記の気泡の特 性を発展的な変性により改善せしめるため、得られる前記の懸濁物を数秒間から 数分間６０〜１２０℃で更に加熱する方法。
11. １１．請求項１に記載の方法により超音波エコグラフィーに適切な微小気泡の懸 濁物へと変換せしめた水性組成物であって、溶液中に膜形成タンパク質０．１〜 ５重量％及び周囲温度粘度を約１００〜６００ｃＰに迄高める水溶性ポリオール 粘度上昇剤４０〜８０重量％、並びに任意的に発泡上昇剤としての界面活性剤及 び該泡の安定性を高めるための架橋剤を含んで成ることを特徴とする組成物。
12. １２．前記のポリオール粘度上昇剤が１分子当りに少なくとも４個のＯＨ基を有 する、請求項１１に記載の組成物。
13. １３．前記の粘度上昇剤がポリアルコール、モノ−、ポリー及びオリゴサッカラ イド並びにその混合物から選ばれる、請求項１２に記載の組成物。
14. １４．前記の粘度上昇剤が、グルコース、フルクトース、マンノース、デキスト ロース、デキストラン、ポリデキストロース、糖分シロップ、コーンシロップ、 少なくとも４個のグリセロール単位を有するポリグリセロール及びその混合物よ り選ばれる、請求項１３に記載の方法。
15. １５．安定剤、例えばホルムアルデヒド又はグルタルアルデヒドが加えられてい る、請求項１１に記載の組成物。
16. １６．少なくとも４週間にわたり安定であることを特徴とする、請求項１に記載 の方法を実施することにより得られる微小気泡の懸濁物。
17. １７．生体のエコグラフィー検査のための請求項１６に記載の懸濁物の利用方法 であって、該懸濁物を生理学的に受け入れられる液体により希釈せしめてその粘 度を約２〜３０ｃＰに迄下げ、そしてこの状態においてこれを検査すべき該生体 の血流に注射せしめ、これにより該生体において反響的応答が発生できるように なる方法。
18. １８．請求項１６に記載の組成物であって、その安定性が、膜形成タンパク質の 硬化を及ぼすために数秒から数分間６０〜１２０℃に更に加熱することによって 高められている組成物。