JPH05317062A - 発酵方法 - Google Patents
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- JPH05317062A JPH05317062A JP4174998A JP17499892A JPH05317062A JP H05317062 A JPH05317062 A JP H05317062A JP 4174998 A JP4174998 A JP 4174998A JP 17499892 A JP17499892 A JP 17499892A JP H05317062 A JPH05317062 A JP H05317062A
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- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 グルコノバクター（Ｇluconobacter）属又は
アセトバクター（Ａcetobacter）属に属し、Ｄ-ソルビ
トールからＬ-ソルボースを生産する能力を有する微生
物（Ａ）と、Ｌ-ソルボースから２-ケト-Ｌ-グロン酸を
生産する能力を有し、かつＤＳＭ Ｎo．４０２５株、
その機能的同等物、継代培養物、突然変異株又は誘導体
の同定における特徴を有する微生物（Ｂ）との混合微生
物培養を用いるＤ-ソルビトールの発酵変換による２-ケ
ト-グロン酸の製法。 【効果】 本方法によれば、Ｌ-アスコルビン酸の製造
中間体として有用な２-ケト-グロン酸を高収率で取得で
きる。
アセトバクター（Ａcetobacter）属に属し、Ｄ-ソルビ
トールからＬ-ソルボースを生産する能力を有する微生
物（Ａ）と、Ｌ-ソルボースから２-ケト-Ｌ-グロン酸を
生産する能力を有し、かつＤＳＭ Ｎo．４０２５株、
その機能的同等物、継代培養物、突然変異株又は誘導体
の同定における特徴を有する微生物（Ｂ）との混合微生
物培養を用いるＤ-ソルビトールの発酵変換による２-ケ
ト-グロン酸の製法。 【効果】 本方法によれば、Ｌ-アスコルビン酸の製造
中間体として有用な２-ケト-グロン酸を高収率で取得で
きる。
Description
【０００１】本発明はＤ-ソルビトールの発酵変換によ
って高収率に２-ケト-Ｌ-グロン酸を製造する方法に関
する。
って高収率に２-ケト-Ｌ-グロン酸を製造する方法に関
する。
【０００２】２-ケト-Ｌ-グロン酸は広く知られている
ライヒシュタイン（Ｒeichstein）法によってＬ-アスコ
ルビン酸に変換されうる、Ｌ-アスコルビン酸の製造に
関する重要な中間体である。
ライヒシュタイン（Ｒeichstein）法によってＬ-アスコ
ルビン酸に変換されうる、Ｌ-アスコルビン酸の製造に
関する重要な中間体である。
【０００３】Ｄ-ソルビトール又はＬ-ソルボースからの
２-ケト-Ｌ-グロン酸の発酵製造は公知である。
２-ケト-Ｌ-グロン酸の発酵製造は公知である。
【０００４】例えば、特公昭５１−４０１５４号公報
は、好気的条件下にＤ-ソルビトールを酸化する能力を
有するアセトバクター（Ａcetobacter）属、バクテリウ
ム（Ｂacterium）属又はシユードモナス（Ｐseudomona
s）属の微生物を用いてＤ-ソルビトールからの２-ケト-
Ｌ-グロン酸の製造方法を開示している。しかし、この
既知の製造方法の収率はかなり低く、６g／l以下であ
る。
は、好気的条件下にＤ-ソルビトールを酸化する能力を
有するアセトバクター（Ａcetobacter）属、バクテリウ
ム（Ｂacterium）属又はシユードモナス（Ｐseudomona
s）属の微生物を用いてＤ-ソルビトールからの２-ケト-
Ｌ-グロン酸の製造方法を開示している。しかし、この
既知の製造方法の収率はかなり低く、６g／l以下であ
る。
【０００５】アクタ マイクロバイオロジカ シニカ
（Ａcta Ｍicrobiologica Ｓinica）、２１（２）１
８５-１９１（１９８１）に開示されている他の既知方
法によれば、シユードモナス・ストリアータ（Ｐseudom
onas striata）及びグルコノバクター・オキシダンス
を含む微生物の混合培養によって、２-ケト-Ｌ-グロン
酸はＬ-ソルボースから製造することができ、その収率
は、Ｌ-ソルボース７０g／lの濃度で開始すると３０g／
lであり、Ｌ-ソルボース１００g／lの濃度で開始すると
３７g／lである。
（Ａcta Ｍicrobiologica Ｓinica）、２１（２）１
８５-１９１（１９８１）に開示されている他の既知方
法によれば、シユードモナス・ストリアータ（Ｐseudom
onas striata）及びグルコノバクター・オキシダンス
を含む微生物の混合培養によって、２-ケト-Ｌ-グロン
酸はＬ-ソルボースから製造することができ、その収率
は、Ｌ-ソルボース７０g／lの濃度で開始すると３０g／
lであり、Ｌ-ソルボース１００g／lの濃度で開始すると
３７g／lである。
【０００６】さらに、ヨーロッパ特許第０２２１ ７０
７号は、共存するバクテリアの存在および非存在下で、
シユードグルコノバクター・サッカロケトゲネス（Ｐse
udogluconobacter saccharoketogenes）によってＬ-ソ
ルボースからの２-ケト-Ｌ-グロン酸の製造を開示して
いる。しかし、シユードグルコノバクター・サッカロケ
トゲネス自体によるこの既知の製造法の収率は、多くて
５５.３−８７.６g／lである（変換率：３４.２−５４.
１％）（参照：ヨーロッパ特許第０２２１ ７０７号、
第１３頁、表４）。
７号は、共存するバクテリアの存在および非存在下で、
シユードグルコノバクター・サッカロケトゲネス（Ｐse
udogluconobacter saccharoketogenes）によってＬ-ソ
ルボースからの２-ケト-Ｌ-グロン酸の製造を開示して
いる。しかし、シユードグルコノバクター・サッカロケ
トゲネス自体によるこの既知の製造法の収率は、多くて
５５.３−８７.６g／lである（変換率：３４.２−５４.
１％）（参照：ヨーロッパ特許第０２２１ ７０７号、
第１３頁、表４）。
【０００７】さらにまた、ヨーロッパ特許第０２７８
４４７号は、ＤＳＭ Ｎo．４０２５株の同定における
特徴を有する微生物及びＤＳＭ Ｎo．４０２６（バチ
ルスメガテリウム株（Ｂacillus megaterium））の同
定における特徴を有する微生物の混合培養によってＬ-
ソルボースから２-ケト-Ｌ-グロン酸を製造する方法を
開示している。この製造法の収率は４０g／l以上であ
る。前記したように、Ｌ-ソルボース又はＤ-ソルビトー
ルのいずれかから２-ケト-Ｌ-グロン酸を微生物学的に
製造しようという様々な試みがあるが、特にＤ-ソルビ
トールからの方法に関して低収率であるため工業的方法
とはなっていない。本発明における製造方法では、少く
とも約６０g／lの収率を可能とし、約１３０g／lの収率
を得ることが可能である。
４４７号は、ＤＳＭ Ｎo．４０２５株の同定における
特徴を有する微生物及びＤＳＭ Ｎo．４０２６（バチ
ルスメガテリウム株（Ｂacillus megaterium））の同
定における特徴を有する微生物の混合培養によってＬ-
ソルボースから２-ケト-Ｌ-グロン酸を製造する方法を
開示している。この製造法の収率は４０g／l以上であ
る。前記したように、Ｌ-ソルボース又はＤ-ソルビトー
ルのいずれかから２-ケト-Ｌ-グロン酸を微生物学的に
製造しようという様々な試みがあるが、特にＤ-ソルビ
トールからの方法に関して低収率であるため工業的方法
とはなっていない。本発明における製造方法では、少く
とも約６０g／lの収率を可能とし、約１３０g／lの収率
を得ることが可能である。
【０００８】他方、Ｄ-ソルビトールからのＬ-ソルボー
スの発酵法が知られており、しかもその方法はライヒシ
ュタイン法の一部でもある。
スの発酵法が知られており、しかもその方法はライヒシ
ュタイン法の一部でもある。
【０００９】例えばアセトバクター・キシリナム（Ａce
tobacter xylinum）及びアセトバクター・サブオキシ
ダンス（Ａcetobacter suboxydans）など各種のアセト
バクター（現在ではグルコノバクター株に分類されてい
る）株が、Ｄ-ソルビトールからＬ-ソルボースを効率よ
く生産することが知られている（バイオテクノロジー
（Ｂiotechnology）、６ａ巻、４３６−４３７、１９８
４、Ｈ．Ｊ．Ｒehm及びＧ．Ｒeed編集、Ｖerlag Ｃhem
ie発行、バインハイム（Ｗeinheim）、ドイツ）。
tobacter xylinum）及びアセトバクター・サブオキシ
ダンス（Ａcetobacter suboxydans）など各種のアセト
バクター（現在ではグルコノバクター株に分類されてい
る）株が、Ｄ-ソルビトールからＬ-ソルボースを効率よ
く生産することが知られている（バイオテクノロジー
（Ｂiotechnology）、６ａ巻、４３６−４３７、１９８
４、Ｈ．Ｊ．Ｒehm及びＧ．Ｒeed編集、Ｖerlag Ｃhem
ie発行、バインハイム（Ｗeinheim）、ドイツ）。
【００１０】Ｌ-ソルボースよりも安価な炭素源、例え
ばＤ-ソルビトールから出発し、２-ケト-Ｌ-グロン酸の
効果的な製造方法を確立できれば、ライヒシュタイン法
が劇的に簡略化されることは明らかである。
ばＤ-ソルビトールから出発し、２-ケト-Ｌ-グロン酸の
効果的な製造方法を確立できれば、ライヒシュタイン法
が劇的に簡略化されることは明らかである。
【００１１】ＤＳＭ Ｎo．４０２５株は、Ｌ-ソルボー
スから効率的に２-ケト-Ｌ-グロン酸を生産しうるが、
Ｄ-ソルビトールからは、低い変換収率である。Ｄ-ソル
ビトールからの２-ケト-Ｌ-グロン酸の低い変換収率
は、Ｄ-グルコース、Ｄ-グルコン酸塩及び２-ケト-Ｄ-
グルコン酸などの副生物を形成することによるものであ
る。異性体である２-ケト-Ｄ-グルコン酸から２-ケト-
Ｌ-グロン酸の精製は困難である。ＤＳＭ Ｎo．４０２
５株におけるＤ-ソルビトールの可能な代謝経路を以下
に示す。
スから効率的に２-ケト-Ｌ-グロン酸を生産しうるが、
Ｄ-ソルビトールからは、低い変換収率である。Ｄ-ソル
ビトールからの２-ケト-Ｌ-グロン酸の低い変換収率
は、Ｄ-グルコース、Ｄ-グルコン酸塩及び２-ケト-Ｄ-
グルコン酸などの副生物を形成することによるものであ
る。異性体である２-ケト-Ｄ-グルコン酸から２-ケト-
Ｌ-グロン酸の精製は困難である。ＤＳＭ Ｎo．４０２
５株におけるＤ-ソルビトールの可能な代謝経路を以下
に示す。
【００１２】
【化１】 Ｄ-ソルビトール→Ｌ-ソルボース→Ｌ-ソルボソン→２-ケト-Ｌ-グロン酸 ↓ Ｄ-グルコース→Ｄ-グルコン酸→２-ケト-Ｄ-グルコン酸 ＤＳＭ Ｎo．４０２５株を用いる発酵法においてＤ-ソ
ルビトールから２-ケト-Ｌ-グロン酸の収率を高めるた
めに、いくつかの方法によって、できるかぎり多くＬ-
ソルボース生成経路を増強することによって達成しうる
ことが考えられた。
ルビトールから２-ケト-Ｌ-グロン酸の収率を高めるた
めに、いくつかの方法によって、できるかぎり多くＬ-
ソルボース生成経路を増強することによって達成しうる
ことが考えられた。
【００１３】従って、本発明の一つの目的は、Ｄ-ソル
ビトールから２-ケト-Ｌ-グロン酸を少くとも約５０モ
ル％から、約８９モル％の高い変換収率で調製する新規
な方法を提供することにある。
ビトールから２-ケト-Ｌ-グロン酸を少くとも約５０モ
ル％から、約８９モル％の高い変換収率で調製する新規
な方法を提供することにある。
【００１４】本発明の他の目的は、例えばＤ-グルコー
ス、Ｄ-グルコン酸及び２-ケト-Ｄ-グルコン酸などの望
ましくない副生物の生成を防止する操作方法を提供する
ことにある。
ス、Ｄ-グルコン酸及び２-ケト-Ｄ-グルコン酸などの望
ましくない副生物の生成を防止する操作方法を提供する
ことにある。
【００１５】本発明は、グルコノバクター属又はアセト
バクター属に属し、Ｄ-ソルビトールからＬ-ソルボース
を生産する能力を有する微生物（Ａ）とＬ-ソルボース
から２-ケト-Ｌ-グロン酸を生産する能力を有し、かつ
ＤＳＭ Ｎo．４０２５株、その機能的同等物、継代培
養物、突然変異株又は誘導体の同定における特徴を有す
る微生物（Ｂ）との混合微生物培養をＤ-ソルビトール
を含む培地中で培養し、該両微生物が全培養期間の少な
くとも一時期培地中に共存する様に混合培養を行ない、
２-ケト-Ｌ-グロン酸又はその塩を単離することを特徴
とする２-ケト-Ｌ-グロン酸又はその塩の製造方法に関
するものである。
バクター属に属し、Ｄ-ソルビトールからＬ-ソルボース
を生産する能力を有する微生物（Ａ）とＬ-ソルボース
から２-ケト-Ｌ-グロン酸を生産する能力を有し、かつ
ＤＳＭ Ｎo．４０２５株、その機能的同等物、継代培
養物、突然変異株又は誘導体の同定における特徴を有す
る微生物（Ｂ）との混合微生物培養をＤ-ソルビトール
を含む培地中で培養し、該両微生物が全培養期間の少な
くとも一時期培地中に共存する様に混合培養を行ない、
２-ケト-Ｌ-グロン酸又はその塩を単離することを特徴
とする２-ケト-Ｌ-グロン酸又はその塩の製造方法に関
するものである。
【００１６】さらに、本発明によるとＬ-ソルボース生
産株によってＤ-ソルビトールから生産されるＬ-ソルボ
ースは、２-ケト-Ｌ-グロン酸を形成する２-ケト-Ｌ-グ
ロン酸生産株によって有効利用されうる。加うるに、前
記した副生物の蓄積は、実質的に認められない。
産株によってＤ-ソルビトールから生産されるＬ-ソルボ
ースは、２-ケト-Ｌ-グロン酸を形成する２-ケト-Ｌ-グ
ロン酸生産株によって有効利用されうる。加うるに、前
記した副生物の蓄積は、実質的に認められない。
【００１７】この点で、ここで使用されるＤ-ソルビト
ールからＬ-ソルボースを生産する能力を有する微生物
（Ａ）は、グルコノバクター属又はアセトバクター属に
属する。Ｌ-ソルボースから２-ケト-Ｌ-グロン酸を生産
する能力を有し、ＤＳＭ Ｎo．４０２５株、その機能
的同等物、継代培養物、突然変異又は誘導体の同定にお
ける特徴を有する微生物（Ｂ）を用いる。
ールからＬ-ソルボースを生産する能力を有する微生物
（Ａ）は、グルコノバクター属又はアセトバクター属に
属する。Ｌ-ソルボースから２-ケト-Ｌ-グロン酸を生産
する能力を有し、ＤＳＭ Ｎo．４０２５株、その機能
的同等物、継代培養物、突然変異又は誘導体の同定にお
ける特徴を有する微生物（Ｂ）を用いる。
【００１８】本方法において、例えば微生物（Ａ）及び
（Ｂ）の菌体を処理することで得られるいずれの生成
物、例えば休止菌体、凍結乾燥菌体又は固定化菌体など
も用いることができる。
（Ｂ）の菌体を処理することで得られるいずれの生成
物、例えば休止菌体、凍結乾燥菌体又は固定化菌体など
も用いることができる。
【００１９】本方法は、様々な方法で行なうことができ
る；例えば微生物（Ａ）及び（Ｂ）の両種を培養開始時
に培地に同時に接種する方法、微生物（Ａ）を最初に接
種し、次にある培養期間後に微生物（Ｂ）を接種する方
法及び微生物（Ａ）及び（Ｂ）の両方を各々の培地に別
々に接種し、次に適当な期間培養を行なった後、直ち
に、部分的に又は連続的にその培養液のいずれかをもう
一方の培養液に加え、続けてさらに培養を行なう。
る；例えば微生物（Ａ）及び（Ｂ）の両種を培養開始時
に培地に同時に接種する方法、微生物（Ａ）を最初に接
種し、次にある培養期間後に微生物（Ｂ）を接種する方
法及び微生物（Ａ）及び（Ｂ）の両方を各々の培地に別
々に接種し、次に適当な期間培養を行なった後、直ち
に、部分的に又は連続的にその培養液のいずれかをもう
一方の培養液に加え、続けてさらに培養を行なう。
【００２０】本発明の方法において、例えば用いる各々
の微生物の性質に応じて混合の方法を変えることなどに
よって培養する微生物に対応して適当な方法を用いるこ
とができる。すなわち、接種する一方の微生物の量と他
方の微生物の量との比率及び接種時期は、各々の微生物
の増殖率及びＬ-ソルボース生産能及び微生物のＬ-ソル
ボースを２-ケト-Ｌ-グロン酸に変換する能力、更に用
いる培地の特性に基づく観点から選択し、決定すること
が好ましい。場合により菌体を処理することによって得
られた生成物を、増殖菌体のいずれか一つの代りとして
用いてもよい。本発明の方法で用いる微生物（Ａ）は、
日本国、大阪（財）発酵研究所の様に、いずれの人の要
求に対しても分譲できるように公的な寄託機関（カルチ
ャーコレクション）によって保存されている微生物を含
み、それらは以下の通りである； 微生物（Ａ）の例 グルコノバクター・サブオキシダンス（Ｇluconobacter suboxydans） ＩＦＯ ３１３０ グルコノバクター・サブオキシダンス ＩＦＯ ３２５５ グルコノバクター・サブオキシダンス ＩＦＯ ３２５６ グルコノバクター・サブオキシダンス ＩＦＯ ３２５７ グルコノバクター・サブオキシダンス ＩＦＯ ３２５８ グルコノバクター・サブオキシダンス ＩＦＯ ３２８９ グルコノバクター・サブオキシダンス ＩＦＯ ３２９０ グルコノバクター・サブオキシダンス ＩＦＯ ３２９１ グルコノバクター・グルコニクス（Ｇluconobacter gluconicus） ＩＦＯ ３１７１ グルコノバクター・グルコニクス ＩＦＯ ３２８５ グルコノバクター・グルコニクス ＩＦＯ ３２８６ グルコノバクター・ルビギノサス（Ｇluconobacter rubiginosus） ＩＦＯ ３２４４ グルコノバクター・アルビダス（Ｇluconobacter albidus） ＩＦＯ ３２５１ グルコノバクター・アルビダス ＩＦＯ ３２５３ グルコノバクター・インダストリアス（Ｇluconobacter industrius） ＩＦＯ ３２６１ グルコノバクター・セリヌス（Ｇluconobacter cerinus） ＩＦＯ ３２６２ グルコノバクター・セリヌス ＩＦＯ ３２６３ グルコノバクター・セリヌス ＩＦＯ ３２６５ グルコノバクター・セリヌス ＩＦＯ ３２６６ グルコノバクター・セリヌス ＩＦＯ ３２６７ グルコノバクター・セリヌス ＩＦＯ ３２７０ グルコノバクター・ジアセトニクス（Ｇluconobacter diacetonicus） ＩＦＯ ３２７３ グルコノバクター・ロセウス（Ｇluconobacter roseus） ＩＦＯ ３９９０ アセトバクター・アセチ亜種オーレアンス (Ａcetobacter aceti subsp．orleans) ＩＦＯ ３２５９ アセトバクター・アセチ亜種アセチ (Ａcetobacter aceti subsp．aceti) ＩＦＯ ３２８１ アセトバクター・リクエフアシアンス (Ａcetobacter liquefaciens) ＩＦＯ １２２５７ アセトバクター・リクエフアシアンス ＩＦＯ １２２５８ アセトバクター・リクエフアシアンス ＩＦＯ １２３８８ アセトバクター・アセチ亜種キシリナム (Ａcetobacter aceti subsp．xylinum) ＩＦＯ ３２８８ アセトバクター・アセチ亜種キシリナム ＩＦＯ １３６９３ アセトバクター・アセチ亜種キシリナム ＩＦＯ １３７７２ アセトバクター・アセチ亜種キシリナム ＩＦＯ １３７７３ 本発明の方法で用いられる微生物（Ｂ）の主な同定にお
ける特徴は、以下の通りである：オキシダーゼテスト陰
性；エタノールを、酢酸に酸化する；Ｄ-グルコースは
Ｄ-グルコン酸と２-ケト-Ｄ-グルコン酸に酸化される；
多価アルコールのケトジエネシスあり；グリセロールか
らジヒドロキシアセトンを実質的に生産しない；Ｄ-グ
ルカル酸から２-ケト-Ｄ-グルカル酸を生産するが、Ｄ-
グルコース、Ｄ-フルクトース、Ｄ-グルコン酸、Ｄ-マ
ンニトール又は２-ケト-Ｄ-グルコン酸からは、生産し
ない；多形性で、明らかにベン毛がない；Ｄ-フルクト
ースから茶色の色素を生産する；バチルス メガテリウ
ム（Ｂacilus megaterium）又はその菌抽出物の存在下
で共存培養を行なう時、良好な増殖が観察される；スト
レプトマイシン（Ｓtreptomycin）感受性である。 微生物（Ｂ）として考えられる特に好ましい微生物は、
ブダペスト条約に基づき、１９８７年５月１７日にＤＳ
Ｍ Ｎo．４０２５としてゲッテインゲン（Ｇoettinge
n）にあるドイツ微生物寄託所（Ｄeutsche Ｓommlung
von Ｍikroorganismen）（現住所：Ｄeutsche Ｓam
mlung von Ｍikroorganismen und Ｚellkulturen
Ｇmbh、Ｍascheroder Ｗeg lb，Ｄ-３３００ Ｂraun
schweig，Ｆederal Ｒepublic of Ｇermany）に寄託
されている。それは、グルコノバクター・オキシダンス
微生物と称されている。
の微生物の性質に応じて混合の方法を変えることなどに
よって培養する微生物に対応して適当な方法を用いるこ
とができる。すなわち、接種する一方の微生物の量と他
方の微生物の量との比率及び接種時期は、各々の微生物
の増殖率及びＬ-ソルボース生産能及び微生物のＬ-ソル
ボースを２-ケト-Ｌ-グロン酸に変換する能力、更に用
いる培地の特性に基づく観点から選択し、決定すること
が好ましい。場合により菌体を処理することによって得
られた生成物を、増殖菌体のいずれか一つの代りとして
用いてもよい。本発明の方法で用いる微生物（Ａ）は、
日本国、大阪（財）発酵研究所の様に、いずれの人の要
求に対しても分譲できるように公的な寄託機関（カルチ
ャーコレクション）によって保存されている微生物を含
み、それらは以下の通りである； 微生物（Ａ）の例 グルコノバクター・サブオキシダンス（Ｇluconobacter suboxydans） ＩＦＯ ３１３０ グルコノバクター・サブオキシダンス ＩＦＯ ３２５５ グルコノバクター・サブオキシダンス ＩＦＯ ３２５６ グルコノバクター・サブオキシダンス ＩＦＯ ３２５７ グルコノバクター・サブオキシダンス ＩＦＯ ３２５８ グルコノバクター・サブオキシダンス ＩＦＯ ３２８９ グルコノバクター・サブオキシダンス ＩＦＯ ３２９０ グルコノバクター・サブオキシダンス ＩＦＯ ３２９１ グルコノバクター・グルコニクス（Ｇluconobacter gluconicus） ＩＦＯ ３１７１ グルコノバクター・グルコニクス ＩＦＯ ３２８５ グルコノバクター・グルコニクス ＩＦＯ ３２８６ グルコノバクター・ルビギノサス（Ｇluconobacter rubiginosus） ＩＦＯ ３２４４ グルコノバクター・アルビダス（Ｇluconobacter albidus） ＩＦＯ ３２５１ グルコノバクター・アルビダス ＩＦＯ ３２５３ グルコノバクター・インダストリアス（Ｇluconobacter industrius） ＩＦＯ ３２６１ グルコノバクター・セリヌス（Ｇluconobacter cerinus） ＩＦＯ ３２６２ グルコノバクター・セリヌス ＩＦＯ ３２６３ グルコノバクター・セリヌス ＩＦＯ ３２６５ グルコノバクター・セリヌス ＩＦＯ ３２６６ グルコノバクター・セリヌス ＩＦＯ ３２６７ グルコノバクター・セリヌス ＩＦＯ ３２７０ グルコノバクター・ジアセトニクス（Ｇluconobacter diacetonicus） ＩＦＯ ３２７３ グルコノバクター・ロセウス（Ｇluconobacter roseus） ＩＦＯ ３９９０ アセトバクター・アセチ亜種オーレアンス (Ａcetobacter aceti subsp．orleans) ＩＦＯ ３２５９ アセトバクター・アセチ亜種アセチ (Ａcetobacter aceti subsp．aceti) ＩＦＯ ３２８１ アセトバクター・リクエフアシアンス (Ａcetobacter liquefaciens) ＩＦＯ １２２５７ アセトバクター・リクエフアシアンス ＩＦＯ １２２５８ アセトバクター・リクエフアシアンス ＩＦＯ １２３８８ アセトバクター・アセチ亜種キシリナム (Ａcetobacter aceti subsp．xylinum) ＩＦＯ ３２８８ アセトバクター・アセチ亜種キシリナム ＩＦＯ １３６９３ アセトバクター・アセチ亜種キシリナム ＩＦＯ １３７７２ アセトバクター・アセチ亜種キシリナム ＩＦＯ １３７７３ 本発明の方法で用いられる微生物（Ｂ）の主な同定にお
ける特徴は、以下の通りである：オキシダーゼテスト陰
性；エタノールを、酢酸に酸化する；Ｄ-グルコースは
Ｄ-グルコン酸と２-ケト-Ｄ-グルコン酸に酸化される；
多価アルコールのケトジエネシスあり；グリセロールか
らジヒドロキシアセトンを実質的に生産しない；Ｄ-グ
ルカル酸から２-ケト-Ｄ-グルカル酸を生産するが、Ｄ-
グルコース、Ｄ-フルクトース、Ｄ-グルコン酸、Ｄ-マ
ンニトール又は２-ケト-Ｄ-グルコン酸からは、生産し
ない；多形性で、明らかにベン毛がない；Ｄ-フルクト
ースから茶色の色素を生産する；バチルス メガテリウ
ム（Ｂacilus megaterium）又はその菌抽出物の存在下
で共存培養を行なう時、良好な増殖が観察される；スト
レプトマイシン（Ｓtreptomycin）感受性である。 微生物（Ｂ）として考えられる特に好ましい微生物は、
ブダペスト条約に基づき、１９８７年５月１７日にＤＳ
Ｍ Ｎo．４０２５としてゲッテインゲン（Ｇoettinge
n）にあるドイツ微生物寄託所（Ｄeutsche Ｓommlung
von Ｍikroorganismen）（現住所：Ｄeutsche Ｓam
mlung von Ｍikroorganismen und Ｚellkulturen
Ｇmbh、Ｍascheroder Ｗeg lb，Ｄ-３３００ Ｂraun
schweig，Ｆederal Ｒepublic of Ｇermany）に寄託
されている。それは、グルコノバクター・オキシダンス
微生物と称されている。
【００２１】さらに好適に用いられる微生物は、前記微
生物の機能的同等物、継代培養物、突然変異株及び誘導
体である。
生物の機能的同等物、継代培養物、突然変異株及び誘導
体である。
【００２２】本発明の好ましい実施態様においては前記
微生物（Ａ）及び（Ｂ）をＤ-ソルビトールを含む培地
に植菌し培養したり、また該微生物の菌体、例えば体止
菌体もしくは菌体から得られるいずれの工程産物を直接
Ｄ-ソルビトールに作用させることも出来る。微生物の
培養技術に関してそれ自体よく知られているいずれの方
法も適用出来るが通気及び撹拌を用いた深部培養槽を用
いるのが特に好ましい。より好ましい結果は、液体培地
を用いた培養から得られる。
微生物（Ａ）及び（Ｂ）をＤ-ソルビトールを含む培地
に植菌し培養したり、また該微生物の菌体、例えば体止
菌体もしくは菌体から得られるいずれの工程産物を直接
Ｄ-ソルビトールに作用させることも出来る。微生物の
培養技術に関してそれ自体よく知られているいずれの方
法も適用出来るが通気及び撹拌を用いた深部培養槽を用
いるのが特に好ましい。より好ましい結果は、液体培地
を用いた培養から得られる。
【００２３】微生物（Ａ）及び（Ｂ）の培養に有効な栄
養培地に関して特別な制限はないが、液体栄養培地は炭
素源及び窒素源を含んでいてもよい。微生物に利用され
うる他の無機塩、少量の他の栄養物等は微生物の培養に
有効であることが望ましい。微生物のより優れた増殖
に、一般的に用いられている様々な栄養物は、培地中に
適当に含まれていてもよい。
養培地に関して特別な制限はないが、液体栄養培地は炭
素源及び窒素源を含んでいてもよい。微生物に利用され
うる他の無機塩、少量の他の栄養物等は微生物の培養に
有効であることが望ましい。微生物のより優れた増殖
に、一般的に用いられている様々な栄養物は、培地中に
適当に含まれていてもよい。
【００２４】本発明で出発物質として用いられるＤ-ソ
ルビトールに加えて、炭素源である他の物質、例えばグ
リセロール、Ｄ-グルコース、Ｄ-マンニトール、Ｄ-フ
ルクトース、Ｄ-アラビトール等も添加してもよい。
ルビトールに加えて、炭素源である他の物質、例えばグ
リセロール、Ｄ-グルコース、Ｄ-マンニトール、Ｄ-フ
ルクトース、Ｄ-アラビトール等も添加してもよい。
【００２５】本発明において各種の有機又は無機質、例
えば肉抽出物、ペプトン、カゼイン、コーンステイープ
リカー、尿素、アミノ酸、窒素、アンモニウム塩などを
窒素源として用いてもよい。無機質として、硫酸マグネ
シウム、リン酸カリウム、塩化第一及び第二鉄、炭酸カ
ルシウムなどを用いてもよい。
えば肉抽出物、ペプトン、カゼイン、コーンステイープ
リカー、尿素、アミノ酸、窒素、アンモニウム塩などを
窒素源として用いてもよい。無機質として、硫酸マグネ
シウム、リン酸カリウム、塩化第一及び第二鉄、炭酸カ
ルシウムなどを用いてもよい。
【００２６】これらの栄養物の混合割合及び各成分の量
は、用いる微生物の属の特性によって変化する。出発物
質であるＤ-ソルビトールの量接種する一方の微生物の
量と他方の微生物の量との比率及び接種時期及び培養の
他の条件は、各々の場合の特性に従って選択又は決定す
ることが出来る。
は、用いる微生物の属の特性によって変化する。出発物
質であるＤ-ソルビトールの量接種する一方の微生物の
量と他方の微生物の量との比率及び接種時期及び培養の
他の条件は、各々の場合の特性に従って選択又は決定す
ることが出来る。
【００２７】培地中の出発物質であるＤ-ソルビトール
の濃度は、用いる微生物の属の特性などに応じて種々変
えてもよい。Ｄ-ソルビトールは、培養開始時に直ちに
又は培養期間中分けて加えてもよい。本方法において、
Ｄ-ソルビトールを分けて加えることがより好ましい。
合計約２０から２５０g／lのＤ-ソルビトール濃度を一
般的に用い、より好ましくは、合計で約５０から２００
g／l濃度である。
の濃度は、用いる微生物の属の特性などに応じて種々変
えてもよい。Ｄ-ソルビトールは、培養開始時に直ちに
又は培養期間中分けて加えてもよい。本方法において、
Ｄ-ソルビトールを分けて加えることがより好ましい。
合計約２０から２５０g／lのＤ-ソルビトール濃度を一
般的に用い、より好ましくは、合計で約５０から２００
g／l濃度である。
【００２８】培養温度は、約１３から３６℃、好ましく
は１８から３３℃及び培地のpＨ値は約４.０から９.０
好ましくは約６.０から８.０に維持してもよいが、培養
条件は、用いる微生物の種及び属の性質によって変化
し、培地の組成は、もちろん最も高収率に生産するため
に各々の特性に合わせて選択又は決定してもよい。通常
は２０ないし８０時間の培養時間で十分であり、培地中
の目的とする生産物の生成はその期間内で最大値に達す
る。
は１８から３３℃及び培地のpＨ値は約４.０から９.０
好ましくは約６.０から８.０に維持してもよいが、培養
条件は、用いる微生物の種及び属の性質によって変化
し、培地の組成は、もちろん最も高収率に生産するため
に各々の特性に合わせて選択又は決定してもよい。通常
は２０ないし８０時間の培養時間で十分であり、培地中
の目的とする生産物の生成はその期間内で最大値に達す
る。
【００２９】酵素活性にとって最も適した培地中のpＨ
値を維持するために、適当な酸又は塩基試薬を培養期間
中の適当な時期に、適量を培地に加えてもよい。同様な
目的は培養の初期に適切な緩衝液又は、緩衝薬を最初に
混合することによって達成される。
値を維持するために、適当な酸又は塩基試薬を培養期間
中の適当な時期に、適量を培地に加えてもよい。同様な
目的は培養の初期に適切な緩衝液又は、緩衝薬を最初に
混合することによって達成される。
【００３０】培地中にかくして生産された２-ケト-Ｌ-
グロン酸をそれ自体既知の方法で分離及び精製すること
が出来、また例えばナトリウム、カリウム、カルシウ
ム、アンモニウムなどの塩として分離することが出来
る。この塩は、それ自体既知の方法で遊離の酸に変換す
ることが出来る。
グロン酸をそれ自体既知の方法で分離及び精製すること
が出来、また例えばナトリウム、カリウム、カルシウ
ム、アンモニウムなどの塩として分離することが出来
る。この塩は、それ自体既知の方法で遊離の酸に変換す
ることが出来る。
【００３１】分離は、次に示す様な方法、例えば塩の形
成又は溶媒間の溶解性、吸収性及び分配係数などの生成
物と周囲不純物間の性質の違いなどのいずれか適切な組
合せ又はそのくり返しによって行うことができる。例え
ばイオン交換樹上の吸着は、生成物を単離するのに便利
な方法を構成する。かくして得られた生成物は、例えば
再結晶又はクロマトグラフイーなどの簡便な方法によっ
て更に精製することが出来る。
成又は溶媒間の溶解性、吸収性及び分配係数などの生成
物と周囲不純物間の性質の違いなどのいずれか適切な組
合せ又はそのくり返しによって行うことができる。例え
ばイオン交換樹上の吸着は、生成物を単離するのに便利
な方法を構成する。かくして得られた生成物は、例えば
再結晶又はクロマトグラフイーなどの簡便な方法によっ
て更に精製することが出来る。
【００３２】本新規な製造方法によって蓄積せしめられ
た２-ケト-Ｌ-グロン酸は、例えば、次の様な方法によ
り容易に単離されうる。すなわち、遠心分離した後に得
られる培養物の上清を、減圧下で濃縮する。この濃縮物
に、例えばエタノールの様な有機溶媒を加えて得られる
２-ケト-Ｌ-グロン酸の結晶を、例えばナトリウム塩あ
るいはカルシウム塩の様な塩の形で分離する。上記した
方法または他の公知の方法を用いることにより、２-ケ
ト-Ｌ-グロン酸は常に容易に単離しうる。
た２-ケト-Ｌ-グロン酸は、例えば、次の様な方法によ
り容易に単離されうる。すなわち、遠心分離した後に得
られる培養物の上清を、減圧下で濃縮する。この濃縮物
に、例えばエタノールの様な有機溶媒を加えて得られる
２-ケト-Ｌ-グロン酸の結晶を、例えばナトリウム塩あ
るいはカルシウム塩の様な塩の形で分離する。上記した
方法または他の公知の方法を用いることにより、２-ケ
ト-Ｌ-グロン酸は常に容易に単離しうる。
【００３３】この様にして得られた２-ケト-Ｌ-グロン
酸あるいはその塩は、エステル化に続きエノール化そし
てラクトン化により、直接Ｌ-アスコルビン酸への変換
に用いる事が可能である。
酸あるいはその塩は、エステル化に続きエノール化そし
てラクトン化により、直接Ｌ-アスコルビン酸への変換
に用いる事が可能である。
【００３４】使用する事が可能な培養方法としては、静
置培養、振盪培養、深部通気撹拌培養が上げられる。大
量培養の場合、回分法、遂時添加培養法、連続培養法を
用いた、深部通気撹拌培養法が好ましい。セルロース担
体、セラミック担体、ガラスビーズ担体の様な物質に吸
着させる方法や、格子構造を持つゲル状物質、たとえ
ば、寒天、アルギン酸カルシウム、κ-カラギーナンや
公知のポリマーに抱括する方法により、微生物（Ａ）や
（Ｂ）の固定化菌体を用いる事も可能である。この方法
は、それらの微生物をくり返し使用することを可能にす
る。
置培養、振盪培養、深部通気撹拌培養が上げられる。大
量培養の場合、回分法、遂時添加培養法、連続培養法を
用いた、深部通気撹拌培養法が好ましい。セルロース担
体、セラミック担体、ガラスビーズ担体の様な物質に吸
着させる方法や、格子構造を持つゲル状物質、たとえ
ば、寒天、アルギン酸カルシウム、κ-カラギーナンや
公知のポリマーに抱括する方法により、微生物（Ａ）や
（Ｂ）の固定化菌体を用いる事も可能である。この方法
は、それらの微生物をくり返し使用することを可能にす
る。
【００３５】以下、実施例により本発明をさらに具体的
に説明する。
に説明する。
【００３６】
【実施例】実施例１ ＤＳＭ Ｎo．４０２５株は、微生物（Ｂ）を意味し、
一方表１に示されている微生物を微生物（Ａ）として用
いた。
一方表１に示されている微生物を微生物（Ａ）として用
いた。
【００３７】種母培養の調製 種母培養は、下に示す様な２種類の異なった方法で調製
した。
した。
【００３８】方法１：試験管（１８mm×２００mm）に、
Ｄ-ソルビトール２％、酵母エキス（オリエンタル酵
母）０.３％、肉エキス０.３％、コーンステイープリカ
ー０.３％、ポリペプトン１.０％、尿素０.１％、リン
酸一カリウム０.１％、硫酸マグネシウム・７水和物０.
０２％、炭酸カルシウム０.１％（殺菌前、pＨ７.０）
を含む培地（ＳＣＭ）５mlを分注し、１２１℃で２０分
間殺菌した。その試験管に一白金耳の微生物（Ａ）と微
生物（Ｂ）を植菌し、３０℃で１日振盪培養（２２０rp
m）した。
Ｄ-ソルビトール２％、酵母エキス（オリエンタル酵
母）０.３％、肉エキス０.３％、コーンステイープリカ
ー０.３％、ポリペプトン１.０％、尿素０.１％、リン
酸一カリウム０.１％、硫酸マグネシウム・７水和物０.
０２％、炭酸カルシウム０.１％（殺菌前、pＨ７.０）
を含む培地（ＳＣＭ）５mlを分注し、１２１℃で２０分
間殺菌した。その試験管に一白金耳の微生物（Ａ）と微
生物（Ｂ）を植菌し、３０℃で１日振盪培養（２２０rp
m）した。
【００３９】方法２：ＳＣＭ５mlを含む試験管（１８mm
×２００mm）に、一白金耳ずつの微生物（Ｂ）と微生物
（Ａ）を同時に植菌し、３０℃で１日振盪培養した。そ
の培養液一滴を２％寒天を含むＳＣＭに塗布し、３０℃
で４日間溶媒した。混合菌として、その寒天培地上に生
育した微生物を直接、次の様な液体培地に植菌するため
に用いた。ＳＣＭ５mlを含む試験管に、上で述べた様な
混合菌一白金耳を植菌し、３０℃で１日振盪培養（２２
０rpm）した。
×２００mm）に、一白金耳ずつの微生物（Ｂ）と微生物
（Ａ）を同時に植菌し、３０℃で１日振盪培養した。そ
の培養液一滴を２％寒天を含むＳＣＭに塗布し、３０℃
で４日間溶媒した。混合菌として、その寒天培地上に生
育した微生物を直接、次の様な液体培地に植菌するため
に用いた。ＳＣＭ５mlを含む試験管に、上で述べた様な
混合菌一白金耳を植菌し、３０℃で１日振盪培養（２２
０rpm）した。
【００４０】本培養 上記の方法で得られたそれぞれの種母培養物５mlを、Ｄ
-ソルビトール８％、コーンステイープリカー１％、尿
素１.５％（別殺菌）、リン酸-カリウム０.１％、硫酸
マグネシウム・７水和物０.０１％、炭酸カルシウム０.
６％、消泡剤０.１％（殺菌前pＨ７.０）から成る生産
培地（ＰＭ）５０mlを含むエルレンマイヤーフラスコ５
００ml容に植菌し、３０℃で４日間振盪培養（１８０rp
m）した。表１は、高速液体クロマトグラフイーによる
培養液中に含まれる２-ケト-Ｌ-グロン酸の定量結果を
示している。
-ソルビトール８％、コーンステイープリカー１％、尿
素１.５％（別殺菌）、リン酸-カリウム０.１％、硫酸
マグネシウム・７水和物０.０１％、炭酸カルシウム０.
６％、消泡剤０.１％（殺菌前pＨ７.０）から成る生産
培地（ＰＭ）５０mlを含むエルレンマイヤーフラスコ５
００ml容に植菌し、３０℃で４日間振盪培養（１８０rp
m）した。表１は、高速液体クロマトグラフイーによる
培養液中に含まれる２-ケト-Ｌ-グロン酸の定量結果を
示している。
【００４１】
【表１】
【００４２】実施例２ グルコノバクター・サブオキシダンス ＩＦＯ ３２５
５と、ＤＳＭ Ｎo.４０２５株との種母培養は、実施例
１の方法１に述べた方法と同じ方法で調製した。グルコ
ノバクター・サブオキシダンス ＩＦＯ ３２５５と、
ＤＳＭ Ｎo.４０２５株の種母培養液中の生育菌体濃度
は、各々、３.７×１０10個／mlと、５.４×１０8個／m
lであった。その各々の種母培養物は、５０mlのＰＭを
含む５００ml容エルレンマイヤーフラスコに合計１０％
（容量／容量）の植菌量で植え、グルコノバクター・サ
ブオキシダンス ＩＦＯ ３２５５とＤＳＭ Ｎo.４０
２５株の間の植菌量の比率は、０対１０、１対９、２対
８、３対７、４対６、５対５、６対４、７対３、８対
２、９対１、１０対０に調製した。それらのフラスコは
３０℃で４日間培養した。その結果は表２に示す。ＤＳ
Ｍ４０２５株とグルコノバクター・サブオキシダンス
ＩＦＯ ３２５５の間の植菌比が１対９と、４対６の範
囲にある時には、２-ケト-Ｄ-グルコン酸の蓄積が認め
られずに、８０g／lのＤ-ソルビトールから６３.９g／l
から６６.６g／lの範囲で、２-ケト-Ｌ-グロン酸（変換
率：７４.９〜７８.１モル％）が生産された。
５と、ＤＳＭ Ｎo.４０２５株との種母培養は、実施例
１の方法１に述べた方法と同じ方法で調製した。グルコ
ノバクター・サブオキシダンス ＩＦＯ ３２５５と、
ＤＳＭ Ｎo.４０２５株の種母培養液中の生育菌体濃度
は、各々、３.７×１０10個／mlと、５.４×１０8個／m
lであった。その各々の種母培養物は、５０mlのＰＭを
含む５００ml容エルレンマイヤーフラスコに合計１０％
（容量／容量）の植菌量で植え、グルコノバクター・サ
ブオキシダンス ＩＦＯ ３２５５とＤＳＭ Ｎo.４０
２５株の間の植菌量の比率は、０対１０、１対９、２対
８、３対７、４対６、５対５、６対４、７対３、８対
２、９対１、１０対０に調製した。それらのフラスコは
３０℃で４日間培養した。その結果は表２に示す。ＤＳ
Ｍ４０２５株とグルコノバクター・サブオキシダンス
ＩＦＯ ３２５５の間の植菌比が１対９と、４対６の範
囲にある時には、２-ケト-Ｄ-グルコン酸の蓄積が認め
られずに、８０g／lのＤ-ソルビトールから６３.９g／l
から６６.６g／lの範囲で、２-ケト-Ｌ-グロン酸（変換
率：７４.９〜７８.１モル％）が生産された。
【００４３】
【表２】
【００４４】実施例３ グルコノバクター・サブオキシダンス ＩＦＯ ３２５
５とグルコノバクター・グルコニカス ＩＦＯ ３２８
５を微生物（Ａ）として用い、ＤＳＭ Ｎo.４０２５株
を微生物（Ｂ）として用いた。実施例１に述べた方法２
と同じ方法で、各々の種母培養物（２００ml）を調製し
た。各々の種母培養物（２００ml）は、１２１℃で２０
分間殺菌された約１.７Ｌの発酵培地：Ｄ-ソルビトール
８％または１０％または１２％、酵母エキス０.５％、
コーンステイープリカー２.５％、硫酸マグネシウム・
７水和物０.００８６％、尿素０.０８６％（別殺菌）、
リン酸一カリウム０.０８６％、消泡剤０.１５％を含む
３Ｌ容発酵槽に植菌した。植菌後、培養液量を殺菌水に
より、容量２Ｌに合わせた。発酵は、３０℃で撹拌数７
００rpm、通気量１.０ｌ／分で行なった。培養液のpＨ
は４Ｎ-炭酸ナトリウムで、７.０に維持した。その結果
を表３に示す。
５とグルコノバクター・グルコニカス ＩＦＯ ３２８
５を微生物（Ａ）として用い、ＤＳＭ Ｎo.４０２５株
を微生物（Ｂ）として用いた。実施例１に述べた方法２
と同じ方法で、各々の種母培養物（２００ml）を調製し
た。各々の種母培養物（２００ml）は、１２１℃で２０
分間殺菌された約１.７Ｌの発酵培地：Ｄ-ソルビトール
８％または１０％または１２％、酵母エキス０.５％、
コーンステイープリカー２.５％、硫酸マグネシウム・
７水和物０.００８６％、尿素０.０８６％（別殺菌）、
リン酸一カリウム０.０８６％、消泡剤０.１５％を含む
３Ｌ容発酵槽に植菌した。植菌後、培養液量を殺菌水に
より、容量２Ｌに合わせた。発酵は、３０℃で撹拌数７
００rpm、通気量１.０ｌ／分で行なった。培養液のpＨ
は４Ｎ-炭酸ナトリウムで、７.０に維持した。その結果
を表３に示す。
【００４５】
【表３】
【００４６】実施例４ 実施例３に記載した方法と同様に、グルコノバクター・
サブオキシダンス ＩＦＯ ３２５５と、ＤＳＭ４０２
５株との混合菌の種母培養物（２００ml）を８％Ｄ-ソ
ルビトールからなる発酵培地を含む３Ｌ容発酵槽に植菌
し、発酵液量を殺菌水で２Ｌに調製した。発酵は、実施
例３に記載した条件で開始した。別に、Ｄ-ソルビトー
ル１２０g、酵母エキス１０g、コーンステイープリカー
５０g、リン酸一カリウム０.１７２g、尿素１.７２g
（別殺菌）、消泡剤２.５gを含む３００mlの遂時添加用
培地の入った５００ml容の培地容器を用意した。発酵
中、本遂時添加用培地は、培養時間１２時間目から１８
時間目の間は、１５ml／時間の速度で、１８時間目から
２１時間目の間は、６０ml／時間の速度で、２１時間目
から２８時間目の間は、４.３ml／時間の速度でペリス
タルテイツクポンプを用い、連続的に発酵槽中に添加し
た。その結果、５１時間の培養で２２４gの２-ケト-Ｌ-
グロン酸が、２７６gのＤ-ソルビトールから変換収率７
６.１モル％で生産された。
サブオキシダンス ＩＦＯ ３２５５と、ＤＳＭ４０２
５株との混合菌の種母培養物（２００ml）を８％Ｄ-ソ
ルビトールからなる発酵培地を含む３Ｌ容発酵槽に植菌
し、発酵液量を殺菌水で２Ｌに調製した。発酵は、実施
例３に記載した条件で開始した。別に、Ｄ-ソルビトー
ル１２０g、酵母エキス１０g、コーンステイープリカー
５０g、リン酸一カリウム０.１７２g、尿素１.７２g
（別殺菌）、消泡剤２.５gを含む３００mlの遂時添加用
培地の入った５００ml容の培地容器を用意した。発酵
中、本遂時添加用培地は、培養時間１２時間目から１８
時間目の間は、１５ml／時間の速度で、１８時間目から
２１時間目の間は、６０ml／時間の速度で、２１時間目
から２８時間目の間は、４.３ml／時間の速度でペリス
タルテイツクポンプを用い、連続的に発酵槽中に添加し
た。その結果、５１時間の培養で２２４gの２-ケト-Ｌ-
グロン酸が、２７６gのＤ-ソルビトールから変換収率７
６.１モル％で生産された。
【００４７】実施例５ 一白金耳のグルコノバクター・サブオキシダンスＩＦＯ
３２５５を、１００mlのＳＣＭを含む５００ml容エルレ
ンマイヤーフラスコ中に植菌し、３０℃で１日培養し
た。その培養液１０mlを１００mlのＳＣＭを含む５００
ml容エルレンマイヤーフラスコに移し、３０℃で１日培
養した。総量１.５Ｌのグルコノバクター・サブオキシ
ダンスＩＦＯ３２５５の種母培養物を用意した。一方、
一白金耳のＤＳＭ Ｎo．４０２５株をＬ-ソルボース８
％、グリセロール０.０５％、尿素０.５％（別殺菌）、
コーンステイープリカー１.７５％、パン酵母（オリエ
ンタル酵母）５.０％、硫酸マグネシウム・７水和物０.
２５％、炭酸カルシウム１.５％、消泡剤０.１％（殺菌
前pＨ７.０）からなる１００mlの種母用培地を含む、５
００ml容のエルレンマイヤーフラスコに植菌し、３０℃
で１日振盪培養（１８０rpm）した。その培養液１０ml
を、上に述べたものと同一組成の培地１００mlに植菌
し、３０℃で１日培養した。この様にして、総量１.５
ＬのＤＳＭ Ｎo.４０２５株の種母培養物が得られた。
５０Ｌ容発酵槽に、Ｄ-ソルビトール８％、コーンステ
イープリカー０.５％、硫酸マグネシウム・７水和物０.
０１％、リン酸一カリウム０.０２５％、消泡剤０.１７
％を含む発酵培地２５Ｌを加え、１２１℃で３０分殺菌
した。両菌の種母培養液（１.５Ｌずつ）を、同時に植
菌し、総培養液量は殺菌水で３０Ｌに調整した。発酵
を、３０℃、撹拌数７００rpm、通気量２０Ｌ／minで行
った。培養液のpＨは、６.２５Ｎ-ＮaＯＨで７.０に維
持した。別に、Ｄ-ソルビトール１,８００g、コーンス
テイープリカー１５０g、硫酸マグネシウム・７水和物
１.２９g、リン酸一カリウム７.５g、消泡剤２５gを含
む４Ｌの遂時添加用培地を５Ｌ容の培地容器に用意し、
１２０℃で２０分殺菌した。培養１２時間後、遂時添加
用培地をペリスタルテイツクポンプを用いて１８時間、
２２２ml／時間の速度で連続的に発酵槽に供給した。培
養４５.５時間後、９３.５g／Ｌの２-ケト-Ｌ-グロン酸
を含む発酵液３６.８Ｌを得た。即ち、３,４４１gの２-
ケト-Ｌ-グロン酸が変換収率７６.８モル％で４,２００
gのＤ-ソルビトールから得られた。
３２５５を、１００mlのＳＣＭを含む５００ml容エルレ
ンマイヤーフラスコ中に植菌し、３０℃で１日培養し
た。その培養液１０mlを１００mlのＳＣＭを含む５００
ml容エルレンマイヤーフラスコに移し、３０℃で１日培
養した。総量１.５Ｌのグルコノバクター・サブオキシ
ダンスＩＦＯ３２５５の種母培養物を用意した。一方、
一白金耳のＤＳＭ Ｎo．４０２５株をＬ-ソルボース８
％、グリセロール０.０５％、尿素０.５％（別殺菌）、
コーンステイープリカー１.７５％、パン酵母（オリエ
ンタル酵母）５.０％、硫酸マグネシウム・７水和物０.
２５％、炭酸カルシウム１.５％、消泡剤０.１％（殺菌
前pＨ７.０）からなる１００mlの種母用培地を含む、５
００ml容のエルレンマイヤーフラスコに植菌し、３０℃
で１日振盪培養（１８０rpm）した。その培養液１０ml
を、上に述べたものと同一組成の培地１００mlに植菌
し、３０℃で１日培養した。この様にして、総量１.５
ＬのＤＳＭ Ｎo.４０２５株の種母培養物が得られた。
５０Ｌ容発酵槽に、Ｄ-ソルビトール８％、コーンステ
イープリカー０.５％、硫酸マグネシウム・７水和物０.
０１％、リン酸一カリウム０.０２５％、消泡剤０.１７
％を含む発酵培地２５Ｌを加え、１２１℃で３０分殺菌
した。両菌の種母培養液（１.５Ｌずつ）を、同時に植
菌し、総培養液量は殺菌水で３０Ｌに調整した。発酵
を、３０℃、撹拌数７００rpm、通気量２０Ｌ／minで行
った。培養液のpＨは、６.２５Ｎ-ＮaＯＨで７.０に維
持した。別に、Ｄ-ソルビトール１,８００g、コーンス
テイープリカー１５０g、硫酸マグネシウム・７水和物
１.２９g、リン酸一カリウム７.５g、消泡剤２５gを含
む４Ｌの遂時添加用培地を５Ｌ容の培地容器に用意し、
１２０℃で２０分殺菌した。培養１２時間後、遂時添加
用培地をペリスタルテイツクポンプを用いて１８時間、
２２２ml／時間の速度で連続的に発酵槽に供給した。培
養４５.５時間後、９３.５g／Ｌの２-ケト-Ｌ-グロン酸
を含む発酵液３６.８Ｌを得た。即ち、３,４４１gの２-
ケト-Ｌ-グロン酸が変換収率７６.８モル％で４,２００
gのＤ-ソルビトールから得られた。
【００４８】実施例６ 実施例５で得られた発酵液（３６.８Ｌ）を、菌体およ
びその他の沈澱物を除去するために遠心分離した。９
３.５g／Ｌの２-ケト-Ｌ-グロン酸を含む上清（２Ｌ）
は、減圧下４５℃で、約１リットルまで濃縮した。濃縮
中、白色の沈澱物が認められた。次に、その濃縮物に１
００mlのエタノールを加え、１０℃で一日放置した。か
くして得られた沈澱物を、濾過によって集め、少量の５
０％の冷エタノールで洗浄し、室温で減圧下乾燥した。
その結果、１３７.６gの２-ケト-Ｌ-グロン酸ナトリウ
ム・一水塩が一番結晶として得られ、その純度は９９.
１４％であった。その母液を約４００mlまで減圧下濃縮
し、１００mlのエタノールを加え、２４時間１０℃に放
置した。その結果、７１.９gの２-ケト-Ｌ-グロン酸ナ
トリウム・一水塩（純度：８５.０４％）が二番結晶と
して得られた。
びその他の沈澱物を除去するために遠心分離した。９
３.５g／Ｌの２-ケト-Ｌ-グロン酸を含む上清（２Ｌ）
は、減圧下４５℃で、約１リットルまで濃縮した。濃縮
中、白色の沈澱物が認められた。次に、その濃縮物に１
００mlのエタノールを加え、１０℃で一日放置した。か
くして得られた沈澱物を、濾過によって集め、少量の５
０％の冷エタノールで洗浄し、室温で減圧下乾燥した。
その結果、１３７.６gの２-ケト-Ｌ-グロン酸ナトリウ
ム・一水塩が一番結晶として得られ、その純度は９９.
１４％であった。その母液を約４００mlまで減圧下濃縮
し、１００mlのエタノールを加え、２４時間１０℃に放
置した。その結果、７１.９gの２-ケト-Ｌ-グロン酸ナ
トリウム・一水塩（純度：８５.０４％）が二番結晶と
して得られた。
【００４９】実施例７ 実施例６で得られた上清（０.５Ｌ）を、アンバーライ
トＩＲ-１２０（Ｈ-型）（ロームアンドハスカンパニー
（Ｒohm and Ｈass Ｃampany））に通し、減圧下に
濃縮した。この乾燥物（約５０g）に、４００mlのメタ
ノールと、０.５mlの９８％硫酸を加えた。その混合物
を９０℃で２時間熱した後、メタノールを除き、沈澱物
を少量のメタノールで洗浄し、乾燥させた。その乾燥沈
澱物を、１５０mlのメタノールに懸濁し、熱しながら１
０gのナトリウムメチラートを加え、還流した。冷却
後、得られた結晶は濾過して減圧下、乾燥させた。その
結果、３５.１gのＬ-アスコルビン酸ナトリウムが得ら
れた。
トＩＲ-１２０（Ｈ-型）（ロームアンドハスカンパニー
（Ｒohm and Ｈass Ｃampany））に通し、減圧下に
濃縮した。この乾燥物（約５０g）に、４００mlのメタ
ノールと、０.５mlの９８％硫酸を加えた。その混合物
を９０℃で２時間熱した後、メタノールを除き、沈澱物
を少量のメタノールで洗浄し、乾燥させた。その乾燥沈
澱物を、１５０mlのメタノールに懸濁し、熱しながら１
０gのナトリウムメチラートを加え、還流した。冷却
後、得られた結晶は濾過して減圧下、乾燥させた。その
結果、３５.１gのＬ-アスコルビン酸ナトリウムが得ら
れた。
【００５０】実施例８ 一白金耳のグルコノバクター・サブオキシダンスＩＦＯ
３２９１を、１００mlのＳＣＭを含む５００ml容のエル
レンマイヤーフラスコに植菌し、３０℃で１８時間培養
した。一方、一白金耳のＤＳＭ Ｎo．４０２５株を、
実施例５に記載した種母培養用培地１００mlを含む５０
０ml容エルレンマイヤーフラスコに植菌し、３０℃で２
２時間培養した。この様にして得られた培養物１０mlを
上で述べられたのと同様な培地１００mlを含む、５００
ml容のエルレンマイヤーフラスコに植菌し、３０℃で１
８時間培養した。３Ｌ容発酵槽に、１６０gのＤ-ソルビ
トール、１０gのコーンステープリカー、０.２gの硫酸
マグネシウム・７水和物、０.５gのリン酸一カリウム及
び２gの消泡剤を含む１.６Ｌの発酵培地を加え、１２１
℃で３０分殺菌した。
３２９１を、１００mlのＳＣＭを含む５００ml容のエル
レンマイヤーフラスコに植菌し、３０℃で１８時間培養
した。一方、一白金耳のＤＳＭ Ｎo．４０２５株を、
実施例５に記載した種母培養用培地１００mlを含む５０
０ml容エルレンマイヤーフラスコに植菌し、３０℃で２
２時間培養した。この様にして得られた培養物１０mlを
上で述べられたのと同様な培地１００mlを含む、５００
ml容のエルレンマイヤーフラスコに植菌し、３０℃で１
８時間培養した。３Ｌ容発酵槽に、１６０gのＤ-ソルビ
トール、１０gのコーンステープリカー、０.２gの硫酸
マグネシウム・７水和物、０.５gのリン酸一カリウム及
び２gの消泡剤を含む１.６Ｌの発酵培地を加え、１２１
℃で３０分殺菌した。
【００５１】上述された両菌の種母培養物（それぞれ１
００ml）を同時に植菌し、その全量は殺菌水の添加によ
り２Ｌに調製した。別に、１８０gのＤ-ソルビトール、
１０gのコーンステイープリカー、０.０８６gの硫酸マ
グネシウム・７水和物、０.２１５gのリン酸一カリウム
及び１gの消泡剤を含む３００mlの遂時添加用培地の入
った５００ml容の培地容器を１２１℃で３０分間殺菌し
た。発酵を通気量１.０Ｌ／minで行ない、培地はＮaＯ
ＨによりpＨ７.０に調製された。その他の発酵条件は表
４に示す。培養６.５時間後遂時添加用培地を１０時
間、３０ml／minの速度でペリスタルテイツクポンプに
より連続的に投入した。表４に示す様に、発酵を２８℃
撹拌速度８００rpmで実施した時に、３２２.７gの２-ケ
ト-Ｌ-グロン酸が、８９.０モル％の変換収率で３４０g
のＤ-ソルビトールから生産された。
００ml）を同時に植菌し、その全量は殺菌水の添加によ
り２Ｌに調製した。別に、１８０gのＤ-ソルビトール、
１０gのコーンステイープリカー、０.０８６gの硫酸マ
グネシウム・７水和物、０.２１５gのリン酸一カリウム
及び１gの消泡剤を含む３００mlの遂時添加用培地の入
った５００ml容の培地容器を１２１℃で３０分間殺菌し
た。発酵を通気量１.０Ｌ／minで行ない、培地はＮaＯ
ＨによりpＨ７.０に調製された。その他の発酵条件は表
４に示す。培養６.５時間後遂時添加用培地を１０時
間、３０ml／minの速度でペリスタルテイツクポンプに
より連続的に投入した。表４に示す様に、発酵を２８℃
撹拌速度８００rpmで実施した時に、３２２.７gの２-ケ
ト-Ｌ-グロン酸が、８９.０モル％の変換収率で３４０g
のＤ-ソルビトールから生産された。
【００５２】
【表４】
【００５３】本実施例中で用いられている菌株および菌
株の混合物についての、ブタペスト条約に基づく追加の
寄託が以下の通り１９９２年３月３０日は行われた。
株の混合物についての、ブタペスト条約に基づく追加の
寄託が以下の通り１９９２年３月３０日は行われた。
【００５４】 Ａ 単独培養 新寄託番号 ＤＳＭ Ｎo．４０２５株 ＦＥＲＭ ＢＰ-３８１２ Ｂ 混合微生物培養 寄託番号 ＤＳＭ Ｎo．４０２５株＋ ＦＥＲＭ ＢＰ-３８１５ グルコノバクター・サブオキシダンス ＩＦＯ３２５６ ＤＳＭ Ｎo．４０２５株＋ ＦＥＲＭ ＢＰ-３８１３ グルコノバクター・サブオキシダンス ＩＦＯ３２９１ ＤＳＭ Ｎo．４０２５株＋ ＦＥＲＭ ＢＰ-３８１４ グルコノバクター・サブオキシダンス ＩＦＯ３２５５
Claims (11)
- 【請求項１】 グルコノバクター（Ｇluconobacter）属
又はアセトバクター（Ａcetobacter）属に属し、Ｄ-ソ
ルビトールからＬ-ソルボースを生産する能力を有する
微生物（Ａ）と、Ｌ-ソルボースから２-ケト-Ｌ-グロン
酸を生産する能力を有し、かつＤＳＭ Ｎo．４０２５
株、その機能的同等物、継代培養物、突然変異株又は誘
導体の同定における特徴を有する微生物（Ｂ）との混合
微生物培養をＤ-ソルビトールを含む培地中で培養し、
該両微生物が全培養期間の少なくとも一時期培地中に共
存する様に混合培養を行ない、２-ケト-Ｌ-グロン酸又
はその塩を単離することを特徴とする２-ケト-Ｌ-グロ
ン酸又はその塩の製造方法。 - 【請求項２】 微生物（Ａ）が、グルコノバクター・サ
ブオキシダンス（Ｇluconobacter suboxydans）、グル
コノバクター・グルコニクス（Ｇluconobacter glucon
icus）、グルコノバクター・ルビギノサス（Ｇluconoba
cter rubiginosus）、グルコノバクター・アルビダス
（Ｇluconobacter albidus）、グルコノバクター・イ
ンダストリアス（Ｇluconobacter industrius）、グル
コノバクター・セリヌス（Ｇluconobacter cerinu
s）、グルコノバクター・ジアセトニクス（Ｇluconobac
ter diacetonicus）、グルコノバクター・ロセウス
（Ｇluconobacter roseus）、アセトバクター・アセチ
亜種オーレアンス（Ａcetobacteraceti subsp．orlean
s）、アセトバクター・リクエフアシエンス（Ａcetobac
ter liquefaciens）又はアセトバクター・アセチ亜種
キシリナム（Ａcetobacter aceti subsp．xylinum）
からなる群より選択される種類に属する一種であること
を特徴とする請求項１に記載の製造方法。 - 【請求項３】 微生物（Ａ）がグルコノバクター、好ま
しくはＩＦＯ３２５５、３２５６、３２５８、３２６
７、３２８５、３２９０、３２９１株のうちの一つであ
ることを特徴とする請求項１又は２に記載の製造方法。 - 【請求項４】 ＤＳＭ Ｎo．４０２５株、その機能的
同等物、継代培養物、突然変異株又は誘導体に相当する
微生物（Ｂ）を使用することを特徴とする請求項１、２
又は３に記載の製造方法。 - 【請求項５】 Ｄ-ソルビトールを約２０g／lないし２
５０g／lの濃度、好ましくは約５０g／lないし２００g
／lの濃度で用いることを特徴とする請求項１ないし４
のいずれか一つに記載の製造方法。 - 【請求項６】 培養をpＨ約４.０ないし９.０、好まし
くは約６.０ないし８.０の間で行なうことを特徴とする
請求項１ないし５のいずれか一つに記載の製造方法。 - 【請求項７】 培養を約１３ないし３６℃の温度、好ま
しくは約１８から３３℃の間で行なうことを特徴とする
請求項１から６のいずれか一つに記載の製造方法。 - 【請求項８】 ２-ケト-Ｌ-グロン酸をそれ自体既知の
方法でアスコルビン酸又はそれらの塩に変換させること
を特徴とする請求項１ないし７のいずれか一つに記載の
製造方法。 - 【請求項９】 グルコノバクター属、又はアセトバクタ
ー属に属し、Ｄ-ソルビトールからＬ-ソルボースを生産
する能力を有する微生物（Ａ）と、Ｌ-ソルボースから
２-ケト-Ｌ-グロン酸を生産する能力を有し、かつＤＳ
Ｍ Ｎo．４０２５株、その機能的同等物、継代培養
物、突然変異体又は誘導体の同定における特徴を有する
微生物（Ｂ）との混合微生物培養。 - 【請求項１０】 微生物（Ａ）がＩＦＯ ３２５５株、
ＩＦＯ ３２５６株またはＩＦＯ ３２９１株及びその
機能的同等物、継代培養物、突然変異株又は誘導体であ
ることを特徴とする請求項９に記載の微生物培養。 - 【請求項１１】 少くとも６０g／l、好ましくは少くと
も１２０g／l、更に好ましくは少くとも１３０g／lの収
量でＤ-ソルビトールから２-ケト-Ｌ-グロン酸を生産す
る能力を有することを特徴とする請求項９に記載の微生
物培養。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP91810451 | 1991-06-13 | ||
| CH91810451.4 | 1991-06-13 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05317062A true JPH05317062A (ja) | 1993-12-03 |
| JP3192487B2 JP3192487B2 (ja) | 2001-07-30 |
Family
ID=8208850
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP17499892A Expired - Fee Related JP3192487B2 (ja) | 1991-06-13 | 1992-06-10 | 発酵方法 |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5312741A (ja) |
| EP (1) | EP0518136B1 (ja) |
| JP (1) | JP3192487B2 (ja) |
| CN (2) | CN1052512C (ja) |
| AT (1) | ATE157400T1 (ja) |
| DE (1) | DE69221777T2 (ja) |
| DK (1) | DK0518136T3 (ja) |
| HR (1) | HRP930952B1 (ja) |
| RU (1) | RU2102481C1 (ja) |
| YU (1) | YU61392A (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| JP2000050892A (ja) * | 1998-07-17 | 2000-02-22 | F Hoffmann La Roche Ag | 連続発酵法 |
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|---|---|---|---|---|
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| US5437989A (en) * | 1992-12-30 | 1995-08-01 | Hoffmann-La Roche Inc. | Alcohol/aldehyde dehydrogenase from Gluconobacter oxydans DSM 4025 FERM BP-3812 |
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| EP0869175B1 (en) * | 1997-04-04 | 2011-03-09 | DSM IP Assets B.V. | Cytochrome C and its gene |
| EP0972843A1 (en) * | 1998-07-17 | 2000-01-19 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Continuous fermentation process |
| KR20010075047A (ko) | 1998-09-11 | 2001-08-09 | 추후제출 | 2-케토-엘-굴론산 제조용 박테리아 균주 |
| DE19907115A1 (de) * | 1999-02-19 | 2000-08-24 | Basf Ag | Verfahren zur Herstellung von L-Sorbose |
| US6204040B1 (en) | 1999-04-22 | 2001-03-20 | Korea Research Institute Of Bioscience And Biotechnology | Gluconobacter suboxydans sorbitol dehydrogenase, genes and methods of use thereof |
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| US7033824B2 (en) | 2000-04-05 | 2006-04-25 | Archer-Daniels-Midland Company | Ketogulonigenium shuttle vectors |
| US6387654B1 (en) | 2000-05-04 | 2002-05-14 | Archer-Daniels-Midland Company | Bacterial strains and fermentation processes for the production of 2-keto-l-gulonic acid |
| GB0119864D0 (en) * | 2001-08-15 | 2001-10-10 | Cerestar Holding Bv | Process for the manufacture of 2-keto-L-gulonic acid |
| CN100560728C (zh) * | 2002-09-27 | 2009-11-18 | 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 | 2-kga的生产方法 |
| JP4566000B2 (ja) | 2002-09-27 | 2010-10-20 | ディーエスエム アイピー アセッツ ビー．ブイ． | ビタミンｃを産生する方法 |
| JP4471841B2 (ja) * | 2002-09-27 | 2010-06-02 | ディーエスエム アイピー アセッツ ビー．ブイ． | 微生物によるビタミンｃの製造 |
| WO2004029262A2 (en) * | 2002-09-27 | 2004-04-08 | Dsm Ip Assets B.V. | Production of 2 - keto - l - gulonic acd |
| CN102757928B (zh) * | 2012-08-09 | 2014-04-16 | 山东天力药业有限公司 | 一种2-酮基-l-古龙酸高耐受型氧化葡糖酸杆菌及其在维生素c发酵生产中的应用 |
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1992
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