JPH05219951A - 微生物によるキモシン及びキモシン前駆体の生産法 - Google Patents

微生物によるキモシン及びキモシン前駆体の生産法

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JPH05219951A JP4206947A JP20694792A JPH05219951A JP H05219951 A JPH05219951 A JP H05219951A JP 4206947 A JP4206947 A JP 4206947A JP 20694792 A JP20694792 A JP 20694792A JP H05219951 A JPH05219951 A JP H05219951A
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 チーズ製造に必要とされるレンネットの代替
物を、組換えＤＮＡ含有微生物にて生産する。 【構成】 特定の塩基配列を有するウシプレプロキモシ
ン又はその各種の対立型又は成熟型をコードする特定構
造遺伝子及び適当なレギュロンを含んでなる組換えプラ
スミドで微生物を形質転換して、その培養物からプレプ
ロキモシン又はその各種の対立型又は成熟型を得る。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、各種の対立型及び成熟
型プレプロキモシンをコードする哺乳類（ウシ）由来の
特定構造遺伝子からなる組換えＤＮＡを含むプラスミド
で形質転換した微生物を用いて、各種の対立型及び成熟
型プレプロキモシンを生産する方法に関する。
【０００２】キモシンは哺乳類新生児の第四胃から得ら
れるタンパク質である。ウシ由来のもの（EC 3.4.23.4
）は不活性な前駆体であるプロキモシンとして分泌さ
れるが、このプロキモシンは365 残基のアミノ酸からな
る単一ポリペプチド鎖である（Foltmann他，Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA, 74, 2321-2324 (1977)，Foltmann
他， J. Biol. Chemistry, 254, 8447-8456 (1979)）。
本発明者らは、ウシのプロキモシンの前駆体であるプレ
プロキモシンが381 残基のアミノ酸からなる一本のポリ
ペプチド鎖で構成させており、アミノ末端に16残基のア
ミノ酸を余分に有するという点でプロキモシンとは異な
っていることを見出だした。この16残基のアミノ酸から
なる伸長部分は、タンパク質の翻訳と同時に進行する分
泌過程に関与するシグナル配列と非常に類似している
（Blobel及び Dobberstein，J. Cell Biol. 67, 835-85
1 (1975)）。
【０００３】
【従来の技術】プロキモシンは限定的加水分解によって
活性型酵素（キモシン）に不可逆的に転換されるが、こ
の過程で合計42残基のアミノ酸がペプチド鎖のアミノ末
端から切り離される。この活性化はｐＨ依存性の２段階
自己消化によって行われる。中間体であるシュードキモ
シンは、ｐＨ２〜３における、27番目と28番目のアミノ
酸残基の結合を切断するような加水分解によって生ず
る。最終産物であるキモシンはｐＨ４〜５におけるシュ
ードキモシンの活性化によって生成する（Pattersen
他，Eur. J. Biochem., 94, 573-580 (1979)）。
【０００４】キモシンの有する酵素活性はκ‐カゼイン
を特異的に加水分解することにある。キモシンは、この
ような性質を有するため、チーズの製造の際の凝乳酵素
として広く利用されている。
【０００５】キモシンは、仔ウシ第四胃の粗抽出物であ
るレンネット中に存在する必須凝乳成分である。レンネ
ットは、世界中いたる地域で何種類かのチーズの製造に
用いられている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、チーズ
の需要増大に伴なって仔ウシのレンネットが次第に不足
する傾向が強まっているため、数多くの研究室で微生物
由来のレンネット代替物が探し求められている。多数の
微生物レンネットのスクリーニングがなされてきたが、
チーズ製造に使用できるものはほんの僅かで、しかもこ
れらの代替物は異なる特異性を示すためチーズとして許
容し難いテクスチャーや苦みを生じさせるおそれがあ
る。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明は、組換えＤＮＡ
含有微生物を用いてキモシンを生産することによって上
記の課題を解決したものである。
【０００８】このような組換えＤＮＡ含有微生物による
キモシンの生産は経済上大きな重要性を有すると思われ
る。
【０００９】組換えＤＮＡ技術の発展に伴なって、ヒト
その他の哺乳類など、高等生物から特定の遺伝子又はそ
の一部を単離又は合成することが可能になり、また、こ
れらの遺伝子又はその断片を細菌や酵母などの微生物に
導入することが可能となった。導入された遺伝子は形質
転換微生物の増殖に伴なって増幅される。その結果、形
質転換微生物は、遺伝子又は遺伝子断片がどんな種類の
タンパク質をコードしていようとも、そのタンパク質を
産生する能力を有するようになる。すなわち、遺伝子又
は遺伝子断片にコードされたものがホルモンであろう
と、抗原であろうと、抗体であろうと、或いはそれらの
一部分であろうとも、それらを産生する能力を獲得す
る。微生物はこのような能力を代々受け継いでいくの
で、かかる遺伝子導入によってそのような能力をもった
新規な微生物株が実際に生まれることになる。例えば、
Ullrich, Science, 196, 1313 (1977)並びにSeeburg, N
ature, 270, 486 (1977)を参照されたい。この技術の実
用性の基礎となるものは、微生物からヒトに至るすべて
の生物のＤＮＡが化学的類似性を有していて、同じ４種
類のヌクレオチドで構成されていることである。重要な
相違点は、高分子ＤＮＡ分子におけるこれら４種類のヌ
クレオチドの配列に存する。タンパク質の多くは異なる
生物種間で相違するが、ヌクレオチド配列とアミノ酸配
列とを暗号付ける関係は基本的にはすべての生物を通し
て同一である。
【００１０】例えば、ヒト脳下垂体細胞中のＨＧＨのア
ミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と同じヌクレ
オチド配列を微生物に導入すると、該微生物中において
も同じアミノ酸配列をコードするものとして認識され
る。
【００１１】経済的な見地からすると、組換えＤＮＡ遺
伝子にコードされたタンパク質は、宿主細胞として認可
された可食性微生物を用いて、該微生物中における最適
条件下で生産することが重要である。この目的を達成す
るための主たる方法は以下の通りである。
【００１２】(1) 所定の生育条件下で菌体当りのタンパ
ク質産生量（最適の菌体数における）ができるだけ高く
なるような、構造遺伝子の有効レギュロン下流への組込
み。
【００１３】こうした目的には、大腸菌（Escherichia
coli）由来の二重ｌａｃＵＶ５及びｔｒｐレギュロン、
並びにバクテリオファージＭ１３、ｆｄ及びｆ１のVIII
遺伝子産物等のレギュロンが特に適しており、これらは
天然の状態でも修飾された状態でもよい。
【００１４】菌体１個当りの所要タンパク質の収率に影
響を与えるもう一つの因子は、上記レギュロンと構造遺
伝子とを含むプラスミドのコピー数の増加度（増幅度）
である。増幅はクロアシンＤＦ１３プラスミド（ｐＶＵ
２０８）由来の温度感受性複製変異を利用して行うこと
ができる。
【００１５】(2) 微生物宿主細胞による該タンパク質の
ペリプラズム（細胞周辺腔）及び／又は培地中への分
泌。こうすることによって、細胞内でのタンパク質分解
を防ぎ、或いは該タンパク質の細胞内濃度が高くなり過
ぎて細胞内での正常なプロセスが阻害されないようにす
る。多くの原核生物及び真核生物において、プロセッシ
ングを受ける前のタンパク質の特異的なＮ末端側アミノ
酸配列がタンパク質の分泌過程に関与していることが一
般に認められている。Blobel及び Dobberstein，J. Cel
l Biol. 67, 835-851 (1975)を参照されたい。
【００１６】本発明においては、上記要件を満足する組
換えＤＮＡ分子を構築するために組換えＤＮＡ技術その
他の分子生物学的技術を用いる。本発明は、また、部位
特異的変異導入法を用いた構造遺伝子の遺伝情報の変化
に関する。
【００１７】本発明の理解を深めるために、本明細書中
で用いる幾つかの重要な用語について以下の通り定義す
る。
【００１８】「オペロン」は、特定のＤＮＡ配列の（構
造）遺伝子（ポリペプチド発現のための）と調節部位又
はレギュロン（上記の発現を調節する）からなる遺伝子
であって、主としてプロモーター配列、オペレーター配
列並びにリボースと結合もしくは相互作用するようなＤ
ＮＡ配列からなる。
【００１９】「構造遺伝子」は、鋳型（ｍＲＮＡ）を介
してポリペプチド固有のアミノ酸配列をコードするＤＮ
Ａ配列である。
【００２０】「プロモーター」は、レギュロン中に存在
するＤＮＡ配列であり、転写開始のためにＲＮＡポリメ
ラーゼが結合するＤＮＡ配列である。
【００２１】「オペレーター」は、レギュロン中に存在
するＤＮＡ配列であって、これにリプレッサーが結合す
ることによって隣接するプロモーターへのＲＮＡポリメ
ラーゼの結合が阻害されるようなＤＮＡ配列である。
【００２２】「インデューサー」は、リプレッサーを不
活性化する物質であり、その結果オペレーターが開放さ
れてＲＮＡポリメラーゼがプロモーターに結合し、転写
が開始される。
【００２３】「クローニングビヒクル」は、適当な宿主
細胞中に形質転換した後で自己複製させることのできる
ＤＮＡ配列（インタクトなレプリコン）を含んでなる非
染色体二本鎖ＤＮＡ、プラスミド又はファージをいう。
【００２４】「ファージ」又は「バクテリオファージ」
は、適当な宿主細菌中で複製可能な細菌ウイルスをい
う。
【００２５】「解読枠」は、ｍＲＮＡレベルで、遺伝情
報がポリペプチドに適切に翻訳されるような、トリプレ
ットと呼ばれる三塩基連鎖（コドン）の枠組をいう。
【００２６】「転写」は、構造遺伝子からＲＮＡが作ら
れる過程をいう。
【００２７】「翻訳」は、ｍＲＮＡからポリペプチドが
作られる過程をいう。
【００２８】「発現」は、構造遺伝子からポリペプチド
が産生する過程をいう。この過程は、少なくとも転写と
翻訳を含めた多数の過程の組合せである。
【００２９】「温度感受性複製変異」は、温度に依存し
てその複製コピー数が変化するような変異を複製起点内
に含んでいるプラスミドをいう。
【００３０】「対立型」は、遺伝子産物の天然に存在す
る２以上の選択型のうちの一つである。
【００３１】「成熟型」は、遺伝子産物の特異的プロセ
ッシング（タンパク加水分解など）によって生じた形を
いう。
【００３２】「プラス鎖」は、ウラシルがチミンに置き
換っている点を除き、ｍＲＮＡの配列と全く同一の塩基
配列を有するＤＮＡ鎖をいう。
【００３３】プレプロキモシンの成熟型は、プロキモシ
ン、シュードキモシン及びキモシンである。
【００３４】プロキモシンはプレプロキモシンにシグナ
ルペプチダーゼが作用することによって生じるが、この
際アミノ末端の（分泌関連）シグナルペプチドが失われ
る。ウシのプレプロキモシンのアミノ酸配列を表１に示
す。ウシのプロキモシンはアミノ酸番号１〜365 に相当
する（表１）。
【００３５】
【表２】
【表２−２】
【００３６】シュードキモシンはｐＨ２におけるプロキ
モシンの自己消化によって生じたもので、プロキモシン
のアミノ末端部分が失われたものである。ウシのシュー
ドキモシンの構造は、表１に示すプロキモシンについて
のアミノ酸番号28〜365 に相当する。
【００３７】キモシンはｐＨ４〜５におけるキモシンの
自己消化によって生じたもので、シュードキモシンのア
ミノ末端部分が失われたものである。ウシのキモシンの
構造は、表１に示すプロキモシンについてのアミノ酸番
号43〜365 に相当する。
【００３８】本明細書中においては、以下の略号を使用
する。
【００３９】ｃＤＮＡ 相補的ＤＮＡ ｄｓＤＮＡ 二本鎖ＤＮＡ Ｎ ヌクレオチドのいずれか ＲＢＳ リボソーム結合部位 bp 塩基対 Ｍ１３ バクテリオファージＭ１３ ＲＦ 複製型 ｐ プラスミド ｐ／ｏ プロモーター／オペレーター ｔｒｐ トリプトファン ｌａｃ ラクトース ｔｓ 温度感受性 ＥＬＩＳＡ enzyme linked immuno sorbent assay ＲＩＡ ラジオイムノアッセイ ＳＤＳ ドデシル硫酸ナトリウム Ａｐ アンピシリン耐性 Ｔｃ テトラサイクリン耐性
【００４０】本発明においては、哺乳類プレプロキモシ
ンの各種対立型及び成熟型をコードする構造遺伝子（特
に表１及び図１に示すもの）と微生物宿主中での該構造
遺伝子の発現を調節する特異的ＤＮＡ配列からなる組換
えプラスミドを導入することによって形質転換した微生
物が供せられる。かかる特異的ＤＮＡ配列は誘導又は構
成レギュロンからなる。
【００４１】好ましい誘導レギュロンとしては、 Goedd
el他，Nature, 281, 544-548 (1971) に記載された二重
ｌａｃＵＶ５系からなるものがある（図７参照）。
【００４２】もう一つの好ましい誘導レギュロンとして
は、Lee 他，J. Mol. Biol. 121, 193-217 (1978) 並び
にScience 189 , 22-26 (1975)（Bertrand他）に記載さ
れたトリプトファン系の構成要素がある。本発明者ら
は、このトリプトファン系を図８に示すように改変し
て、より好適な系を得た。この改変系においては、ｔｒ
ｐアテニュエータータンパク質をコードする領域が除去
されているが、そのリボソーム結合部位は残っている。
２つのｔｒｐレギュロンの後端と先端とを連結した形で
用いると発現が大きく促進される。この系の合成法を図
１０に示した。
【００４３】本発明の組換えプラスミドは、構造遺伝子
の発現を調節するようなＤＮＡ配列、好ましくはバクテ
リオファージＭ１３、ｆｄ又はｆ１のVIII遺伝子の改変
プロモーター／リボソーム結合部位を含んでいる（van
Wezenbeek 他，Gene, 11, 129-148 (1980)）。
【００４４】上述のレギュロン系の使用に加えて組換え
クローニングビヒクルのコピー数を増加させれば、所望
タンパク質の菌体当りの収率は大幅に増大する。コピー
数の増加はクロアシンＤＦ１３プラスミドｐＶＵ２０８
由来の温度感受性複製変異を利用することによって達成
できる（A. Stuitje，学位論文、アムステルダム王立大
学(1981)）。温度を増加させるとコピー数が10乃至100
倍増大する。かかるプラスミドの構築法を図１１及び図
１２に示す。
【００４５】本発明の組換えプラスミドにおいては、レ
ギュロンは構造遺伝子に直接連結させてもよいし、以下
に示す新規開始コドンとＥｃｏＲＩとを含有するＤＮＡ
リンカーを介して間接的に連結させてもよい。このＤＮ
Ａリンカーは、次の塩基配列： (5')p CAT(N)n GAATTC(N')n ATG OH(3') （ただし、ｎ＝０，１，２又は３であり、Ｎ及びＮ′は
ヌクレオチドＡ，Ｔ，Ｇ又はＣのいずれかで二本鎖中に
２回回転対称構造が存在するようなものである。）を含
んでなるものである。２回回転対称構造とは、例えばＮ
が塩基ＡであればＮ′がその相補的な塩基Ｔであること
を意味する。レギュロンと構造遺伝子との間のＡＡＴＴ
配列を除去すると発現効率が増大する場合もあることが
判明した。
【００４６】表１に示すウシプレプロキモシンとは異な
る対立型も構築した。これらの構築例の概略を図１７に
示し、また、部位特異的変異導入法を用いた構築手順に
ついては後述の(10e) において詳述する。この部位特異
的変異導入法は、微生物宿主中で効率的に分泌されるよ
うにシグナル配列を特異的に改変したプレプロキモシン
の生産や、改良された酸性自己消化特性を有するプロキ
モシンの生産にも役立てることができる。
【００４７】本発明においては、多くの段階を経て、プ
レプロキモシンの各種対立型及び成熟型をコードする構
造遺伝子を含む微生物クローニングビヒクルを調製し、
各種プレプロキモシンを生産させる。その工程の中で最
も重要なものは、 (1) プレプロキモシンｍＲＮＡの単離及び濃縮。 (2) 該ｍＲＮＡの二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）への変
換。 (3) ポリｄＣテールを有するｄｓＤＮＡの構築。 (4) 該ｄｓＤＮＡ‐ポリｄＣテール分子の、ＰｓｔＩで
切断してポリｄＧテールを結合させたプラスミドｐＢＲ
３２２由来ＤＮＡへの導入。 (5) コンピテントな大腸菌の形質転換、並びにテトラサ
イクリン耐性コロニーの選択。 (6) ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼーション及びインビ
トロ（in vitro）翻訳、並びに特異的な32Ｐ標識ｃＤＮ
Ａプローブを用いたＤＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼーシ
ョンによる挿入部分の素性の決定。 (7) ＤＮＡ配列及びＲＮＡ配列の解析による、クローン
化ＰｓｔＩ挿入部分の素性の二重チェック。 (8a)シュードキモシンのアミノ末端部分及びアミノ末端
（に付加した）翻訳開始ＡＴＧコドンをコードするＤＮ
Ａの作成。 (8b)キモシンのアミノ末端部分及びアミノ末端（に付加
した）翻訳開始ＡＴＧコドンをコードするＤＮＡの作
成。 (8c)プロキモシンのアミノ末端部分及びアミノ末端（に
付加した）翻訳開始ＡＴＧコドンをコードするＤＮＡの
作成。 (8d)プレプロキモシンのアミノ末端部分及びアミノ末端
（に付加した）翻訳開始ＡＴＧコドンをコードするＤＮ
Ａの作成。 (9) 構成又は誘導レギュロンを含むプラスミドの構築
（該プラスミドは温度感受性複製変異を含むものであっ
ても含まないものであってもよい）。 (10)上記(9) のプラスミドにプレプロキモシン遺伝子又
はその各種成熟型遺伝子を連結したものからなるプラス
ミドの構築、並びに該プラスミドによる大腸菌の形質転
換。 (11)上記(10)の組換えプラスミドを含む微生物細胞（例
えば大腸菌）の培養、並びに培養液からのプレプロキモ
シン、プロキモシン、シュードキモシン又はキモシンの
検出と単離。培養条件は、菌体当りのプレプロキモシン
又はその成熟型タンパク質の収率に関して最適化する。
各種前駆体の活性型キモシンへの転換についても最適化
する。
【００４８】次に、以上の各段階をさらに詳細に説明す
る。
【００４９】
【実施例】(1) ウシプレプロキモシンｍＲＮＡの単離・
精製 前反芻期の仔ウシの第四胃（芻胃、フリジア種）を液体
窒素下で粉砕し、フェノール抽出した後、Wiegers 及び
Hilzの方法（FEBS Letters, 23, 77-82 (1972)）に従っ
て塩化リチウムによるＲＮＡの選択的沈殿を行った。ポ
リＡ結合ｍＲＮＡは、オリゴｄＴ‐セルロースカラム
（Aviv及び Leder，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69,
1408-1412 (1972)に記載）に数回通して回収した。
【００５０】(2) （プレプロ）キモシンｍＲＮＡの二本
鎖ＤＮＡへの変換 Buell 他の方法（J. Biol. Chemistry, 253, 2471-2482
(1978) ）に従って、精製（プレプロキモシン）ｍＲＮ
ＡをＡＭＶ逆転写酵素でコピーして一本鎖ＤＮＡを得
た。次に、Davis 他の方法（Gene, 10, 205-218 (198
0)）に従って、上記ｃＤＮＡをＤＮＡポリメラーゼを用
いて二本鎖ＤＮＡに変換した。その後、この二本鎖ＤＮ
Ａコピーのループ構造をＳ１ヌクレアーゼ消化によって
除去した。
【００５１】(3) ポリｄＣテールを有する二本鎖ＤＮＡ
の構築 ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行って所望の長さの
ＤＮＡ分子をゲルから抽出して得た後、ターミナルトラ
ンスフェラーゼを用いてポリｄＣテールを結合させた
（Roychoudhury他，Nucleic Acids Research, 3, 863-8
77 (1976) に記載の方法に従った）。
【００５２】(4) ｄｓＤＮＡ‐ポリｄＣ分子のプラスミ
ドｐＢＲ３２２への導入 プラスミドｐＢＲ３２２を制限酵素ＰｓｔＩで処理し
て、アンピシリン耐性遺伝子中に存在するＰｓｔＩ部位
で該プラスミドを切断した。このようにして得たｐＢＲ
３２２の線状化ＤＮＡの３′末端のＰｓｔＩ部位に、タ
ーミナルトランスフェラーゼを用いてポリｄＧテールを
付加した。上記(3) で得たポリｄＣテール結合ＤＮＡ分
子を、このポリｄＧテール結合ｐＢＲ３２２にアニール
した。
【００５３】この後、以下の (5)〜(7) で詳述する形質
転換及びスクリーニングを経て、後述のプラスミドｐＵ
Ｒ１００１を得た。
【００５４】(5) 形質転換及びクローン選択 このようにして得たプラスミドを、塩化カルシウム処理
した大腸菌に導入した。形質転換後、ハイブリッドＤＮ
Ａを有する菌体をそのテトラサイクリン耐性に基づいて
選択した（Mandel及びHiga，J. Mol. Biol. 53, 159-16
2 (1970)）。
【００５５】(6) 挿入部分の素性の決定（Ｉ）‐ＤＮＡ
／ＤＮＡコロニーハイブリダイゼーション、ＲＮＡ／Ｄ
ＮＡハイブリダイゼーション及びインビトロ翻訳法 放射性標識したキモシン特異的ｃＤＮＡを用いてのコロ
ニーハイブリダイゼーション法（Thayer，Anal. Bioche
m., 98, 60-63 (1979)）により、陽性コロニーをさらに
選択した。上記標識ｃＤＮＡは、オリゴヌクレオチド(5
')dTTCATCATGTTOH(3')をプライマーとして用いる上記
(1) のｍＲＮＡ標品の逆転写（上記(2) 参照）によって
得た。このオリゴヌクレオチドは本発明者らの設計した
ものであって、（プレプロ）キモシン分子に特有の183
〜186 番目のアミノ酸配列（-Asn-Met-Met-Asn‐）をコ
ードする可能性のある２通りのヌクレオチド配列のうち
の一つに対応する。このウンデカヌクレオチドをプライ
マーとしてｃＤＮＡを合成すると、鎖長約650 ヌクレオ
チドのはっきりとしたｃＤＮＡが得られた。これを単離
してコロニーハイブリダイゼーション用プローブとして
用いた。幾つかの陽性コロニーが同定できたが、さらに
該クローン化ＤＮＡの同定を二重にチェックするため
に、これらのコロニーの中の幾つかからプラスミドを単
離してWilliams他，Cell, 17, 903-913 (1979)に記載の
ハイブリッド形成及びインビトロ翻訳法を行った。
【００５６】(7) 挿入部分の素性の決定（II）‐ＤＮＡ
／ＲＮＡ配列解析 （プレプロ）キモシン挿入部分の塩基配列を、マクサム
・ギルバート法（Maxam 及び Gilbert，Methods in Enz
ymology, Vol.65(1)，499-560 頁、Academic Press社(1
980)）及びジデオキシ／ニック翻訳法（Maat及び Smit
h，Nucleic Acids Research, 5, 4537-4545 (1978) ）
で決定した。（プレプロ）キモシンｍＲＮＡの塩基配列
に関する情報を、さらに、伸長反応阻害剤存在下でのＡ
ＭＶ逆転写酵素による鋳型（プレプロ）キモシンｍＲＮ
Ａ上でのプライマー伸長反応（Zimmern 及びKaesberg，
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 4257-4261 (1978)）
から間接的に得た。このスクリーニングによって、特
に、プレプロキモシンｍＲＮＡのほぼ完全なコピーを含
んだプラスミドｐＵＲ１００１が得られた。
【００５７】表１にウシプレプロキモシンＢのｍＲＮＡ
に対応するＤＮＡ配列、並びにそのアミノ酸配列を示
す。該表中、「Ｓ」を付した番号はシグナル配列中のア
ミノ酸残基の番号である。
【００５８】(8a)シュードキモシンＡＴＧアミノ末端部
分をコードするＤＮＡの作成 特記しない限り、以下に記載する番号は表１に示すプレ
プロキモシンｍＲＮＡについてのものである。
【００５９】図２及び図３を参照する。
【００６０】プラスミドｐＢＲ３２２を制限酵素Ｈａｅ
III で切断し、得られた断片の平滑末端に合成Ｈｉｎｄ
III リンカー(5')dCCAAGCTTGG(3') を連結した。この混
合物にＨｉｎｄIII とホスファターゼを加えてインキュ
ベートした。フェノール／クロロホルム（50／50 v/v）
混合液でタンパク抽出して反応を停止させ、ＤＮＡをＰ
ｓｔＩで切断した。得られた混合物をポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動にかけ、電気泳動的に溶出してｐＢＲ３
２２のＤＮＡ配列の3608〜3756番目（Sutcliffe, Cold
Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology, 4
3, 77-90 (1978)の記載に従う）に位置する148 bpの断
片（図２，断片Ａ）をゲルから単離した。
【００６１】プラスミドｐＵＲ１００１をＥｃｏＲＩで
切断し、仔ウシホスファターゼで処理した。混合物をフ
ェノール／クロロホルムで抽出し、ＰｓｔＩを加えた。
得られた断片をアガロースゲル電気泳動で分離した。ｐ
ＵＲ１００１クローンの549位のＥｃｏＲＩ部位からカ
ルボキシル末端側のプレプロキモシン非コード領域のＰ
ｓｔＩ部位までの断片Ｂを単離した（図２）。
【００６２】ｐＵＲ２０１、ｐＵＲ３０１、ｐＵＲ４０
１、ｐＵＲ３０３、ｐＵＲ２１０、ｐＵＲ３１０、ｐＵ
Ｒ４１０、ｐＵＲ３１１のＥｃｏＲＩ‐ＨｉｎｄIII 大
フラグメント（総括して断片Ｃと呼ぶ）に断片Ａと断片
Ｂを連結して、それぞれ、ｐＵＲ１５２０、ｐＵＲ１５
３０、ｐＵＲ１５４０、ｐＵＲ１７３０、ｐＵＲ１８２
０、ｐＵＲ１８３０、ｐＵＲ１８４０、ｐＵＲ１９３０
を得た（図２）。
【００６３】次に、プラスミドｐＵＲ１００１のＰｓｔ
Ｉ処理断片に、合成ペンタヌクレオチド (5')dHOCTGCA
(3') を連結した。連結後、混合物をｄＧＴＰ存在下で
大腸菌ＤＮＡポリメラーゼの大フラグメントとインキュ
ベートして平滑末端とした。Ｔ４キナーゼとＡＴＰを用
いてこのＤＮＡをリン酸化し、次の構造の合成ＥｃｏＲ
Ｉリンカー (5')dCAT(N)n GAATTC(N')n ATG(3') （ただし、ｎ＝０，１，２又は３であり、Ｎ及びＮ′は
ヌクレオチドＡ，Ｔ，Ｇ又はＣのいずれかで二本鎖中に
２回回転対称構造が存在するようなものである）を連結
した。このＤＮＡをＥｃｏＲＩ処理して約400 bpの大き
さの断片Ｉを得て、これを単離した（図３）。
【００６４】(8b)キモシンのアミノ末端部分をコードす
るＤＮＡの作成 図４を参照する。
【００６５】プラスミドｐＵＲ１００１をＰｓｔＩで切
断して、1300bpのＰｓｔＩ挿入部分を単離した。このＤ
ＮＡ断片を熱変性して一本鎖とした。合成プライマー
(5')dGGGGAGGTGG(3')を用い、大腸菌ＤＮＡポリメラー
ゼの大フラグメントを作用させて、198 番目の塩基から
カルボキシル末端方向に伸びる相補的ＤＮＡを合成し
た。次にこのＤＮＡをＳ１ヌクレアーゼ処理して平滑末
端とした。この二本鎖ＤＮＡに上記合成ＥｃｏＲＩリン
カー (5')dCAT(N)n GAATTC(N')n ATG(3') を連結した。
ＥｃｏＲＩで消化してホスファターゼ処理した後、ＤＮ
Ａを今度はＢｇｌIIで切断した。得られた断片IIを単離
した（図４）。
【００６６】(8c)プロキモシンのアミノ末端部分をコー
ドするＤＮＡの作成 図５を参照する。
【００６７】プラスミドｐＵＲ１００１をＨｐｈＩで処
理した後、Ｓ１ヌクレアーゼで処理した。202 bpの断片
III を得た（図６）。この断片III に上記合成ＥｃｏＲ
Ｉリンカー (5')dCAT(N)n GAATTC(N')n ATG(3') を連結
し、ＥｃｏＲＩ消化し、ホスファターゼ処理して脱リン
酸化した。得られたＤＮＡをＢｇｌIIで切断して、生じ
た断片IVを単離した（図５）。
【００６８】(8d)プレプロキモシンのアミノ末端部分を
コードするＤＮＡの作成 図６を参照する。
【００６９】プラスミドｐＵＲ１００１をＥｃｏＲＩ及
びＰｓｔＩで切断した。396 bpの断片を単離した。この
断片をエキソヌクレアーゼIII 処理して一本鎖非相補的
ＤＮＡを作成した（Smith, Nucleic Acids Res., 6, 83
1-841 (1979)）。このＤＮＡを、Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA, 75, 5822-5826 (1978)（Akusjarvi 及び Pette
rson）記載の条件下でプレプロキモシンｍＲＮＡにハイ
ブリダイズさせた。上記(2) に記載の手順でｃＤＮＡ合
成を行った。熱変性後に、プライマー (5')dAGGTGTCTCG
OH(3')及びＤＮＡポリメラーゼ大フラグメントを用いて
二本鎖ＤＮＡを作成した。この二本鎖ＤＮＡをＳ１ヌク
レアーゼ処理して、上記合成ＥｃｏＲＩリンカー (5')d
CAT(N)n GAATTC(N')n ATG(3') を連結した。ＥｃｏＲＩ
消化し、（仔ウシ腸由来の）ホスファターゼで脱リン酸
化した後、ＤＮＡをＢｇｌIIで切断した。得られた約23
0 bpの断片Ｖを単離した（図６）。
【００７０】(9) 構成又は誘導レギュロンを含むプラス
ミドの構築（温度感受性複製変異を含む又は含まない）
【００７１】(9a)プラスミドｐＵＲ２０１の構築 図７を参照する。
【００７２】Cell, 13, 65-71 (1978)（Backman 及び P
tashne）に記載のｐＫＢ２６８をＥｃｏＲＩ処理して、
二重ｌａｃレギュロン（ｌａｃＵＶ５）からなる285 bp
の断片を得た。この断片をｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ部
位に挿入連結した。ｌａｃレギュロンが正しい方向に収
まったプラスミドＤＮＡ（ｐＵＲ２００，図７）を、大
腸菌ＲＮＡポリメラーゼ存在下において、ＥｃｏＲＩで
部分切断した。これによってＨｉｎｄIII 切断部位から
最も離れたＥｃｏＲＩ部位が優先的に切断される。線状
化ＤＮＡをＳ１ヌクレアーゼ処理し、アガロースゲル電
気泳動で精製し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで環状化して、大
腸菌を形質転換した。テトラサイクリン耐性形質転換体
から、正しい構造のｐＵＲ２０１を得た（図７）。
【００７３】(9b)プラスミドｐＵＲ３０１の構築 図８を参照する。
【００７４】Hallewell 及びEmtage，Gene, 9, 27-47
(1980) に記載のｐｔｒｐＥＤ５をＨｉｎｆＩ処理し
て、ｔｒｐレギュロンを含む約510 bpのＤＮＡ断片を得
た。この断片を大腸菌ＲＮＡポリメラーゼ存在下におい
てＴａｑＩで部分切断した。こうしてｔｒｐレギュロン
内のＴａｑＩ部位（Bertrand他，Science 189, 22-26
(1975) 並びに Lee他，J. Mol. Biol. 121, 193-217 (1
978) に記載）を選択的に保護しながら、ｔｒｐレギュ
ロンを含む234 bpの断片（図８）を得た。この断片をＳ
１ヌクレアーゼ処理して平滑末端とし、これにＥｃｏＲ
Ｉリンカー (5')dGGAATTCCOH(3')を連結した。これをＥ
ｃｏＲＩで切断した後、ｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ部位
にクローン化した。
【００７５】正しい方向にｔｒｐレギュロンを有するプ
ラスミドｐＵＲ３００（図８）を単離した。臭化エチジ
ウム存在下でのｐＵＲ３００のＥｃｏＲＩ部分切断並び
にＳ１ヌクレアーゼ処理によって、ＨｉｎｄIII 部位か
ら最も離れたＥｃｏＲＩ部位を除去した。線状化ＤＮＡ
分子をＴ４ＤＮＡリガーゼで環状化した。テトラサイク
リン耐性形質転換体から、正しい構造のｐＵＲ３０１
（図８）を得た。
【００７６】(9c)プラスミドｐＵＲ４０１の構築 図９を参照する。
【００７７】ＲＦ（複製）型Ｍ１３のＤＮＡをＴａｑＩ
及びＨａｅIII 処理して遺伝子VIIIプロモーターを含む
269 bpの断片（ＤＮＡ配列1128‐1379，van Wezenbeek
他，Gene, 11, 129-148 (1980)参照）を得、大腸菌ＤＮ
Ａポリメラーゼによる修復反応でＴａｑＩ部位を平滑末
端とした。この断片を次に制限酵素ＭｎｌＩで部分消化
した。この部分消化断片をＴ４ＤＮＡポリメラーゼ及び
Ｓ１ヌクレアーゼで処理して平滑末端とした後、Ｅｃｏ
ＲＩリンカー (5')dGGAATTCCOH(3')を連結し、ＥｃｏＲ
Ｉで切断した後、ｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ部位に連結
した。制限酵素解析及びＤＮＡ配列決定を行って、Ｍ１
３遺伝子VIIIのＤＮＡ配列のリボソーム結合部位の直後
にＥｃｏＲＩ部位が位置するプラスミドｐＵＲ４００を
単離した。本発明者らは、ヌクレオチド1128からヌクレ
オチド1291乃至1297までのＭ１３レギュロンを有するプ
ラスミドが適当な発現用レギュロンであることを見出だ
した。ｐＵＲ３０１について述べた手順で、ＨｉｎｄII
I 部位から最も離れたＥｃｏＲＩ部位を除去した。ｐＵ
Ｒ４０１の構造の概略を図９に示す。
【００７８】(9d)プラスミドｐＵＲ４０１の構築 図１０を参照する。
【００７９】プラスミドｐＵＲ３００（上記(9b)、図
８）をＥｃｏＲＩ消化し、234 bpのｔｒｐレギュロンを
含む断片を単離した。この断片を、予めＥｃｏＲＩで切
断しホスファターゼで脱リン酸化しておいたｐＵＲ３０
１ＤＮＡにＴ４リガーゼで連結した。この連結混合物で
コンピテントな大腸菌細胞を形質転換し、アンピシリン
耐性形質転換体の中からｐＵＲ３０２を得た。このプラ
スミドは同一の転写方向性を有する２つのｔｒｐレギュ
ロンを含んでいる（図１０）。臭化エチジウム存在下で
ｐＵＲ３０２をＥｃｏＲＩで部分切断し、Ｓ１ヌクレア
ーゼ処理して平滑末端とし、切断されたプラスミドＤＮ
ＡをＴ４リガーゼで再連結した。この連結混合物でコン
ピテントな大腸菌細胞を形質転換し、アンピシリン耐性
形質転換体の中からｐＵＲ３０３を得た。このプラスミ
ドｐＵＲ３０３からは、ｐＵＲ３０２に含まれる２つの
ｔｒｐレギュロン間のＥｃｏＲＩ部位が除かれている。
【００８０】(9e)プラスミドｐＵＲ１０の構築 図１１を参照する。
【００８１】プラスミドｐＢＲ３２２をＰｓｔＩ及びＰ
ｖｕIIで切断し、次にホスファターゼで脱リン酸化し
て、2817bpの断片（図１１，断片Ｄ）を単離した。別個
に、プラスミドｐＢＲ３２２をＭｂｏIIで切断し、Ｓ１
ヌクレアーゼ及びホスファターゼで処理した後、Ｐｓｔ
Ｉで切断した。塩基番号3201〜3608（Sutcliffe, ColdS
pring Harbor Symposia on Quantitative Biology, 43,
77-90 (1978)の記載に従う）の400 bpの断片（図１
１，断片Ｅ）を単離した。プラスミドｐＶＵ２０８（A.
Stuitje，学位論文、アムステルダム王立大学(1981)）
をＢａｍＨＩで切断し、Ｓ１ヌクレアーゼ処理した。ｃ
ｏｐ ｔｓ変異とｃｌｏ ＤＦ１３の複製起点を含む76
0 bpの断片（図１１，断片Ｆ）を単離した。
【００８２】ｐＵＲ１０を構築するために、まず上記断
片Ｄと断片Ｅを連結し、次いで断片Ｆを連結した。この
連結混合物でコンピテントな大腸菌細胞を形質転換し
た。アンピシリン及びテトラサイクリン耐性形質転換体
の中からｐＵＲ１０を有する菌体を単離した。この複製
起点を含む断片は、複製が反時計回りに一方向に進行す
るような配置をしている。
【００８３】(9f)プラスミドｐＵＲ２１０，ｐＵＲ３１
０，ｐＵＲ３１１，ｐＵＲ４１０の構築 図１２を参照する。
【００８４】プラスミドｐＵＲ２１０、ｐＵＲ３１０、
ｐＵＲ３１１及びｐＵＲ４１０は、それぞれ、ｐＵＲ２
０１、ｐＵＲ３０１、ｐＵＲ３０３及びｐＵＲ４０１か
ら誘導されたもので、ｐＵＲ１０のｃｏｐ ｔｓ複製起
点を含んでいる。
【００８５】ｐＵＲ１０をＰｓｔＩ及びＢａｍＨＩで消
化し、アガロースゲル電気泳動及び電気泳動的溶出によ
って2841bpの断片（図１２，断片Ｇ）を単離した。
【００８６】プラスミドｐＵＲ２０１、ｐＵＲ３０１、
ｐＵＲ３０３及びｐＵＲ４０１の各々を、ＰｓｔＩ及び
ＢａｍＨＩで消化し、レギュロン含有断片（図１２，総
括的に断片Ｈとして示す）を単離した。
【００８７】断片Ｇと断片ＨをＴ４ＤＮＡリガーゼで連
結し、この連結混合物でコンピテントな大腸菌細胞を形
質転換した。アンピシリン及びテトラサイクリン耐性コ
ロニーの中からそれぞれプラスミドｐＵＲ２１０、ｐＵ
Ｒ３１０、ｐＵＲ３１１及びｐＵＲ４１０を含む菌体を
単離した。
【００８８】(10)構成又は誘導レギュロンとそれに連結
したプレプロキモシン遺伝子又はその各種成熟型遺伝子
を含むプラスミドの構築、並びに該プラスミドによる大
腸菌の形質転換
【００８９】(10a) ウシシュードキモシンの産生をもた
らす発現プラスミドの構築 図１３を参照する。
【００９０】上記(8a)のｐＵＲ１５２０、ｐＵＲ１５３
０、ｐＵＲ１５４０、ｐＵＲ１７３０、ｐＵＲ１８２
０、ｐＵＲ１８３０、ｐＵＲ１８４０及びｐＵＲ１９３
０を、各々、ＥｃｏＲＩで切断し、ホスファターゼで脱
リン酸化した。得られたそれぞれの断片を、断片Ｉ（上
記(8a)、図３）と連結した。この連結混合物でコンピテ
ントな大腸菌細胞（ＰＲＩ株）を形質転換し、アンピシ
リン耐性形質転換体の中から、シュードキモシンをコー
ドする情報が連続的に一体として存在するように断片Ｉ
の挿入された、ｐＵＲ１５２１、ｐＵＲ１５３１、ｐＵ
Ｒ１５４１、ｐＵＲ１７３１、ｐＵＲ１８２１、ｐＵＲ
１８３１、ｐＵＲ１８４１及びｐＵＲ１９３１を含む菌
体を選択した。
【００９１】(10b) キモシンの産生をもたらす発現プラ
スミドの構築 図１４を参照する。
【００９２】上記(10a) のプラスミドｐＵＲ１５２１を
ＨｉｎｄIII で切断し、ホスファターゼで脱リン酸化し
た後、ＢｇｌIIで切断した。得られた約1300bpの断片VI
（図１４）を精製した。ベクター断片Ｃ（上記(8a)，図
２）の各々に断片II（上記(8b)，図４）及び断片VIを連
結した。この連結混合物でコンピテントな大腸菌細胞を
形質転換し、アンピシリン耐性形質転換体の中から、ｐ
ＵＲ１５２２、ｐＵＲ１５３２、ｐＵＲ１５４２、ｐＵ
Ｒ１７３２、ｐＵＲ１８２２、ｐＵＲ１８３２、ｐＵＲ
１８４２及びｐＵＲ１９３２を含む菌体を選択した。
【００９３】(10c) キモシンの産生をもたらす発現プラ
スミドの構築 図１５を参照する。
【００９４】ベクター断片Ｃ（上記(8a)，図２）の各々
に断片IV（上記(8c)，図５）及び断片VI（上記 (10b)，
図１４）を連結した。この連結混合物でコンピテントな
大腸菌細胞を形質転換し、アンピシリン耐性形質転換体
の中から、ｐＵＲ１５２３、ｐＵＲ１５３３、ｐＵＲ１
５４３、ｐＵＲ１７３３、ｐＵＲ１８２３、ｐＵＲ１８
３３、ｐＵＲ１８４３及びｐＵＲ１９３３を含む菌体を
選択した。
【００９５】(10d) プレプロキモシンの産生をもたらす
発現プラスミドの構築 図１６を参照する。
【００９６】ベクター断片Ｃ（上記(8a)，図２）の各々
に断片Ｖ（上記(8d)，図６）及び断片VI（上記 (10b)，
図１４）を連結した。この連結混合物でコンピテントな
大腸菌細胞を形質転換し、アンピシリン耐性形質転換体
の中から、ｐＵＲ１５２４、ｐＵＲ１５３４、ｐＵＲ１
５４４、ｐＵＲ１７３４、ｐＵＲ１８２４、ｐＵＲ１８
３４、ｐＵＲ１８４４及びｐＵＲ１９３４を含む菌体を
選択した（図１６）。
【００９７】(10e) 部位特異的変異導入法でウシプレプ
ロキモシン又は成熟型の表１に示す構造とは別の対立型
を生じさせ、アミノ酸残基202 及び286 をそれぞれ別個
に又は同時にアスパラギン酸に変換させた例 図１７及び表２〜５を参照する。
【００９８】プラスミドｐＵＲ１００１をＰｓｔＩで切
断し、得られたＤＮＡ断片を合成ペンタヌクレオチド(5
')HOdCTGCAOH(3')に連結した。連結後に、混合物をｄＧ
ＴＰ存在下で大腸菌ＤＮＡポリメラーゼの大フラグメン
トとインキュベートして平滑末端とし、Ｔ４キナーゼ及
びＡＴＰでリン酸化した。このＤＮＡに、ＥｃｏＲＩリ
ンカー (5')dCATGAATTCATG(3')を付加した後、ＥｃｏＲ
Ｉ処理した。キモシンをコードするＤＮＡの塩基番号54
9 のＥｃｏＲＩ部位からカルボキシル末端までの約880
bpの断片を単離した。この断片を複製型Ｍ１３ｍｐ２の
ＥｃｏＲＩ部位にクローン化した。ＥｃｏＲＩ挿入部の
配向の異なる２つのクローン（Ｍ１３．１０２０及びＭ
１３．１０２１）を単離した（図１７）。即ち、Ｍ１
３．１０２０はコード鎖（プラス鎖）を含むが、Ｍ１
３．１０２１は非コード鎖（マイナス鎖）を含んでい
る。Gillam他の方法（Nucleic Acids Res., 6, 2973-29
85 (1979) ）に従って、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ大フ
ラグメント、各ｄＮＴＰ及び下記のいずれかのプライマ
ーを用いて、Ｍ１３．１０２０の一本鎖ファージＤＮＡ
を二本鎖ＤＮＡに変換した。
【００９９】
【０１００】括弧で示す部分は、プライマー／鋳型ハイ
ブリッド間のミスマッチを示す。コンピテントな大腸菌
ＪＭ１０１．７１１８株（Gronenborn及び Messing，Na
ture, 272, 375-377 (1978) ）を形質転換した後、プラ
ークハイブリダイゼーション法（３２Ｐで標識した上記
ペンタヌクレオチド(i) 及び(ii)をプローブとして用い
る）並びにＤＮＡ配列決定法で、所望変異の導入につい
てファージをスクリーニングした。
【０１０１】下記のＤＮＡ配列を含む２種類のファージ
（Ｍ１３．１０２２及びＭ１３．１０２３）が単離され
た。
【０１０２】
【０１０３】複製型のＭ１３．１０２２及びＭ１３．１
０２３をＥｃｏＲＩで切断し、脱リン酸化した後、Ｐｓ
ｔＩで切断した。それぞれの標品をアガロースゲル電気
泳動にかけて、888 bpの断片を単離した。この断片は、
所定の変異部を除いては断片Ｂ（上記(8a)，図２）と同
一であった。
【０１０４】上記(8a)から(8c)に記載の手順と同一の手
順で、特異的に変異を加えたシュードキモシン、キモシ
ン、プロキモシン及びプレプロキモシンの産生をもたら
す発現プラスミドを構築した。
【０１０５】表２〜５に、それぞれ、プレプロキモシ
ン、プロキモシン（＋ＡＴＧコドン）、シュードキモシ
ン（＋ＡＴＧコドン）及びキモシン（＋ＡＴＧコドン）
をコードする構造遺伝子のプラス鎖の配列を一般化した
ものを示す。
【０１０６】
【表３】
【０１０７】
【表４】
【０１０８】
【表５】
【０１０９】
【表６】
【０１１０】表中、Ａはデオキシアデニル基、Ｇはデオ
キシグアニル基、Ｃはデオキシシトシル基、Ｔはチミジ
ル基であり、ＪはＡ又はＧであり、ＫはＴ又はＣであ
り、ＬはＡ、Ｔ、Ｃ又はＧであり、ＭはＡ、Ｃ又はＴで
あり、ＸはＴもしくはＣ（ＹがＡ又はＧの場合）又はＣ
（ＹがＣ又はＴの場合）であり、ＹはＡ、Ｇ、Ｃもしく
はＴ（ＸがＣの場合）又はＡもしくはＧ（ＸがＴの場
合）であり、ＷはＣもしくはＡ（ＺがＧ又はＡの場合）
又はＣ（ＺがＣ又はＴの場合）であり、ＺはＡ、Ｇ、Ｃ
もしくはＴ（ＷがＣの場合）又はＡもしくはＧ（ＷがＡ
の場合）であり、ＱＲはＴＣ（ＳがＡ、Ｇ、Ｃ又はＴの
場合）又はＡＧ（ＳがＴ又はＣの場合）であり、Ｓは
Ａ、Ｇ、ＣもしくはＴ（ＱＲがＴＣの場合）又はＴもし
くはＣ（ＱＲがＡＧの場合）である。
【０１１１】(11)上記(10)の組換えプラスミドを含む菌
体の培養、並びに培養液からのプレプロキモシン、プロ
キモシン、シュードキモシン又はキモシンの検出と単離 プラスミドｐＵＲ１５２１、ｐＵＲ１５３１、ｐＵＲ１
５４１、ｐＵＲ１７３１、ｐＵＲ１８２１、ｐＵＲ１８
３１、ｐＵＲ１８４１、ｐＵＲ１９３１、ｐＵＲ１５２
２、ｐＵＲ１５３２、ｐＵＲ１５４２、ｐＵＲ１７３
２、ｐＵＲ１８２２、ｐＵＲ１８３２、ｐＵＲ１８４
２、ｐＵＲ１９３２、ｐＵＲ１５２３、ｐＵＲ１５３
３、ｐＵＲ１５４３、ｐＵＲ１７３３、ｐＵＲ１８２
３、ｐＵＲ１８３３、ｐＵＲ１８４３、ｐＵＲ１９３
３、ｐＵＲ１５２４、ｐＵＲ１５３４、ｐＵＲ１５４
４、ｐＵＲ１７３４、ｐＵＲ１８２４、ｐＵＲ１８３
４、ｐＵＲ１８４４又はｐＵＲ１９３４を含み、レギュ
ロンとプレプロキモシン（又はその成熟型）遺伝子との
間のリンカー内にＡＡＴＴ配列を含む又は含まない、大
腸菌細胞を最適生育条件下で培養した。培養条件は菌体
中に存在するプラスミドの種類により異なるが、選択圧
力を維持するため常に適当な抗生物質（アンピシリン）
を存在させた。
【０１１２】このような条件下で、上記のプラスミドの
いずれかを含む菌体は、各々かなりの量のシュードキモ
シン、キモシン、プロキモシン、プレプロキモシンを産
生した。産生量は、菌体１個当り１０3 〜１０7 分子で
あった。
【０１１３】プレプロキモシン又は修飾プレプロキモシ
ンをコードするプラスミドを含んだ大腸菌細胞は、細胞
質中に（修飾）プレプロキモシンを含んでおり、ペリプ
ラズム（細胞周辺腔）にプロキモシンを含んでいた。
【０１１４】細菌の産生するプレプロキモシン、プロキ
モシン及びシュードキモシンは、V.B.Pedersen他の方法
（Eur. J. Biochem., 94, 573-580 (1979)）によって、
キモシンへと変換することができる。このようにして得
たキモシン並びに細菌の産生するキモシンは、完全なタ
ンパク分解活性を有する。
【０１１５】タンパク質の存在は、ＳＤＳポリアクリル
アミドゲル電気泳動（場合によって免疫沈降反応を組み
合わせる）、並びにＥＬＩＳＡ及びＲＩＡ法による免疫
学的手法により、さらに確認した。上記の試験に用いた
抗血清は、仔ウシのキモシンをフロイントアジュバント
と共にヒツジ及びウサギに注射して得た。
【０１１６】上記の記載は、大腸菌内でのキモシンの合
成について述べたものであるが、ストレプトコッカス、
ラクトバチルスもしくはバチルスなどの細菌又は酵母な
どのような非毒性食用微生物を用いても本発明の目的を
達成することは可能である。
【０１１７】以下のプラスミドを含有する大腸菌Ｋ１
２．２９４株はＡＴＣＣ（American Type Culture Coll
ection）に寄託されている。
【０１１８】 ｐＵＲ１５２１ − ＡＴＣＣ ３９１２０ （ブダペスト条約に基づく国際寄託） ｐＵＲ１５３３ − ＡＴＣＣ ３９１２１ （ブダペスト条約に基づく国際寄託） ｐＵＲ１７３４ − ＡＴＣＣ ３９１９８ （ブダペスト条約に基づく国際寄託） ｐＵＲ１８３２ − ＡＴＣＣ ３９１９７ （ブダペスト条約に基づく国際寄託）
【図面の簡単な説明】
【図１】ウシのプレプロキモシンの対立型の変異部分の
概略を示したものである。最上段の図は表１に示したも
のに対応する。括弧内の番号はプレプロキモシン分子の
アミノ酸残基の番号を表し、それ以外の番号はｍＲＮＡ
の塩基配列の番号を示す。
【図２】(8a)に記載の、ｐＵＲ１５２０、１５３０、１
５４０、１７３０、１８２０、１８４０及び１９３０の
構築手順を示したものである。
【図３】(8a)に記載の、シュードキモシンのアミノ末端
をコードする二本鎖ＤＮＡに転写開始ＡＴＧコドンを連
結したものの構築手順を示したものである。
【図４】(8b)に記載の、キモシンのアミノ末端をコード
する二本鎖ＤＮＡに転写開始ＡＴＧコドンを連結したも
のの構築手順を示したものである。
【図５】(8c)に記載の、プロキモシンのアミノ末端をコ
ードする二本鎖ＤＮＡに転写開始ＡＴＧコドンを連結し
たものの構築手順を示したものである。
【図６】(8d)に記載の、プレプロキモシンのアミノ末端
をコードする二本鎖ＤＮＡに転写開始ＡＴＧコドンを連
結したものの構築手順を示したものである。
【図７】(9a)に記載の、ｐＵＲ２０１の構築手順を示し
たものである。
【図８】(9b)に記載の、ｐＵＲ３０１の構築手順を示し
たものである。
【図９】(9c)に記載の、ｐＵＲ４０１の構築手順を示し
たものである。
【図１０】(9d)に記載の、ｐＵＲ３０３の構築手順を示
したものである。
【図１１】(9e)に記載の、ｐＵＲ１０の構築手順を示し
たものである。
【図１２】(9f)に記載の、ｐＵＲ２０１、２１０、３１
１及び４１０の構築手順を示したものである。
【図１３】(10a) に記載の、ｐＵＲ１５２１、１５３
１、１５４１、１７３１、１８２１、１８３１、１８４
１及び１９３１の構築手順を示したものである。
【図１４】(10b) に記載の、ｐＵＲ１５２２、１５３
２、１５４２、１７３２、１８２２、１８３２、１８４
２及び１９３２の構築手順を示したものである。
【図１５】(10c) に記載の、ｐＵＲ１５２３、１５３
３、１５４３、１７３３、１８２３、１８３３、１８４
３及び１９３３の構築手順を示したものである。
【図１６】(10d) に記載の、ｐＵＲ１５２４、１５３
４、１５４４、１７３４、１８２４、１８３４、１８４
４及び１９３４の構築手順を示したものである。
【図１７】(10e) に記載の、Ｍ１３．１０２０、Ｍ１
３．１０２１及びウシプレプロキモシンの対立型をコー
ドする二本鎖ＤＮＡ部分の構築手順を示したものであ
る。なお、これらの図面において、一般にプラスミドを
１本線で図示したが、これらは二本鎖ＤＮＡを表す（た
だし、バクテリオファージＭ１３は複製型のものを除き
一本鎖ＤＮＡである）。制限酵素部位におけるＤＮＡ断
片の５´末端は特記しない限りリン酸化されており、３
´末端は常に脱リン酸化されている。イタリック体で示
した番号は表１のウシのプレプロキモシンのＤＮＡ配列
を示し、それ以外はプラスミドＤＮＡ配列を示す。
フロントページの続き (72)発明者 アドリアヌス・マリヌス・レデボエル オランダ国 ロツテルダム、ブルグ・レ フエブレ デ モンテイグニイプレイン ８ (72)発明者 ルツポ・エデンス オランダ国 マースルイス、アルベルト シユバイツードレーフ 29

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 微生物を（所望により選択圧力下で）培
    養し、目的物質を回収することによって、プレプロキモ
    シン、プロキモシン、シュードキモシン又はキモシンを
    生産する方法にして、該微生物が、以下の要素 (1)〜
    (5) を下記の順序で含んでなる組換えプラスミドで形質
    転換された微生物であることを特徴とする方法。 (1) プレプロキモシン、プロキモシン、シュードキモシ
    ン又はキモシンのいずれかをコードする二本鎖ＤＮＡで
    あって、そのプラス鎖が以下に示す配列（Ｉ）の、 【表１】 【表１−２】 【表１−３】 (a) ポリヌクレオチド24〜1166（プレプロキモシン遺伝
    子）、 (b) ポリヌクレオチド72〜1166（プロキモシン遺伝
    子）、 (c) ポリヌクレオチド153 〜1166（シュードキモシン遺
    伝子）、又は (d) ポリヌクレオチド198 〜1166（キモシン遺伝子） （ただし、上記配列（Ｉ）中の、675 番目の塩基Ａは塩
    基Ｇで、928 番目の塩基Ｇは塩基Ａで、それぞれ独立に
    置換されていてもよい）のいずれかの配列を有する二本
    鎖ＤＮＡ、 (2) 上記(1) の二本鎖ＤＮＡの３´末端に結合した翻訳
    終結コドン、 (3) 上記微生物に適した選択マーカー及び複製部位、 (4) 上記(1) の二本鎖ＤＮＡのプラス鎖の上流に位置す
    る、上記微生物に適した発現レギュロン、及び (5) 上記(1) の二本鎖ＤＮＡがプロキモシン、シュード
    キモシン又はキモシンのいずれかをコードする場合に
    は、該二本鎖ＤＮＡの５´末端に結合した翻訳開始ＡＴ
    Ｇトリプレット。
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