JP7354285B2 - 蛍光輝度を増加させるためのリンカー及び酵素により遊離可能な蛍光部分を有する接合体での可逆的な細胞検出 - Google Patents
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Description
したがって、本発明の目的は、蛍光消光を回避するさらなる標識を可能にするために、生物学的試験体の試料における標的部分の特異的な標識、検出及び脱標識のための接合体及びその方法を提供することであった。
(I) (Xo-L)n-P-Ym
[式中、Y:標的部分を認識する抗原認識部分
P:酵素により分解可能なスペーサー
X:蛍光部分
L:1つ以上のポリエチレングリコール残基を含むリンカーユニット
n、m:1~100までの整数
o:1~100までの整数]
で特徴付けられる、細胞上で標的部分を標識付けするための接合体に関し、その際、Lは、蛍光部分Xと酵素により分解可能なスペーサーPとを結合し、Yは、酵素により分解可能なスペーサーPに共有結合し、かつ酵素により分解可能なスペーサーPは、多糖、ポリエステル、核酸及びそれらの誘導体からなる群から選択される。
a) 一般式I
(I) (Xo-L)n-P-Ym
[式中、Y:標的部分を認識する抗原認識部分
P:酵素により分解可能なスペーサー
X:蛍光部分
L:1つ以上のポリエチレングリコール残基を含むリンカーユニット
n、m:1~100までの整数
o:1~100までの整数
ここで、Lは、蛍光部分Xと酵素により分解可能なスペーサーPとを結合し、Yは、酵素により分解可能なスペーサーPに共有結合する]を有する少なくとも1つの接合体を準備すること
b) 生物学的試験体の試料と式(I)による接合体とを接触させ、それにより抗原認識部分Yによって認識された標的部分を標識付けすること
c) 蛍光部分Xを有する接合体で標識付けされた標的部分を検出すること
によって、生物学的試験体の試料における標的部分を検出するための方法である。
本発明の方法及び接合体は、標的細胞のインビトロ検出のために使用することが好ましい。
本発明の方法で検出される標的部分は、任意の生物学的試験体上、例えば組織スライス上、細胞集合体上、浮遊細胞上、又は付着細胞上であってよい。細胞は、生きているか又は死んでいてよい。好ましくは、標的部分は、生物学的試験体、例えば動物全体、器官、組織スライス、細胞集合体、又は無脊椎動物(例えば、カエノラブディティス・エレガンス(Caenorhabditis elegans)、キイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster))、脊椎動物(例えば、ゼブラフィッシュ(Danio rerio)、アフリカツメガエル(Xenopus laevis))及び哺乳類(例えば、ハツカネズミ(Mus musculus)、ホモ・サピエンス(Homo sapiens))の単一細胞上の細胞内又は細胞外で発現される抗原である。
適した蛍光部分Xは、免疫蛍光技術、例えばフローサイトメトリー又は蛍光顕微鏡法の技術から公知のものである。本発明のこれらの実施形態において、接合体で標識付けした標的部分は、蛍光部分Xを励起し、得られる発光(光ルミネッセンス)を検出することによって検出される。有用な蛍光部分は、有機小分子色素、例えばフルオレセインのようなキサンテン色素、又はローダミン色素、クマリン色素、シアニン色素、ピレン色素、オキサジン色素、ピリジルオキサゾール色素、ピロメテン色素、アクリジン色素、オキサジアゾール色素、カルボピロニン色素、ベンズピリリウム色素、フルオレセイン色素、又は有機金属錯体、例えばRu、Eu、Pt錯体であってよい。単一分子実体に加えて、有機小分子色素のクラスター、蛍光オリゴマー、又は蛍光ポリマー、例えばポリフルオレンも、蛍光部分として使用できる。さらに、蛍光部分は、タンパク質ベース、例えばフィコビリタンパク質、ナノ粒子、例えば量子ドット、アップコンバージョンナノ粒子、金ナノ粒子、染色したポリマーナノ粒子であってよい。
「抗原認識部分Y」という用語は、細胞上で細胞内又は細胞外で発現した生物学的試験体、例えば抗原上で発現した標的部分に対して結合する任意の種類の分子をいう。「抗原認識部分Y」という用語は、特に、抗体、断片化した抗体、断片化した抗体誘導体、TCR分子を標的とするペプチド/MHC複合体、細胞接着受容体分子、共刺激分子の受容体、又は人工的に操作した結合分子、ペプチド、レクチンもしくはアプタマー、RNA、DNA、オリゴヌクレオチド及びそれらの類似体に関する。
酵素により分解可能なスペーサーPは、特異的酵素、例えば加水分解酵素によって切断されうる任意の分子であってよい。酵素により分解可能なスペーサーPとして、例えば、多糖類、タンパク質、ペプチド、デプシペプチド、ポリエステル、核酸、及びそれらの誘導体が適している。
リンカーLは、2~500、好ましくは4~30のエチレングリコールの繰り返し単位を含む、極性親水性オリゴマーである。
本発明の方法の好ましい実施形態は、酵素により分解可能なスペーサーPを酵素によって分解し、それによって、標識付けした標的部分から蛍光部分Xを切断するステップd)を含む。
この方法のステップa)において、一般式(I)を有する少なくとも1つの接合体を提供する。異なる検出部分によって異なる標的部分又は同一の標的部分を検出するために、一般式(I)を有する異なる接合体を提供でき、ここで、接合体及びその成分、Y、P、L、X、o、n、mは同一の意味を有するが、同一又は異なる種類及び/又は量の抗原認識部分Y及び/又はリンカーユニットL及び/又は酵素により分解可能なスペーサーP及び/又は蛍光部分Xであってよい。この方法のさらなる実施形態において、生物学的試験体の試料を、リンカーLを含まない酵素により分解可能な接合体で標識付けすることが可能である。
(II) (X)n-P-Ym
式中、
Y:標的部分を認識する抗原認識部分
P:酵素により分解可能なスペーサー
X:蛍光部分
n、m:1~100までの整数
ここで、X及びYは、酵素により分解可能なスペーサーPに共有結合し、生物学的試験体の試料と式(II)による接合体とを接触させ、それにより抗原認識部分Yによって認識された標的部分を標識付けする。
(Xo-L)n-P’-Ym(III) 及び/又は Xn-P’-Ym(IV)
式中、Y、L、X、n、mは、式(I)における意味と同一の化学的意味を有するが、P’は酵素により分解可能ではないスペーサーである。X、Xo-L、P’及びYは、共有結合又は非共有結合される。
ステップb)において、生物学的試験体の試料の標的部分は、式(I)~(VI)による接合体で標識される。
接合体で標識付けした標的部分を検出するための方法及び装置は、蛍光部分Xによって決定される。
ステップd)におけるステップc)での標的部分の検出及び/又は単離後に、スペーサーPを酵素により分解され、それによって少なくとも蛍光部分X、リンカーユニットLを接合体から切断する。
酵素により分解可能なスペーサーPは、適切な酵素の添加により分解される。遊離試薬としての酵素の選択は、酵素により分解可能なスペーサーPの化学的性質によって決定され、1種又は異なる酵素混合物であってよい。
本発明の方法は、複雑な混合物からの特定の標的部分の検出及び/又は単離のために特に有用であり、ステップa)~d)の1つ以上の順序で実施してよい。それぞれの順序の後に、蛍光部分及び任意に抗原認識部分Yが、標的部分から遊離(除去)される。さらに、ステップa)~d)のいずれかを組み合わせた順序が可能である。順序は、ステップa)~d)のいずれかで停止できる。追加の洗浄ステップを実施できる。
本発明の方法は、次の実施形態で実施されうる。
本発明の方法は、研究、診断及び細胞治療における種々の適用に使用できる。
実施例1 - デキストラン-PEG-クマリン-色素とデキストラン-クマリン-色素の結合及び蛍光消光の測定
本発明による接合体を調製するために、有機小分子色素、例えば、Pacific Blue NHS-エステル(Thermo Fisher Scientific社から入手可能)を、DMSO中で溶解し、そしてカルボキシ-PEG-アミン、例えばCA(PEG)24(Thermo Fisher Scientific社から入手可能)をDMSO中に溶解して追加した。その反応混合物を2時間室温で撹拌した。その後、カルボキシ-PEG-クマリン-色素を、室温で一晩EDC及びNHS(例えばMerck社により入手可能)を添加することによって活性化した。
式(I)(Xo-L)n-P-Ym又は式(II)(X)n-P-Ymに従って、抗体-又はFab-デキストラン-蛍光色素接合体を調製するために、デキストラン-PEG-クマリン-色素-接合体及びデキストラン-クマリン-色素-接合体を、SMCCで室温で60分間インキュベートすることにより活性化させ、PBS/EDTA緩衝液を使用したサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。抗体又はFab、例えば抗-CD4を、MES緩衝液中で10mM DTTで還元した。室温で90分インキュベートした後に、抗体を、PBS/EDTA-緩衝液を使用したサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。抗体-又はFab-デキストラン-蛍光色素接合体の接合のために、活性化させたFab又は抗体を、活性化させたデキストランに添加した。室温で60分間インキュベートした後に、β-メルカプトエタノール、続いてN-エチルマレイミドをモル過剰で連続して添加して、未反応のマレイミド官能基又はチオール官能基をブロックした。抗体-又はFab-デキストラン-蛍光色素-接合体を、PBS/EDTA-緩衝液を使用したサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。抗体又はFab及び蛍光部分の濃度を、280nmでの吸光度及び蛍光色素の特定の波長での吸光度によって測定した。
PBS/EDTA/BSA緩衝液中でのPBMCを、抗CD4-Fab-デキストラン-クマリン-色素接合体DOF5.0又は抗CD4-Fab-デキストラン-PEG-クマリン-色素-接合体DOF4.1、6.5、及び8.6で、4℃で10分間染色した。細胞を、冷PBS/EDTA-BSA-緩衝液で洗浄し、そしてフローサイトメトリーにより分析した。蛍光標識の可逆性のために、細胞をデキストラナーゼで21℃で10分間インキュベートし、PBS/EDTA-BSA-緩衝液で洗浄し、そしてフローサイトメトリーで分析した。
Claims (12)
- 一般式
(I) (Xo-L)n-P-Ym
[式中、Y:標的部分を認識する抗原認識部分
P:酵素により分解可能なスペーサー
X:蛍光部分
L:1つ以上のポリエチレングリコール残基であるリンカーユニット
n、m:1~100までの整数
o:1~100までの整数
ここで、Lは、蛍光部分Xと酵素により分解可能なスペーサーPとを共有結合し、Yは、酵素により分解可能なスペーサーPに共有結合し、かつ酵素により分解可能なスペーサーPは、多糖、ポリエステル、核酸及びそれらの誘導体からなる群から選択される]
を特徴とする、細胞上で標的部分を標識付けするための接合体。 - リンカーユニットLが、ポリヒドロキシ化合物、ポリアミノ化合物、ポリチオ化合物からなる群から選択される少なくとも1つのコアユニットに結合する1つ以上のポリエチレングリコール残基であることを特徴とする、請求項1に記載の接合体。
- リンカーユニットLが、エチレングリコールの2~500繰り返し単位を有する1つ以上のポリエチレングリコール残基であることを特徴とする、請求項1又は2に記載の接合体。
- 抗原認識部分Yが、抗体、断片化した抗体、断片化した抗体誘導体、TCR分子を標的とするペプチド/MHC複合体、細胞接着受容体分子、共刺激分子は人工的に操作した結合分子の受容体、ペプチド、レクチン又はアプタマー、RNA、DNA、オリゴヌクレオチド、及びそれらの類似体であることを特徴とする、請求項1から3までのいずれか1項に記載の接合体。
- 蛍光部分が、キサンテン色素、ローダミン色素、クマリン色素、シアニン色素、ピレン色素、オキサジン色素、ピリジルオキサゾール色素、ピロメテン色素、アクリジン色素、オキサジアゾール色素、カルボピロニン色素、ベンズピリリウム色素、フルオレセイン色素、蛍光オリゴマー又は蛍光ポリマーからなる群から選択されることを特徴とする、請求項1から4までのいずれか1項に記載の接合体。
- 酵素により分解可能なスペーサーPが、一般式(Xo-L)n-P(L)l(X)x-Ym[式中、l及びxは0~100の整数である]に従って、蛍光部分Xに結合していない少なくとも1つの共有結合リンカーユニットL、及び/又はリンカーユニットLに結合していない少なくとも1つの共有結合蛍光部分Xをさらに備えていることを特徴とする、請求項1から5までのいずれか1項に記載の接合体。
- 以下、
a) 一般式I
(I) (Xo-L)n-P-Ym
[式中、Y:標的部分を認識する抗原認識部分
P:酵素により分解可能なスペーサー
X:蛍光部分
L:1つ以上のポリエチレングリコール残基であるリンカーユニット
n、m:1~100までの整数
o:1~100までの整数
ここで、Lは、蛍光部分Xと酵素により分解可能なスペーサーPとを共有結合し、Yは、酵素により分解可能なスペーサーPに共有結合する]
を有する少なくとも1つの接合体を準備すること
b) 生物学的試験体の試料と式(I)による接合体とを接触させ、それにより抗原認識部分Yによって認識された標的部分を標識付けすること
c) 蛍光部分Xを有する接合体で標識付けした標的部分を検出すること
によって、生物学的試験体の試料において標的部分を検出するための方法。 - ステップd)において、酵素により分解可能なスペーサーPを酵素によって分解し、それにより、標識付けした標的部分から蛍光部分Xを切断することを特徴とする、請求項7に記載の方法。
- ステップd)において、酵素により分解可能なスペーサーPを酵素によって分解し、それにより、標識付けした標的部分から蛍光部分X及び抗原認識部分Yを切断することを特徴とする、請求項7又は8に記載の方法。
- 酵素により分解可能なスペーサーPを分解するために使用される酵素が、グリコシダーゼ、デキストラナーゼ、プルラナーゼ、アミラーゼ、イヌリナーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、ペクチナーゼ、キトサナーゼ、キチナーゼ、プロテイナーゼ、エステラーゼ、リパーゼ、及びヌクレアーゼからなる群から選択されることを特徴とする、請求項7から9までのいずれか1項に記載の方法。
- さらに、一般式II
(II) (X)n-P-Ym
[式中、Y:標的部分を認識する抗原認識部分
P:酵素により分解可能なスペーサー
X:蛍光部分
n、m:1~100までの整数
ここで、X及びYは、酵素により分解可能なスペーサーPに共有結合し、生物学的試験体の試料と式(II)による接合体とを接触させ、それにより抗原認識部分Yによって認識された標的部分を標識付けする]
を有する少なくとも1つの接合体を提供することを特徴とする、請求項7から10までのいずれか1項に記載の方法。 - 酵素により分解可能なスペーサーPが、一般式(Xo-L)n-P(L)l(X)x-Ym[式中、l及びxは0~100の整数である]に従って、蛍光部分Xに結合していない少なくとも1つの共有結合リンカーユニットL、及び/又はリンカーユニットLに結合していない少なくとも1つの共有結合蛍光部分Xをさらに備えていることを特徴とする、請求項7から11までのいずれか1項に記載の方法。
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