JPH0540B2

JPH0540B2 -

Info

Publication number: JPH0540B2
Application number: JP2291463A
Authority: JP
Inventors: Makoto Kasugai
Original assignee: MEITO KK
Current assignee: MEITO KK
Priority date: 1990-10-29
Filing date: 1990-10-29
Publication date: 1993-01-05
Also published as: JPH04117300A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、無酸素（以下、「無酸素」とは酸素
濃度が0.1容量％以下であることをいい、酸素及
び炭酸ガス濃度についての「％」は「容量％」を
意味する。）でかつ10〜12％の炭酸ガスを含む
雰囲気を作り出して多種の嫌気性細菌を同時に検
出する方法に関する。本発明において嫌気性菌とは酸素の存在が何ら
かの方法で毒性に働らくような細菌を称する。近年各種の嫌気性菌を培養することにより、そ
の存在を検出することが各種の細菌検査の手段と
して有用なものとされ、従来多くの方法が開発さ
れている。特に医療上は、嫌気性菌培養のための
雰囲気を簡易な方法で作り出すことが要求され、
各種の脱酸素剤や炭酸ガス発生剤が開発されてお
り、炭酸ガス濃度３〜５％とした無酸素雰囲気中
で培養する方法が実用化されている。しかし、細菌の検出方法として要求される簡易
性、及び一つの培養によつて検出されうる菌種の
制限等の問題がなお従来法にあり、その改善が望
まれていた。特に、検査の簡易性に関し、脱酸素
剤と炭酸ガス発生剤とを各々の培養器の容量にあ
わせて秤量し密閉封入する方法では、現実には医
療の現場で多量の検体をその都度必要に応じて
個々に培養する必要があるため、その際、個々の
検体について従来のような方法をとることは困難
であつた。本発明は、上述の従来法の欠点を解消し、簡易
でかつ、一つの検査によりできるだけ多種の代表
的菌種の培養検出を可能とする。嫌気性菌の検出
方法を提供することを目的とする。また、本発明
はあらかじめ配合された薬剤組成物を培養器中に
併置するだけで、雰囲気を無酸素でかつ10〜12％
の炭酸ガス量にいたらしめる簡易な方法を提供す
ることを目的とする。上記目的は、次の検査方法により達成すること
ができる。検体を接種された培養媒体と、酸素を吸収する
第１組成物とこれと別体の酸素を吸収し炭酸ガス
を放出する第２組成物とを組合せて成り炭酸ガス
発生量が酸素吸収量に対し体積比でほぼ２分の１
となる雰囲気調整剤を培養器に導入し、前記培養
器を密閉し、少なくとも21時間のあいだ酸素濃度
0.1容量％以下で炭酸ガス濃度10〜12％容量内で
培養器中の雰囲気を保持し、その後生成した集落
について少くとも８種の嫌気性菌、バクテロイデ
ス、フソバクテリウム、クロストリデイウム、プ
ロピオニバクテリウム、ラクトバチルス、ペプト
コツカス、ペプトストレプトコツカス及びベイヨ
ネラについてその存否を確認する、紡錘菌を含む
多種の嫌気性菌の同時検出方法。密閉された培養器は、好ましくは、酸素不透過
性でかつ透明な袋の開口端を密封したものであ
る。また好ましくは、前記炭酸ガス濃度を48時間保
持する。代表的な種類の嫌気性細菌をできるだけ多数種
良好な条件で培養するためには、その雰囲気が単
に無酸素というだけでなく、10〜12容量％程度炭
酸ガスを含んでいることが望ましいことが本発明
者により確められ、本発明はこれに基づいて成さ
れたものである。従来脱酸素剤に炭酸ガス発生剤を併用するもの
として炭酸ガス濃度を約５％とするものが知られ
ているが、この場合、代表的な８種の嫌気性菌の
うち紡錘菌（fusobacterium nucleatum）が培養
検査により検出できなかつた。これに対し、炭酸
ガス濃度については10〜12％とすることにより、
紡錘菌についても確実に検出可能となる。このた
め、紡錘菌を検出するための他の検査をする必要
が省略される。上述の８種を含む代表的30種の検
出に対して、本発明の検出方法によれば完全な検
出ができる。なお、培地は固定培地でよいが、他
の公知の培地も当然利用できる。本発明により確実に検出される嫌気性菌の代表
的８種は、バクテロイデス、フソバクテリウム、
クロストリデイウム、プロピオニバクテリウム、
ラクトバチルス、ペプトコツカス、ペプトストレ
プトコツカス、及びベイヨネラの諸属であり、こ
れらのうちクロストリデイウム及びラクトバチル
スを除く６種は、病原的観点から臨床的に特に重
要とされている。本発明の方法では、更にこれらを含む30種の嫌
気性菌について検出可能であることが確められて
おり、実験の継続によりさらに多種のものにも応
用されうることが期待されている。培養は、接種の後少くとも24時間後から48時間
後までの間、好ましくは６時間後から48時間後ま
での間、酸素0.1％以下（体積％、以下同じ）、炭
酸ガス10〜12％の濃度に保持することにより行
う。本発明において脱酸素−炭酸ガス発生組成物
の好ましいものを用いる場合には、約３時間後酸
素0.1％以下、炭素ガス10％に到達できる。但し
もう少しゆつくりした反応速度の脱酸素−炭酸ガ
ス発生組成物を用いることも可能である。本発明に用いる脱酸素−炭酸ガス発生組成物と
しては、例えばアスコルビン酸又はその塩／炭酸
アルカリ及び又は炭酸水素アルカリ／反応促進剤
の系統のものがある。アスコルビン酸としてはＬ
−アスコルビン酸又はＤ−iso−アスコルビン酸
がある。炭酸アルカリ又は炭酸水素アルカリのア
ルカリ塩としては、ナトリウム，カリウム，リチ
ウム，等の塩及びこれらとアルカリ土類金属（マ
グネシウム，カルシウム等の）混合塩等がある。
さらに任意成分として水酸化アルカリ即ちアルカ
リ金属及び／又はアルカリ土類金属の水酸化物を
添加することもできる。また塩化カルシウム等の潮解性の塩も場合によ
り含有できる。反応促進剤としては、第一鉄化合
物と活性炭の混合物があり、その配合量は所要反
応速度に応じては選ぶ。そのうち、第一鉄化合物
は、硫酸第一鉄，塩化第一鉄，水酸化第一鉄，炭
酸第一鉄，酸化第一鉄の無水塩又は含水塩であ
り、硫酸第一鉄含水塩が好ましい。活性炭は微粉
状の公知のものであり、水蒸気，CO₂，空気，塩
素，減圧加熱その他の公知の方法で活性処理した
ものである。上述の脱酸素−炭酸ガス発生組成物の基本的配
合は、たとえば次のようなものである。

【表】その他の下記の(B)に例示される如く、脱酸素成
分として鉄粉を用いたものもある。 (B)鉄粉 10重量部硫酸第一鉄・７水塩 56 水酸化カルシウム 10 亜硫酸ナトリウム７水塩７炭酸水素ナトリウム 10 塩化カルシウム２水塩７活性炭 1.5 上掲の配合によれば、一方で酸素を吸収除去し
つつ、同時に炭酸ガスを発生させ、密閉後少なく
とも24時間から48時間後までの間炭酸ガス濃度を
10％とすることができる。実際の使用に当つて
は、湿度、温度等の条件によつて前記配合以外の
脱酸素剤や炭酸ガス発生剤を使用したい場合も考
えられる。その時は、他の剤を併用しつつ、前記
配合の各化合物の割合をそれに合わせて調整する
こともできる。いずれにしても酸素除去量は、炭
酸ガス発生量のほぼ２倍（体積比）であることが
必要である。また、この組成物は、２個の部分組成物の組合
せとする。即ち、一方は炭酸ガス発生作用を伴わ
ない純粋の脱酸素剤であつて、他方は脱酸素機能
と炭酸ガス発生機能を備えた部分組成物の組合せ
とし、後者は例えば体積比で酸素除去量（吸収
量）と炭酸ガス発生量が約１対１のものを用い、
前者と後者との酸素除去速度が等しいものを用い
ることにより可能である。このような、部分組成
物の組合せによる方法は、その他酸素除去量と炭
酸ガス発生量との体積比が異なるものについて
も、対応して部分組成物の間の酸素除去速度を定
めることにより可能である。脱酸素剤としては公知の鉄系のものがあり、例
えば特公昭54−438，54−439，54−471，54−
472，54−476号公報等に開示のものは本発明の目
的に用いることができる。その他アスコルビン酸
又はその塩／水酸化アルカリ／反応促進剤の系の
ものがある。これは、前述の炭酸ガス発生を伴う
脱酸素−炭酸ガス発生組成物中のアルカリの炭酸
塩及び／又は炭酸水素塩に代わり水酸化アルカリ
（好ましくは水酸化カルシウム等）を用いたもの
でよい。この場合脱酸素−炭酸ガス発生部分組成物とし
ては、前述の通り、脱酸素量と炭酸ガス発生量と
が１対１のものを用いることができる。その一例
としては、重量部にてＬ−アスコルビン酸ナトリ
ウム６部，炭酸水素ナトリウム６部，炭酸ナトリ
ウム・10水塩６部，硫酸第一鉄７水塩２部，及び
活性炭６部から成るものがある。一般に炭酸ガス発生剤としては、炭酸塩と水に
溶解する際に炭酸ガスを生成し酸性（PH６未満）
のPHを与えるものとの組合せがあり、前者として
は、炭酸水素ナトリウム，炭酸ナトリウム，炭酸
カリウム、又はセスキ炭酸ナトリウム等がある。
後者としては、アスコルビン酸，酒石酸，コハク
酸，リンゴ酸，フマール酸，乳酸等があり、アス
コルビン酸を用いたものが好ましい。その他の方法として、培養器の容器容積がが一
定である場合には、酸素を10％まで吸収する脱酸
素剤（部分組成物）と、酸素除去量と炭酸ガス発
生量の体積比が１対１の部分組成物との組合せに
よつても、本発明の目的は達成される。なお、本発明の脱酸素−炭酸ガス発生組成物
（雰囲気調整剤）は、このように培養器にあわせ
てそれぞれの薬剤を秤量する必要もなく、全酸素
を捕捉できる最低量さえ下まわらぬ量であれば適
当量を培養器中に封入するだけでよい。従つて、
実際の使用に際して極めて簡便である。実際の使用をさらに簡便なものとするために
は、本発明の脱酸素−炭酸ガス発生組成物を２重
の袋に封入しておくことが有用である。この袋は、非通気性のプラスチツクフイルムか
らなる外装袋と、この外装袋内に収納されたそれ
自体通気性のある布または和紙等の袋か、通気性
のあるプラスチツクスフイルム製の内装袋とによ
り二重に包装されている。保存のために、更に外
側にアルミ箔等の金属箔又はこれとの積層フイル
ムでおおつてもよい。一般に使用時には外装袋を切断し内装袋を培養
器中に挿入して密閉する。培養器としては、本発明の場合、必ずしも従来
のような真空容器（真空耐圧力を備えたもの）を
用いる必要がなく、炭酸ガス濃度10〜12％のため
わずかな減圧状態に保たれるので、培養器として
酸素等のガス不透過性の袋を用いることができ
る。このような条件に適合しさえすれば、空気中の
約21％を占める酸素がほぼ全量捕捉された時、そ
の１／２体積量の炭酸ガスが発生していることに
なり、理論的には炭酸ガスの含有量は11.7％にお
ちつくことになる。従つて、実用上10〜12％の炭
酸ガス濃度を達成することができる。その結果順次必要に応じて且つ個々に炭酸ガス
濃度10〜12％にて嫌気性培養することが可能とな
る。雰囲気調整剤の違いによる嫌気性雰囲気の調整
実験結果は次の通りである容量250c.c.の密封された培養器中に前記のアス
コルビン酸系の脱酸素−炭酸ガス発生組成物(A)を
規定量封入して酸素と炭酸ガス濃度を測定した。
24時間後には酸素濃度が0.1％以下、炭酸ガス濃
度が10.2％であつた。48時間後には酸素濃度が
0.1％以下、炭酸ガス濃度が10.4％であつた。第２に、市販の脱酸素剤Ｓ−50，Ｓ−30（それ
ぞれ三菱瓦斯化学(株)製）各１個、脱酸素兼炭酸ガ
ス発生剤Ｃ−500（凸版印刷(株)製）２個を容量250
c.c.の培養器中に封入し37℃に保持した結果では、
３時間後の酸素濃度は0.1以下、炭酸ガス濃度は
約10％であり、24時間後の酸素濃度は0.1％以下
（以後48時間も同じ）、炭酸ガス濃度は10.1％（48
時間後9.2％）であつた。また上記第２の雰囲気調整方法において、培養
器容積を200〜500c.c.として同様の測定を行つた結
果いずれもほぼ同様な結果を得た。即ち、本発明の方法は、無酸素状態への到達が
速く、かつ炭酸ガス濃度をそれに対応して約10％
に保持でき、また持続性にもすぐれている。次に簡易な嫌気性培養方法について使用状態を
示す図面を基に説明する。外装袋１は、ガス不透過性の透明プラスチツク
フイルムであつて酸素透過度50c.c.／m²・atm・
dry以下、好ましくは20c.c.／m²・atm・dry以下の
もの（例えば商品名KOP／CP，KOP／PE，
KON／PE，エバール，サラネツクス，OV，バ
リアロン，ボブロン，ナイロン／PE，トリプル
ナイロン，キヤズフイルム，ダイヤミロン等）で
できており、その端1bは密封されている。培地
７に検体を接種したシヤーレ６を外装袋１の中に
入れると共に、脱酸素−炭酸ガス発生組成物４，
５の入つた通気性の内装袋２，３を外装袋１内に
入れ、さらに脱酸素状態の公知のインデイケータ
ー９（色により酸素濃度を示すもの）を入れた
後、開端１ａをクリツプ８により封止する。内装袋２，３は、図示では２個であるが、必要
に応じて１個ないし２個以上用いることができ
る。封止方法は、クリツプ８に代り、熱圧着等他
の封止手段によることもできる。炭酸ガスが10％程度発生するので、脱酸素状態
においても、外装袋１は強く圧しつぶされること
なく、通常のシヤーレで十分安全に使用でき、更
に個々のシヤーレを外部から観察できるので、
個々の検体についての培養の進行状態を観察する
のに好適である。また培養器容器を機密性フイル
ムとしたので、培養器内部の温度制御が容易であ
る。さらに、本発明によれば、発熱又は吸熱のない
反応により所定の嫌気性雰囲気を調整できるの
で、培養時の温度調節もさらに容易であり、反応
による水分の放出、吸収もなく湿度の調節も容易
である。実施例１前記市販の脱酸素剤（Ｓ−50，Ｓ−30）と、脱
酸素−炭酸ガス発生剤として前掲Ａ−１の組成物
を用い接種後６時間から48時間後までの間に雰囲
気を酸素0.1％以下炭酸ガス濃度10〜12％に保持
し、GAM寒天培地を用い、37℃の温度条件下に
て48時間下記の臨床分離株を培養し、集落の大き
さを比較し検出菌種を観察した。バクテロイデス，フソバクテリウム，クロスト
リデイウム，プロピオニバクテリウム，ラクトバ
チルス，ペプトコツカス，ペプトストレプトコツ
カス、及びベイヨネラ。その結果これら全菌種は十分な集落の大きさを
示し確実に検出された。その他同様にして30種類
の嫌気性菌について、培養検査を行つたところい
ずれも良好な結果をえた。比較例１炭酸ガス濃度５％としその他は実施例１と同様
にして培養実験を行つたところ、１種（フソバク
テリウム）について検出できなかつた。比較例２炭酸ガス濃度20％、酸素濃度0.1％以下として
同様の培養実験を行つた結果では、極めて発育が
悪く、検出できない菌種が多かった。実施例２脱酸素剤として「エージレスＳ−50（三菱瓦斯
化学(株)製」を用い、脱酸素−炭酸ガス発生剤とし
て「Ｃ−1000（凸版印刷(株)製）」を用い、種々の菌
種について希釈度を変化させて37℃で48時間培養
した。培養器としては、ガス不透過で透明な容量250
mlの袋を用いた。培地としては、GAM寒天培地
を用いた。培養器の雰囲気は、培養器密封後２〜３時間で
酸素濃度0.1未満かつ炭酸ガス濃度約10％に達し
た。比較例３従来から市販の検査システムにより、即ち、培
養器として円筒形で耐圧性の容量１の容器を用
い、市販の水素と炭酸ガスを発生させる方式の雰
囲気調整剤（BBL社製，ガスパツク水素／炭酸
ガス発生剤及びカタリスト，設定炭酸ガス濃度４
％）を用いて実施例２と同じ時間培養を行つた。
なお、培養器の雰囲気は、培養器密封後４〜５時
間で所定の酸素濃度0.1％未満に達した。実施例２及び比較例３による培養後の夫々の細
菌の集落を観察し、その大きさによる比較を行な
つた。その結果を第１表に示す。第１表によれ
ば、紡錘菌（fusobacterrium nucleatum）は、
10^-5よりも高い希釈度においては比較例３により
検出できなかつたが、実施例２により検出できた
ということがわかる。

【表】

【表】 (注) 図中の数字は、数えられた集落の数
を示す。
以上の結果から、炭酸ガス10〜12％を含む嫌気
性雰囲気による培養検査により、検体に含まれる
実際の真菌の存在の検出可能な範囲が拡大するの
で、多種の嫌気性菌の同時検出方法として本発明
は極めて有用であることが判明した。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明に用いる嫌気性菌培養装置の一
実施例の縦断面図を示す。１……外装袋、１ａ……開端、１ｂ……閉端、
２，３……内装袋、４，５……脱酸素−炭酸ガス
発生組成物、６……シヤーレ、７……培地、８
……クリツプ。

Claims

【特許請求の範囲】１検体を接種された培養媒体と、酸素を吸収す
る第１組成物とこれと別体の酸素を吸収し炭酸ガ
スを放出する第２組成物とを組合せて成り炭酸ガ
ス発生量が酸素吸収量に対し体積比でほぼ２分の
１となる雰囲気調整剤を培養器に導入し、前記培
養器を密閉し、少なくとも21時間のあいだ酸素濃
度0.1容量％以下で炭酸ガス濃度10〜12容量％内
で培養器中の雰囲気を保持し、その後生成した集
落について少くとも８種の嫌気性菌、バクテロイ
デス，フソバクテリウム，クロストリデイウム，
プロピオニバクテリウム，ラクトバチルス，ペプ
トコツカス，ペプトストレプトコツカス及びベイ
ヨネラについてその存否を確認することを特徴と
する紡錘菌を含む多種の嫌気性菌の同時検出方
法。２前記の密閉された培養器は、酸素不透過性で
かつ透明な袋の開口端を密封したものである特許
請求の範囲第１項に記載の方法。３前記炭酸ガス濃度を48時間保持することを特
徴とする特許請求の範囲第１項又は第２項に記載
の方法。