JPH0318877B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、生物活性物質の固定化方法に関す
る。更に詳しくは、酵素、微生物などの生物活性
物質を樹脂成形品上に固形化する方法に関する。 従来から酵素、微生物などの生物活性物質を
種々の材料上に固定化し、例えばバイオセンサー
用膜、アフイニテイクロマトグラフイー、バイオ
リアクターなどの用途に用いることが行われてい
る。一方、やはり従来から人工血管、カテーテ
ル、人工臓器などの材料として用いられているポ
リテトラフルオロエチレンなどのフツ素樹脂に、
例えばウロキナーゼ酵素を固定すれば、生体材料
の問題点となつている抗血栓性の特性を付与する
ことができるなどの効果が期待される。即ち、耐
熱性、耐薬品性、酸素透過性などの性質ですぐれ
た特性を示すフツ素樹脂に、生物学的特性を更に
付加させることができれば、それの応用範囲は質
的にもまた量的にも飛躍的に拡大できることが期
待されるのである。 その一つの手段として、まずフツ素樹脂成形品
上にアミノ基を導入し、それを足掛りとして生物
活性物質をそこに固定させることが考えられる
が、元来含窒素基を有しない材料上に、通常の有
機合成反応によりアミノ基を導入するためには煩
雑な工程を必要とする。特にフツ素樹脂の如き材
料の場合には、そこにアミノ基を導入すること
は、有機合成反応によつてはほぼ不可能であり、
即ち例えばポリテトラフルオロエチレンでは、Ｃ
−Ｆ結合力が大きく、またＦ原子がＣ−Ｃ結合の
周囲を隈なく埋めていて、Ｃ−Ｆ結合に対する他
の原子や官能性基からの攻撃を防いでいるため、
アミノ基の導入は不可能である。従つて、アミノ
基を足掛りとして、そこに生物活性物質を固定化
させることも、当然不可能であつた。 本発明者は、有機合成反応に代る方法により、
フツ素樹脂成形品上にアミノ基を導入する方法に
ついて種々検討の結果、窒素ガス雰囲気下での低
温プラズマによりそこにアミノ基を結合させ、そ
れを足掛りとして生物活性物質を固定化させ得る
ことをここに身出した。 従つて、本発明は生物活性物質の固定化方法に
係り、この方法では、窒素ガス雰囲気下での低温
プラズマによりフツ素樹脂成形品表面にアミノ基
を結合させ、次いでこれをアミノ基と反応する多
官能性基を有する架橋剤と反応させた後、生物活
性物質溶液と接触させ、フツ素樹脂成形品上に生
物活性物質を固形化させることが行われる。 窒素ガス雰囲気下での低温プラズマ処理は、例
えば第１図にその概要が示されるような装置を用
いて行われる。即ち、真空ポンプ１、リークバル
ブ２およびメインバルブ３に接続され、真空計４
を備えたプラズマ反応器５内にフツ素樹脂成形品
６を収容し、反応器内を高真空にした状態で、窒
素ガスボンベ７からの窒素ガスを流量調節バルブ
８を通して反応器内に約0.01〜0.1Torrの圧力迄
導入し、高周波発生装置（13.56MHz）９および
マツチングユニツト１０よりなる、電力約40〜70
ワツトの高周波電源を用いて、約15〜60℃で約１
〜20分間プラズマ反応器内にグロー放電を生ぜし
めることにより、フツ素樹脂成形品上にアミノ基
を結合せしめる。 この低温プラズマ処理によるアミノ基の生成
は、赤外分光光度計を用い、アミノ基の特有吸収
である1600cm^-1付近の吸収度を測定することによ
り確認された。また、生成アミノ基の定量は、窒
素の元素分析により行われ、更にその最適処理条
件は、濡れ角を測定することにより求めることが
できる。 このようにして低温プラズマ処理により、その
表面にアミノ基を結合させたフツ素樹脂成形品
は、アミノ基と反応する多官能性基を有する架橋
剤と反応せしめる。かかる架橋剤としては、比較
的短かい構造を有する化合物が好ましく、具体的
には例えばグルタルアルデヒドなどのジアルデヒ
ド基含有化合物またはトルイレンジイソシアー
ト、４，4′−ジフエニルメタンジイソシアネー
ト、バイトリレンジイソシアネート、１，５−ナ
フタレンジイソシアネートなどのジイソシアネー
ト基含有化合物が用いられる。反応は、これらの
多官能性基含有化合物の溶液、一般には水溶液中
に一定時間プラズマ処理成形品を浸漬することに
より行われる。そして、アミノ基と次のように反
応するものと考えられる。 〜NH₂＋Ｒ（CHO）₂→ 〜Ｎ＝CHRCHO 〜NH₂＋R′（NCH）₂→ 〜NHCONHR′NCO これらの架橋剤反応物は、水洗後生物活性物質
の溶液、一般には水性溶液中に浸漬させるなどし
て接触させる。そして、次のように結合して、固
定化されるものと考えられる。 生物活性物質 〜Ｎ＝CHRCHO――――――――→ 〜Ｎ＝CHRCH＝Ｎ ｜ 生物活性物質 生物活性物質 〜NHCONHR′NCOH――――――――→ 〜NHCONHR′NHCON ｜ 生物活性物質 ここで、生物活性物質としては、酵素、微生物
などが用いられる。酵素としては、例えばグリコ
ースオキシダーゼ、アミノ酸オキシダーゼ、コレ
ステロールオキシダーゼ、ウリカーゼなどのオキ
シダーゼ類、ウリアーゼ、クレアキニナーゼ、グ
ルタミナーゼ、ペニシリナーゼ、カタラーゼ、パ
ーオキシダーゼ、インベルターゼ、ムタロター
ゼ、アミラーゼ、パパイン、トリプシンなどのプ
ロテアーゼ類、グリコースイソメラーゼ、ウロキ
ナーゼなどが挙げられる。また、微生物として
は、例えばシユードモナス・フルオレツセンス、
バチルス・ズブチリス、シユードモナス・エルギ
ノーサなどの細菌類、アスペルギルス・ニガー、
リゾプス・ホルモセンシスなどの糸状菌類、スト
レプトミセス・グリセウスなどの放線菌類、酵母
菌、かびなどが挙げられる。この他に、その構造
中にアミノ基を有するたん白質などの生物学的活
性を有する他の物質にも、本発明方法は適用され
る。 このようにして、本発明方法によつて膜状物、
球状物などのフツ素樹脂成形品上に固定させた生
物活性物質は、前述の既知の用途に用いられるば
かりではなく、抗血栓性人工血管、抗血栓性カテ
ーテル、抗血栓性人工臓器などにも、いずれも有
効に使用することができる。 次に、実施例について本発明を説明する。 実施例 １ 市販の酸素透過性ポリテトラフルオロエチレン
樹脂膜（厚さ0.03mm、島津製作所製XD−3Aを用
いたＸ線回析法による結晶化度81.2％）につい
て、第１図に示される低温プラズマ発生装置を用
い、窒素ガス圧力0.05Torr、電力40〜60W、時
間１〜９分間の条件下で、プラズマ処理を行なつ
た。 樹脂膜上に結合されるアミノ基を形成させるた
めの最適条件を決定するために、プラズマ処理膜
について、逆浸透水を用いた濡れ角の測定を行な
つた。これは、樹脂膜上にアミノ基が結合してい
れば親水性が増し、樹脂膜の表面張力が減少し、
濡れ角が小さくなるからである。25℃、１分間の
測定条件下での濡れ角の測定を、種々のプラズマ
処理条件下で得られた樹脂について行ない、その
結果を次の表に示した。

【表】 第２図のグラフは、30°〜80°の濡れ角を示す樹
脂膜を与えるプラズマ処理条件（電力および時
間）を等高線図として示したものである。 なお、濡れ角の測定と同様に、低温プラズマ処
理された樹脂膜の表面状態を走査型電子顕微鏡
（日立−明石製MSM−７）を用いて、10000倍に
拡大して観察したが、未処理樹脂膜のそれとの間
に違いはみられなかつた。 次に、プラズマ処理膜について、赤外分光光度
計（日立製作所製260−30を用いて、アミノ基の
定性試験を行なつた。上記表に示された処理膜
は、いずれも1600cm^-1にアミノ基特有の吸収を示
した。そして、その吸収度は、上記濡れ角のデー
ターに対応し、No.７のものが透過度が最も小さか
つた。 また、ケルダール窒素分析装置（三菱化成製
KN−13）を用いて、窒素の元素分析法によるア
ミノ基の定量を行なつた。それによると、上記No.
７のものは、ポリテトラフルオロエチレン40mg当
り0.04μｇのアミノ基が結合していることが判つ
た。 これらの試験結果から、アミノ基の結合が確認
されたポリテトラフルオロエチレン樹脂膜のNo.７
について、酵素の固定化操作が次の工程順を追つ
て行なわれた。即ち、こ樹脂膜を、トルイレンジ
イソシアネートを0.5％含有するｎ−ヘキサン溶
液中に５分間浸漬した後、逆浸透水で洗浄し、次
いで１mg／ml濃度のインベルダーゼ酵素（生化学
工業製品）の水溶液中に１時間浸漬した。その
後、水溶液から引き上げた膜をPH７のリン酸緩衝
液で十分洗浄した後、同じ緩衝液中に浸漬しなが
ら４℃で保存した。なお、リン酸緩衝液の調整に
はKH₂PO₄が用いられ、そのPHはNaOHで調整さ
れた。 固定化されたインベルターゼ量を、ゲルダール
窒素分析法で測定すると、ポリテトラフルオロエ
チレン40mg当り0.1μｇのインベルターゼが結合し
ていることが判つた。 このポリテトラフルオルエチレン樹脂膜上に固
定されたインベルターゼ酵素が活性を保持してい
るか否かを、基質としてしよ糖を用いた所定のネ
ルソン−ソモギイ法で測定した。この場合のイン
ベルターゼ酵素の作用は、次の如くである。 しよ糖＋水インベルターゼ ―――――――――→ ぶどう糖＋果糖 そして、生成したぶどう糖を発色させ、紫外お
よび可視吸光光度計（島津製作所製UV−190）
で750nｍの波長を測定することにより定量した。
その結果、非結合酵素の活性に対する相対的な活
性値は85％であつた。 この結果から、インベルターゼ酵素は、その活
性を殆んど損うことなく、ポリテトラフルオルエ
チレン樹脂膜上に固定されたことが確認された。 実施例 ２ 実施例１の酵素の固定化操作において、架橋剤
としてトルイレンジイソシアネートのｎ−ヘキサ
ン溶液の代りに５％グルタルアルデヒド水溶液が
用いられた。固定化されたインベルターゼの量
は、ポリテトラフルオロエチレン40mg当り0.07μ
ｇであり、また非結合酵素の活性値に対する相対
的な活性値は70.5％であつた。 実施例 ３ 実施例１において、インベルターゼ酵素の代り
に10mg／ml濃度の酵母（s.cerevisiae）水溶液を
用い、酵母の固定化が行なわれた。固定化された
酵母は、酸素消費を示し、活性を有していること
が確認された。 実施例 ４ 実施例２において、インベルターゼ酵素の代り
に、10mg／ml濃度の酵母（s.cerevisiae）水溶液
を用い、酵母の固定化が行なわれた（ただし、酵
母水溶液中への浸漬時間は５分間）。固定化され
た酵母は、酸素消費を示し、活性を有しているこ
とが確認された。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明で用いられる低温プラズマ処
理装置の概要を示すものである。また、第２図
は、プラズマ処理された樹脂膜に一定の濡れ角を
与えるプラズマ処理条件を等高線図として示した
ものである。 （符号の説明）、１……真空ポンプ、５……プ
ラズマ反応器、６……フツ素樹脂成形品、７……
窒素ボンベ、９……高周波発生装置。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 窒素ガス雰囲気下での低温プラズマによりフ
   ツ素樹脂成形品表面にアミノ基を結合させ、次い
   でこれをアミノ基と反応する多官能性基を有する
   架橋剤と反応させた後、生物活性物質溶液と接触
   させ、フツ素樹脂成形品上に生物活性物質を固定
   させることを特徴とする生物活性物質の固定化方
   法。 ２ フツ素樹脂成形品としてポリテトラフルオロ
   エチレン樹脂膜が用いられる特許請求の範囲第１
   項記載の生物活性物質の固定化方法。 ３ 生物活性物質が酵素である特許請求の範囲第
   １項記載の生物活性物質の固定化方法。 ４ 生物活性物質が微生物である特許請求の範囲
   第１項記載の生物活性物質の固定化方法。 ５ アミノ基反応性多官能性基含有架橋剤がジア
   ルデヒド基含有化合物である特許請求の範囲第１
   項、第３項または第４項記載の生物活性物質の固
   定化方法。 ６ アミノ基反応性多官能性基含有架橋剤がジイ
   ソシアネート基含有化合物である特許請求の範囲
   第１項、第３項または第４項記載の生物活性物質
   の固定化方法。