JP2574732B2 - コラーゲン代謝賦活剤 - Google Patents
コラーゲン代謝賦活剤Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は絹繊維より得られるコラ
ーゲン代謝賦活剤に関し、さらに詳しくは、分子量が５
００以下の絹繊維の硫酸加水分解物を含む、細胞のコラ
ゲナーゼ産生を促進するコラーゲン代謝賦活剤に関す
る。
ーゲン代謝賦活剤に関し、さらに詳しくは、分子量が５
００以下の絹繊維の硫酸加水分解物を含む、細胞のコラ
ゲナーゼ産生を促進するコラーゲン代謝賦活剤に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】コラーゲンが異常に蓄積する疾病（肝お
よび肺線維症、ケロイド、肥厚性瘢痕および鞏皮症等）
では、コラーゲンの合成と分解のバランスが失われてい
ることが示唆されており、例えば肝硬変症に伴う肝線維
化はコラーゲン生合成増加やコラーゲン分解能の低下(B
iochemical Journal 、118 巻、229 頁、1970年およびL
ife Sciences、30巻、1379頁、1982年参照）により生ず
る。このうち、コラーゲン分解能の低下は、各組織や皮
膚線維芽細胞のコラゲナーゼ活性の低下によると考えら
れており（皮膚、14巻、217頁、1972年、Journl of Cli
nical Invest-igation 、56巻、1175頁、1975年および
Life Sciences、30巻、1379頁、1982年参照）、コラゲ
ナーゼ活性の増強が望まれている。
よび肺線維症、ケロイド、肥厚性瘢痕および鞏皮症等）
では、コラーゲンの合成と分解のバランスが失われてい
ることが示唆されており、例えば肝硬変症に伴う肝線維
化はコラーゲン生合成増加やコラーゲン分解能の低下(B
iochemical Journal 、118 巻、229 頁、1970年およびL
ife Sciences、30巻、1379頁、1982年参照）により生ず
る。このうち、コラーゲン分解能の低下は、各組織や皮
膚線維芽細胞のコラゲナーゼ活性の低下によると考えら
れており（皮膚、14巻、217頁、1972年、Journl of Cli
nical Invest-igation 、56巻、1175頁、1975年および
Life Sciences、30巻、1379頁、1982年参照）、コラゲ
ナーゼ活性の増強が望まれている。
【０００３】一方、上記のような病態のみならず生理的
条件に於いても、老化に伴い皮膚コラーゲンの代謝回転
が低下することが知られており（現代化学、12月号、36
頁、1990年参照）、この様な場合も、コラーゲンの代謝
低下を防止するためにコラゲナーゼ活性の増強が望まれ
る。
条件に於いても、老化に伴い皮膚コラーゲンの代謝回転
が低下することが知られており（現代化学、12月号、36
頁、1990年参照）、この様な場合も、コラーゲンの代謝
低下を防止するためにコラゲナーゼ活性の増強が望まれ
る。
【０００４】また、老化に伴い架橋コラーゲンの割合が
増すと共に、コラゲナーゼ分解に抵抗性を示すようにな
り（Aging of the Skin 、121 頁、1989年、Raven Pres
s、New York）、一定量のコラーゲンを分解するために
は、より多くのコラゲナーゼが必要となる。
増すと共に、コラゲナーゼ分解に抵抗性を示すようにな
り（Aging of the Skin 、121 頁、1989年、Raven Pres
s、New York）、一定量のコラーゲンを分解するために
は、より多くのコラゲナーゼが必要となる。
【０００５】コラゲナーゼは、結合組織中の間質型コラ
ーゲン（Ｉ型、ＩＩ型、およびＩＩＩ型コラーゲン）を
分解する際の律速酵素であり、コラーゲンの代謝に重要
な役割を果たしている。コラゲナーゼは、前駆体である
プロコラゲナーゼとして細胞より分泌され、生体内では
その後プラスミンやストロムライシン等のタンパク分解
酵素によってコラゲナーゼに活性化される(Biochemical
Journal、166 巻、21頁、1977年および Proceedings o
f the National Academy of Sciences of theU.S.A.、8
6巻、2632頁、1989年参照）と考えられているが、プロ
コラゲナーゼは一般的に得ることが困難で、充分に研究
が進んでいるとは言えず、その産生制御や活性化機構等
まだ未知の点が多い。
ーゲン（Ｉ型、ＩＩ型、およびＩＩＩ型コラーゲン）を
分解する際の律速酵素であり、コラーゲンの代謝に重要
な役割を果たしている。コラゲナーゼは、前駆体である
プロコラゲナーゼとして細胞より分泌され、生体内では
その後プラスミンやストロムライシン等のタンパク分解
酵素によってコラゲナーゼに活性化される(Biochemical
Journal、166 巻、21頁、1977年および Proceedings o
f the National Academy of Sciences of theU.S.A.、8
6巻、2632頁、1989年参照）と考えられているが、プロ
コラゲナーゼは一般的に得ることが困難で、充分に研究
が進んでいるとは言えず、その産生制御や活性化機構等
まだ未知の点が多い。
【０００６】以上のことから、コラーゲン代謝を賦活す
る為には、プロコラゲナーゼの産生を促進する物質が有
効と考えられる。
る為には、プロコラゲナーゼの産生を促進する物質が有
効と考えられる。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】従って本発明の目的と
するところは、組織への浸透性に有利な低分子物質より
なる、病的あるいは生理的に低下したコラーゲン代謝の
賦活剤を提供することにある。
するところは、組織への浸透性に有利な低分子物質より
なる、病的あるいは生理的に低下したコラーゲン代謝の
賦活剤を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】上述の目的は、分子量が
５００以下の絹繊維の硫酸加水分解物を含むコラーゲン
代謝賦活剤によって達成される。
５００以下の絹繊維の硫酸加水分解物を含むコラーゲン
代謝賦活剤によって達成される。
【０００９】絹繊維の部分加水分解物、特に、可溶化し
た水溶性シルクペプチドは皮膚化粧料等に用いられる公
知物質であり、例えばその製造法として特公昭５８−１
７７６３号公報（分子量分布；１５００〜５０００
０）、特公昭５９−３１５２０号公報（平均重合度；２
〜２０）、特公昭６０−４１０４３号公報（分子量分
布；２００〜４００）等が知られている。
た水溶性シルクペプチドは皮膚化粧料等に用いられる公
知物質であり、例えばその製造法として特公昭５８−１
７７６３号公報（分子量分布；１５００〜５０００
０）、特公昭５９−３１５２０号公報（平均重合度；２
〜２０）、特公昭６０−４１０４３号公報（分子量分
布；２００〜４００）等が知られている。
【００１０】本発明に於いて用いられる絹繊維の硫酸加
水分解物としては、精練絹繊維に４０〜６０容量％硫酸
を直接添加し、６０℃で１〜４８時間処理する（特公昭
６０−４１０４３号公報）か、或いは絹繊維を塩化カル
シウム等により予め可溶化フィブロイン溶液とした後、
硫酸を添加（特公昭５９−３１５２０号公報）すること
により得た加水分解物等が使用できる。
水分解物としては、精練絹繊維に４０〜６０容量％硫酸
を直接添加し、６０℃で１〜４８時間処理する（特公昭
６０−４１０４３号公報）か、或いは絹繊維を塩化カル
シウム等により予め可溶化フィブロイン溶液とした後、
硫酸を添加（特公昭５９−３１５２０号公報）すること
により得た加水分解物等が使用できる。
【００１１】尚、塩酸、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリ
ウム等の酸あるいはアルカリ加水分解や、パンクレアチ
ン等のプロテアーゼによる加水分解では、本発明の目的
とするプロコラゲナーゼの産生促進効果は得られない。
ウム等の酸あるいはアルカリ加水分解や、パンクレアチ
ン等のプロテアーゼによる加水分解では、本発明の目的
とするプロコラゲナーゼの産生促進効果は得られない。
【００１２】本発明のコラーゲン代謝賦活剤を、セファ
デックスＧ−２５TMファイン（ファルマシア社製）で分
画した結果、プロコラゲナーゼの産生促進活性をもつの
は主に、塩類、アミノ酸およびオリゴペプチドの溶出す
る分子量５００以下の低分子画分であることが分かっ
た。
デックスＧ−２５TMファイン（ファルマシア社製）で分
画した結果、プロコラゲナーゼの産生促進活性をもつの
は主に、塩類、アミノ酸およびオリゴペプチドの溶出す
る分子量５００以下の低分子画分であることが分かっ
た。
【００１３】本発明のコラーゲン代謝賦活剤としては、
皮膚線維芽細胞の存在する真皮層（結合組織）への作用
が大きいので、この分子量５００以下のものが好まし
い。
皮膚線維芽細胞の存在する真皮層（結合組織）への作用
が大きいので、この分子量５００以下のものが好まし
い。
【００１４】本発明のコラーゲン代謝賦活剤を、その使
用目的に応じて、通常用いられる公知の成分に配合する
ことによって、液剤，固形剤，半固形剤等の各種剤形に
調製することが可能で、好ましい組成物として軟膏、ゲ
ル、クリーム、スプレー剤、貼付剤、ローション等が挙
げられる。
用目的に応じて、通常用いられる公知の成分に配合する
ことによって、液剤，固形剤，半固形剤等の各種剤形に
調製することが可能で、好ましい組成物として軟膏、ゲ
ル、クリーム、スプレー剤、貼付剤、ローション等が挙
げられる。
【００１５】その例として、本発明のコラーゲン代謝賦
活剤を、ワセリン等の炭化水素、ステアリルアルコール
等の高級アルコール、ミリスチン酸イソプロピル等の高
級脂肪酸低級アルキルエステル、ラノリン等の動物性油
脂、グリセリン等の多価アルコール、グリセリン脂肪酸
エステル、モノステアリン酸ポリエチレングリコール等
の界面活性剤、無機塩、蝋、樹脂、水および要すればパ
ラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸ブチル等
の防腐剤に混合することによって、化粧品や医薬品を製
造することができる。
活剤を、ワセリン等の炭化水素、ステアリルアルコール
等の高級アルコール、ミリスチン酸イソプロピル等の高
級脂肪酸低級アルキルエステル、ラノリン等の動物性油
脂、グリセリン等の多価アルコール、グリセリン脂肪酸
エステル、モノステアリン酸ポリエチレングリコール等
の界面活性剤、無機塩、蝋、樹脂、水および要すればパ
ラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸ブチル等
の防腐剤に混合することによって、化粧品や医薬品を製
造することができる。
【００１６】その際のコラーゲン代謝賦活剤の添加量は
剤形により異なるが、絹繊維として０. ５〜４重量％含
むコラーゲン代謝賦活剤の場合、適用する組成物全量を
基準として通常０. １〜１０重量％、好ましくは１〜５
重量％含有することが望ましい。
剤形により異なるが、絹繊維として０. ５〜４重量％含
むコラーゲン代謝賦活剤の場合、適用する組成物全量を
基準として通常０. １〜１０重量％、好ましくは１〜５
重量％含有することが望ましい。
【００１７】
【発明の効果】本発明のコラーゲン代謝賦活剤を、種々
のヒト皮膚線維芽細胞の培養系に添加すると、プロコラ
ゲナーゼの産生量が促進される（後記試験例−１および
２参照）。更に、本発明のコラーゲン代謝賦活剤は、加
齢した皮膚線維芽細胞に対し、加齢に伴って低下したプ
ロコラゲナーゼの産生量を回復させる（後記試験例−３
参照）。
のヒト皮膚線維芽細胞の培養系に添加すると、プロコラ
ゲナーゼの産生量が促進される（後記試験例−１および
２参照）。更に、本発明のコラーゲン代謝賦活剤は、加
齢した皮膚線維芽細胞に対し、加齢に伴って低下したプ
ロコラゲナーゼの産生量を回復させる（後記試験例−３
参照）。
【００１８】従って、本発明のコラーゲン代謝賦活剤
は、線維芽細胞に作用し、コラゲナーゼ活性を増強する
ことにより、病的あるいは生理的に低下したコラーゲン
の代謝を賦活することができる。
は、線維芽細胞に作用し、コラゲナーゼ活性を増強する
ことにより、病的あるいは生理的に低下したコラーゲン
の代謝を賦活することができる。
【００１９】
【実施例】実施例１
【００２０】塩化カルシウムの６０重量％水溶液４００
ｍｌに、精練絹原料５６ｇを加熱溶解した。この際、溶
解を容易にするため、エチルアルコール１６０ｍｌを添
加した。次いで、これを２４時間透析し濃縮後、１８重
量％の可溶化フィブロイン水溶液３１２ｍｌを得た。
ｍｌに、精練絹原料５６ｇを加熱溶解した。この際、溶
解を容易にするため、エチルアルコール１６０ｍｌを添
加した。次いで、これを２４時間透析し濃縮後、１８重
量％の可溶化フィブロイン水溶液３１２ｍｌを得た。
【００２１】このうち２３５ｍｌに濃硫酸１６５ｍｌを
ゆっくりと加え、６０℃で６時間加温した。次いでこれ
に水を加え総量１.８ｌとし、室温で一夜放置後氷冷し
ながら水酸化ナトリウムで中和、濾過することにより本
発明のコラーゲン代謝賦活剤２ｌ（２.１重量％相当の
フィブロインを含む）を得た。
ゆっくりと加え、６０℃で６時間加温した。次いでこれ
に水を加え総量１.８ｌとし、室温で一夜放置後氷冷し
ながら水酸化ナトリウムで中和、濾過することにより本
発明のコラーゲン代謝賦活剤２ｌ（２.１重量％相当の
フィブロインを含む）を得た。
【００２２】（試験例−１） 正常ヒト線維芽細胞株〔白人女性の皮膚より採取された
Detroit-551 (ATCC CCL 110)〕を１０容量％ウシ胎仔血
清（以下ＦＢＳと略記）を含むＭＥＭ培地にて１ｘ１０
5 個／ｍｌに調整し、６穴プレートに２ｍｌずつ播種し
て、５％炭酸ガス、飽和水蒸気下、３７℃で培養した。
Detroit-551 (ATCC CCL 110)〕を１０容量％ウシ胎仔血
清（以下ＦＢＳと略記）を含むＭＥＭ培地にて１ｘ１０
5 個／ｍｌに調整し、６穴プレートに２ｍｌずつ播種し
て、５％炭酸ガス、飽和水蒸気下、３７℃で培養した。
【００２３】尚、ＭＥＭ培地は、大日本製薬社製最少必
須培地１０−１０１に、それぞれ終濃度０.１重量％ラ
クトアルブミン酵素水解物（シグマ社製）、１容量％非
必須アミノ酸、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（以上いず
れも大日本製薬社製）、０.１２重量％炭酸水素ナトリ
ウムおよび５０ｍｇ／ｌストレプトマイシンを添加して
調製した。
須培地１０−１０１に、それぞれ終濃度０.１重量％ラ
クトアルブミン酵素水解物（シグマ社製）、１容量％非
必須アミノ酸、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（以上いず
れも大日本製薬社製）、０.１２重量％炭酸水素ナトリ
ウムおよび５０ｍｇ／ｌストレプトマイシンを添加して
調製した。
【００２４】２４時間後培養液を吸引除去し、終濃度
０.６容量％ＦＢＳを添加したＭＥＭで細胞を２回洗浄
した後、同培地１.９ｍｌを加える。これに、ポアーサ
イズが０.２μｍのニトロセルロース膜（アドバンテッ
ク東洋製、DISMIC-25 ）で濾過滅菌した実施例１のコラ
ーゲン代謝賦活剤を添加（終濃度５容量％）し、７日間
同様に培養して培養上清を得た。
０.６容量％ＦＢＳを添加したＭＥＭで細胞を２回洗浄
した後、同培地１.９ｍｌを加える。これに、ポアーサ
イズが０.２μｍのニトロセルロース膜（アドバンテッ
ク東洋製、DISMIC-25 ）で濾過滅菌した実施例１のコラ
ーゲン代謝賦活剤を添加（終濃度５容量％）し、７日間
同様に培養して培養上清を得た。
【００２５】本発明に於いて用いられる、絹繊維の硫酸
加水分解物のプロコラゲナーゼ産生促進活性を調べるの
に先立って、培養上清中にプロコラゲナーゼと同時に産
生されている、コラゲナーゼインヒビター（蛋白質）の
除去を行う。
加水分解物のプロコラゲナーゼ産生促進活性を調べるの
に先立って、培養上清中にプロコラゲナーゼと同時に産
生されている、コラゲナーゼインヒビター（蛋白質）の
除去を行う。
【００２６】コラゲナーゼインヒビターの除去： 得ら
れた培養上清２５０μｌに１０ｍＭトリス塩酸緩衝液
〔４℃でｐＨ７.８に調整、１ｍＭ塩化カルシウム、０.
０５容量％Brij-35(ＩＣＩ社製ポリオキシエチレン(23)
ラウリルエーテル）を含む〕を１.７５ｍｌ加え、同緩
衝液で平衡化した CM-セファロースCL-6B TM（ファルマ
シア社製、ベッド容量０.５ｍｌ）に供した。
れた培養上清２５０μｌに１０ｍＭトリス塩酸緩衝液
〔４℃でｐＨ７.８に調整、１ｍＭ塩化カルシウム、０.
０５容量％Brij-35(ＩＣＩ社製ポリオキシエチレン(23)
ラウリルエーテル）を含む〕を１.７５ｍｌ加え、同緩
衝液で平衡化した CM-セファロースCL-6B TM（ファルマ
シア社製、ベッド容量０.５ｍｌ）に供した。
【００２７】次に、１２５ｍＭ食塩を含む同緩衝液０.
５ｍｌにてインヒビターを除去（計４回、総量２ｍｌ）
し、５００ｍＭ食塩を含む同緩衝液０.５ｍｌにてプロ
コラゲナーゼを回収（計４回、総量２ｍｌ）した。
５ｍｌにてインヒビターを除去（計４回、総量２ｍｌ）
し、５００ｍＭ食塩を含む同緩衝液０.５ｍｌにてプロ
コラゲナーゼを回収（計４回、総量２ｍｌ）した。
【００２８】プロコラゲナーゼ産生量の定量： 本実験
で用いた細胞では、産生されるコラゲナーゼはそのまま
では活性をもたないプロコラゲナーゼとして回収される
ので、プロコラゲナーゼ産生量は、トリプシンで活性化
して得られるコラゲナーゼ活性として定量した。トリプ
シンによる活性化法、およびフルオレッセインイソチオ
シアネートで標識されたＩ型コラーゲン（コスモバイオ
社製）を基質としたコラゲナーゼ活性の測定法は、永井
らの方法（Japanese Journal of Inflamation、4巻、12
3 頁、1984年参照）に準じた。
で用いた細胞では、産生されるコラゲナーゼはそのまま
では活性をもたないプロコラゲナーゼとして回収される
ので、プロコラゲナーゼ産生量は、トリプシンで活性化
して得られるコラゲナーゼ活性として定量した。トリプ
シンによる活性化法、およびフルオレッセインイソチオ
シアネートで標識されたＩ型コラーゲン（コスモバイオ
社製）を基質としたコラゲナーゼ活性の測定法は、永井
らの方法（Japanese Journal of Inflamation、4巻、12
3 頁、1984年参照）に準じた。
【００２９】なお１単位は、３５℃で１分間に１μｇの
Ｉ型コラーゲンを分解する酵素量を示す。
Ｉ型コラーゲンを分解する酵素量を示す。
【００３０】得られた培養上清中のプロコラゲナーゼ量
を定量した結果、対照（無添加）では１０．８±０．１
単位／ｍｌ（平均値±標準誤差、ｎ＝３）に対し、実施
例１で得られたコラーゲン代謝賦活剤添加では、３７．
１±０．３単位／ｍｌ（平均値±標準誤差、ｎ＝３）を
示し、プロコラゲナーゼの産生が促進されることが分か
った。
を定量した結果、対照（無添加）では１０．８±０．１
単位／ｍｌ（平均値±標準誤差、ｎ＝３）に対し、実施
例１で得られたコラーゲン代謝賦活剤添加では、３７．
１±０．３単位／ｍｌ（平均値±標準誤差、ｎ＝３）を
示し、プロコラゲナーゼの産生が促進されることが分か
った。
【００３１】実施例２ 絹晒ノイル１０ｇを４０容量％硫酸５０ｍｌに浸積し、
６０℃で１２時間加熱した後、２００ｍｌの冷水を加え
１夜室温で放置した。次いで、１０Ｎ水酸化ナトリウム
溶液を徐々に加えて中和した後、濾過して上清液３３０
ｍｌ（３重量％相当のフィブロインを含む）を得た。
６０℃で１２時間加熱した後、２００ｍｌの冷水を加え
１夜室温で放置した。次いで、１０Ｎ水酸化ナトリウム
溶液を徐々に加えて中和した後、濾過して上清液３３０
ｍｌ（３重量％相当のフィブロインを含む）を得た。
【００３２】（試験例−２） 正常ヒト線維芽細胞株として、いずれも白人女性皮膚よ
り採取されたDetroit-551 (ATCC CCL 110)、Detroit-54
8 (ATCC CCL 116)および、BUD-8(ATCC CRL1554) を用
い、実施例２で得られたコラーゲン代謝賦活剤の添加効
果を試験例−１と同様にして調べた結果を表１に示す。
り採取されたDetroit-551 (ATCC CCL 110)、Detroit-54
8 (ATCC CCL 116)および、BUD-8(ATCC CRL1554) を用
い、実施例２で得られたコラーゲン代謝賦活剤の添加効
果を試験例−１と同様にして調べた結果を表１に示す。
【００３３】
【表１】
【００３４】調べた３株の正常ヒト線維芽細胞に対し、
本発明のコラーゲン代謝賦活剤は、プロコラゲナーゼの
産生を促進することが分かった。
本発明のコラーゲン代謝賦活剤は、プロコラゲナーゼの
産生を促進することが分かった。
【００３５】（試験例−３） 正常ヒト線維芽細胞として継代日数の異なるDetroit-55
1 細胞を用い、加齢とコラゲナーゼ産生量およびそれに
対する本発明のコラーゲン代謝賦活剤の添加効果を調べ
た。
1 細胞を用い、加齢とコラゲナーゼ産生量およびそれに
対する本発明のコラーゲン代謝賦活剤の添加効果を調べ
た。
【００３６】Detroit-551 細胞入荷後、３２、６９、７
３、８７、１１２および１３２日継代培養したものを用
い、コラーゲン代謝賦活剤として、濾過滅菌した実施例
２のコラーゲン代謝賦活剤を用い、添加後の培養日数を
９日間とした以外は、全て試験例−１と同様に培養して
培養上清を得た。
３、８７、１１２および１３２日継代培養したものを用
い、コラーゲン代謝賦活剤として、濾過滅菌した実施例
２のコラーゲン代謝賦活剤を用い、添加後の培養日数を
９日間とした以外は、全て試験例−１と同様に培養して
培養上清を得た。
【００３７】得られた培養上清から、試験例−１と同様
の方法で、インヒビターを除去し、プロコラゲナーゼ産
生量を測定した。結果を表２に示す。
の方法で、インヒビターを除去し、プロコラゲナーゼ産
生量を測定した。結果を表２に示す。
【００３８】
【表２】
【００３９】実施例２のコラーゲン代謝賦活剤の添加に
より、加齢に伴って低下した線維芽細胞のプロコラゲナ
ーゼ産生量が回復することが明らかとなった。
より、加齢に伴って低下した線維芽細胞のプロコラゲナ
ーゼ産生量が回復することが明らかとなった。
【００４０】（試験例−４） 実施例１および実施例２で得られたコラーゲン代謝賦活
剤を、０.１Ｎ酢酸で平衡化したゲル濾過カラム（セフ
ァデックスＧ−２５TMファイン、直径 4 cm 、高さ 20c
m 、充填容量 250 ml)に供し、Detroit-551 に対して、
プロコラゲナーゼの産生を促進させる活性の溶出パター
ンを調べた。
剤を、０.１Ｎ酢酸で平衡化したゲル濾過カラム（セフ
ァデックスＧ−２５TMファイン、直径 4 cm 、高さ 20c
m 、充填容量 250 ml)に供し、Detroit-551 に対して、
プロコラゲナーゼの産生を促進させる活性の溶出パター
ンを調べた。
【００４１】実施例１および実施例２で得られた両コラ
ーゲン代謝賦活剤共に、活性のピークは電気伝導度（バ
イオラッド社製Gradient Monitor Model 1710 にて測
定) のピークと全く同位置に溶出され、低分子物質であ
ることが予想された。
ーゲン代謝賦活剤共に、活性のピークは電気伝導度（バ
イオラッド社製Gradient Monitor Model 1710 にて測
定) のピークと全く同位置に溶出され、低分子物質であ
ることが予想された。
【００４２】溶離液として０.１容量％トリフルオロ酢
酸を含む４５容量％アセトニトリルを用い、２２０ｎｍ
の紫外吸収を指標として、上記ゲル濾過によって得られ
た活性画分を、高速液体クロマトグラフィー（ゲル浸透
Ｇ３０００ＰＷ−ＸＬカラム、東ソー（株））に供し、
分子量の推定をおこなった結果、その分子量は約５００
以下であった。
酸を含む４５容量％アセトニトリルを用い、２２０ｎｍ
の紫外吸収を指標として、上記ゲル濾過によって得られ
た活性画分を、高速液体クロマトグラフィー（ゲル浸透
Ｇ３０００ＰＷ−ＸＬカラム、東ソー（株））に供し、
分子量の推定をおこなった結果、その分子量は約５００
以下であった。
【００４３】尚、実施例１および実施例２で得られた両
コラーゲン代謝賦活剤共に、ゲル濾過カラム（セファデ
ックスＧ−２５TMファイン）で分析した結果、元の絹繊
維あるいはフィブロインの約９５％（実施例１）および
約９０％（実施例２）が、分子量５００以下のペプチド
およびアミノ酸に分解されていた。
コラーゲン代謝賦活剤共に、ゲル濾過カラム（セファデ
ックスＧ−２５TMファイン）で分析した結果、元の絹繊
維あるいはフィブロインの約９５％（実施例１）および
約９０％（実施例２）が、分子量５００以下のペプチド
およびアミノ酸に分解されていた。
【００４４】以下に本発明のコラーゲン代謝賦活剤を応
用した組成物の処方例を示す。
用した組成物の処方例を示す。
【００４５】処方例１−軟膏 実施例１のコラーゲン代謝賦活剤３ｇと下記親水性成分
とを、湯浴で８０℃に加温して混合し、これを、８０℃
に加温した下記の親油性成分混合物に攪拌しながら徐々
に加えた。次に、ホモジナイザー（TOKUSYUKIKA KOGYO
製）で２分半激しく攪拌(2500rpm) して各成分を充分乳
化分散させた後、攪拌しながら徐々に冷却し、１００ｇ
中に３重量％のコラーゲン代謝賦活剤を含む軟膏を得
た。
とを、湯浴で８０℃に加温して混合し、これを、８０℃
に加温した下記の親油性成分混合物に攪拌しながら徐々
に加えた。次に、ホモジナイザー（TOKUSYUKIKA KOGYO
製）で２分半激しく攪拌(2500rpm) して各成分を充分乳
化分散させた後、攪拌しながら徐々に冷却し、１００ｇ
中に３重量％のコラーゲン代謝賦活剤を含む軟膏を得
た。
【００４６】 「親水性成分」 パラオキシ安息香酸メチル ０．１ｇ プロピレングリコール ６．７ｇ 精製水 ４１．１ｇ
【００４７】 「親油性成分」 スクワラン ４．７ｇ 白色ワセリン ２４．０ｇ ステアリルアルコール ８．７ｇ ミリスチン酸イソプロピル ６．０ｇ モノステアリン酸ポリエチレングリコール （商品名NIKKOL MYS-45 、日本サーファクタント工業（株）製） １．３ｇ ポリエチレンアルキルエーテルリン酸 （商品名NIKKOL DDP-2、日本サーファクタント工業（株）製） ２．３ｇ モノステアリン酸グリセリン ２．０ｇ パラオキシ安息香酸ブチル ０．１ｇ
【００４８】 処方例２−ローション 重量％ 実施例２のコラーゲン代謝賦活剤 １．０ エタノール １０．０ 乳酸 ０．３ クエン酸ナトリウム ０．１ グリセリン ２．０ 防腐剤、香料および界面活性剤 適量 精製水 残量 ──────────────────────────────── １００％
【００４９】 処方例３−入浴剤 重量％ 実施例１のコラーゲン代謝賦活剤 ５．０ 炭酸水素ナトリウム ４５．０ 香料および界面活性剤 適量 有機色素 適量 無水硫酸ナトリウム 残量 ──────────────────────────────── １００％
【００５０】（試験例−５） 垂直型拡散セル装置（図１参照、Kercso Engineering社
製：有効面積８ｃｍ2）にラット（Wister系雄ラット、
１０週令、体重２００〜２３０ｇ）の腹部剥離皮膚を装
着し、３７℃空気恒温槽に置いた。donor 側には蒸留水
または本発明の絹加水分解物の２倍あるいは４倍希釈液
をそれぞれ１ml、receptor側には脱気蒸留水（約４５m
l）を供した。
製：有効面積８ｃｍ2）にラット（Wister系雄ラット、
１０週令、体重２００〜２３０ｇ）の腹部剥離皮膚を装
着し、３７℃空気恒温槽に置いた。donor 側には蒸留水
または本発明の絹加水分解物の２倍あるいは４倍希釈液
をそれぞれ１ml、receptor側には脱気蒸留水（約４５m
l）を供した。
【００５１】６時間後にreceptor溶液を全量採取し、た
だちに−２０℃で冷凍保存した。再溶解後、凍結乾燥を
行い、ＭＥＭ培地２mlに再溶解し、ポアサイズ０．２μ
ｍのフィルターで濾過滅菌後、コラーゲン代謝賦活剤の
添加効果を試験例−１と同様にして調べた結果を表３に
示す。
だちに−２０℃で冷凍保存した。再溶解後、凍結乾燥を
行い、ＭＥＭ培地２mlに再溶解し、ポアサイズ０．２μ
ｍのフィルターで濾過滅菌後、コラーゲン代謝賦活剤の
添加効果を試験例−１と同様にして調べた結果を表３に
示す。
【００５２】コラーゲン代謝賦活剤の２倍希釈液のrece
ptor溶液に高いプロコラゲナーゼ産生促進作用が見られ
た。
ptor溶液に高いプロコラゲナーゼ産生促進作用が見られ
た。
【００５３】
【表３】
【００５４】比較例１，２ 絹晒ノイル１０ｇを３５容量％硝酸あるいは１９容量％
塩酸５０ｍｌに浸積し、６０℃で１２時間加熱した後、
２００ｍｌの冷水を加え１夜室温で放置した。次いで、
１０Ｎ水酸化ナトリウム溶液を徐々に加えて中和した
後、濾過して上清液３３０ｍｌ（３重量％相当のフィブ
ロインを含む）を得た（比較例１，２）。
塩酸５０ｍｌに浸積し、６０℃で１２時間加熱した後、
２００ｍｌの冷水を加え１夜室温で放置した。次いで、
１０Ｎ水酸化ナトリウム溶液を徐々に加えて中和した
後、濾過して上清液３３０ｍｌ（３重量％相当のフィブ
ロインを含む）を得た（比較例１，２）。
【００５５】なお、ＨＰＬＣにより、上記絹加水分解物
が充分低分子化されていること（平均分子量５００以
下）が確認されている。
が充分低分子化されていること（平均分子量５００以
下）が確認されている。
【００５６】（試験例−６） 比較例１，２の絹加水分解物および実施例２のコラーゲ
ン代謝賦活剤の添加効果を試験例−１と同様にして調べ
た結果を表４に示す。
ン代謝賦活剤の添加効果を試験例−１と同様にして調べ
た結果を表４に示す。
【００５７】
【表４】
【図１】試験例５で使用した、垂直型拡散セル装置を表
す図である。
す図である。
１ テフロン製ふた部 ２ サンプリング口 ３ 薬物試料 ４ 皮膚 ５ Ｏ−リング ６ レセプター相 ７ 攪拌子
Claims (1)
- 【請求項１】分子量が５００以下の絹繊維の硫酸加水分
解物を含むコラーゲン代謝賦活剤
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5975291A JP2574732B2 (ja) | 1991-02-28 | 1991-02-28 | コラーゲン代謝賦活剤 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5975291A JP2574732B2 (ja) | 1991-02-28 | 1991-02-28 | コラーゲン代謝賦活剤 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0624935A JPH0624935A (ja) | 1994-02-01 |
| JP2574732B2 true JP2574732B2 (ja) | 1997-01-22 |
Family
ID=13122299
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5975291A Expired - Fee Related JP2574732B2 (ja) | 1991-02-28 | 1991-02-28 | コラーゲン代謝賦活剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2574732B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7060260B2 (en) | 2003-02-20 | 2006-06-13 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Water-soluble silk proteins in compositions for skin care, hair care or hair coloring |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2788709B2 (ja) * | 1994-03-08 | 1998-08-20 | 鐘紡株式会社 | 浴剤組成物 |
-
1991
- 1991-02-28 JP JP5975291A patent/JP2574732B2/ja not_active Expired - Fee Related
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|---|---|---|---|---|
| US7060260B2 (en) | 2003-02-20 | 2006-06-13 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Water-soluble silk proteins in compositions for skin care, hair care or hair coloring |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0624935A (ja) | 1994-02-01 |
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