JPS6232884A - 生理活性物質の固定化方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、生理活性物質の固定化方法に関する。

更に詳しくは、試験管内壁面に生理活性物質を固定化さ
せ、それを臨床検査などの生医学分野に有効に利用し得
るようにする方法に関する。

〔従来の技術〕

従来から、各種の材料で作られた試験管の内壁に、酵素
、抗原、抗体などの生理活性物質を固定化させ、それを
簡易臨床検査器とする試みがなされている。例えば、ガ
ラス、シリコン、ポリスチレン樹脂製などの試験管の内
壁に、有機シランと架橋剤とを用いて生理活性物質を固
定化する試みがある。これらの場合には、固定化の前処
理が２段階であるため、操作が煩雑となるのを避けるこ
とができない。また、ポリアミド樹脂製の場合には、樹
脂構造中のアミド結合をまずアミノ化させ、次いでそこ
に架橋剤を結合させる方法がとられているが、この場合
にも２段階処理であって操作が煩雑となる。

〔発明が解決しようとする問題点〕

本発明者は先に、生理活性物質固定化材、例えばフッ素
樹脂成形品、ガラス成形品などの表面にアルデヒド化合
物またはイソシアネート化合物をプラズマ重合させ１次
いでそこに生理活性物質を結合させる生理活性物質の固
定化方法を提案しているが（特願昭５９−１６９０３０
号）、かかる固定化方法を各種材料で作られた試験管に
適用することにより、前述の如き操作上の難点を克服し
て、生理活性物質を試験管の内壁面上に有効に固定化さ
せることができた。

〔問題点を解決するための手段〕および〔作用〕従って
、本発明は生理活性物質の固定化方法に係り、生理活性
物質の固定化は、アルデヒド化合物またはイソシアネー
ト化合物のモノマーガス雰囲気を充満させた試験管内壁
にプラズマを照射し、試験管内壁面上にアルデヒド基ま
たはイソシアネート基を形成させた後、これらの官能性
基に生理活性物質のアミノ基を反応させることにより行
われる。

生理活性物質固定化材としての試験管には、ガラス、シ
リコン、ポリスチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ポリ
アミド樹脂など各種の材料から作られたものがいずれも
用いられる。プラズマ処理に際しては、試験管の外壁部
分にはテープなどを巻き付けてマスキングしておき１例
えば第１図に示されるようなプラズマ反応装置を用いて
、次のようにしてモノマーであるアルデヒド化合物また
はイソシアネート化合物のプラズマ重合反応が行われる
。

まず、真空ポンプ１．リークバルブ２およびメインバル
ブ３に接続され、真空計４を備えたプラズマ反応容器５
内に、上記の外壁マスキング試験管６を収容し、反応容
器内の圧力を約０．００１〜１０Ｔｏｒｒとした後バル
ブ７を開き、反応容器内にタンク８からモノマーガスを
約０．０１〜５　Ｔｏｒｒの圧力になる迄導入する。こ
の際、アルデヒド化合物などモノマーが水溶液として用
いられる場合には、このタンクをドライヤーなどの加熱
手段（図示せず）で加熱しながら減圧化させる。

このようにして試験管内壁側に七ツマーガス雰囲気を充
満させたら、高周波発生装置（１３，５６ＭＨｚ）９お
よびマツチングユニット１０からなる高周波電源を用い
て、有効電力約５０〜７０Ｗ、グロー放電時間約１〜３
０分間の条件下で１発振コイル１１からプラズマ照射す
る。

反応容器としては、チューブ状あるいはペルジャー型の
いずれをも用いることができ、また放電電極としては、
コイル状のもの以外に、外部もしくは内部平行電極板を
用いることもできる。

プラズマ重合モノマーとしてのアルデヒド化合物として
は、例えばグルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、ア
セトアルデヒドなどが用いられ、またイソシアネート化
合物としては、例えばトルエンジイソシアネート、　４
．４　’−ジフェニルメタンジイソシアネート、バイト
リレンジイソシアネート、１，５−ナフタレンジイソシ
アネートなどが用いられる。

これらのモノマーは、そのままの状態あるいは水溶液な
どの状態で用いられ、中には沸点の高い化合物もみられ
るが、前記した如きプラズマ反応容器内の減圧度によっ
て、また更に約４０〜１００℃に適宜加熱することによ
って、ガス状の雰囲気としてプラズマ反応に供せられる
。

このようにしてプラズマ重合処理され、その表面にアル
デヒド基またはイソシアネート基である官能性基を形成
させた試験管は、その中に濃度が約０．０１〜１０ｍｇ
／ｍ　Ｑに調整された生理活性物質の溶液、一般には緩
衝溶液を加え、生理活性物質のアミノ基との反応をそこ
で行ない、−ＣＨ＝Ｎ−または−ＮＨＣＯＮＨ−結合を
形成させて固定化させる。

この反応は、約４〜４０℃の温度で約１０分間〜２４時
間程度行われ、反応終了後に反応に用いた緩衝液で洗浄
し、更に０．１Ｍグリシン水溶液などを用いて未反応官
能性基のアミノ基によるブロッキングが行われる。なお
、用いられる緩衝液の組成やｐＨは、生理活性物質の種
類によって異なる。

固定化される生理活性物質としては、酵素、抗原、抗体
などが挙げられる。

酵素としては、例えば尿素窒素定量用としてのウレアー
ゼ、クレアチニン用としてのクレアチニンデイミナーゼ
、クレアチニンアミドヒドロラーゼ、ぶどう活用として
のグルコースオキシダーゼ、パーオキシダーゼ、ヘキソ
キナーゼ、カタラーゼ、Ｇ−６−Ｐデヒドロゲナーゼ、
アンモニア用としてのグルタメートデヒドロゲナーゼ、
尿酸用としてのウリカーゼ、コレステロール用としての
コレステロールオキシダーゼ、コレステロールエステル
ヒドロラーゼ、リン脂質用としてのアデノシン１−リフ
ォスファターゼ、アルカリホスファターゼ、ホスホリパ
ーゼＣなどが挙げられる。また、抗原、抗体としては、
ホルモン、たん白質などの抗原およびそれらに対する抗
体、各種の免疫グロブリンなどが例示される。

〔発明の効果〕

本発明方法による官能性基含有モノマーのプラズマ処理
により、試験管内壁面への生理活性物質固定化のための
前処理工程は１段階で済み、その固定化工程がより容易
化された。しかも、その固定化手段は共有結合によって
いるため、固定化力も強固なものとなっている。

従って、このようにして生理活性物質をその内壁面に固
定化させた試験管は、臨床検査用などに有効に使用する
ことができる。

〔実施例〕

次に、実施例について本発明を説明する。

実施例 図示された態様に従って、プラズマ処理が行われた。用
いられたガラス製試験管は、外壁部分をビニルテープで
マスキングし、プラズマ反応容器内に設置した。モノマ
ータンクには、５０％グルタルアルデヒド水溶液５ｍＡ
を入れておき、タンクをドライヤーで約８０〜９０℃に
加熱しながら、プラズマ反応容器内の真空度を０．　Ｉ
　Ｔｏｒｒとし、試験管内壁側にグルタルアルデヒドモ
ノマーガス雰囲気を充満させた。この段階で、１３．５
６Ｍ）ｌｚの高周波を発振させ、反応容器内にプラズマ
を発生させた。

このときの条件は、電力６０Ｗ、照射時間２５分間であ
る。照射終了後、試験管をプラズマ反応容器からとり出
し、マスキングテープを剥した後、空気中に１時間放置
してから蒸留水で洗浄した。

このプラズマ処理試験管の半分程度の高さ迄、ウレアー
ゼ酵素（シグマ社製品ＥＣ３，５，１，５）の１ｍｇ／
ｍ　ｆｌ溶液（ｐＨ７，０）を管中に注ぎ、４℃で２４
時間反応させた。その後、液を除去した試験管を０．１
Ｍグリシン溶液（ＰＨ７，０）で洗浄して、未反応のア
ルデヒド基をアミノ基でブロッキングした。

このようにしてガラス製試験管の内壁面に固定化された
ウレアーゼ酵素の酵素活性を、インドフェノール法を用
いて測定したところ、その活性の存在が確認された。即
ち、測定試薬に和光紬薬製品Ｕｒｅａ　ＮＢ−Ｔｅｓｔ
　Ｗａｋｏを用い、尿素０．０１ｍｇをリン酸緩衝液（
ＰＨ７，０、ニトロプルシドナトリウムおよびサリチル
酸ナトリウムを含む）２ｍＱ中に溶解してその溶液をウ
レアーゼ酵素固定化試験管中に入れ、３７℃で１５分間
放置後次亜塩素酸ナトリウムを含む発色液２ｍ１２を加
え、更に１０分間この温度で放置した。試験管から反応
液をとり出し、吸光光度計で波長５７０ｒ＋ｍの吸光度
を測定したところ、０．２８９の値を示した。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明で用いられるプラズマ反応装置の一態
様を示す概略図である。 （符号の説明） ５・・・・・プラズマ反応容器 ６・・・・・試験管 ８・・・・・モノマータンク ９・・・・・高周波発生装置 １１・・・・・発振コイル

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、アルデヒド化合物またはイソシアネート化合物のモ
   ノマーガス雰囲気を充満させた試験管内壁にプラズマを
   照射し、試験管内壁面上にアルデヒド基またはイソシア
   ネート基を形成させた後、これらの官能性基に生理活性
   物質のアミノ基を反応させることを特徴とする生理活性
   物質の固定化方法。 ２、生理活性物質が酵素である特許請求の範囲第１項記
   載の生理活性物質の固定化方法。