JPH05246838A - コラーゲン代謝賦活剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 硫酸塩、硝酸塩又はアンモニウム塩よりなる
群より選ばれた１種または２種以上を含有することを特
徴とするコラーゲン代謝賦活剤。 【効果】 ヒト正常線維芽細胞に作用し、病的あるいは
加齢等生理的に低下したコラゲナーゼ産生量を増強する
ことによりコラーゲン代謝を賦活する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は硫酸塩、硝酸塩又はアン
モニウム塩よりなる群より選ばれた１種または２種以上
を含有することを特徴とするコラーゲン代謝賦活剤に関
する。

【０００２】

【従来の技術】コラーゲンが異常に蓄積する疾病（肝お
よび肺線維症、ケロイド、肥厚性瘢痕および鞏皮症等）
では、コラーゲンの合成と分解のバランスが失われてい
ることが示唆されており、例えば肝硬変症に伴う肝線維
化はコラーゲン生合成増加やコラーゲン分解能の低下
［バイオケミカル ジャーナル(Biochemical Journal)
、118 巻、229 頁、1970年およびライフ サイエンシ
ス(Life Sciences) 、30巻、1379頁、1982年参照] によ
り生ずる。このうち、コラーゲン分解能の低下は、各組
織や皮膚線維芽細胞のコラゲナーゼ活性の低下によると
考えられており［皮膚、14巻、217 頁、1972年、ジャー
ナル オブ クリニカル インベスティゲイション (Jo
urnal of Clinical Investigation)、56巻、1175頁、19
75年およびライフ サイエンシス(Life Sciences) 、30
巻、1379頁、1982年参照] 、コラゲナーゼ活性の増強が
望まれている。

【０００３】一方、上記のような病態のみならず生理的
条件に於いても、老化に伴い皮膚コラーゲンの代謝回転
が低下することが知られており（現代化学、12月号、36
頁、1990年参照）、この様な場合も、コラーゲンの代謝
低下を防止するためにコラゲナーゼ活性の増強が望まれ
る［コネクティブ ティシュ(Connective Tissue) 、23
巻、 164頁、1992年参照] 。

【０００４】また、老化に伴い架橋コラーゲンの割合が
増すと共に、コラゲナーゼ分解に抵抗性を示すようにな
り［エイジング オブ ザ スキン(Aging of the Ski
n) 、121 頁、1989年、Raven Press 、New York] 、一
定量のコラーゲンを分解するためには、より多くのコラ
ゲナーゼが必要となる。

【０００５】コラゲナーゼは、結合組織中の間質型コラ
ーゲン（Ｉ型、II型、およびIII 型コラーゲン）を分解
する際の律速酵素であり、コラーゲンの代謝に重要な役
割を果たしている。コラゲナーゼは、前駆体であるプロ
コラゲナーゼとして細胞より分泌され、生体内ではその
後プラスミンやストロムライシン等のタンパク分解酵素
によってコラゲナーゼに活性化される［バイオケミカル
ジャーナル(Biochemical Journal) 、166 巻、21頁、
1977年及びプロシーディングス オブ ザ ナショナル
アカデミー オブ サイエンシス オブ ザ ユーエ
スエー(Proceedings of the National Academy of Scie
nces of the U.S.A.) 、86巻、2632頁、1989年参照] と
考えられているが、プロコラゲナーゼは一般的に得るこ
とが困難で、充分に研究が進んでいるとは言えず、その
産生制御や活性化機構等まだ未知の点が多い。

【０００６】以上のことから、コラーゲン代謝を賦活す
る為には、プロコラゲナーゼの産生を促進する物質が有
効と考えられる。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】従って本発明の目的と
するところは、組織への浸透性に有利な低分子物質より
なる、病的あるいは生理的に低下したコラーゲン代謝の
賦活剤を提供するにある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】上述の目的は、硫酸塩、
硝酸塩又はアンモニウム塩よりなる群より選ばれた１種
または２種以上を含有することを特徴とするコラーゲン
代謝賦活剤によって達成される。

【０００９】本発明に於いて用いられる硫酸塩として
は、例えば硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸ア
ンモニウム又は硫酸カリウム等、硝酸塩としては、例え
ば硝酸カリウム、硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム
等、アンモニウム塩としては、例えば酢酸アンモニウ
ム、酒石酸アンモニウム等が挙げられる。

【００１０】硫酸ナトリウムは経皮吸収されることが報
告されており( 日本温泉気候学会雑誌、86巻、2632頁、
1989年参照）、本発明に於いて用いられる硫酸塩、硝酸
塩又はアンモニウム塩は低分子である為、皮膚線維芽細
胞の存在する真皮層（結合組織）への作用に有利であ
る。

【００１１】硫酸塩、硝酸塩又はアンモニウム塩は、そ
の使用目的に応じて、通常用いられる公知の成分に配合
することによって、液剤，固形剤，半固形剤等の各種剤
形のコラーゲン代謝賦活剤に調製することが可能で、好
ましい組成物として軟膏、ゲル、クリーム、スプレー
剤、貼付剤、ローション等が挙げられる。

【００１２】その例として、硫酸塩、硝酸塩又はアンモ
ニウム塩を、ワセリン、スクワラン等の炭化水素、ステ
アリルアルコール等の高級アルコール、ミリスチン酸イ
ソプロピル等の高級脂肪酸低級アルキルエステル、ラノ
リン等の動物性油脂、グリセリン、プロピレングリコー
ル等の多価アルコール、グリセリン脂肪酸エステル、モ
ノステアリン酸ポリエチレングリコール、ポリエチレン
アルキルエーテルリン酸等の界面活性剤、パラオキシ安
息香酸メチル、パラオキシ安息香酸ブチル等の防腐剤、
蝋、樹脂、各種香料、各種色素、クエン酸ナトリウム、
炭酸ナトリウム、乳酸等の各種無機塩や各種酸、水およ
びエタノールに混合することによって、本発明のコラー
ゲン代謝賦活剤を調製し、化粧品や医薬品を製造するこ
とができる。

【００１３】その際の硫酸塩、硝酸塩又はアンモニウム
塩の添加量は剤形により異なるが、適用する組成物全量
を基準として通常0.001 〜 2重量％、好ましくは0.06〜
1.2重量％含有することが望ましい。ただし、入浴剤の
ように、使用時に希釈されるものはさらに添加量を増や
すことが出来る。

【００１４】

【発明の効果】硫酸塩を、種々のヒト皮膚線維芽細胞の
培養系に添加すると、濃度依存的にプロコラゲナーゼの
産生量が促進される（後記試験例−１および２参照）。
又アンモニウム塩をヒト皮膚線維芽細胞の培養系に添加
すると、濃度依存的にプロコラゲナーゼの産生量が促進
される（後記試験例−３および４参照）。さらに硝酸塩
を、種々のヒト皮膚線維芽細胞の培養系に添加すると、
濃度依存的にプロコラゲナーゼの産生量が促進される
（後記試験例−５参照）。

【００１５】従って、本発明のコラーゲン代謝賦活剤
は、線維芽細胞に作用し、コラゲナーゼ活性を増強する
ことにより、病的あるいは生理的に低下したコラーゲン
の代謝を賦活することができる。

【００１６】

【実施例】以下、実施例、試験例によって、本発明を更
に詳細に説明する。尚、試験例において示したプロコラ
ゲナーゼ産生量は、３回測定した平均値に標準誤差を加
えた値である。

【００１７】実施例１（硫酸塩） 1M硫酸ナトリウム水溶液をポアーサイズが0.2 μｍのニ
トロセルロース膜（アドバンテック東洋製、DISMIC-25)
で濾過滅菌した。ＭＥＭ-0.6FBS 培地で希釈して 0、1
0、20、40、60、80mMの硫酸ナトリウムを含む培地とし
て、コラーゲン代謝賦活剤を調製した。なお、80mMは1.
1 重量％である。

【００１８】試験例−１ Minimum Essential Medium (大日本製薬社製、10-101)1
0.6gにそれぞれ終濃度として0.1 重量％ラクトアルブミ
ン酵素水解物（シグマ社製、l-9010) 、1 容量％Non Es
sential Amino Acid（大日本製薬社製、16-810) 、1mM
ピルビン酸ナトリウム（大日本製薬社製、16-820) 、1.
2 重量％炭酸水素ナトリウム、50mg/l硫酸ストレプトマ
イシンを添加し、蒸留水を加えて1lとした後、炭酸ガス
を吹き込んでpHを約７に調整した( 以下、ＭＥＭ培地と
略記する。）。

【００１９】ＭＥＭ培地にウシ胎仔血清(Irvine Scient
ific社製）を10容量％（以下、ＭＥＭ-10FBS培地と略記
する。）あるいは0.6 容量％（以下、ＭＥＭ-0.6FBS 培
地と略記する。）となるように加えた。

【００２０】白人女性皮膚由来の正常ヒト線維芽細胞株
[Detroit-551(ATCC CCL 110)] をＭＥＭ-10FBS培地にて
1Ｘ10⁵ 個/ml に調製し、３枚の６穴プレートに、各々
2ml播種して５％炭酸ガス、飽和水蒸気下、37℃で24時
間培養した。

【００２１】細胞播種24時間後、培養液を取り除き、Ｍ
ＥＭ-0.6FBS 培地で２回洗浄後、各濃度に調製した実施
例１の培地2ml に置換し、６日間同様に培養して培養上
清を得た。

【００２２】本発明に於いて用いられる硫酸塩のプロコ
ラゲナーゼ産生促進活性を調べるのに先立って、培養上
清中にプロコラゲナーゼと同時に産生されている、コラ
ゲナーゼインヒビター（蛋白質）の除去を行う。

【００２３】コラゲナーゼインヒビターの除去： 得ら
れた培養上清250 μｌに10mMトリス塩酸緩衝液〔４℃で
pH7.8 に調整、1mM 塩化カルシウム、0.05容量％Brij-3
5(ＩＣＩ社製ポリオキシエチレン(23)ラウリルエーテ
ル）を含む。〕を1.75ml加え、同緩衝液で平衡化した C
M-セファロースCL-6B ^TM（ファルマシア社製、ベッド容
量0.5ml)に供した。

【００２４】次に、125mM 食塩を含む同緩衝液0.5ml に
てインヒビターを除去（計４回、総量2ml)し、500mM 食
塩を含む同緩衝液0.5ml にてプロコラゲナーゼを回収
（計４回、総量2ml)した。

【００２５】プロコラゲナーゼ産生量の定量： 本実験
で用いた細胞では、産生されるコラゲナーゼはそのまま
では活性をもたないプロコラゲナーゼとして回収される
ので、プロコラゲナーゼ産生量は、トリプシンで活性化
して得られるコラゲナーゼ活性として定量した。トリプ
シンによる活性化法、およびフルオレッセインイソチオ
シアネートで標識されたＩ型コラーゲン（コスモバイオ
社製）を基質としたコラゲナーゼ活性の測定法は、永井
らの方法[ ジャパニーズ ジャーナル オブインフラメ
イション（Japanese Journal of Inflamation)、４巻、
123 頁、1984年参照] に準じた。

【００２６】なお１単位は、３５℃で１分間に１μｇの
Ｉ型コラーゲンを分解する酵素量を示す。

【００２７】得られた培養上清中のプロコラゲナーゼ量
を定量した結果を表１に示した。対照（無添加）が10.8
±0.1 単位／ｍｌであるのに対し、硫酸ナトリウム60mM
(0.9重量%)添加では、41.4±0.3 単位／ｍｌを示し、本
発明のコラーゲン代謝賦活剤が、プロコラゲナーゼの産
生を促進することが分かった。

【００２８】

【表１】

【００２９】実施例２（硫酸塩） 実施例１と同様に、0.5M硫酸カリウム、1M硫酸マグネシ
ウム、1M硫酸アンモニウムを0.2 μｍのニトロセルロー
ス膜（アドバンテック東洋製、DISMIC-25 ）で濾過滅菌
し、ＭＥＭ-0.6FBS 培地で希釈して、硫酸カリウム又は
硫酸マグネシウムを20mM(0.3重量%)、或いは硫酸アンモ
ニウムを 5mM(0.7重量%)含む培地としてコラーゲン代謝
賦活剤を調製した。

【００３０】試験例−２ 実施例２のコラーゲン代謝賦活剤を用いて試験例−１と
同様にしてプロコラゲナーゼ産生量を調べたところ、対
照（無添加）が 4.5±0.0 単位／ｍｌであるのに対し、
20mM硫酸カリウムを含む場合は 7.0±0.6 単位／ｍｌ、
20mM硫酸マグネシウムを含む場合は12.2±2.2 単位／ｍ
ｌ、5mM 硫酸アンモニウムを含む場合は8.9±1.7 単位
／ｍｌを示し、プロコラゲナーゼの産生が促進されるこ
とが分かった。

【００３１】実施例３（硫酸アンモニウム） 実施例１と同様にして硫酸アンモニウムを2mM,5mM,10mM
含む培地としてコラーゲン代謝賦活剤を調製した。

【００３２】試験例−３ 実施例３のコラーゲン代謝賦活剤を用いて試験例−１と
同様にしてプロコラゲナーゼ産生量を調べた結果を表２
に示した。対照（無添加）が22.5±2.8 単位／ｍｌであ
るのに対し、硫酸アンモニウム10mM添加では、43.9±5.
5 単位／ｍｌを示し、本発明のコラーゲン代謝賦活剤
が、プロコラゲナーゼの産生を促進することが分かっ
た。

【００３３】

【表２】

【００３４】実施例４（アンモニウム塩） 実施例１と同様にして、酢酸アンモニウム、酒石酸アン
モニウム、硝酸アンモニウムを、表３に示す濃度で含む
培地として、コラーゲン代謝賦活剤を調製した。

【００３５】試験例−４ 実施例４のコラーゲン代謝賦活剤を用いて試験例−１と
同様にしてプロコラゲナーゼ産生量を調べた結果を表３
に示した。対照（無添加）が21.6±5.0 単位／ｍｌであ
るのに対し、酢酸アンモニウム0.015 重量％添加では3
5.9±2.9 単位／ｍｌ、酒石酸アンモニウム0.018 重量
％添加では48.1±14.7単位／ｍｌ、硝酸アンモニウム0.
016 重量％添加では36.9±4.1 単位／ｍｌを示し、本発
明のコラーゲン代謝賦活剤が、プロコラゲナーゼの産生
を促進することが分かった。

【００３６】

【表３】

【００３７】実施例５（硝酸塩） 実施例１と同様にして、硝酸ナトリウムを表４に示す濃
度で含む培地として、コラーゲン代謝賦活剤を調製し
た。

【００３８】試験例−５ 実施例５のコラーゲン代謝賦活剤を用いて試験例−１と
同様にしてプロコラゲナーゼ産生量を調べた結果を表４
に示した。対照（無添加）が8.5 ±1.3 単位／ｍｌであ
るのに対し、硝酸ナトリウム80mM(0.7重量%)添加では1
7.9±5.2 単位／ｍｌを示し、本発明のコラーゲン代謝
賦活剤が、プロコラゲナーゼの産生を促進することが分
かった。

【００３９】

【表４】

【００４０】実施例６（硝酸塩） 実施例１と同様にして、硝酸カリウムを20mM含む培地と
して、コラーゲン代謝賦活剤を調製した。

【００４１】試験例−６ 実施例６のコラーゲン代謝賦活剤を用いて試験例−１と
同様にしてプロコラゲナーゼ産生量を調べた結果、対照
（無添加）が15.8±3.5 単位／ｍｌであるのに対し、硝
酸カリウム20mM(0.2重量％) を含む場合は19.5±2.7 単
位／ｍｌを示し、本発明のコラーゲン代謝賦活剤が、プ
ロコラゲナーゼの産生を促進することが分かった。

【００４２】実施例７（軟膏） 硫酸ナトリウム１ｇと下記親水性成分とを、湯浴で８０
℃に加温して混合し、これを、８０℃に加温した下記の
親油性成分混合物に攪拌しながら徐々に加えた。次に、
ホモジナイザー（TOKUSYUKIKA KOGYO 製）で２分半激し
く攪拌(2500rpm）して各成分を充分乳化分散させた後、
攪拌しながら徐々に冷却し、１００ｇ中に１重量％の硫
酸ナトリウムを含むコラーゲン代謝賦活剤としての軟膏
を得た。

【００４３】 「親水性成分」 パラオキシ安息香酸メチル ０. １ｇ プロピレングリコール ６. ７ｇ 精製水 ４３. １ｇ 「親油性成分」 スクワラン ４. ７ｇ 白色ワセリン ２４. ０ｇ ステアリルアルコール ８. ７ｇ ミリスチン酸イソプロピル ６. ０ｇ モノステアリン酸ポリエチレングリコール ［商品名NIKKOL MYS-45 、日本サーファクタント工業（株）製］１．３ｇ ポリエチレンアルキルエーテルリン酸 ［商品名NIKKOL DDP-2、日本サーファクタント工業（株）製］ ２．３ｇ モノステアリン酸グリセリン ２. ０ｇ パラオキシ安息香酸ブチル ０. １ｇ

【００４４】実施例８（軟膏） 硫酸ナトリウム１ｇに代えて、硝酸ナトリウム０．７ｇ
とし、又精製水を４３．４ｇとする以外は、実施例７と
同様にして、１００ｇ中に０．７重量％の硝酸ナトリウ
ムを含むコラーゲン代謝賦活剤としての軟膏を得た。

【００４５】実施例９（軟膏） 硫酸ナトリウム１ｇに代えて、酢酸アンモニウム０．０
８ｇとし、又精製水を４４．０ｇとする以外は、実施例
７と同様にして、１００ｇ中に０．０８重量％の酢酸ア
ンモニウムを含むコラーゲン代謝賦活剤としての軟膏を
得た。

【００４６】実施例１０（ローション） 硫酸ナトリウム０．５ｇと下記成分を混合し、コラーゲ
ン代謝賦活剤としてのローション１００ｇを得た。

【００４７】 エタノール １０. ０ｇ 乳酸 ０. ３ｇ クエン酸ナトリウム ０. １ｇ グリセリン ２. ０ｇ 防腐剤、香料および界面活性剤 適量 精製水 残量 ─────────────────────────── 計９９．５ｇ

【００４８】実施例１１（ローション） 硫酸ナトリウム０．５ｇに代えて、硝酸ナトリウム０．
５ｇを用いる以外は、実施例１０と同様にして、コラー
ゲン代謝賦活剤としてのローション１００ｇを得た。

【００４９】実施例１２（ローション） 硫酸ナトリウム０．５ｇに代えて、硫酸アンモニウム
０．１ｇを用いる以外は、実施例１０と同様にして、コ
ラーゲン代謝賦活剤としてローション１００ｇを得た。

【００５０】実施例１３（入浴剤） 硫酸ナトリウム５０ｇ及び硫酸アンモニウム３５ｇと下
記成分を混合し、コラーゲン代謝賦活剤としての入浴剤
１００ｇを得た。

【００５１】 香料 ０．１ｇ 有機色素 １０ ｍｇ 炭酸水素ナトリウム １４．９ｇ

【００５２】尚、この入浴剤は使用時に約3000倍に希釈
される。

【００５３】実施例１４（入浴剤） 硝酸ナトリウム８５ｇを用い、実施例１３と同様にして
コラーゲン代謝賦活剤としての入浴剤１００ｇを得た。

【００５４】尚、この入浴剤は使用時に約3000倍に希釈
される。

【００５５】実施例１５（入浴剤） 酒石酸アンモニウム８０ｇを用い、実施例１３と同様に
してコラーゲン代謝賦活剤としての入浴剤１００ｇを得
た。

【００５６】尚、この入浴剤は使用時に約8000倍に希釈
される。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 33/04 ＡＤＤ 8314−4Ｃ

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 硫酸塩、硝酸塩又はアンモニウム塩より
   なる群より選ばれた１種または２種以上を含有すること
   を特徴とするコラーゲン代謝賦活剤。