JPH05333026A - 免疫測定用標識試薬 - Google Patents
免疫測定用標識試薬Info
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- JPH05333026A JPH05333026A JP13891192A JP13891192A JPH05333026A JP H05333026 A JPH05333026 A JP H05333026A JP 13891192 A JP13891192 A JP 13891192A JP 13891192 A JP13891192 A JP 13891192A JP H05333026 A JPH05333026 A JP H05333026A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 免疫物質と結合し、標識体で修飾されたアミ
ノグリカンが、アミノ基の２０〜８０％が飽和脂肪酸で
アシル化されているアミノグリカンである免疫測定用標
識試薬。 【効果】 本発明の標識試薬は、凍結保存又は凍結乾燥
保存したものを再溶解したとき、沈殿を生ずることがな
く、このような標識試薬を用いることにより、標識試薬
の感度や信頼性が向上した。
ノグリカンが、アミノ基の２０〜８０％が飽和脂肪酸で
アシル化されているアミノグリカンである免疫測定用標
識試薬。 【効果】 本発明の標識試薬は、凍結保存又は凍結乾燥
保存したものを再溶解したとき、沈殿を生ずることがな
く、このような標識試薬を用いることにより、標識試薬
の感度や信頼性が向上した。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、免疫測定法による生理
活性物質の測定に使用される標識試薬に関し、アミノ基
の２０〜８０％が飽和脂肪酸でアシル化されているアミ
ノグリカンを用いることにより、標識試薬の凍結保存が
可能となった標識試薬に関するものである。
活性物質の測定に使用される標識試薬に関し、アミノ基
の２０〜８０％が飽和脂肪酸でアシル化されているアミ
ノグリカンを用いることにより、標識試薬の凍結保存が
可能となった標識試薬に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】従来、免疫測定法に用いる標識試薬の高
感度化を図る手段としては、複数の反応活性基を有し、
その大部分の反応活性基が多数の標識物質（酵素、色
素、発光物質等）で修飾された化合物を用いることによ
って、免疫物質１分子当りの標識量を増加させるため
に、本発明者は特願平２−５０６２４３号において複数
のアミノ基を有するアミノグリカンを提案した。
感度化を図る手段としては、複数の反応活性基を有し、
その大部分の反応活性基が多数の標識物質（酵素、色
素、発光物質等）で修飾された化合物を用いることによ
って、免疫物質１分子当りの標識量を増加させるため
に、本発明者は特願平２−５０６２４３号において複数
のアミノ基を有するアミノグリカンを提案した。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】アミノグリカンは、入
手の容易さからキトサンが一般に用いられるが、市販の
キトサンは甲殻類から抽出したキチンを酸により処理し
て製造され、そのアミノ基の１０％未満がアセチル化さ
れている。このようなキトサンは水に対する溶解度が低
いため、これを用いた標識試薬を凍結あるいは凍結乾燥
して保存し、使用時に解凍・溶解した場合、その一部が
不溶のまま残存し、免疫測定時の感度や再現性が低下す
るという問題点があった。
手の容易さからキトサンが一般に用いられるが、市販の
キトサンは甲殻類から抽出したキチンを酸により処理し
て製造され、そのアミノ基の１０％未満がアセチル化さ
れている。このようなキトサンは水に対する溶解度が低
いため、これを用いた標識試薬を凍結あるいは凍結乾燥
して保存し、使用時に解凍・溶解した場合、その一部が
不溶のまま残存し、免疫測定時の感度や再現性が低下す
るという問題点があった。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者は、キトサンな
どのアミノグリカンのアミノ基の２０〜８０％をアシル
化し、これを用いて製造された標識試薬は、凍結保存や
凍結乾燥保存ができることを見い出した。本発明は、免
疫物質と結合し、標識体で修飾されたアミノグリカンが
アミノ基の２０〜８０％が飽和脂肪酸でアシル化されて
いるアミノグリカンである免疫測定用標識試薬である。
どのアミノグリカンのアミノ基の２０〜８０％をアシル
化し、これを用いて製造された標識試薬は、凍結保存や
凍結乾燥保存ができることを見い出した。本発明は、免
疫物質と結合し、標識体で修飾されたアミノグリカンが
アミノ基の２０〜８０％が飽和脂肪酸でアシル化されて
いるアミノグリカンである免疫測定用標識試薬である。
【０００５】以下、本発明の標識試薬の製造法を説明す
る。 分子量が１０4 〜５×１０6 、好ましくは１０5 〜１
０6 であるキトサン、ポリガラクトサミンのようなアミ
ノグリカンを、炭素数１〜６の飽和脂肪酸の水溶液に溶
解し、縮合剤を加えて反応させ、アミノ基の２０〜８０
％をアシル化し、これを透析又はゲル濾過等により精製
する。該アシル化度は、ケイ光分光光度計により励起波
長２２５nmにおける４６０nmの蛍光を測定することによ
り、分子量及び濃度既知のアミノグリカンを標準とし
て、概算して求めることができる。また、該脂肪酸と縮
合剤の組合わせの代わりに、該脂肪酸の無水物を用いて
もよい。
る。 分子量が１０4 〜５×１０6 、好ましくは１０5 〜１
０6 であるキトサン、ポリガラクトサミンのようなアミ
ノグリカンを、炭素数１〜６の飽和脂肪酸の水溶液に溶
解し、縮合剤を加えて反応させ、アミノ基の２０〜８０
％をアシル化し、これを透析又はゲル濾過等により精製
する。該アシル化度は、ケイ光分光光度計により励起波
長２２５nmにおける４６０nmの蛍光を測定することによ
り、分子量及び濃度既知のアミノグリカンを標準とし
て、概算して求めることができる。また、該脂肪酸と縮
合剤の組合わせの代わりに、該脂肪酸の無水物を用いて
もよい。
【０００６】上記によりアシル化されたアミノグリ
カンに、色素、酵素等の標識体を混合し、縮合剤を加え
て反応させ、アシル化されていない残余のアミノ基に標
識体を反応させることにより、標識体で修飾されたアミ
ノグリカンを得る。標識体の色素としては、フルオレセ
イン、ローダミン類、クマリン系色素及びシアニン色素
（例えば日本感光色素研究所製ＮＫ１１６０）等が用い
られる。酵素としては、ペルオキシダーゼ、ルシフェラ
ーゼ等の酸化還元酵素、又はホスファターゼ、グルコシ
ダーゼもしくはエステラーゼ等の加水分解酵素等が用い
られる。酵素の基質としては、酵素反応により発色又は
蛍光を発する物質の他、酵素反応により発光する物質、
例えばペルオキシダーゼに対してはルミノール、ルシフ
ェラーゼに対してはルシフェリン及びホスファターゼに
対してはＡＰＰＤＭが用いられる。
カンに、色素、酵素等の標識体を混合し、縮合剤を加え
て反応させ、アシル化されていない残余のアミノ基に標
識体を反応させることにより、標識体で修飾されたアミ
ノグリカンを得る。標識体の色素としては、フルオレセ
イン、ローダミン類、クマリン系色素及びシアニン色素
（例えば日本感光色素研究所製ＮＫ１１６０）等が用い
られる。酵素としては、ペルオキシダーゼ、ルシフェラ
ーゼ等の酸化還元酵素、又はホスファターゼ、グルコシ
ダーゼもしくはエステラーゼ等の加水分解酵素等が用い
られる。酵素の基質としては、酵素反応により発色又は
蛍光を発する物質の他、酵素反応により発光する物質、
例えばペルオキシダーゼに対してはルミノール、ルシフ
ェラーゼに対してはルシフェリン及びホスファターゼに
対してはＡＰＰＤＭが用いられる。
【０００７】標識体で修飾されたアミノグリカンに、
免疫物質（抗原又は抗体）を縮合剤と共に加えて反応さ
せて標識試薬を得る。免疫物質は、標識もしくはアシル
化されていないアミノ基に結合させる。上記、、
で用いられる縮合剤としては、カルボジイミド類、Ｎ−
ブロモスクシイミド等を用いることができる。また、標
識体で修飾されたアミノグリカンが、ビオチンとアビジ
ンを介して複数の標識体で修飾されたものを用いれば、
免疫物質１分子当りの標識量を増加させることができ、
好ましい。そのような標識試薬は、前記の工程におい
て、標識体を反応させる代わりにビオチンを反応させ
て、残余のアミノ基にビオチンを結合させ、前記の工
程後、標識体で修飾されたアビジンを混合して、例えば
式（Ｉ）のような標識試薬を得る。
免疫物質（抗原又は抗体）を縮合剤と共に加えて反応さ
せて標識試薬を得る。免疫物質は、標識もしくはアシル
化されていないアミノ基に結合させる。上記、、
で用いられる縮合剤としては、カルボジイミド類、Ｎ−
ブロモスクシイミド等を用いることができる。また、標
識体で修飾されたアミノグリカンが、ビオチンとアビジ
ンを介して複数の標識体で修飾されたものを用いれば、
免疫物質１分子当りの標識量を増加させることができ、
好ましい。そのような標識試薬は、前記の工程におい
て、標識体を反応させる代わりにビオチンを反応させ
て、残余のアミノ基にビオチンを結合させ、前記の工
程後、標識体で修飾されたアビジンを混合して、例えば
式（Ｉ）のような標識試薬を得る。
【０００８】
【化１】
【０００９】さらに、ビオチン＋アミノグリカン＋免疫
物質と、標識体で修飾されたアビジンとは結合していな
くてもよい。このような場合、ビオチン＋アミノグリカ
ン＋免疫物質（抗原等）と光ファイバー上の免疫物質
（抗体）とを免疫反応させ、さらに標識体で修飾された
アビジンを反応させる。このように後から標識アビジン
を反応させることにより、免疫反応中に標識体が酸化さ
れたり加水分解されることを防止することができる。
物質と、標識体で修飾されたアビジンとは結合していな
くてもよい。このような場合、ビオチン＋アミノグリカ
ン＋免疫物質（抗原等）と光ファイバー上の免疫物質
（抗体）とを免疫反応させ、さらに標識体で修飾された
アビジンを反応させる。このように後から標識アビジン
を反応させることにより、免疫反応中に標識体が酸化さ
れたり加水分解されることを防止することができる。
【００１０】
【作用】アミノグリカン中の遊離のアミノ基は、水酸基
と水素結合して分子間で強固に結合している。そのた
め、アミノ基がプロトン化されにくいので、水に対して
難溶性となる。しかし、一部のアミノ基がアシル化され
ると、その箇所の水素結合が妨げられるため、プロトン
化されやすくなり結果的に水に溶解しやすくなる。一
方、アシル化が進み過ぎると遊離のアミノ基数が少なく
なり、再び水に対して難溶性となる。従って、アミノ基
の２０〜８０％、好ましくは２５〜３０％がアシル化さ
れたアミノグリカンを用いれば、凍結や凍結乾燥後も水
に可溶な標識試薬を作成するこができる。
と水素結合して分子間で強固に結合している。そのた
め、アミノ基がプロトン化されにくいので、水に対して
難溶性となる。しかし、一部のアミノ基がアシル化され
ると、その箇所の水素結合が妨げられるため、プロトン
化されやすくなり結果的に水に溶解しやすくなる。一
方、アシル化が進み過ぎると遊離のアミノ基数が少なく
なり、再び水に対して難溶性となる。従って、アミノ基
の２０〜８０％、好ましくは２５〜３０％がアシル化さ
れたアミノグリカンを用いれば、凍結や凍結乾燥後も水
に可溶な標識試薬を作成するこができる。
【００１１】
【発明の効果】アミノ基の２０〜８０％をアシル化した
アミノグリカンを用いて製造された標識試薬は、凍結保
存又は凍結乾燥保存したものを再溶解したとき、沈殿を
生ずることがなく、このような標識試薬を用いることに
より、標識試薬の感度や信頼性が向上した。
アミノグリカンを用いて製造された標識試薬は、凍結保
存又は凍結乾燥保存したものを再溶解したとき、沈殿を
生ずることがなく、このような標識試薬を用いることに
より、標識試薬の感度や信頼性が向上した。
【００１２】
実施例１ カルシトニンの測定：サンドイッチ法 （１）アセチル化度５％、分子量約１０6 のキトサン
を、１０％酢酸に３mg／mlとなるように溶解した。次い
でこのキトサン溶液に水溶性カルボジイミドを６０mg／
mlとなるように添加し、室温で６時間反応させた。この
反応混合物を蒸留水で透析し、アセチル化度約３０％の
キトサン原液を得た。 （２）水１００mlに炭酸ナトリウム４mgとビオチン１０
mgを溶解した。このビオチン溶液に前記（１）のキトサ
ン原液２mlを混合し、さらに水溶性カルボジイミド１０
０mgを添加して、一晩反応させた。次いで、これに０．
２ g／ml炭酸ナトリウムと０．１ g／mlの塩化ナトリウ
ムの混合液４mlを加えて、ビオチン化キトサンを沈殿さ
せた。遠心分離により沈殿を回収した後、この沈殿を
０．１ g／ml炭酸ナトリウムと０．３ g／ml塩化ナトリ
ウムの混合液で２回洗浄した。この沈殿を１０mMリン酸
緩衝液（pH７）２mlに懸濁し、同緩衝液中で４℃、一晩
透析し、透析物をビオチン化キトサン懸濁液とした。
を、１０％酢酸に３mg／mlとなるように溶解した。次い
でこのキトサン溶液に水溶性カルボジイミドを６０mg／
mlとなるように添加し、室温で６時間反応させた。この
反応混合物を蒸留水で透析し、アセチル化度約３０％の
キトサン原液を得た。 （２）水１００mlに炭酸ナトリウム４mgとビオチン１０
mgを溶解した。このビオチン溶液に前記（１）のキトサ
ン原液２mlを混合し、さらに水溶性カルボジイミド１０
０mgを添加して、一晩反応させた。次いで、これに０．
２ g／ml炭酸ナトリウムと０．１ g／mlの塩化ナトリウ
ムの混合液４mlを加えて、ビオチン化キトサンを沈殿さ
せた。遠心分離により沈殿を回収した後、この沈殿を
０．１ g／ml炭酸ナトリウムと０．３ g／ml塩化ナトリ
ウムの混合液で２回洗浄した。この沈殿を１０mMリン酸
緩衝液（pH７）２mlに懸濁し、同緩衝液中で４℃、一晩
透析し、透析物をビオチン化キトサン懸濁液とした。
【００１３】（３）前記（２）のビオチン化キトサン懸
濁液に、ウサギ由来ヒトカルシトニン抗体１００μg を
加え、さらに水溶性カルボジイミド１０mgを添加して、
４℃で６時間反応させた。この反応混合物を、１０mMリ
ン酸カリウム緩衝液（pH７．０）で一晩透析し、次いで
陰イオン交換カラムを用いて未反応物質を除去し、ヒト
カルシトニン抗体が結合したビオチン化キトサンを得
た。 （４）アビジン１mg及びトリエチルアミン０．２mlをエ
タノール１mlに溶解した溶液にシアニン色素ＮＫ１１６
０ ２mgを加えて充分に溶解し、さらにジシクロヘキシ
ルカルボジイミド０．３mlを加えて、室温で一晩反応さ
せた。遠心分離により沈殿を回収した後、この沈殿をエ
タノールで２回洗浄し、さらに遠心分離により沈殿を回
収し、沈殿中に残っているエタノールを減圧除去した。
この残留物を２０mM酢酸緩衝液（pH６．５）２mlに溶解
し、ＮＫ１１６０で修飾されたアビジンを得た。
濁液に、ウサギ由来ヒトカルシトニン抗体１００μg を
加え、さらに水溶性カルボジイミド１０mgを添加して、
４℃で６時間反応させた。この反応混合物を、１０mMリ
ン酸カリウム緩衝液（pH７．０）で一晩透析し、次いで
陰イオン交換カラムを用いて未反応物質を除去し、ヒト
カルシトニン抗体が結合したビオチン化キトサンを得
た。 （４）アビジン１mg及びトリエチルアミン０．２mlをエ
タノール１mlに溶解した溶液にシアニン色素ＮＫ１１６
０ ２mgを加えて充分に溶解し、さらにジシクロヘキシ
ルカルボジイミド０．３mlを加えて、室温で一晩反応さ
せた。遠心分離により沈殿を回収した後、この沈殿をエ
タノールで２回洗浄し、さらに遠心分離により沈殿を回
収し、沈殿中に残っているエタノールを減圧除去した。
この残留物を２０mM酢酸緩衝液（pH６．５）２mlに溶解
し、ＮＫ１１６０で修飾されたアビジンを得た。
【００１４】（５）水０．５mlに硫酸ニッケル１０mgを
溶解し、さらにエタノール２．５mlを加えた。この際生
じた沈殿を遠心分離により除去し、採取した上清をＮｉ
−エタノール溶液とした。次に２０mM水酸化カリウムの
エタノール溶液０．４mlに、Ｎｉ−エタノール溶液０．
１mlと５０％グルタルアルデヒド５０μl を添加し、反
応溶液とした。 （６）ポリメタクリル酸メチル樹脂製光ファイバー（三
菱レイヨン製）を３cmに切り、両端面をポリシングフィ
ルムで研磨した。この光ファイバーの片面を、前記
（５）の反応溶液に５０℃で１０分間浸漬した後、２０
mM塩酸、次いでリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄
した。次にこの光ファイバーを２mg／mlのヤギ由来カル
シトニン抗体溶液に浸漬し、４℃で一晩放置した。光フ
ァイバーを溶液から取り出し、１％ＮａＢＨ4 水溶液に
１５分間浸漬した後、ＰＢＳで洗浄して、ヤギ由来ヒト
カルシトニン抗体固定化センサーを作成し、これを検出
部とした。
溶解し、さらにエタノール２．５mlを加えた。この際生
じた沈殿を遠心分離により除去し、採取した上清をＮｉ
−エタノール溶液とした。次に２０mM水酸化カリウムの
エタノール溶液０．４mlに、Ｎｉ−エタノール溶液０．
１mlと５０％グルタルアルデヒド５０μl を添加し、反
応溶液とした。 （６）ポリメタクリル酸メチル樹脂製光ファイバー（三
菱レイヨン製）を３cmに切り、両端面をポリシングフィ
ルムで研磨した。この光ファイバーの片面を、前記
（５）の反応溶液に５０℃で１０分間浸漬した後、２０
mM塩酸、次いでリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄
した。次にこの光ファイバーを２mg／mlのヤギ由来カル
シトニン抗体溶液に浸漬し、４℃で一晩放置した。光フ
ァイバーを溶液から取り出し、１％ＮａＢＨ4 水溶液に
１５分間浸漬した後、ＰＢＳで洗浄して、ヤギ由来ヒト
カルシトニン抗体固定化センサーを作成し、これを検出
部とした。
【００１５】（７）前記（３）のウサギ由来ヒトカルシ
トニン抗体が結合したビオチン化キトサンと、前記
（４）のＮＫ１１６０で修飾されたアビジンを混合して
標識試薬を得た。これを凍結乾燥して、−２０℃で２週
間保存した （８）各濃度のカルシトニン溶液１０μl に前記（６）
の検出部を浸漬し、室温に３０分放置後、前記（７）の
凍結乾燥粉末を蒸留水に懸濁した溶液に３０分浸漬し
た。検出部を０．２％トゥイーン２０含有１M ＫＳＣＮ
水溶液で洗浄し、図１に示す装置にて蛍光強度を測定し
たところ、０．３ng／mlまで測定できた。これは、前記
（７）の標識試薬を凍結乾燥保存せずに、調製後直ちに
用いた場合と同じ感度であった。
トニン抗体が結合したビオチン化キトサンと、前記
（４）のＮＫ１１６０で修飾されたアビジンを混合して
標識試薬を得た。これを凍結乾燥して、−２０℃で２週
間保存した （８）各濃度のカルシトニン溶液１０μl に前記（６）
の検出部を浸漬し、室温に３０分放置後、前記（７）の
凍結乾燥粉末を蒸留水に懸濁した溶液に３０分浸漬し
た。検出部を０．２％トゥイーン２０含有１M ＫＳＣＮ
水溶液で洗浄し、図１に示す装置にて蛍光強度を測定し
たところ、０．３ng／mlまで測定できた。これは、前記
（７）の標識試薬を凍結乾燥保存せずに、調製後直ちに
用いた場合と同じ感度であった。
【００１６】比較例１ （１）アセチル化処理を行わなかったキトサン（アセチ
ル化度５％）を用いた以外は、実施例１と同様の方法で
標識試薬を調製し、これを凍結乾燥して、−２０℃で２
週間保存した。 （２）前記（１）の凍結乾燥標品を蒸留水に懸濁しても
溶解しないため、測定不能であった。
ル化度５％）を用いた以外は、実施例１と同様の方法で
標識試薬を調製し、これを凍結乾燥して、−２０℃で２
週間保存した。 （２）前記（１）の凍結乾燥標品を蒸留水に懸濁しても
溶解しないため、測定不能であった。
【００１７】実施例２ カルシトニンの測定：サンドイ
ッチ法 （１）アセチル化度１％、分子量約１０5 のポリガラク
トサミンを実施例１の（１）と同様の方法でアセチル化
した。生成物のアセチル化度は約４０％であった。 （２）キトサンの代わりに、前記（１）のポリガラクト
サミンを用いた以外は、実施例１の（２）と同様の方法
で、ヒトカルシトニン抗体が結合したビオチン化ポリガ
ラクトサミンを得た。 （３）実施例１の（３）〜（７）と同様の方法を用い
て、ＮＫ１１６０で修飾された標識試薬及びヤギ由来ヒ
トカルシトニン抗体固定化センサーを作成した。 （４）実施例１の（８）と同様の方法で、ヒトカルシト
ニンを測定したところ、０．４ng／mlまで測定できた。
ッチ法 （１）アセチル化度１％、分子量約１０5 のポリガラク
トサミンを実施例１の（１）と同様の方法でアセチル化
した。生成物のアセチル化度は約４０％であった。 （２）キトサンの代わりに、前記（１）のポリガラクト
サミンを用いた以外は、実施例１の（２）と同様の方法
で、ヒトカルシトニン抗体が結合したビオチン化ポリガ
ラクトサミンを得た。 （３）実施例１の（３）〜（７）と同様の方法を用い
て、ＮＫ１１６０で修飾された標識試薬及びヤギ由来ヒ
トカルシトニン抗体固定化センサーを作成した。 （４）実施例１の（８）と同様の方法で、ヒトカルシト
ニンを測定したところ、０．４ng／mlまで測定できた。
【００１８】比較例２ （１）アセチル化処理を行わなかったポリガラクトサミ
ンキトサン（アセチル化度１％）を用いた以外は、実施
例２と同様の方法で標識試薬を調製し、これを凍結乾燥
して、−２０℃で２週間保存した。 （２）前記（１）の凍結乾燥標品を蒸留水に懸濁しても
溶解しないため、測定不能であった。
ンキトサン（アセチル化度１％）を用いた以外は、実施
例２と同様の方法で標識試薬を調製し、これを凍結乾燥
して、−２０℃で２週間保存した。 （２）前記（１）の凍結乾燥標品を蒸留水に懸濁しても
溶解しないため、測定不能であった。
【００１９】実施例３ ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン
（ｈＣＧ）の測定：競合法 （１）アセチル化度５％、分子量約１０6 のキトサン
を、５％プロピオン酸に３mg／mlとなるように溶解し、
次いでこの溶液に水溶性カルボジイミド（ＣＨＭＣ）を
５０mg／mlとなるように添加して、室温で６時間反応さ
せた。生成物のアシル化度は約２５％であった。 （２）実施例１の（２）と同様の方法で、ビオチン化キ
トサン懸濁液を得た。 （３）ウサギ由来ヒトカルシトニン抗体１００μg の代
わりに、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）１００
μg を加えた以外は、実施例１の（３）と同様の方法で
ｈＣＧが結合したビオチン化キトサンを得た。 （４）アビジン１mg及びトリエチルアミン０．２mlをエ
タノール１mlに溶解した溶液に、フルオレセインイソチ
オシアネート（フルオレセイン）１．８mgを溶解し、遮
光下、室温で６時間反応させた。遠心分離により沈殿を
回収した後、この沈殿をエタノールで２回洗浄し、さら
に遠心分離により沈殿を回収し、沈殿中のエタノールを
減圧除去した。この残留物を５０mM酢酸緩衝液（pH５．
５）１mlに懸濁し、フルオレセインで修飾されたアビジ
ンを得た。
（ｈＣＧ）の測定：競合法 （１）アセチル化度５％、分子量約１０6 のキトサン
を、５％プロピオン酸に３mg／mlとなるように溶解し、
次いでこの溶液に水溶性カルボジイミド（ＣＨＭＣ）を
５０mg／mlとなるように添加して、室温で６時間反応さ
せた。生成物のアシル化度は約２５％であった。 （２）実施例１の（２）と同様の方法で、ビオチン化キ
トサン懸濁液を得た。 （３）ウサギ由来ヒトカルシトニン抗体１００μg の代
わりに、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）１００
μg を加えた以外は、実施例１の（３）と同様の方法で
ｈＣＧが結合したビオチン化キトサンを得た。 （４）アビジン１mg及びトリエチルアミン０．２mlをエ
タノール１mlに溶解した溶液に、フルオレセインイソチ
オシアネート（フルオレセイン）１．８mgを溶解し、遮
光下、室温で６時間反応させた。遠心分離により沈殿を
回収した後、この沈殿をエタノールで２回洗浄し、さら
に遠心分離により沈殿を回収し、沈殿中のエタノールを
減圧除去した。この残留物を５０mM酢酸緩衝液（pH５．
５）１mlに懸濁し、フルオレセインで修飾されたアビジ
ンを得た。
【００２０】（５）カルシトニン抗体の代わりにｈＣＧ
抗体を用いた以外は、実施例１の（５）及び（６）と同
様の方法でｈＣＧ抗体固定化センサーを作成し、これを
検出部とした。 （６）前記（３）のｈＣＧが結合したビオチン化キトサ
ンと、前記（４）のフルオレセインで修飾されたアビジ
ンを混合し標識試薬を得た。これを−２０℃で１週間凍
結保存した。 （７）各濃度のｈＣＧ溶液１０μl に、前記（６）の凍
結保存品を解凍して一定量添加し、さらに前記（５）の
検出部を浸漬して室温に３０分放置した。この検出部を
０．２％トゥイーン２０含有ＰＢＳで洗浄し、次いで１
％炭酸ナトリウム溶液に浸漬し、図２に示す装置を用い
て７８０nmと１３６０nmの半導体レーザを照射して５１
８nmの蛍光を測定したところ、０．４mg／mlまで測定で
きた。
抗体を用いた以外は、実施例１の（５）及び（６）と同
様の方法でｈＣＧ抗体固定化センサーを作成し、これを
検出部とした。 （６）前記（３）のｈＣＧが結合したビオチン化キトサ
ンと、前記（４）のフルオレセインで修飾されたアビジ
ンを混合し標識試薬を得た。これを−２０℃で１週間凍
結保存した。 （７）各濃度のｈＣＧ溶液１０μl に、前記（６）の凍
結保存品を解凍して一定量添加し、さらに前記（５）の
検出部を浸漬して室温に３０分放置した。この検出部を
０．２％トゥイーン２０含有ＰＢＳで洗浄し、次いで１
％炭酸ナトリウム溶液に浸漬し、図２に示す装置を用い
て７８０nmと１３６０nmの半導体レーザを照射して５１
８nmの蛍光を測定したところ、０．４mg／mlまで測定で
きた。
【００２１】比較例３ （１）アシル化処理を行わなかったキトサン（アセチル
化度５％）を用いた以外は、実施例３と同様の方法で標
識試薬を調製し、これを−２０℃で１週間凍結保存し
た。 （２）前記（１）の凍結保存標品を室温に２０分放置し
て解凍したところ、一部不溶性の沈殿が生じたため、測
定値にばらつきが生じ、５０ng／mlまでしか検出できな
かった。
化度５％）を用いた以外は、実施例３と同様の方法で標
識試薬を調製し、これを−２０℃で１週間凍結保存し
た。 （２）前記（１）の凍結保存標品を室温に２０分放置し
て解凍したところ、一部不溶性の沈殿が生じたため、測
定値にばらつきが生じ、５０ng／mlまでしか検出できな
かった。
【００２２】実施例４ ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン
（ｈＣＧ）の測定：競合法 （１）実施例３の（１）〜（４）と同様の方法で、ｈＣ
Ｇが結合したビオチン化キトサン及びフルオレセインで
修飾されたアビジンを得た。 （２）前記（１）のｈＣＧが結合したビオチン化キトサ
ン及びフルオレセインで修飾されたアビジンを、それぞ
れ別々に凍結乾燥して、−２０℃で１カ月凍結保存し
た。 （３）実施例３の（５）と同様の方法でｈＣＧ抗体固定
化センサーを作成し、これを検出部とした。 （４）各濃度のｈＣＧ溶液１０μl に、前記（２）のｈ
ＣＧが結合したビオチン化キトサンの凍結乾燥標品を蒸
留水に溶解した溶液を一定量添加し、さらに前記（３）
の検出部を浸漬して室温に３０分放置した。次いで、こ
の検出部を０．２％トゥイーン２０含有ＰＢＳで洗浄
し、前記（２）のフルオレセインで修飾されたアビジン
の凍結乾燥標品を蒸留水に溶解した溶液に浸漬して、室
温に１０分放置した。この検出部を０．２％トゥイーン
２０含有ＰＢＳで洗浄し、次いで１％炭酸ナトリウム溶
液に浸漬し、図２に示す装置を用いて７８０nmと１３６
０nmの半導体レーザを照射して５１８nmの蛍光を測定し
たところ、０．４ng／mlまで測定できた。
（ｈＣＧ）の測定：競合法 （１）実施例３の（１）〜（４）と同様の方法で、ｈＣ
Ｇが結合したビオチン化キトサン及びフルオレセインで
修飾されたアビジンを得た。 （２）前記（１）のｈＣＧが結合したビオチン化キトサ
ン及びフルオレセインで修飾されたアビジンを、それぞ
れ別々に凍結乾燥して、−２０℃で１カ月凍結保存し
た。 （３）実施例３の（５）と同様の方法でｈＣＧ抗体固定
化センサーを作成し、これを検出部とした。 （４）各濃度のｈＣＧ溶液１０μl に、前記（２）のｈ
ＣＧが結合したビオチン化キトサンの凍結乾燥標品を蒸
留水に溶解した溶液を一定量添加し、さらに前記（３）
の検出部を浸漬して室温に３０分放置した。次いで、こ
の検出部を０．２％トゥイーン２０含有ＰＢＳで洗浄
し、前記（２）のフルオレセインで修飾されたアビジン
の凍結乾燥標品を蒸留水に溶解した溶液に浸漬して、室
温に１０分放置した。この検出部を０．２％トゥイーン
２０含有ＰＢＳで洗浄し、次いで１％炭酸ナトリウム溶
液に浸漬し、図２に示す装置を用いて７８０nmと１３６
０nmの半導体レーザを照射して５１８nmの蛍光を測定し
たところ、０．４ng／mlまで測定できた。
【００２３】比較例４ （１）アセチル化度５％、分子量約１０6 のキトサン
を、３０％酢酸に３mg／mlとなるように溶解し、次いで
このキトサン溶液に水溶性カルボジイミドを２０mg／ml
となるように添加し、さらに２時間おきに２０mg／mlず
つ３回添加し、最終的に８０mg／mlとして、室温で１６
時間反応させた。この反応混合物を蒸留水に透析し、ア
セチル化度約８５％のキトサン原液を得た。 （２）実施例１の（２）〜（７）と同様の方法で、ＮＫ
１１６０で修飾された標識試薬及びヤギ由来ヒトカルシ
トニン抗体固定化センサーを作成した。 （３）各濃度のカルシトニン溶液１０μl に前記（２）
の検出部を浸漬し、室温に３０分放置後、前記（２）の
凍結乾燥粉末を蒸留水に懸濁した溶液に３０分浸漬し
た。このとき浸漬を開始してから１０分ぐらいするとわ
ずかに沈殿が生じた。検出部を０．２％トゥイーン２０
含有１M ＫＳＣＮ水溶液で洗浄し、図１に示す装置にて
蛍光強度を測定したところ、１０mg／mlまでしか測定で
きなかった。
を、３０％酢酸に３mg／mlとなるように溶解し、次いで
このキトサン溶液に水溶性カルボジイミドを２０mg／ml
となるように添加し、さらに２時間おきに２０mg／mlず
つ３回添加し、最終的に８０mg／mlとして、室温で１６
時間反応させた。この反応混合物を蒸留水に透析し、ア
セチル化度約８５％のキトサン原液を得た。 （２）実施例１の（２）〜（７）と同様の方法で、ＮＫ
１１６０で修飾された標識試薬及びヤギ由来ヒトカルシ
トニン抗体固定化センサーを作成した。 （３）各濃度のカルシトニン溶液１０μl に前記（２）
の検出部を浸漬し、室温に３０分放置後、前記（２）の
凍結乾燥粉末を蒸留水に懸濁した溶液に３０分浸漬し
た。このとき浸漬を開始してから１０分ぐらいするとわ
ずかに沈殿が生じた。検出部を０．２％トゥイーン２０
含有１M ＫＳＣＮ水溶液で洗浄し、図１に示す装置にて
蛍光強度を測定したところ、１０mg／mlまでしか測定で
きなかった。
【図１】１個のレーザを使用する蛍光測定系
【図２】２個のレーザを使用する蛍光測定系
１ 光ファイバー ２ レーザ ３ 光軸合わせのためのガイドレール ４ 検出部 ５ フィルター ６ 蛍光検出器 ７ ハーフミラー
Claims (3)
- 【請求項１】 免疫物質と結合し、標識体で修飾された
アミノグリカンが、アミノ基の２０〜８０％が飽和脂肪
酸でアシル化されているアミノグリカンであることを特
徴とする免疫測定用標識試薬。 - 【請求項２】 前記標識体で修飾されたアミノグリカン
が、ビオチンとアビジンを介して複数の標識体で修飾さ
れている請求項１記載の免疫測定用標識試薬。 - 【請求項３】 免疫物質と結合しビオチンで修飾された
アミノグリカンと、標識体で修飾されたアビジンの組み
合せからなる免疫測定用標識試薬であって、前記アミノ
グリカンのアミノ基の２０〜８０％が飽和脂肪酸でアシ
ル化されていることを特徴とする免疫測定用標識試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13891192A JP3147992B2 (ja) | 1992-05-29 | 1992-05-29 | 免疫測定用標識試薬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13891192A JP3147992B2 (ja) | 1992-05-29 | 1992-05-29 | 免疫測定用標識試薬 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05333026A true JPH05333026A (ja) | 1993-12-17 |
| JP3147992B2 JP3147992B2 (ja) | 2001-03-19 |
Family
ID=15233028
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP13891192A Expired - Lifetime JP3147992B2 (ja) | 1992-05-29 | 1992-05-29 | 免疫測定用標識試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3147992B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003500367A (ja) * | 1999-05-20 | 2003-01-07 | マリンクロッド・インコーポレイテッド | 生物医学的適用のための新規なシアニンおよびインドシアニン染料バイオコンジュゲート |
-
1992
- 1992-05-29 JP JP13891192A patent/JP3147992B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003500367A (ja) * | 1999-05-20 | 2003-01-07 | マリンクロッド・インコーポレイテッド | 生物医学的適用のための新規なシアニンおよびインドシアニン染料バイオコンジュゲート |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3147992B2 (ja) | 2001-03-19 |
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