JPH02445A - ヒトプロラクチン生産用組み換えｄｎａ、菌株及びヒトプロラクチンを生産する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） この発明は、デオキシリボ核酸（以下、これをＤＮＡと
いう）の組み換え技術により作成された、ヒトプロラク
チン生産用ＤＮＡに関するものである。また、この発明
は、こうして得られたヒトプロラクチン生産用ＤＮＡを
、細菌に導入して得られた形質転換された細菌に関する
ものである。さらに、この発明は、こうして得られた細
菌を培養して、ヒトプロラクチンを生産する方法に関す
るものである。

（従来の技術） ヒトプロラクチン（以下、ＨＰという）は、脳下垂体か
ら分泌される分子１約２２０００のペプチドホルモンで
ある。ＨＰは、ルテオトロビン、黄体刺激ホルモン、乳
腺刺激ホルモンとも呼ばれている。

ＨＰについては不明なことが多い。Ｊ−Ｂ−Ｊｏｓｉ、
ｍｏｖｉｃｈらは、エンドクリノロジ（Ｅｎｄｏｃｒｉ
ｎｏｌｏｇｙ）７１，２０９（１９６２）でＨＰにライ
て報告し、Ｌ−Ｍ−５ｈｅｒＷｏｏｄｏらは、プロシー
テインク・オプ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・
サイエンｘ（Ｐｒｏｃ−Ｎａｔｌ−Ａｃａｄ−５ｃｉ　
・）ＵＳＡ、５３゜２３０７（１９６７）で、ＨＰにつ
いて報告している。

これらの報告によると、）（Ｐは、乳腺の発育促進及び
乳汁分泌の開始と維持、前立腺及び精のう腺の発育促進
を司る作用を持つとされている。ＨＰは、微１しか得ら
れないために、その特性を調べることが困難で、従って
それ以外のことはよく知られていない。だから、ＨＰは
ヒトの疾患、例えば、乳汁分泌不全などの疾患の予防並
びに治療に役立つであろうことが予測されるだけで、そ
の有用性が充分に解明されない状態である。

他方、ＨＰ遺伝子のクローニングについては、Ｎ−Ｅ−
Ｃｏｏｋｅらによってジャーナル・オプ・バイオロジカ
ル・ケミストリ（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、）２５
６゜ツバ８．・４００７（１９８１）に報告され、また
中高らによって特開昭６１−２０２６９０号公報に開示
され、さも１．：Ｈ，Ｔａｋａｈａｓｈｉらによってジ
ャーナル・オブ・バイオケミストリ（Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ、）９５，１４９１（１９８４）に報告されている。

このうち、特開昭６１−２０２６９０号公報は、ＨＰ遺
伝子を増殖させるためのプラスミドを提供している。詳
しく云えば、上記公報は、ＨＰを生産するためのＤＮＡ
を提供するものでなく、大腸菌内でＨＰ遺伝子を増殖さ
せるためのプラスミドを提供するに過ぎない。従って、
この公報の提供するプラスミドを大腸菌内に導入すれば
、ＨＰ遺伝子が大腸菌内で増殖することになるが、実際
にＨＰを生産するには至らない。

（発明が解決しようとする問題点） この発明は、上述のようにＨＰが有用な物質であること
までは予測されても、その取得量が微ユであるために、
現実の有効性も生理活性も確かめ得なかった事実に着目
し、組み換えＤＮＡ技術によりＨＰを細菌に生産させよ
うとしてなされたものである。そのために、この発明は
、細菌に導入したとき、菌体内でヒトプロラクチンを生
産できるような組み換えＤＮＡを提供することを第１の
目的としている。

（問題を解決するための手段） この発明者は、大腸菌内で増殖できるＨＰ遺伝子が、特
開昭６１−２０２６９０号公報により提供されたのを利
用し、この遺伝子の上流にプロモーター、シャインダル
ガル／配列及び翻訳開始コドンをこの順序に組み込んで
新たな遺伝子を作り、これを大腸菌に導入して形質転換
された大腸菌を作ると、この大腸菌の培養によりＨＰを
生産できることを実際に確認した。この発明は、このよ
うな確認に基づいてなされたものである。

（発明の要旨） すなわち、この出願における第１の発明は、第１表に示
したヒトプロラクチンポリペプチドをコードする遺伝子
の上流に、プロモーター、シャインダルガル／配列及び
翻訳開始コドンをこの順序に組み込んで作られた、ヒト
プロラクチン生産用組み換えＤＮＡに関するものである
。

この出願における第２の発明は、上記の組み換えＤＮＡ
を細菌に導入することによって作られた形質転換菌株に
関するものである。また、この出願における第３の発明
は、上記の形質転換菌株を培養してヒトプロラクチンポ
リペプチドを生産させ、これを採取することを特徴とす
る、ヒトプロラクチンポリペプチドの生産方法に関する
ものである。

（ＨＰ遺伝子の説明） この発明は、ヒトプロラクチンポリペプチドをコードす
る遺伝子を用いる。この遺伝子は、特開昭６１−２０２
６９０号公報に開示されている。

この公報の開示する遺伝子は、前述のように、ヒトプロ
ラクチンをコードしたクローン化遺伝子であって、大腸
菌内で増殖可能なプラスミドに過ぎない。すなわち、こ
の公報の開示した遺伝子は、これを大腸菌内に導入して
も、大腸菌にヒトプロラクチンを生産させることはでき
ない。そこで、この発明は、この公報の開示した遺伝子
を利用し、これにプロモーター、シャインダルガル／配
列及び翻訳開始コドンをこの順序に組み込んで組み換え
ＤＮＡを作り、これを細菌内に導入したとき、細菌がヒ
トプロラクチンポリペプチドを生産するようにしたので
ある。

この発明は、ヒトプロラクチンポリペプチドをコードす
る遺伝子として、第１表に示したような塩基配列のもの
を用いる。第１表に示した塩基配列の遺伝子は、特開昭
６１−２０２６９０号公報が表に掲げたものと実質的に
同一である。両者が異なるように見えるのは、上記公報
の表が遺伝子の塩基配列を二重鎖の形にして示している
のに対し、この発明の第１表は、遺伝子の塩基配列を単
一鎖の形で示して、これを上段に配置し、同時に下段に
対応するアミノ酸を付加しているからである。両者が同
一であることは、本願第１表の式中２行目以下における
塩基とアミノ酸との併記部分の塩基配列ｒＡＴＧＡＡＣ
ＡＴＣＡＡ−・・・Ｊｂｉ、特開昭６１−２０２６９０
号公報第５６１頁右上欄１３行末尾及び１５行の塩基配
列ｒＡＴＧＡＡＣＡＴＣＡＡ・・・・・」と、完全に一
致することがら明らがである。

（プロモーターの説明） この発明において、組み込むべきプロモーターとしては
、トリプトファンＭ　（ｔ　ｒ　ｐ）、ラクトース、ｍ
（ｌａｃ）、タック、？５（ｔａｃ）、ビー−ｚ−ルＥ
　（Ｐ　Ｌ）の各プロモーターが適している。ｔｒｐプ
ロモーターは、次に示すような塩基配列を持っている。

（Ｒｕｓｓｅｌ。

Ｄ、　Ｒ，、Ｂｅｎｎｅｔ　ｔ、　Ｇ、　Ｎ、、　Ｇｅ
ｎｅ、　２０．２３１　　（１９８２））。

また、ｌａｃプロモーターは、次に示すような塩基配列
を持っている。（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ、Ｃ，
。

Ｖｉｅｉｒａ、Ｊ、　　ａｎｄ　　　ＭｅｓｓｉｎＬＪ
、、　　３３．　１０３　　（ｔａｃプロモーターは、
ｄｅ　　Ｂｏｅｒ、Ｈ，Ａ、。

Ｐｔｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、、
７８．２１（１９８３）に記載され、次に示すような塩
基配列を持っている。

また、ＰＬプロモーターは、ラムダファージ、ビー、エ
ル、プロモーターであって、Ｒｅｍａｕｔ。

Ｅ、ｅｔａｌ、、Ｇｅｎｅ、、１５．８］、（１９８１
）に記載されている。

（ＳＤ配列の説明） シャインダルガル／配列（以下、ＳＤ配列という）は、
一般に蛋白質の生合成の開始に、重要な役割を果すとさ
れている領域である。ＳＤ配列は、プリン塩基に富んで
おり、３〜９塩基の長さを持っている。

（翻訳開始コドンの説明） 翻訳開始コドンは、蛋白質合成の開始を指定する遺伝暗
号である。この遺伝暗号は、３箇の核酸塩基の配列から
成り、ＡＴＧの順序に配列された３箇のヌクレオチド結
合から成る部分である。

プロモーター、ＳＤ配列及び翻訳開始コドンは、何れも
、ヒトプロラクチンポリペプチド３コードする遺伝子の
上流に、この順序で組み込む必要がある。しかも、それ
らの組み込み位ｎは、ヒトプロラクチンポリペプチドを
コードする遺伝子から適当な距離にあって、相互に適当
な距離な置いていなければならない。すなわち、プロモ
ーターは、ｍＲＮＡの転写開始点より−１０から−３５
の位置にあり、ＳＤ配列と翻訳開始コドンとの間には、
６〜１８箇の塩基対が介在するようにする。

ＳＤ配列および翻訳開始コドンが、組み込むべきプロモ
ーター含有のベクターＤＮＡ中に含まれていない場合に
は、ＳＤ配列及び翻訳開始コドンを、組み込まなければ
ならない。しかし、ＳＤ配列および翻訳開始コドンが、
組み込むべきプロモーター含有のベクター中に既に含ま
れている場合には、格別にＳＤ配列及び翻訳開始コドン
を組み込む必要がない。

ＳＤ配列及び翻訳開始コドンを含んだプロモーター含有
のベクターＤＮＡとしては、例えば、プラスミドｐＵＣ
１９を使用することができる。ＳＤ配列及びプロモータ
ー含有のベクターＤＮＡとしては、プラスミドｐＫＫ２
２３−３を使用することができる。また、プロモーター
含有のベクターＤＮＡとしては、プラスミドｐＤＲ７２
０を使用することができる。プラスミドｐＵＣ１９は、
Ｙａｎｉｓｈ−Ｐｅｒｒｏｎ、Ｃ，、Ｖｉｅｉｒａ、Ｊ
、ａｎｄ　　Ｍｅｓｓｉｎｇ、Ｊ、。

Ｇｅｎｅ　　３３，１０３（１９８５）に記載されてお
り、プラスミドｐＤＲ７２０は、Ｒｕ５ｓｅｌ、Ｄ、Ｒ
，ａｎｄＢｅｎｎｅｔｔ、Ｇ、Ｎ、、Ｇｅｎｅ　　２０
．２３１（１９８２）に記載されており、プラスミドｐ
ＫＫ２２３−３は、ｄｅ　Ｂｏｅｒ、Ｈ，Ａ、、Ｐｒｏ
ｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

ＵＳＡ　　７８．２１（１９８３）に記載されている。

（組み込み） ヒトプロラクチンをコードするＤＮＡにプロモーター等
を含有するベクターＤ　Ｎ　、Ａを組み込むには、制限
酵素を用いて両ＤＮｉ〜を適当な位置で切断してのち、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合させるという、一般的
なりＮＡ組み換え技術によってこれを行うことができる
。

こうして、プロモーター、ＳＤ配列及び翻訳開始コドン
を、ヒトプロラクチンをコードする遺伝子に組み込んだ
ＤＮＡは、例えば次のような塩基配列のものである。

ｔｒｐプロモーターの例 く　　　　八 Ｆ−”− ９塩基 クチンｃＤＮＡが続く） Ｉａｃプロモーターの例 ＣＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＧＣＣＣＣＣ・・−−−−）（
以下、７’　ｏ　５クチンｃ　ＤＮＡが続く） （組み換え方法） 組み換え技術の一例として、プラスミドｐｈＰＲＬ９と
、ｐＵＣ１９とからプラスミドｐＬＰ１００　を作る方
法について、そのあらましを以下に説明する。

まずプラスミドｐｈＰＲＬ９　よりヒトプロラクチン成
熟ペプチドＮ末端付近をコードするＨ訳！ＩＩＩ−ＥＣ
ｏＲＩ断片を得、Ｈａ　ｅ　Ｍ切断部位に下記忙示すＨ
ｉｎｄｌリンカ−ＤＮＡ　値酒造製） ５’−ＡＣＡＡＧＣＴＴＧＴ−３’ ３’−ＴＧＴＴＣＧＡＡＣＡ−５’ をＴ４ＤＡＮリガーゼにより結合し、Ｈａｅ　Ｉ切断部
位をＨｉｎ’ｄ璽切断部位に変える。また、ヒトプロラ
クチン成熟ペプチドＣ末端付近をコードするＥｃｏＲニ
ーＨｉｎｄｌ断片を得る。

次にラクトースプロモーターおよびβ−ガラクトシダー
ゼ遺伝子を含むプラスミドｐＵＣ１９をＨｉｎｄｌｌＫ
より切断し、バクチリアルアルカリホスファターゼによ
り５′位のリン酸基を脱リン酸する。

上記３つのＤＮＡ断片を７４ＤＮＡＩＪガーゼで結合し
、第１図に示した組み換え体プラスミドｐＬＰ１００を
得る。本プラスミドはラクトースプロモーターの下流に
β−ガラクトシダーゼと成熟ヒトプロラクチンをコード
する領域が翻訳フレームを一致するように連結したもの
である。

さらに、組み換え技術の他の例として、プラスミドｐｈ
ＰＲＬ９　　ｐＬＰｌｏｏ及びｐＤＲ７２０から、プラ
スミドｐＴＰ１０Ｑを作る方法について以下圧そのあら
ましを説明する。まず、プラスミドｐｈＰＲＬ９よりヒ
トプロラクチン成熟ペプチドＮ末端付近をコードするＨ
ｐａｌ−ＥｃｏＲＩ断片を得る。

また、゛プラスミドｐＬＰ１００よりヒトプロラクチン
成熟ペプチドＣ末端付近をコードするＥｃｏＲＩ−Ｂａ
ｍＨＩ断片を得る。一方、以下に示すＤＮＡＩＪンカー
を作成する。

５　ＬＡＡＣＴＡＧＴＡＣＧＣＡＡＧＴｒＣＡＣＧＴＡ
ＡＡＡＡＧＧＧＴＡＴＣＧ３ＬＴｒＧＡＴＣＡＴＧＣＧ
ＴｒＣＭＧＴＧＣＡＴｒＴｒＴＣＣＣＡＴＡＧＣＡＣＡ
匝′ロｌα工萄工ＴＧＴＣＣ，−３’ＭｅｔＬｅｕＰｒ
ｏｌｌｅＣｙｓＰｒ。

この合成り　Ｎ　Ａ　’Ｊンカーはｔｒｐ　　プロモー
ターの一１０領域の一部の配列、ＳＤ配列、翻訳開始コ
ドンおよびそｎにつづいて成熟ヒトプロラクチンのＮ末
端付近をコードするＤＮＡ配列を含む。

次とプラスミドｐＤＲ７２０よりｔｒｐ　　プロモータ
ー？含むＨｐａｌ−ＢａｍＨ１断片を得る。

上記３つのＤＮＡ断片および合成りＮＡＩＪンカーをＴ
４ＤＮＡリガーゼにより結合し、第２図例示した組み換
え体プラスミドｐＴＰ１００を得る。本プラスミドはｔ
ｒｐ　　プロモーターの下流Ｋｔ熟ＨＰをコードする領
域が連結した形を有する。

さらに、組み換え技術の例として、プラスミドｐｈＰＲ
Ｌ９．ｐＫＫ２２３−３から、プラスミドｐＴＬ１００
を作る方法について、以下にそのあらましを説明する。

まず、プラスミドｐｈＰＲＬ９より成熟ヒトプロラクチ
ンペプチドＣ末端付近をコードするＢｓｔＥＩＩ　Ｈｉ
ｎｄｌ！！断片を得る。

一方、以下に示すＤＮＡリンカ−を作成する。

５’−ＡＡＴＴＡＴＧＴＴＡＣＣＡＡＴＴＴＧＴＣＣＡ
ＧＧＡＧＧＡ３’−ＴＡＣＡＡＴＧＧＴＴＡＡＡＣＡＧ
ＧＴＣＣＴＣＣＴＧＣＡＧＣＡＡＧＡＴＧＴＣＡＧ−３
’ＣＧＴＣＧＴＴＣＴＡＣＡＧＴＣＣＡＣＴＧ−５’こ
の合成りＮＡリンカ−は開始コドン及びそれに続いて成
熟ヒトプロラクチンのＮ末端付近をコドするＤＮＡ配列
を含む。

次にプラスミドｐＫＫ２２３−３よりｔａｃプロモータ
ー及びシャイン・ダルガルノ配列を含むＥｃｏＲＩ−Ｈ
ｉｎｄｌ断片を得る。

上記２つのＤＮＡ断片および合成りＮＡリンカ−をＴ４
　ＤＮＡ’Ｊガーゼにより結合し、第３図に示した組み
換え体プラスミド２丁Ｌ１００を得る。本プラスミドは
ｔａｃプロモーターの下流に成熟ＨＰをコードする領域
が連結した形を有する。

（組み換え反応条件） 上記組み換え技術における反応は、一般的に云うと下記
のとおりに行うことができる。

以下で述べる制限酵素およびＴ４　ＤＮＡ’Ｉガーゼと
しでは宝酒造社製を使用し、活性の単位の定義は、同社
のテキスト〔Ｔａｋａｒａ　　Ｒｅａｇｅｎｔｓ　　ｆ
ｏｒＧｅｎｅｔｉｃ　　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｒｅ
５ｅａｒｃｈ（１９８７））Ｋ従った。

ＤＮＡの制限酵素洗よる切断反応は、通常０．１〜２０
、ＩＩ！のＤＮＡを２〜２００ｍＭ（好ましくは１０〜
４０　ｍＭ）のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ン−ＨＣＩ（以下、トリス−Ｈｃｌという）（ｐＨ６，
０〜９，５好ましくはｐＦＩ７．０〜８．０）　、０〜
２００　ｍＭのＮａＣＬ　２〜３０　ｍＭ（好ましくは
５〜１０ｍＭ）のＭｇＣ１，を含む反応液中で、制限酵
素０．１〜１００単位（好ましくは１７ｙのＤＮＡ　Ｋ
対して１〜５単位）を用い、２０〜７０’Ｃ（各々の制
限酵素の至適温度）をておいて、１〜２４時間行う。反
応の停止は、通常５５〜７０℃で、５〜３０分間加熱す
ること（でよるか、あるいはフェノールなどの試薬によ
り制限酵素を失活させる方法も用いることができる。

制限酵素処理により生じたＤＮＡ断片の抽出および精製
は、ポリアクリルアミド電気泳動法や低融点アガロース
法などの方法によって行うことができる。

ＤＮＡ断片の結合反応は、２〜２００　ｍＭ（好ましく
は１０−４０　ｍＭ）のトリス−ＭＣＩ（ｐＨ６，１〜
９．５、好ましくはｐＨ７，０〜８．０）、２〜２０　
ｍＭ　（好ましくは５〜１０ｍＭ）のＭｇＣＩ２．０．
１〜ｌ　ＯｍＭ（好ましくは０．５〜２．０　ｍＭ）の
アデノシン５′−三＋）　ン酸（以下、ＡＴＰという）
１〜５０ｍＭ（好ましくは５〜ｌｏｍＭ）のジチオスレ
イトール３含む反応液中で、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ０．３
〜１０単位を用い、１〜３７℃（好ましくは３〜２０’
Ｃ）で１５分間〜７２時間（好ましくは２〜２４時間）
行う。

（形質転換菌） 結合反応によって生じた組み換え体プラスミドＤＮＡは
、必要洗よりＣｏｈｅｎ等の形質転換法〔ニス・ｘヌ−
：Ｉ−ｘン（Ｓ、Ｎ、Ｃｏｈｅｎ）等：プロ　シ−ティ
ング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブｌイｘ
＞：ｘ、　（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、
）。

ＵＳＡ、６９．２１１０　（１９７２））Ｋよって、こ
れを大腸菌に導入する。

形質転換の宿主として用いる大腸菌としては、とくに特
定の菌株を用いる必要はない。大腸菌の中では、Ｅ、ｃ
ｏｌｉＤＨｌ　（ＡＴＣＣ３３８４９）、Ｅ、ｃ。

ｌ　ｉ　ＪＭ１０３．　Ｅ、　ｃｏ　Ｉ　１ＨＢ１０１
　（ＡＴＣＣ３３６９４）が適当である。組み換え体プ
ラスミドＤＮＡを保持する大腸菌から該ＤＮＡの単離は
、バーンボイム（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ）等の方法〔エイチ
・シー・バーンボイム（Ｈ，Ｃ，Ｂｉ　ｒｎｂｏ　ｉｍ
）等：ヌクレイツク・アシド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ　　Ａｃ１ｄ　　Ｒｅｓ、）７゜１５１３　（１９７
９）により行う。

プラスミドＤＮＡを１〜１０種類の制限酵素で切断後、
アガロースゲル電気泳動あるいはぎリアクリルアミドゲ
ル電気泳動により切断部位を調べる。さらＩｃＤＮＡの
塩基配列を決定する必要がある場合はマキサム・ギルバ
ード法〔プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・ア
カデミア・オプ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａ
ｃａｄ、Ｓｃｉ、）、７４゜５６００９７’ｌ））また
はＭ１３ファージを泪いたサンガー（Ｓ　ａ　ｎ　ｇ　
ｅ　ｒ）法〔サンガー（Ｓ　ａ　ｎ　ｇ　ｅ　ｒ）等：
プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−
・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ　ｌ、　Ａｃ
ａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７４，５４６３　（１９７７）
）によって決定する。

未発明洸よｎば、ヒトプロラクチンポリペプチドは以下
のようにして、製造することができる。

すなわち、プラスミド（例えばｐＬＰｌｏｏ、ｐ”ｒｐ
ｌｏｏ）を用いて大腸菌を形質転換させ、アンピシリン
耐性のコロニーの中から各々のプラスミドを保持する大
腸菌分選び出す。形質転換されたアンピシリン耐性の大
腸菌のヒトプロラクチンぎりペプチドの発現の確認は、
下記に示すコロニーイムノアッセイ法により行うことが
できる。すなわち寒天培地に生育した形質転換菌株のコ
ロニーをニトロセルロースフィルターに移し、菌体をリ
ゾチームにより溶菌し、ヒトプロラクチンポリペプチド
の存在をＨＰに対する抗体とプロティンＡ・ホースラデ
イシュ・パーオキシダーゼ・コンジュゲ−）（Ｅ−Ｙラ
ボラトリーズ）および４−クロロ−１−ナフトールを眉
いるエンザイム・イムノアッセイＩＰ、Ｂｕｃｌｅ　　
ａｎｄ　　Ｅ、Ｚｅｈｅｌｅｉｎ：Ｇｅｎｅ、１６，１
４９　（１９８１））により調べるコトカテキル。

こｎらのプラスミドを保持する大腸菌を適当な培地に培
養することＫより、培養物中にヒトプロラクチンポリペ
プチドを生成させることができる。

（ＨＰの生産） ここで用いる培地としては、大腸菌の生育ならびにヒト
プロラクチンポリペプチドの生産に好適なものならば、
合成培地及び天然培地のいずれも使用することができる
。

炭素源としては、グルコース、フラクトース、ラクトー
ス、グリセロール、マンニトール、ソルビトール等が、
窒素源としては、ＮＨ，ＣＩ　、　（ＮＨ４’）２ＳＯ
，、カザミノ酸、酵母エキス、ポリペプトン、肉エキス
、バクトドリブトン、フーン・ステーブ・リカー等が使
用できる。

培養は、ρ８５．５〜８．５、温度１８°Ｃ−４０°Ｃ
で、通気攪拌培養により行われる。培養５〜９０時間で
培養菌体中にＨＰが蓄積するので、培養物から菌体を集
菌、破砕し、遠心分離して得られる上澄から通常の抽出
方法に従ってポリペプチドを採取する。菌体の破砕は、
菌体をリゾチーム処理後、凍結、融解する方法、超音波
処理による方法、浸透圧による方法により行うことがで
きる。また、該ポリペプチドの検出は培養菌体を直接レ
ムリ　（Ｌａｅｍｍｌｉ）のサンプルバッファー〔レム
リ（Ｌａｅｍｍｌｉ）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、
２２７，６８０（１９７０））Ｋ溶解後、５ＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動〔レム’Ｊ　（Ｌａｅｍｍ
ｌ　ｉ）の方法：同上文献〕を行い、クマシーブリリア
ントプルー姿色によって打う。

また生産されたホ゛リペブ千ドがヒトプロラフチント１
ｉ−のポリペプチドであることを確認するには、上記に
従って５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル−気米動によっ
て分離されたポリペプチドを、ＮａｎＫニトロセルロー
スフィル！’　　ＣＷ、Ｎ、Ｂｕｒｎｅｔｔｅ：Ａｎａ
ｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、１１２．１９５−２０３（１９
８１））プロッティングし、プロラクチンのバンドＥＨ
Ｐに対する抗体と、プロティンＡ・ホースラデイシュ・
パーオキシダーゼ・コンジュゲー）（Ｅ−Ｙラボラトリ
ーズ）および４−クロロ−１−ナフトールを用いるエン
ザイム・イムノアラ七イ％ｇＰ、Ｂｕｃｌｅ　　ａｎｄ
　　Ｅ、Ｚｅｈｅｌｅｉｎ：Ｇｅｎｅ、１６，１４９（
１９８１）ｌ）Ｉｃより、検出することができる。

（実　施　例） 以下）て本発明の実施例を示す。

実施Ｍ１　１ａｃプロモーター洸よるＨＰの発現ＨＰを
コードするＤＮＡを含むプラスミドｐｈＰＲＬ９　２５
ｐ９を１０　ｍＭ、　）リス−ＨＣＩ（ｐ）１７．５）
　、　　７ｍＭＭｇｃＩ２．６０ｍＭＮａＣｌ、７ｍＭ
２−メルカプトエタノールを含む溶液３００＃に溶解し
、制限酵素ＨａｅｌｌＯＯ単位を加え、３７℃２時間消
化を行なった。この反応液をポリアクリルアミドゲル電
気泳動を行った後、電気溶出法によりＮ末端付近江相当
する１　４５　ｂｐのＤＮＡ断片約０．８ｐりを得た。

次Ｋ、このＤＮＡ０．８メｙと下記に示す１０ｍｅｒの
リン酸化Ｈｉ　ｎ　ｄ　ＩＩリンカ−ＤＮＡ（全酒造社
製） ５’−ｐＣＣＡＡＧＣＴＴＧＧ　　−３’３’−ＧＧＴ
ＴＣＧＡＡＣＣｐ−５’ １）ｔｙを６６　ｍＭ　）リス−ＨＣＩ（ｐＨ７，６）
　、　　６．６ｍＭＭｇＣ１２，１０ｍＭ　　ジ千オス
レイトール、１ｍＭＡＴＰを含む溶液２０声ｌＫ溶解し
、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（全酒造社製）５０単位を加え、
１４５℃１６時間結合反応分行った。該反応液からエタ
ノール沈澱法によりＤＮＡを回収した。このＤＮＡを１
０　ｍＭトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，５）、　７ｍＭ　
ＭｇＣ１４，６０ｍＭＮａＣ１を含む溶液（以下Ｈｉｎ
ｄｉＳｌ衝液という）析液０／ｉｌＫ溶解し、制限酵素
Ｈｉｎｄｌ１００単位を加え、３７℃で２時間消化を行
った。該反応液からエタノール沈澱法によりＤＮＡを回
収した。

このＤＮＡＥｌｏｏｍＭ　　）リス−ＨＣＩ（ｐＨ７，
５）。

７ｍＭ　Ｍｇｃ＋２．５０ｍＭＮａＣｌ、７ｍＭ　２−
ｙｔｈカプトエタノール、０．０１％ウシ血清アルブミ
ン？含む溶液（以下、ＥｃｏＲＩ緩衝液という）１００
＃に溶解し、制限酵素ＥｃｏＲ１１０単位？加え、３７
　”Ｃ２時間消化を行った。この反応液をポリアクリル
アミドゲル電気泳動を行った後、電気溶出法によりヒト
プロラクチンのＮ末端付近に相当する１２８ｂｐのＨｉ
ｎｄｌｌ−ＥｃｏＲＩ断片約ｏ、５ｐｙを得た。

次に、プラスミドｐｈＰＲＬ９２５ｆｉ！ｊをＥｃｏＲ
Ｉ緩ｊ液３００）’ｌＫ溶解し、制限酵素ＥｃｏＲ１１
００単位を加え、３７°Ｃ２時間消化反応を打った。該
反応液からエタノール沈澱法によりＤＮＡを回収した。

このＤＮＡをＨｉｎｄｍｌｉ液３００ｚ／液溶００ｚ／
限酵素ＨｉｎｄＩＩ　１００単位を加え、３７°Ｃ２時
間消化を行った。この反応液３ポリアクリルアミドゲル
電気泳動を行った後、電気油出法によりヒトプロラクチ
ンのＣ末端付近洗相当する５４１ｂｐのＥｃｏＲＩ−Ｈ
ｉｎｄｌｌｌＤＮＡ断片約２．ｉＩ？を得た。

次に、プラスミドｐＵＣ１９５）”；’をＨｉｎｄｌｌ
緩衝液１００／ｌｔ！に溶解し、制＠酵素Ｈｉｎｄｌ１
１５単位を加え、３７°Ｃ２時間消化を行った。この反
応液からエタノール沈澱法てよりＤＮＡを回収した。こ
のＤＮＡを１０ｍＭ）リス−ＨＣＩ（ｐＨｓ、　０　）
、　Ｏ，１ｍＭ　ｘ千しンジアミン四酢酸（以下、ＥＤ
ＴＡという）Ｋ溶解し、バクチリアルアルカリホスファ
ターゼ（全酒造社製）０．４単位を加え、６５°Ｃ２時
間反応を行い、５′位のリン酸基を脱リン酸した。

上記で得たプラスミドｐｈＰＲＬ９由来のＨｉｎｄｕ−
ＥｃｏＲＩ断片（１２８ｂｌ））０．０２８ｐｍｏＬ　
ＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄ１１ＤＮＡ断片（５４１ｂｐ）０
．０２８ｐｍｏｌ、　　プラスミドｐＵＣ１９のＨｉｎ
ｄ１１１消化物（約２．７Ｋｂ）０．０２８ｐｍｏＩを
６６ｍＭ）リス−ＨＣ１（ｐＨ７，６）、　８．６ｍＭ
　ＭｇＣｌ２．１０ｍＮ■ジチオスレイトール、１ｍＭ
ＡＴＰを含む溶液２０声ｌに溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼ５０単位を加え、１２．５°Ｃ１６時間結合時間分行
った。

この反応液を用いてＥ、ｃｏｌｉＪＭ１０３を形質転換
し、アンピシリン耐性の形質転換株を得た。これらの株
の中からＨＰを生産する株をＨＰＫ対する抗血清とプロ
ティンＡ・ホースラデイシュ・パーオキシダーゼ・フン
シュゲート（Ｅ−Ｙラボラトリーズ社製品）および４−
クロロ−１−ナフトールを用いるエンザイム・イムノア
ッセイ法［：Ｐ、Ｂｕｃｋｌ　　ａｎｄ　　Ｅ、Ｚｅｈ
ｅｌｅｉｎ：Ｇｅｎｅ、１６，１４９（１９８１））に
より選択した。ＨＰ生産株よりプラスミドＤＮＡを回収
し、第１図に示したプラスミドｐＬＰ１００を得た。プ
ラスミドｐＬＰ１００の構造は制限酵素Ｈ＋　ｎ　ｄ　
ＩＩ　＋　Ｅ　ＣＯＲＩで切断し、アガロースゲル電気
泳動およびポリアクリルアミドゲル電気泳動法により確
認した。

実ｔｍ例２　　トリプトファンプロモーターによるヒト
プロラクチンの発現 ヒトプロラクチンをコードするＤＮＡを含むプラスミド
ｐｈＰＲＬ９２５／’！？を１０ｍＭ）リス−ＨＣＩ（
ｐＨ７，５）、７ｍＭＭｇＣｌ□、７ｍＭ　２−メルカ
プトエタノールを含む溶液３００ｐｌＫ溶解し、制限酵
素Ｈｐａｌｌ　１００単位を加え、３７°Ｃ２時間消化
を行った。この反応液からエタノール沈澱法によりＤＮ
Ａを回収した。

このＤＮＡをＥｃｏＲｆＭ＆液、３００．ｇｆに溶解し
、制限酵素ＥｃｏＲＩ　１００単位を加え、３７℃２時
間消化を行った。この反応液をポリアクリルアミドゲル
電気泳動２打った後、電気溶出法により１０１ｂｐのＨ
ｐａｎ−ＥｃｏＲＩＤＮＡ断片約０．５．Ｂ９を得た０
次にプラスミドｐＬＰ１００１５／’ＰをＥｃｏＲＩ緩
衝液１００／’７’に溶解し、制限酵素ＥｃｏＲＩ　４
５単位３力ａえ、３７°Ｃ２時間消化を行った。この反
応液からエタノール沈澱法によりＤＮＡを回収した。

このＤＮＡを１０ｍＭ　　トリス−ＨＣＩ（ｐＨｓ、　
Ｏ）、　７ｍＭ　ＭｇＣｌ２，１００ｍＭ　ＮａＣ１，
２ｍＭ　　２−メにカプトエタノール、０．０１％ウシ
血清アルブミンを含む溶液ｃ以下、ＢａｍＨＩ緩衝液と
いう）１００．ＩＩ／に溶解ｔ、、制限酵素ＢａｍＨＩ
　４５単位を加え、３７℃２時間消化を行った。この反
応液をアクリルアミド電気泳動後、電気溶出法により５
７１ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩＤＮＡ断片約Ｌ５，
１１９を得た。

次にプラスミドｐＤＲ７２０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製
）５ｐ９を１０ｍＭ）リス−ＨＣｌ、７ｍＭ　ＭｇＣｌ
、、１００ｍＭＫＣＩ、　７ｍＭ　２　　Ｚ　ｋヵプト
エタ／−ル、Ｑ、Ｑ１％ウシ血清アルブミン溶液を含む
１００．ｇｌに溶解し、制限酵素Ｈｐａｌ１５単位を加
え、３７°ｃ２時間消化を行った。この反応液がらエタ
ノール沈澱法によりＤＮＡｔ−回収した。このＤＮＡを
ＢａｍＨＩａ）析液１０（１／に溶解し、制限酵素Ｂａ
ｍＨＩ　１５単位を加え、３７℃２時間消化を打った。

この反応液を低融点アガロースゲル電気泳動後、約４ｋ
ｂのＨｐａｌ−ＢａｍＨＩＤＮＡ断片約２）１ノを得た
。

一方成熟ヒトプロラクチンをコードスルＤ　Ｎ　Ａの発
現に必要な翻訳開始コドンＡＴＧおよびＳＤ配列を付加
し、さらにベクターＤＮＡと上記ＤＮＡ断片を連結する
目的でＤＮＡリンカ−を合成した。

まず下記に示した一本ｍＤＮＡ５４ｍｅｒと５６ｍｅ　
ｒを固相ホスホ・アミダイト法洸より合成した。

ＡＣＡＡＴＧＴＴＧＣＣＣＡＴＣＴＧＴＣＣ−３’ＴＧ
ＴＴＡＣＡＡＣＧＧＧＴＡＧＡＣＡＧＧＧＣ−５’５４
ｍｅｒおよび５６ｍｅｒの一本ａｉｌ　ＤＮＡ各々１０
０ｐ１００ｐを１０ｍＭ　トリス−ＨＣＩ（ｐＨ７，５
）、　１ｍＭ　ＥＤＴＡを含む溶液ｌＯμｌに溶解した
。

上記で得たプラスミドｐｈＰＲＬ９由来のＨｐａｌｌ−
ＥｃｏＲＩ断片（１０１ｂｌ））０．０１９　ｐｍｏ　
ｌ、プラスミドｐＬＰ１００由来のＥｃｏＲＩ−Ｂａｍ
ＨＩ断片（５７１ｂ　ｐ）０．０１９ｐｍｏｌ、プラス
ミド’ｐＤＲ７２０１７）ＨｐａＩ−ＢａｍＨＩ断片（
約４　Ｋｂ）０．０１９　ｐｍｏ　ｌを６６ｍＭトリス
ＨＣＩ（ｐＨ７，６）、　６．６ｍＭ　ＭｇＣ１２，１
０ｍＭジ千オジチオスレイトールＭ　ＡＴＰを含む溶液
２０ｐｌンζ溶解し、これに上記の合成りＮＡ溶夜１．
ＩＩｌを加えた。この混合液πＴ４ＤＮＡ’Ｊガーゼ（
宝漬造社製）５０単位Ｐ加え、１２．５°Ｃ１６時間結
合時間分打った。この反応液を用いてＥ、ｃｏｌｉＨＢ
ｌｏｌを形質転換し、アンピシリン耐性の形質転換株を
得た。

こｎらの株の中からヒトプロラフ千ン？生産する株をヒ
トプロラクチンに対する抗血清とプロティンＡ・ホース
ラディシュ・パーオキシダーゼ・フンジュゲー）（Ｅ−
Ｙラボラ）　ＩＪ−Ｘ社製）および４−クロロ−１−ナ
フトールを用いるエンザイム・イムノアッセイ法（Ｐ、
Ｂｕｃ−ｋｌ　ａｎｄ　Ｅ、Ｚｅｈｅｌｅｉｎ：Ｇｅｎ
ｅ、１６，１．４９（１９８１））により選択した。

ヒトプロラクチン生産株よりプラスミドＤＮＡを回収し
、第２図に示したプラスミドｐＴｐ１００を得た。プラ
スｓ　ト”ｐＴＰｌｏｏの構造は制限酵素ＢａｍＨ１、
ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＨ，ＨｐａＩ、ＨｐａＩＩで切
断し、アガロースゲル電気泳動およびボ゛リアクリルア
ミドゲル電気泳動法により確認した。

実施例３ タック・プロモーターによるヒトプロラクチンの発現 ヒトプロラクチンをコードするＤＮＡを含むブラフ、　
ミ）’　ｐｈＰＲＬ９２５１ｔ９を１０ｍＭ　）　’Ｊ
スーＨＣ１（ｐＨｓ、　０　）、１５０ｍＭのＮ”　ｃ
ｌ＋　１０ｍＭのＭ　ｇ　Ｃｌ　２．１０　ｍＭの２−
メルカプトエタノールを含む溶液３００＃Ｌ：溶解し、
＄ｉ！ｌｌ１ＪＰ酵素Ｂｓ　ｔＥＩＩｔ　１００単位加
え、３７°Ｃで２時間消化を行った。この反応液からエ
タノール沈澱法によりＤＮＡを回収した。

コノＤ　Ｎ　Ａ　ヲＨ＋　ｎ　ｄ　ＩＩ緩衝液１ｏｏｐ
Ｉ！ｔ、＝ｇ解し、制限酵素Ｈｉ　ｎ　ｄ　ｍを５０単
位加え、３７°Ｃで２時間消化を行った。この反応液を
ポリアクリルアミドゲル電気泳動処理に付した後、電気
溶出法により６２０ｂｐのＢｓｔＥＤ−Ｈｉｎｄ１ｍＤ
ＮＡ断片約２メクを得た０ 次に、プラスミドｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ社製）５声７をＨｉｎｄｌｌｌ緩衝液１００＊ｒに溶
解し、制限酵Ｎ　Ｈｉ　ｎ　ｄ　ＩＩを１０単位加え、
３７°Ｃで２時間消化を行った。この反応液からエタノ
ール沈澱法によりＤＮＡを回収した。このＤＮＡをＥｃ
ｏＲＩ緩衝液１００，１１１！、：溶解し、利■酵素Ｅ
ｃｏＲＩｔｌＯ単位加え、３７℃で２時間消化を行った
。この反応液を低融点アガロ−スゲルミ気泳動処理に付
して後、約４．５ｋｂのＨｉｎｄｌｌｌ−ＥｃｏＲ１断
片約４７１７を得た。一方成熟ヒトブロラクチンをコー
ドｊるＤＮＡに、その発現に必要な翻訳開始コドンＡＴ
Ｇを付加する目的で、またベクターＤＮＡと上記ＤＮＡ
断片を連結する目的で、Ｄ　Ｎ　Ａ　’Ｊンヵーを合成
したＯ まず下記に示した一本鎖ＤＮＡ４３ｍｅｒと４４ｍｅｒ
を固相ホスホ・アミダイト法により合成した。

５’−ＡＡＴＴＡＴＧＴＴＡＣＣＡＡＴＴＴＧＴＣＣＡ
ＧＧＡＧＧＡ３’−ＴＡＣＡＡＴＧＧＴＴＡＡＡＣＡＧ
ＧＴＣＣＴＣＣＴＧＣＡＧＣＡＡＧＡＴＧＴＣＡＧ−３
’ＣＧＴＣＧＴＴＣＴＡＣＡＧＴＣＣＡＣＴＧ−５’４
３ｍｅｒおよび４４ｍｅｒの一本ｍＤＮＡ各々１００ｐ
１００ｐを１０ｍＭのトリス−ＨＣ／（ｐＨ７，５）と
、１ｍＭのＥＤＴＡとを含む溶液１ｏμｌに溶解した。

上記で得たプラスミドｐｈＰＲＬ９由来のＢｓｔＥＩＩ
−Ｈｉ　ｎ　ｄ　ｆｆ１（６２０ｂ　ｐ）の０．０２８
ｐｍｏｌと、プラスミドｐＫＫ２２３−３由来のＨｉ　
ｎｄ　’Ｍ−Ｅｃ　ｏＲＩ断片（約４．５　ｋ　ｂ）の
０．０２８ｐｍｏｌとを、６６ｍＭのトリス−ＨＣｌ争
８７．６）と、６．６　ｍ　ＭのＭｇＣ１，と、１０ｍ
Ｍのジチオスレイトールと、１ｍＭのＡＴＰとを含む溶
液２０声ｌに溶解し、これに上記の合成りＮＡ溶液１）
”ｌを加えた。この混合液に７４ＤＮＡＩＪガーゼ（全
酒造社製）を５０単位加え、１１５°Ｃ１１６時間結合
反応を行った。この反応液を用いてＥ、ｃｏｌｉ　ＪＭ
１０９を形質転換し、アンピシリン耐性の形質転換株を
得た。これらの株の中からヒトプロラクチンを生産する
株を、ヒトプロラクチンに対する抗血清と、プロティン
Ａ・ホースラデイシュ・パーオキシダーゼ・コンジュゲ
ート（Ｅ−Ｙラボラトリーズ社製）と、４−クロロ−１
−す７トールとを眉いるエンザイム・イムノアッセイ法
により、選択した。ヒトプロラクチン生産株よりプラス
ミドＤＮＡを回収し、第３図に示したプラスミドｐＴＬ
１００を得た。プラスミドｐＴＬ１００の構造は、制限
酵素ＥＣ０ＲＩ％ＢｓｔＥＩ［、Ｈｉｎｄｌｌｌで切断
し、アガロース電気泳動法により確認した。

実施例４ この実施例は、プラスミドｐＬＰ１００を保持するＥ、
ｃｏｌｉ　　ＪＭ１０３を培養してＨＰを生産させた。

その詳細は次のとおりである。

まず、実施例１で示した組み換えプラスミドｐＬＰ１０
０を保持するＥ、ｃｏｌｉ　　ＪＭ１０３を５ｍｅのし
−ｂｒｏｔｈ　（ＬＯ％Ｔｒｙｐｔｏｎ、０．５％Ｙｅ
ａｓｔｅｘｔｒａｃｔ、ＬＯ％　ＮａＣ１，５０Ａｆ’
１ｒｎｔＴンピシリン）に接種し、３７℃で培養し、培
養液の濁度がＯＤｇｓｏ　ｎｍｚｏ、２〜０．３になっ
た時点で、ラクトースプロモーターの誘導剤であるβ−
Ｄ　−−（ソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を
２ｍＭの濃度になるように添加し、３７℃で１５時間培
養を継続した。得られた培養液を１２０００ｒｐｍ、１
０分間遠心して菌体を回収した。この菌体をＬａｅｍｍ
ｌｉのサンプルバッファーに懸濁し、１００°Ｃ１１０
分間加熱した後、Ｌａｅｍｍｌｉの方ｆｇＵ、　Ｋ、　
Ｌａ　ｅｍｍ　Ｉ　ｉ　：Ｎａｔｕｒｅ、２２７，６８
０−６８５（１９７０））に従って５ＤＳ−ポリアクリ
ルアミド電気泳動を行い、次にＢｕｒｎｅｔｔｅの方叡
Ｗ、Ｎ、Ｂｕｒｎｅｔｔｅ：Ａｎａｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、、１１２，１９５−２０３（１９８１
））に従って分離されたポリペプチドをニトロセルロー
スフィルターに電気的にブロッティングした。次いで、
コノニトロセルロースフィルターをＨＰに対スる抗体と
プロティンＡ・ホースラディシュ・パーオキシダーゼ・
フンシュゲートおよび４−クロロ−１−す７　）−ルヲ
用いるエンザイム・イムノアッセイ法により処理をして
、分子量的２２，０００の位置にプロラクチンのバンド
を検出した。このバンドは該プラスミドを保持しない大
腸菌には検出できなかった。この結果、プラスミドｐＬ
Ｐ１００　　を保持する大腸菌はＨＰを生産しているこ
とがねがった。

プラスミドｐＬＰ１００を保持する大腸菌Ｅ、（ｏｌｉ
ＬＰｌｏｏは、昭和６２年１２月１２日にＦＥＲＭＰ−
９７５９として、工業技術院微生物工業技術研究所に寄
託されている。

実施例５ この実施例は、プラスミドｐＴｐ１００を保持するムシ
すｉ　　ＨＢＩＯＩを培養してＨＰを生産させた。

その詳細は次のとおりである。

まず、実施例２で示した組み換えプラスミドｐＴＰ１０
０を保持するＥ、ｃｏｌｉ　　ＨＢＩＯＩを５ゴのＭ９
−カザミノ酸培地（０，６％Ｎａ２ＨＰＯ，，０，３％
ＫＨ２ＰＯ４゜０．５％ＮａＣｌ、０．１％ＮＨ，ＣＩ
、０．２％グルコース、０．２％カザミノ酸、２／＋り
／ｄ塩酸チアミン、　２　ｍＭ　Ｍ　ｇ　Ｓ　０４　＋
０．１ｍＭ　ＣａＣ１，，２００）’？／ｍｌプロリ：
／、２００／’り／−ロイシン、１００μ！／ｍｔ７ン
ビシリン）に接種し、３７°Ｃで培養し、培養液の濁度
がＯＤ　６．、　ｎｍ＝０．２〜０．３になった時点で
、トリプトファンプロモーターの誘導剤であるβ−イン
ドールアクリル酸（ＩＡＡ）を２５μｙ／ｍｌの濃度に
なるように添加し、３７°Ｃで１５時間培養を継続した
。得られた培養液を１２００Ｏｒｐｍ、１０分間遠心し
て菌体を回収した。この菌体をＬａｅｍｍｌｉのサンプ
ルバッファーに懸濁し、１００°Ｃ１１０分間加熱した
後、Ｌａｅｍｍｌｉの方法（Ｕ、に、Ｌａｅｍｍｌｉ：
Ｎａｔｕｒｅ、２２７，６８０−６８５（１９７０））
に従って５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル１気泳動を行
い、次にＢｕｒ−ｎｅｔｔｅの方法（Ｗ、Ｎ。

Ｂｕｒｎｅｔｔｅ：Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、１１
２，１９５−２０３（１９８１）〕に従って分離された
ポリペプチドを二トロセ・１０−スフイルターに電気的
にプロ゛ンティングした。次いで、このニトロセルロー
スフィルターをＨＰに対する抗体と、プロティンＡ・ホ
ースラブ・ｆシュ・パーオキシダーゼ・フンジュゲ）　
オ、１：　’ＣＦ　４−クロロ−１−ナフトールを用い
るエンザイム・イムノアッセイ法により処理をして、分
子１約２２，０００の泣面にＨＰの・くンドを検出した
。このバンドは該プラスミドを保持しない大腸菌には検
出できなかった。この結果、プラスミドｐＴＰ１００を
保持する大腸菌はＨＰを生産していることがわかった。

プラスミドｐＴＰ１００を保持する大腸菌Ｅ、ｃｏｌｉ
ＴＰ１００は、昭和６２年１２月１２日にＦ　Ｅ　ＲＭ
Ｐ−９７６０として、工業技術院微生物工業技術研究所
に寄託されている。

実施例に の実施例は、プラスミドｐＴＬ１００を保持するＥ、Ｃ
ｏｔｉ　ＪＭ１０９を培養してＨＰを生産させた。

その詳細は次のとおりである。

まず、実施例３で得た組み換えプラスミドｐＴＬ１００
を保持するＥ、ｅｏｌ＋　ＪＭ１０９を、５ＴｎｅのＬ
−ｂｒｏｔｈ（１０％のＴｒｙｐｔｏｎ、　０．５％の
Ｙｅａｓｔ　　ｅｘ（ｒａｃｔ、１０％のＮａＣｌ、　
５０／’９Ｉ／ｍｅ〕？　ンヒシ’Ｊ　；）に接種し、
３７°Ｃ″ｃ培養し、菌体の生育がＯＤ６．。

ｎｍ＝０．２〜０．３になった時点で、タック・プロモ
ーターの誘導剤であるβ−Ｄ−イソプロピルチオガラク
トサイド（ＩＰＴＧ）を２ｍＭの濃度になるように添加
し、３７°Ｃで１５時間培養を継続した。得られた培養
液を１２００Ｏｒｐｍで１０分間遠心して菌体を回収し
た。この菌体をＬａｅｍｍｌｉのサンプルバッファーに
懸濁して後、１００°Ｃで１０分間加熱し、その後Ｌａ
ｅｍｍｌｉの方法（Ｕ、　Ｋ、　Ｌａｅｍｍｌ　ｉ　：
Ｎａｔｕｒｅ、２２７，６８０−６８５（１９７０））
に従って５ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動を行い、
次にＢｕｒｎｅｔｔｅの方法（Ｗ、Ｎｅａｌ　Ｂｕｒｎ
ｅｔｔｅ：Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、１１２，１９
５−２０３（１９８１））に従って分離されたポリペプ
チドをニトロセルロースフィルターに電気的にブロッテ
ィングした。次いで、このニトロセルロースフィルター
を、ヒトプロラクチンに対する抗体と、プロティンＡ・
ホースラデイシュ・パーオキシダーゼ・フンシュゲート
を用いるエンザイム・イムノアッセイ法により処理をし
て、分子１約２２，０００の部位にプロラクチンのバン
ドを検出した。このバンドは該プラスミドを保持し、な
い大腸菌には検出できなかった。

この結果、ｐＴＬｌｏｏを保持する大腸菌はヒトプロラ
クチンを生産していることがわかった。

ｐＴＬｌｏｏを保持する大腸菌は、昭和６３年１１月３
０日に　ＦＥＲＭ　Ｐ−１０４２１として、工業技術院
微生物工業技術研究所に寄託されている。

（発明の効果） 本発明によれば、微生物中においてヒトプロラクチンポ
リペプチドをコードするＤ　Ｎ　、Ａを発現する組み換
え体ＤＮＡ、該組み数組体ＤＮＡを含む菌類が得られ、
これによってヒトプロラクチンポリペプチドを大量に生
産することができる。ヒトプロラクチンポリペプチドを
大】に生産すれば、ＨＰの生理活性等の解明に役立つだ
けでなく、さらに種々の疾患の治療に役立てることがで
きるので、その貢献は甚だ大きい。

【図面の簡単な説明】

第１図は組み換えプラスミドｐＬＰ１００の構築過程を
示し、第２図は組み換えプラスミドｐＴＰ１００の構築
過程を示し、第３図は組み換えプラスミドｐＴＬ１００
の構築過程分示している。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、第１表に示したヒトプロラクチンポリペプチドをコ
   ードする遺伝子の上流に、プロモーター、シャインダル
   ガルノ配列及び翻訳開始コドンをこの順序に組み込んで
   作られた、ヒトプロラクチン生産用組み換えＤＮＡ。 ２、第１表に示したヒトプロラクチンポリペプチドをコ
   ードする遺伝子がプラスミドｐｈＰＲＬ９から得られ、
   プロモーター、シヤインダルガルノ配列及び翻訳開始コ
   ドンがプラスミドｐＵＣ１９から得られ、これらを結合
   させてプラスミドｐＬＰ１００とした、特許請求の範囲
   第１項に記載するヒトプロラクチン生産用組み換えＤＮ
   Ａ。 ３、第１表に示したヒトプロラクチンポリペプチドをコ
   ードする遺伝子がプラスミドｐＬＰ１００から得られ、
   プロモーター、シヤインダルガルノ配列及び翻訳開始コ
   ドンがプラスミドｐＤＲ７２０と合成りＮＡリンカーか
   ら得られ、これらを結合させてプラスミドｐＴＰ１００
   とした、特許請求の範囲第１項に記載するヒトプロラク
   チン生産用組み換えＤＮＡ。 ４、第１表に示したヒトプロラクチンポリペプチドをコ
   ードする遺伝子がプラスミドｐｈＰＲＬ９から得られ、
   プロモーター、シヤインダルガルノ配列及び翻訳開始コ
   ドンがプラスミドｐＫＫ２２３−３と合成りＮＡリンカ
   ーから得られ、これらを結合させてプラスミドｐＴＬ１
   ００とした、特許請求の範囲第１項に記載するヒトプロ
   ラクチン生産用組み換えＤＮＡ。 ５、第１表に示したヒトプロラクチンポリペプチドをコ
   ードする遺伝子の上流に、プロモーター、シヤインダル
   ガルノ配列及び翻訳開始コドンを、この順序に組み込ん
   で作られたヒトプロラクチン生産用組み換えＤＮＡを細
   菌に導入してなる、ヒトプロラクチン生産用菌株。 ６、細菌がエッシエリヒア・コリである特許請求の範囲
   第５項に記載する菌株。 ７、第１表に示したヒトプロラクチンポリペプチドをコ
   ードする遺伝子の上流に、プロモーター、シヤインダル
   ガルノ配列及び翻訳開始コドンをこの順序に組み込んで
   作られたヒトプロラクチン生産用組み換えＤＮＡを細菌
   に導入して形質転換された菌株を作り、この菌を培養し
   てヒトプロラクチンポリペプチドを生産させ、これを採
   取することを特徴とするヒトプロラクチンの生産方法。