JPH0528108B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、生理活性物質の固定化方法に関す
る。更に詳しくは、試験管内壁面に生理活性物質
を固定化させ、それを臨床検査などの生医学分野
に有効に利用し得るようにする方法に関する。

〔従来の技術〕

従来から、各種の材料で作られた試験管の内壁
に、酵素、抗原、抗体などの生理活性物質を固定
化させ、それを簡易臨床検査器とする試みがなさ
れている。例えば、ガラス、シリコン、ポリスチ
レン樹脂製などの試験管の内壁に、有機シランと
架橋剤とを用いて生理活性物質を固定化する試み
がある。これらの場合には、固定化の前処理が２
段階であるため、操作が煩雑となるのを避けるこ
とができない。また、ポリアミド樹脂製の場合に
は、樹脂構造中のアミド結合をまずアミノ化さ
せ、次いでそこに架橋剤を結合させる方法がとら
れているが、この場合にも２段階処理であつて操
作が煩雑となる。

〔発明が解決しようとする問題点〕

本発明者は先に、生理活性物質固定化材、例え
ばフツ素樹脂成形品、ガラス成形品などの表面に
アルデヒド化合物またはイソシアネート化合物を
プラズマ重合させ、次いでそこに生理活性物質を
結合させる生理活性物質の固定化方法を提案して
いるが、（特願昭59−169030号（特開昭61−65569
号））、かかる固定化方法を各種材料で作られた試
験管に適用することにより、前述の如き操作上の
難点を克服して、生理活性物質を試験管の内壁面
上に有効に固定化させることができた。

〔問題点を解決するための手段〕および〔作用〕 従つて、本発明は生理活性物質の固定化方法に
係り、生理活性物質の固定化は、アルデヒデド化
合物またはイソシアネート化合物のモノマーガス
雰囲気を充満させた試験管内壁にプラズマを照射
し、試験管内壁面上にアルデヒド基またはイソシ
アネート基を形成させた後、これらの官能性基に
生理活性物質のアミノ基を反応させることにより
行われる。

生理活性物質固定化材としての試験管には、ガ
ラス、シリコン、ポリスチレン樹脂、ポリプロピ
レン樹脂、ポリアミド樹脂など各種の材料から作
られたものがいずれも用いられる。プラズマ処理
に際しては、試験管の外壁部分にはテープなどを
巻き付けてマスキングしておき、例えば第１図に
示されるようなプラズマ反応装置を用いて、次の
ようにしてモノマーであるアルデヒド化合物また
はイソシアネート化合物のプラズマ重合反応が行
われる。

まず、真空ポンプ１、リークバルブ２およびメ
インバルブ３に接続され、真空計４を備えたプラ
ズマ反応容器５内に、上記の外壁マスキング試験
管６を収容し、反応容器内の圧力を約0.001〜
10Torrとした後バルブ７を開き、反応容器内に
タンク８からモノマーガスを約0.01〜5Torrの圧
力になる迄導入する。この際、アルデヒド化合物
などモノマーが水溶液として用いられる場合に
は、このタンクをドライヤーなどの加熱手段（図
示せず）で加熱しながら減圧化させる。

このようにして試験管内壁側にモノマーガス雰
囲気を充満させたら、高周波発生装置（13.56M
Hz）９およびマツチングユニツト１０からなる高
周波電源を用いて、有効電力約50〜70W、グロー
放電時間約１〜30分間の条件下で、発振コイル１
１からプラズマ照射する。

反応容器としては、チユーブ状あるいはベルジ
ヤー型のいずれをも用いることができ、また放電
電極としては、コイル状のもの以外に、外部もし
くは内部平行電極板を用いることもできる。

プラズマ重合モノマーとしてのアルデヒド化合
物としては、例えばグルタルアルデヒド、ホルム
アルデヒド、アセトアルデヒドなどが用いられ、
またイソシアネート化合物としては、例えばトル
エンジイソシアネート、４，4′−ジフエニルメタ
ンジイソシアネート、バイトリレンジイソシアネ
ート、１，５−ナフタレンジイソシアネートなど
が用いられる。

これらのモノマーは、そのままの状態あるいは
水溶液などの状態で用いられ、中には沸点の高い
化合物もみられるが、前記した如きプラズマ反応
容器内の減圧度によつて、また更に約40〜100℃
に適宜加熱することによつて、ガス状の雰囲気と
してプラズマ反応に供せられる。

このようにしてプラズマ重合処理され、その表
面にアルデヒド基またはイソシアネート基である
官能性基を形成させた試験管は、その中に濃度が
約0.01〜10mg／mlに調整された生理活性物質の溶
液、一般には緩衝溶液を加え、生理活性物質のア
ミノ基との反応をそこで行ない、−CH＝Ｎ−ま
たは−NHCONH−結合を形成させて固定化させ
る。

この反応は、約４〜40℃の温度で約10分間〜24
時間程度行われ、反応終了後に反応に用いた緩衝
液で洗浄し、更に0.1Mグリシン水溶液などを用
いて未反応官能性基のアミノ基によるブロツキン
グが行われる。なお、用いられる緩衝液の組成や
PHは、生理活性物質の種類によつて異なる。

固定化される生理活性物質としては、酵素、抗
原、抗体などが挙げられる。

酵素としては、例えば尿素窒素定量用としての
ウレアーゼ、クレアチニン用としてのクレアチニ
ンデイミナーゼ、クレアチニンアミドヒドロラー
ゼ、ぶどう糖用としてのグルコースオキシダー
ゼ、パーオキシダーゼ、ヘキソキナーゼ、カタラ
ーゼ、Ｇ−６−Ｐデヒドロゲナーゼ、アンモニア
用としてのグルタメートデヒドロゲナーゼ、尿酸
用としてのウリカーゼ、コレステロール用として
のコレステロールオキシダーゼ、コレステロール
エステルヒドロラーゼ、リン脂質用としてのアデ
ノシントリフオスフアターゼ、アルカリホスフア
ターゼ、ホスホリパーゼＣなどが挙げられる。ま
た、抗原、抗体としては、ホルモン、たん白質な
どの抗原およびそれらに対する抗体、各種の免疫
グロブリンなどが例示される。

〔発明の効果〕

本発明方法による官能性基含有モノマーのプラ
ズマ処理により、試験管内壁面への生理活性物質
固定化のための前処理工程は１段階で済み、その
固定化工程がより容易化された。しかも、その固
定化手段は共有結合によつているため、固定化力
も強固なものとなつている。

従つて、このようにして生理活性物質をその内
壁面に固定化させた試験管は、臨床検査用などに
有効に使用することができる。

〔実施例〕

次に、実施例について本発明を説明する。

実施例 図示された態様に従つて、プラズマ処理が行わ
れた。用いられたガラス製試験管は、外壁部分を
ビニルテープでマスキングし、プラズマ反応容器
内に設置した。モノマータンクには、50％グルタ
ルアルデヒド水溶液５mlを入れておき、タンクを
ドライヤーで約80〜90℃に加熱しながら、プラズ
マ反応容器内の真空度を0.1Torrとし、試験管内
壁側にグルタルアルデヒドモノマーガス雰囲気を
充満させた。この段階で、13.56MHzの高周波を
発振させ、反応容器内にプラズマを発生させた。
このときの条件は、電力60W、照射時間25分間で
ある。照射終了後、試験管をプラズマ反応容器か
らとり出し、マスキングテープを剥した後、空気
中に１時間放置してから蒸留水で洗浄した。

このプラズマ処理試験管の半分程度の高さ迄、
ウレアーゼ酵素（シグマ社製品EC3.5.1.5）の１
mg／ml溶液（PH7.0）を管中に注ぎ、４℃で24時
間反応させた。その後、液を除去した試験管を
0.1Mグリシン溶液（PH7.0）で洗浄して、未反応
のアルデヒド基をアミノ基でブロツキングした。

このようにしてガラス製試験管の内壁面に固定
化されたウレアーゼ酵素の酵素活性を、インドフ
エノール法を用いて測定したところ、その活性の
存在が確認された。即ち、測定試薬に和光純薬製
品Urea NB−Test Wakoを用い、尿素0.01mgを
リン酸緩衝液（PH7.0、ニトロプルシドナトリウ
ムおよびサリチル酸ナトリウムを含む）２ml中に
溶解してその溶液をウレアーゼ酵素固定化試験管
中に入れ、37℃で15分間放置後次亜鉛素酸ナトリ
ウムを含む発色液２mlを加え、更に10分間この温
度で放置した。試験管から反応液をとり出し、吸
光光度計で波長570nｍの吸光度を測定したとこ
ろ、0.289の値を示した。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明で用いられるプラズマ反応装
置の一態様を示す概略図である。 （符号の説明）、５……プラズマ反応容器、６
……試験管、８……モノマータンク、９……高周
波発生装置、１１……発振コイル。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ アルデヒド化合物またはイソシアネート化合
   物のモノマーガス雰囲気を充満させた試験管内壁
   にプラズマを照射し、試験管内壁面上にアルデヒ
   ド基またはイソシアネート基を形成させた後、こ
   れらの官能性基に生理活性物質のアミノ基を反応
   させることを特徴とする生理活性物質の固定化方
   法。 ２ 生理活性物質が酵素である特許請求の範囲第
   １項記載の生理活性物質の固定化方法。