JPH05170796A

JPH05170796A - 細胞接着活性ペプチド及びその高分子修飾体

Info

Publication number: JPH05170796A
Application number: JP3355319A
Authority: JP
Inventors: Ichiro Azuma; 市郎東; 育夫 ▲済▼木; Ikuo Saiki; Naoto Kususe; 直人楠瀬; Zenji Ikeda; 善治池田; Keiichi Ono; 圭一小野
Original assignee: Sumitomo Pharmaceuticals Co Ltd
Current assignee: Sumitomo Pharmaceuticals Co Ltd
Priority date: 1991-12-19
Filing date: 1991-12-19
Publication date: 1993-07-09
Anticipated expiration: 2016-12-04
Also published as: JP3235855B2; WO1993012140A1

Abstract

(57)【要約】【構成】細胞接着コア配列の繰り返し構造からなる、
式（Ｉ）【化１】〔式中、ｎは３以上２０以下の整数である。〕で表され
る高純度の細胞接着活性ペプチド。および、この細胞接
着活性ペプチドのＮ末端アミノ基をポリエチレングリコ
ール誘導体を用いて高分子修飾することによって得られ
る高分子修飾ペプチド。【効果】本発明の細胞接着活性ペプチドは、強い癌転
移抑制活性を有し、その高分子修飾ペプチドはさらに強
い癌転移抑制活性を有する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、細胞接着活性ペプチ
ド、およびその高分子修飾体である、ポリエチレングリ
コール誘導体によって修飾された高分子修飾ペプチドに
関する。さらに、これらペプチドまたは高分子修飾ペプ
チドを含む癌転移抑制剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】フィブロネクチン，ラミニンおよびビト
ロネクチン等は、細胞と間質結合組織との接着に関与
し、動物細胞の細胞機能に関連した多彩な生理活性を持
つ蛋白質であり、細胞接着活性蛋白質と総称される。例
えばフィブロネクチンは肝臓で合成されヒト血漿中に約
０．３mg／mlの濃度で存在する糖蛋白質である。フィブ
ロネクチンは、分子量約２５０ＫのポリペプチドＡ鎖と
約２４０ＫのＢ鎖がカルボキシル末端近くでジスルフィ
ド結合し、二量体を形成している。フィブロネクチンの
一次構造は、コーンブリットら（Ｋｏａｒｎｂｌｉｈｔ
ｔ，Ａ．Ｒ．ｅｔａｌ：ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ．
４，２５１９（１９８５））により分子クローニング技
術を用いて決定されている。また、ラミニンの一次構造
は佐々木ら（Ｓａｓａｋｉ，Ｍ．ｅｔａｌ：Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８４，９３
５（１９８７）；Ｓａｓａｋｉ，Ｍ．ｅｔａｌ：Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２，１７１１１（１９８
７））により、そしてビトロネクチンは鈴木ら（Ｓｕｚ
ｕｋｉ，Ｓ．ｅｔａｌ：ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ．
４，１７５５（１９８５））によってそれぞれ決定され
ている。そして、細胞接着活性に関与する結合部位の研
究も行われ、フィブロネクチンを蛋白質分解酵素で限定
分解して得られる断片のヘパリン、コラーゲン、細胞お
よび細菌への結合の研究から、それぞれＡ鎖、Ｂ鎖の両
鎖とも結合部位が決定されている（Ｙａｍａｄａ，Ｋ．
Ｍ．：Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５２，７６
１（１９８３））。さらに、その細胞結合部位のコア配
列はＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）であることが１
９８４年に解明された（Ｐｉｅｒｓｃｈｂａｃｈｒ，
Ｍ．Ｄ．ｅｔａｌ：Ｎａｔｕｒｅ，３０９，３０（１
９８４））。このＲＧＤ配列は、ビトロネクチンなど他
の接着性蛋白質にも存在していることが明らかになって
いる。

【０００３】フィブロネクチンは上記コア配列を介し
て、被接着細胞のレセプターと接合し、その情報を接着
細胞に伝達しており、また、ヘパリン、コラーゲン、フ
ィブリン等の生体高分子との結合能を有し、細胞と間質
結合組織との接着、細胞の分化、増殖に関与していると
考えられている（Ｙａｍａｄａ，Ｋ．Ｍ．：Ａｎｎ．Ｒ
ｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５２，９６１（１９８
３））。このように、細胞接着活性蛋白質は、種々の生
物活性を有するため、医薬等への応用が研究されてい
る。例えば、血漿中のフィブロネクチン量が低下すると
網内皮系の機能が低下する。このような場合としては、
外科手術や外傷による敗血症、播種性血管内血液凝固、
火傷、重症感染症や外科的ショック等が挙げられる。そ
れらの症状の改善のために、フィブロネクチンの投与が
有効であると考えられている。また、フィブロネクチン
は繊維芽細胞やマクロファージの遊走能を刺激すること
から、創傷の治癒や免疫能の機能の調整への応用が考え
られている。とくに創傷の治癒促進効果を利用した角膜
障害への局所治療は、既に試みられている（Ｆｕｊｉｋ
ａｗａ，Ｌ．Ｓ．ｅｔａｌ：Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓ
ｔ．，４５，１２０（１９８１））。

【０００４】更に、細胞接着活性蛋白質は、癌転移に関
係する物質としても注目されている。癌転移の一連の段
階では、癌細胞は種々の宿主細胞や生体高分子と接触す
る。この時、フィブロネクチンやラミニンのような細胞
接着分子が存在すると、該細胞は多細胞塊を形成し、癌
細胞の増殖や生存をより容易にする。事実、ラミニンを
癌細胞と混合して動物に投与すると、癌転移が増強する
ことが認められている。ところが、ラミニン由来のプ
ロテアーゼ分解フラグメントは、逆に癌転移阻害活性を
有することが報告されている（Ｂａｒｓｋｙ，Ｓ．Ｈ．
ｅｔａｌ：Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，７４，８４
３（１９８４））。同様に、フィブロネクチンの接着コ
アであるトリペプチドＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（Ｈｕｍ
ｐｈｉｒｉｅｓ，Ｍ．Ｊ．ｅｔａｌ：Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ，２３３，４６７（１９８６））やラミニンの接着コ
アであるペンタペプチドＴｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅ
ｒ−Ａｒｇ（Ｉｗａｍｏｔｏ，Ｙ．ｅｔａｌ：Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ，２３８，１１３２（１９８７））も癌の転移
を抑制することが確認されている。さらに、これら接着
コアの繰り返し構造からなるポリマーペプチドは、その
モノマーペプチドに比べ強い血小板凝集抑制活性および
癌転移抑制活性を示すことが知られている。（東等，
特開平２−１７４７９８号公報）

【０００５】一方、ペプチド性医薬品を生体内に投与す
る際の問題点として、生体内クリアランスが非常に速い
という点と、ヒト型の天然蛋白質以外には抗原性がある
という点が挙げられる。このような問題点を解決するた
めの有用な手段のひとつとして、ポリエチレングリコー
ル誘導体によってタンパク質，ペプチドを修飾すること
により、生体内クリアランスを遅延させたり、抗原性を
低下させることが知られている。（Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎ
ｃｅｒＲｅｓ．，７７，１２６４（１９８６）．，特
公昭５６−２３５８７号公報，特開昭６１−１７８９２
６号公報，ＣａｎｃｅｒＢｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ．，７，１７５（１９８４）．，特開昭６２−１１
５２８０号公報など。）

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】上述のように、フィブ
ロネクチンやラミニン等の細胞接着活性蛋白質は、様々
な生物活性を有しており、その関連物質を医薬として応
用する技術の開発が望まれていた。特に、フィブロネク
チンやラミニン等の接着コア配列の癌転移抑制作用は、
医薬としての応用価値の高いものと考えられるが、該コ
ア配列の細胞接着活性が充分でないため、それらの癌転
移抑制作用は実際の医療に応用するためには充分満足で
きるものではなく、この点で更に高い活性を持つ物質の
開発が望まれていた。しかしながら、細胞接着活性蛋白
質は天然物質であるからその供給に制限があり、しかも
糖蛋白質であるから、合成法や遺伝子工学的に効率良く
生産するのも非常に困難である。上述の問題点を解決す
る為に、先に述べたように細胞接着コア配列の繰り返し
構造を有するＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐのポリマー、Ａｒ
ｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒのポリマー、およびＡｒｇ
−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｈｒのポリマーにすることによ
り、細胞接着活性が上昇することが知られている（特開
平２−１７４７９８号公報，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ．，８１，６６０（１９９０）．，Ｃａｎｃｅ
ｒＲｅｓ．，４９，３８１５（１９８９）．，Ｉｎ
ｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．，１１，２２６
（１９８９））。上記文献のいずれの場合においても、
ポリマーペプチドの製造は対応するモノマーペプチドを
ジフェニルホスホリルアジド（ＤＰＰＡ）による連続的
重合化法で重合化させて製造する方法である。しかしな
がら、上記文献に記載の方法によってＡｒｇ−Ｇｌｙ−
Ａｓｐ−Ｔｈｒのポリマーの合成を試みたところ、逆相
高速液体クロマトグラフィーによる分析の結果、反応生
成物は極めて多種類のポリマーおよびポリマー合成時の
副生成物であると予想される多種類の化合物からなる混
合物であることが判明した。

【０００７】すなわち、従来知られている方法ではポリ
マーペプチドを得るための重合度をコントロールするこ
とは極めて難しく、事実上均一なポリマーペプチドのみ
を得るのは極めて困難であることが判明した。加えて、
本製造法では一定の品質の化合物を得ることが難しいと
予想され、医薬品化を考慮した場合、大きな問題になる
と思われる。また、このような広範囲にわたる分子量を
持つ種々の化合物を含むペプチド混合物から、工業的な
分離，精製手段（再結晶，再沈澱，限外濾過など）によ
って細胞接着コア配列繰り返し構造を持つ分子量の明確
なペプチドを得ることは、従来なし得られていないのが
実状である。さらに、このような広範囲にわたる分子量
を持つ種々の化合物を含むペプチド混合物を原料とし
て、さらに誘導化（例えば、高分子修飾試剤による修飾
など）をする場合には、得られる誘導体においても同様
の問題が生じることは明らかであり、このようなペプチ
ド混合物は誘導化の原料としては不適当である。従っ
て、本発明の目的のひとつは、細胞接着活性蛋白質の接
着コアアミノ酸配列の繰り返し構造からなる均一で高純
度のポリペプチドを提供することである。また、前述し
たように接着コアアミノ酸配列を繰り返し構造にするこ
とにより、高活性になることが知られているが、医薬品
として使用するためには、さらに活性の強い化合物が望
まれている。そこで、本発明のもう１つの目的は更によ
り生物活性の強い化合物を得るために、上記の高純度の
ポリペプチドにポリエチレングリコール誘導体を縮合さ
せることによって得られる修飾ポリペプチドを提供する
ことにある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために鋭意検討を行った結果、式（Ｉ）の高
純度の細胞接着活性ペプチド（ペプチド（Ｉ））を得る
ことができた。また、ポリエチレングリコールを用いて
高分子修飾体を製造することにより、高活性化に導くこ
とができ、さらに研究を重ねて本発明を完成するに至っ
た。

【０００９】本発明は、（１）式（Ｉ）

【化４】〔式中、ｎは３以上２０以下の整数を表す。〕で表さ
れ、高純度であることを特徴とするペプチド（ペプチド
（Ｉ））、（２）式（ＩＩ）

【化５】〔式中、ｎは３以上２０以下の整数を、Ｒ₁およびＲ₂
は同一または異なる低級アルキル基を、ｐおよびｑは各
ポリエチレングリコール部分の平均分子量が約１０００
〜１２０００となる同一または異なる任意の正の整数
を、ｔは０または任意の正の整数を表す。〕で表される
高分子修飾ペプチド（修飾ペプチド（ＩＩ））、（３）
式（ＩＩＩ）

【化６】〔式中、Ｒ₃は低級アルキル基を、ｋはポリエチレング
リコール部分の平均分子量が約１０００〜１２０００と
なる任意の正の整数を、ｎは３以上２０以下の整数を、
ｕは任意の正の整数を表す。〕で表される高分子修飾ペ
プチド（修飾ペプチド（ＩＩＩ））、（４）ペプチド
（Ｉ）を含む癌転移抑制剤、および（５）修飾ペプチド
（ＩＩ）または（ＩＩＩ）を含む癌転移抑制剤を提供す
るものである。

【００１０】上記式中、ｎで示される正の整数として
は、３ないし１１が好ましく、Ｒ₁、Ｒ₂、およびＲ₃
で表される低級アルキル基は、直鎖状，分枝状のいずれ
でもよいが、メチル，エチル，イソプロピル，ｎ−ブチ
ル等の炭素数１〜４の低級アルキル基が好ましい。ま
た、ポリエチレングリコール部分の平均分子量としては
３０００ないし７０００が好ましく、ｔで表される整数
としては０ないし１０が好ましく、ｕで表される正の整
数としては１ないし１０が好ましい。本発明のペプチド
および高分子修飾ペプチドには、Ｌ−型アミノ酸および
Ｄ−型アミノ酸からなるもの、いずれも含まれる。特
に、Ｌ−型アミノが好ましい。また、本発明の化合物は
医薬品として用いるために、薬学的に許容さる塩、例え
ば塩酸塩、硫酸塩等の無機酸との塩や、酢酸塩、トリフ
ルオロ酢酸塩、乳酸塩、酒石酸塩等の有機酸との塩にし
てもよく、そのような塩への変換は、慣用手段で行うこ
とができる。

【００１１】本発明のペプチド（Ｉ）は目的とする化合
物の純度を高めるため、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｈ
ｒのモノマーを重合させる方法とは異なり、合成の各段
階において中間体の１次配列がはっきりしている方法
で、目的物の１次配列を構築する方法にて合成すること
ができる。このような方法としては、化学的合成法およ
び遺伝子工学的手法を用いた合成法が知られているが、
いずれの方法にても合成することができる。化学的合成
法においては、液相法，固相法が知られているが、いず
れの方法にても合成可能である。また、目的とする１次
配列をＮ末端またはＣ末端より順次構築するステップワ
イズ延長法、目的とする１次配列を適当なフラグメント
に分け、それらフラグメントを縮合させて目的物を構築
するフラグメント縮合法が知られているが、いずれの方
法またはそれらを組み合わせることにより、合成するこ
とができる。また、必要に応じては、官能基（アミノ
基，カルボキシル基，グアニジノ基，水酸基）を保護し
ても良い。縮合法，保護基，反応条件等については、
「ペプチド合成の基礎と実験」（丸善株式会社），「生
化学実験講座・第一巻蛋白質の化学ＩＶ」（東京化学
同人）などに記載の通常のペプチド合成に用いられる方
法，保護基，反応条件を用いて合成することができる。
また、必要に応じては、逆相ＨＰＬＣ，イオン交換クロ
マトグラフィー，ゲル濾過クロマトグラフィーなどの通
常のペプチドの精製法に従って、精製しても良い。こう
して得られる細胞接着活性ペプチドの純度は、ＨＰＬＣ
の面積百分率９０％以上であり、好ましくは９５％以上
である。本発明の細胞接着活性ペプチドは、Ａｒｇ−Ｇ
ｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｈｒのモノマーを重合させる方法で製
造した分子量の明確でない複数の成分からなるポリマー
に比べ、効果的に癌転移を抑制する。くわえて、本発明
の細胞接着活性ペプチドは、高純度であるために医薬品
としてより生物活性の強い化合物を得るための誘導化
（たとえば高分子修飾試剤による修飾など）の原料ペプ
チドとして極めて有用である。

【００１２】本発明の修飾ペプチド（ＩＩ）または（Ｉ
ＩＩ）の製造は、それぞれ、式（ＩＶ）

【化７】〔式中、Ｒ₁，Ｒ₂，ｐ，ｑ，ｔは式（ＩＩ）と同意義
を有する。〕で表されるポリエチレングリコール誘導体
（ＩＶ）、または式（Ｖ）

【化８】〔式中、Ｒ₃，ｋおよびｕは、式（ＩＩＩ）と同意義を
有する。〕で表されるポリエチレングリコール誘導体
（Ｖ）のカルボキシル基活性化体とアミノ基を有するペ
プチド（Ｉ）とを反応させることによって行われる。ポ
リエチレングリコール誘導体（ＩＩ）または（Ｖ）の活
性化方法は通常のカルボキシル基の活性化法、例えば生
化学実験講座第一巻，タンパク質の化学ＩＶ（東京化学
同人）、ペプチド合成の基礎と実験（泉屋ら、丸善株式
会社）に記載されているカルボキシル基の活性化方法よ
り活性化することができる。ポリエチレングリコール誘
導体（ＩＩ）または（Ｖ）のカルボキシル基活性化体
と、ペプチド（Ｉ）との反応においては、反応の温度は
当該ペプチド（Ｉ）が失活しない温度であればいずれで
も良く、例えば０〜２５℃の範囲が好ましい。本発明に
おいて用いられるポリエチレングリコール誘導体（Ｉ
Ｉ）または（Ｖ）は、ｐＨ４．５以上のいずれのｐＨで
も反応させることができるので、反応のｐＨは当該ペプ
チドが失活しないｐＨ４．５以上のｐＨであればいずれ
でも良いが、６〜９の範囲が好ましい。

【００１３】反応に用いる溶媒は、反応を妨害しないも
のであればいずれでもよく、例えばリン酸緩衝液、ホウ
酸緩衝液、炭酸ナトリウム水溶液、炭酸水素ナトリウム
水溶液、Ｎ−エチルモルホリン−酢酸緩衝液、マレイン
酸ナトリウム緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液等の緩衝液
が挙げられる。また、当該ペプチドを失活させず、かつ
反応に不活性な有機溶媒、例えばメタノール、エタノー
ル、プロパノール等の低級アルコールやアセトニトリ
ル、ジオキサン、テトラヒドロフラン等を添加してもよ
い。反応時間は１〜７２時間で充分である。反応終了後
に、反応液を塩析やゲル濾過、イオン交換クロマトグラ
フィー、吸着クロマトグラフィー、アフィニティクロマ
トグラフィー、限外瀘過、逆相ＨＰＬＣなどの通常の蛋
白質の精製法で精製して目的の修飾ペプチドを得ること
ができる。

【００１４】本発明の高純度のペプチド（Ｉ）は細胞接
着活性蛋白質のコア配列を繰り返して有し、該コア配列
を介して細胞接着活性蛋白質と同様の機序で細胞に接着
すると考えられる。そのため細胞接着活性蛋白質のアゴ
ニストまたはアンタゴニストとして、種々の生物活性を
示す。特に、細胞接着活性蛋白質のコア配列に比べて本
発明のペプチド（Ｉ）は、数倍強い癌転移抑制作用を有
する。その他にも毛細血管中で起こる癌細胞による血小
板凝集の抑制作用などの生物活性が認められている。さ
らに、ポリエチレングリコール誘導体（ＩＩ）および
（Ｖ）で修飾されたペプチド（Ｉ）は、対応する非修飾
ペプチド（Ｉ）と比較すると非常に安定な化合物であ
り、かつ非修飾ペプチド（Ｉ）に比べ強力な癌転移抑制
活性を有する。即ちポリエチレングリコール修飾ペプチ
ドは、さらに生体内クリアランスも著しく遅延（即ち持
続性が延長）され、長時間有効にその生理活性を示す。
しかも、本発明の修飾ペプチドは非修飾ペプチド（Ｉ）
の有する生理活性をそのまま有するものである。本発明
のペプチドおよび高分子修飾ペプチドは医薬品，動物薬
として極めて有効である。本発明のペプチドおよび高分
子修飾ペプチドは、通常それ自体公知の担体、希釈剤な
どを用い、適宜の医薬品組成物よりなる製剤（例えば、
カプセル剤、注射剤など）として経口的または非経口的
に哺乳動物（例えば、ウシ，ウマ，ブタ，ヒツジ，ヒト
など）に投与される。癌転移抑制剤として投与する場合
には、本発明のペプチドおよび高分子修飾ペプチドは、
０．２μｇ／kg〜４００mg／kgの範囲で、症状，年齢，
体重等に基づいて決定され、１日１回から数回に分けて
投与することができる。

【００１５】

【実施例】以下の実施例により本発明をより具体的に説
明するが、本発明はこれらによって制限されるものでは
ない。なお、以下の実施例において、ペプチドまたは高
分子修飾ペプチドのアミノ酸分析値とは、これらペプチ
ドまたは高分子修飾ペプチドの酸分解物（６Ｎ塩酸−フ
ェノール，１１０℃，２４時間処理後の分解物）中のア
ミノ酸分析値を表す。略号は以下の通りである。Ｂｏｃ：ベンジルオキシカルボニルｃＨｅｘ：シクロヘキシルＢｚｌ：ベンジルＴｏｓ：ｐ−トルエンスルホニルＰａｃ：フェナシル

【００１６】実施例１（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ）₅の調製ａ）Boc-(Asp(OcHex)Thr(Bzl)Arg(Tos)Gly) ₂-OPac Boc-Asp(OcHex)Thr(Bzl)Arg(Tos)Gly-OPac１７．２４ｇ
（０．０１７ｍｏｌ）をアセトニトリル７０mlに溶解
し、氷冷下メタンスルホン酸１３．３６ｇ（０．１３９
ｍｏｌ）を滴下したのち、室温で１時間攪拌した。再び
氷冷し、ＤＭＦ７０mlを滴下し、さらにトリエチルアミ
ン１２．３ｇ（０．０２０ｍｏｌ）を滴下した。つづい
て、Boc-Asp(OcHex)Thr(Bzl)Arg(Tos)Gly-OH １６．０
ｇ（０．０１８ｍｏｌ），１−ヒドロキシベンゾトリア
ゾール（以下ＨＯＢｔと省略）２．７２ｇ（０．０２０
ｍｏｌ），１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロ
ピル）−カルボジイミド（以下ＷＳＣと省略）３．１２
ｇ（０．０２０ｍｏｌ）を氷冷下で加え、３０分攪拌し
たのち、室温で３時間攪拌した。反応液を１％食塩水２
l中に注ぎ、氷冷下で３０分間攪拌後、沈澱物を瀘取
し、水洗後エーテルで洗浄、乾燥して表題化合物３０．
２ｇを得た。

【００１７】ｂ）Boc-(Asp(OcHex)Thr(Bzl)Arg(Tos)Gly) ₂-OH 実施例１（ａ）の化合物３０．８０ｇ（０．０１８ｍｏ
ｌ）を９０％酢酸２００mlに溶解し、氷冷下亜鉛末５
７．２ｇ（０．８８３ｍｏｌ）を３回に分けて５分ごと
に加え、室温に戻して激しく攪拌した。３時間後、反応
液をセライト濾過し、濾液を１％食塩水２．２ l中に注
ぎ、氷冷下で攪拌したのち沈澱物を濾取し、水洗後、エ
ーテルで洗浄、乾燥して表題化合物２７．１ｇを得た。

【００１８】ｃ）Boc-Arg(Tos)Gly-(Asp(OcHex)Thr(Bzl)Arg(Tos)Gly) ₂-OPac 実施例１（ａ）の化合物１５．７５ｇ（９．０ｍｍｏ
ｌ）をアセトニトリル１５０mlに溶解し、氷冷下、メタ
ンスルホン酸１３．８２ｇ（０．１４４ｍｏｌ）を滴下
したのち、室温で１時間攪拌した。再び氷冷し、ＤＭＦ
１５０mlを滴下し、さらにトリエチルアミン１３．６
４ｇ（０．１３５ｍｏｌを滴下した。つづいて、Boc-Ar
g(Tos)Gly-OH ４．７８ｇ（０．０１０ｍｏｌ），ＨＯ
Ｂｔ１．４７ｇ（０．０１１ｍｏｌ），ＷＳＣ１．６
９ｇ（０．０１１ｍｏｌ）を氷冷下で加え、３０分間攪
拌したのち、室温で３．５時間攪拌した。反応液を１％
食塩水２．５ l中に注ぎ、氷冷下で３０分攪拌後、沈澱
物を濾取し、水洗後エーテルで洗浄、乾燥して、表題化
合物１８．０ｇを得た。

【００１９】ｄ）Boc-Arg(Tos)Gly-(Asp(OcHex)Thr(Bzl)Arg(Tos)Gly) ₂-OH 実施例１（ｃ）の化合物１７．５２ｇ（８．３ｍｍｏ
ｌ）を９０％酢酸水４５０mlに溶解し、氷冷下亜鉛末２
７．０ｇ（０．４１５ｍｏｌを３回に分けて５分ごとに
加え、室温に戻して激しく攪拌した。１時間後、反応液
をセライト濾過し、濾液を１％食塩水２．５ l中に注
ぎ、氷冷下で攪拌したのち沈澱物を濾取し、水洗後エー
テルで洗浄、乾燥して、表題化合物１８．７ｇを得た。

【００２０】ｅ）Boc-Arg(Tos)Gly-(Asp(OcHex)Thr(Bzl)Arg(Tos)Gly) ₄-OH 実施例１（ａ）の化合物１３．７９ｇ（７．９ｍｍｏ
ｌ）をアセトニトリル１００mlに溶解し、氷冷下、メタ
ンスルホン酸１５．１７ｇ（０．１５８ｍｏｌ）を滴下
したのち室温で１時間攪拌した。再び氷冷し、ＤＭＦ２
０ml、つづいてトリエチルアミン１５．１６ｇ（０．１
５０ｍｏｌ）を滴下した。つづいて実施例１（ｄ）の化
合物１６．５ｇ（８．３ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ１．２３
ｇ（９．１ｍｍｏｌ）、ＷＳＣ１．４１ｇ（９．１ｍ
ｍｏｌ）を氷冷下で加え、３０分間攪拌したのち室温で
１．５時間攪拌した。反応液を１％食塩水２．５ l中に
注ぎ、氷冷下で３０分間攪拌後、沈澱物を濾取し、水洗
後エーテルで洗浄、乾燥して、表題化合物２９．２ｇを
得た。

【００２１】ｆ）Boc-Arg(Tos)Gly-(Asp(OcHex)Thr(Bzl)Arg(Tos)Gly) ₄-OH 実施例１（ｅ）の化合物２８．９７ｇ（８ｍｍｏｌ）を
９０％酢酸水１．３ lとトリフルオロエタノール２５０
mlの混合溶媒に溶解し、室温で亜鉛末１０４ｇ（１．６
ｍｏｌ）を３回に分けて、５分ごとに加え、４５℃に加
温して２時間激しく攪拌した。セライト濾過し、濾液を
１％食塩水２．５ l中に滴下し、氷冷下で攪拌したのち
沈澱物を濾取し水洗後エーテルで洗浄、乾燥して、表題
化合物２２．２ｇを得た。

【００２２】ｇ）Boc-(Arg(Tos)GlyAsp(OcHex)Thr(Bzl)) ₅-OBzl Boc-Asp(OcHex)Thr(Bzl)-OBzl １．９１ｇ（３．２ｍｍ
ｏｌ）をアセトニトリル１００mlに溶解し、氷冷下メタ
ンスルホン酸２．４６ｇ（２２．４ｍｍｏｌ）を滴下し
たのち、室温で１時間攪拌した。再び氷冷し、ＤＭＦ
２２５ml、Ｎ−メチル−２−ピロリジノン２５mlを滴
下し、さらにトリエチルアミン１．９４ｇ（１９．２
ｍｍｏｌ）を滴下した。つづいて、実施例１（ｆ）の化
合物１２．０ｇ（３．４ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ０．５
５ｇ（４．０ｍｍｏｌ）、ＷＳＣ０．６４ｇ（４．０
ｍｍｏｌ）を氷冷下で加え、３０分間攪拌したのち、室
温で３時間攪拌した。反応液を１％食塩水２ l中に注
ぎ、氷冷下で３０分間攪拌後沈澱物を濾取し水洗後エー
テルで洗浄、乾燥して表題化合物１２．４ｇを得た。

【００２３】ｈ）（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ）₅ 実施例１（ｇ）の化合物６．０ｇをアニソール２５ml、
メチルエチルスルフィド７mlの存在下無水フッ化水素
１６０mlを減圧下、−７８℃で加え、−２０℃で１．５
時間、０℃で２２時間処理した。フッ化水素を減圧下０
℃で除去し、残渣をエーテルでトリチュレートした。得
られた固体を、５％酢酸水に溶解し、不溶物を濾去後、
濾液を凍結乾燥し、表題化合物の粗生成品３．７０ｇ
得た。この粗生成品３．７０ｇを逆相ＨＰＬＣ（カラ
ム：ＹＭＣ−ＯＤＳ５０mmφ×５００mm，１５〜３０
μ；流速：１５ml／ｍｉｎ；検出波長：２２０ｎｍ；溶
出液：（Ａ）水−０．１％トリフルオロ酢酸（Ｂ）ア
セトニトリル−０．１％トリフルオロ酢酸；グラジェン
ト：（Ｂ）０％→（１８０分）６％→（２４０分）１０
％）によって精製して、表題化合物８７０mgを得た
（ＨＰＬＣ面積百分率９７．２％）。ＭＳ（ＦＡＢ）ｍ／ｅ２１６６（Ｍ＋Ｈ⁺）アミノ酸分析値：Ａｓｘ（４．８３），Ｇｌｙ^*（５．
００），Ａｒｇ（４．７９），Ｔｈｒ（４．７５）〔Ｇ
ｌｙ^*を基準として算出〕逆相ＨＰＬＣカラム：ＹＭＣ−ＯＤＳ，５μ ４．６mmφ×２５０mm 溶出液：グラジェントＡ液：水−０．１％トリフルオロ酢酸Ｂ液：アセトニトリル−０．１％トリフルオロ酢酸初期Ｂ液濃度：７％濃度勾配：０．５％／分流速：１ml／分検出波長：２２０ｎｍ保持時間：１２．５５分

【００２４】実施例２（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ）₁₁の調製ａ）Boc-(Asp(OcHex)Thr(Bzl)Arg(Tos)Gly) ₂-Asp(OcHex)Thr(Bzl)-OBzl Boc-Asp(OcHex)Thr(Bzl)-OBzl ２．３９ｇ（４．０ｍｍ
ｏｌ）をアセトニトリル３０mlに溶解し、氷冷下メタン
スルホン酸３．０８ｇ（３２ｍｍｏｌ）を滴下したの
ち、室温で１時間攪拌した。再び氷冷し、ＤＭＦ５０
mlを滴下し、さらにトリエチルアミン２．８３ｇ（２８
ｍｍｏｌ）を滴下した。つづいて、実施例１（ｂ）の化
合物６．８５ｇ（４．２ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ６５４
mg（４．８ｍｍｏｌ）、ＷＳＣ７５１mg（４．８ｍｍ
ｏｌ）を氷冷下で加え、３０分攪拌したのち、室温で３
時間攪拌した。反応液を１％食塩水７００ml中に注ぎ、
氷冷下で３０分間攪拌後、沈澱物を瀘取、水洗し、エー
テルで洗浄、乾燥して表題化合物７．９５ｇを得た。

【００２５】ｂ）Boc-(Asp(OcHex)Thr(Bzl)Arg(Tos)Gly) ₄-Asp (OcHex)Thr(Bzl)-OBzl 実施例２（ａ）の化合物７．９５ｇ（３．８ｍｍｏｌ）
をアセトニトリル７０mlに懸濁し、氷冷下メタンスル
ホン酸５．８０ｇ（６０．３ｍｍｏｌ）を滴下したの
ち、室温で１時間攪拌した。再び氷冷し、ＤＭＦ１２
０mlを滴下し、さらにトリエチルアミン５．７２ｇ
（５６．６ｍｍｏｌ）を滴下した。つづいて実施例１
（ｂ）の化合物６．４５ｇ（４．０ｍｍｏｌ）、ＨＯＢ
ｔ６１６mg（４．６ｍｍｏｌ）、ＷＳＣ７０８mg
（４．６ｍｍｏｌ）を加え、３０分間攪拌後、室温で
３．５時間攪拌した。反応液を１％食塩水１６００ml
中に注ぎ、氷冷下で３０分間攪拌後、沈澱物を濾取、水
洗し、エーテルで洗浄、乾燥して表記化合物１３．１ｇ
を得た。

【００２６】ｃ）Boc-(Asp(OcHex)Thr(Bzl)Arg(Tos)Gly) ₆-Asp (OcHex)Thr(Bzl)-OBzl 実施例２（ｂ）の化合物１３．０ｇ（９．０ｍｍｏｌ）
をアセトニトリル７０mlに懸濁させ、氷冷下メタンスル
ホン酸７．２５ｇ（１１１ｍｍｏｌ）を滴下したの
ち、室温で１時間攪拌した。再び氷冷し、Ｎ−メチル−
２−ピロリジノン１００mlを滴下し、さらにトリエチル
アミン１０．９ｇ（１０８ｍｍｏｌ）を滴下した。つ
づいて実施例１（ｂ）の化合物６．１５ｇ（３．８ｍ
ｍｏｌ），ＨＯＢｔ５８７mg（４．３ｍｍｏｌ），Ｗ
ＳＣ６７５mg（４．３ｍｍｏｌ）を加え、３０分間攪
拌後、室温で４時間攪拌した。反応液を１％食塩水
１．６ l中に注ぎ、氷冷下で３０分間攪拌後、沈澱物を
濾取、水洗し、エーテルで洗浄、乾燥して表題化合物１
６．３ｇを得た。

【００２７】ｄ）H-(Asp(OcHex)Thr(Bzl)Arg(Tos)Gly) ₆-Asp(Oc Hex)Thr(Bzl)-OBzl 実施例２（ｃ）の化合物１６．０ｇ（３．１ｍｍｏｌ）
をトリフルオロ酢酸１３０mlに溶解し、氷冷下で３．５
時間攪拌した。反応液を、氷冷したエーテル１ l中に注
ぎ、３０分間攪拌して沈澱を濾取した。この沈澱を、Ｄ
ＭＦ３００mlにとかしトリエチルアミン３．１６ｇ
（３１ｍｍｏｌ）を氷冷下で滴下したのち、３０分間攪
拌した。反応液を１％食塩水１．５ l中に注ぎ、氷冷
下で３０分間攪拌後、沈澱物を濾取、水洗し、エーテル
で洗浄、乾燥して表題化合物１５．０ｇを得た。

【００２８】ｅ）Boc-(Arg(Tos)GlyAsp(OcHex)Thr(Bzl)) ₁₁-OBzl 実施例１（ｆ）の化合物１０．４ｇ（２．９６ｍｍｏ
ｌ）と実施例２（ｄ）の化合物１４．９０ｇ（２．９６
ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ２００mlと、Ｎ−メチルピロリ
ジノン２００mlの混合溶媒に溶解し５〜１０℃でＨＯ
Ｂｔ４８５mg（３．５９ｍｍｏｌ），ＷＳＣ・ＨＣｌ
６９０mg（３．５９ｍｍｏｌ）を加え、室温で３時間
攪拌した。反応液を、１％食塩水３ l中に注ぎ、氷冷
下で３０分間攪拌後、沈澱物を濾取し、水洗後エーテル
で洗浄、乾燥して表題化合物２２．６ｇを得た。

【００２９】ｆ）（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ）₁₁ 実施例２（ｅ）の化合物７．５０ｇをアニソール１２m
l，メチルエチルスルフィド２mlの存在下無水フッ化
水素８０mlを減圧下、−７８℃で加え、実施例１
（ｆ）と同様の処理を行い、表題化合物の粗生成品
４．５０ｇを得た。この粗生成物４．５０ｇを逆相Ｈ
ＰＬＣ（カラム：ＹＭＣ−ＯＤＳ５０mmφ×５００m
m，１５〜３０μ；流速：１５ml／ｍｉｎ；検出波長：
２２０ｎｍ；溶出液：（Ａ）水−０．１％トリフルオロ
酢酸（Ｂ）アセトニトリル−０．１％トリフルオロ酢
酸；グラジェント：（Ｂ）０％→（１８０分）８％→
（１８０分）１７％）によって精製して、表記化合物
１．０３ｇを得た（ＨＰＬＣ面積百分率９６．９％）。ＭＳ（ＦＡＢ）ｍ／ｅ４７４３（Ｍ＋Ｈ⁺）アミノ酸分析値：Ａｓｘ（１１．１），Ｇｌｙ^*（１
１．０），Ａｒｇ（１１．３），Ｔｈｒ（１１．１）
〔Ｇｌｙ^*を基準として算出〕逆相ＨＰＬＣ分析条件は実施例１と同じ保持時間：１７．５６分

【００３０】実施例３（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ）₇の調製ａ）Boc-(Arg(Tos)GlyAsp(OcHex)Thr(Bzl)) ₇-OBzl 実施例２（ｄ）の化合物１．２２ｇ（０．２４ｍｍｏ
ｌ），Boc-Arg(Tos)Gly-OH １２９mg（０．２７ｍｍｏ
ｌ）をＤＭＦ５mlと、Ｎ−メチル−２−ピロリジノン
２５mlの混合溶媒に溶解し、５〜１０℃でＨＯＢｔ３
９mg（０．２９ｍｍｏｌ），ＷＳＣ・ＨＣｌ５６mg
（０．２９ｍｍｏｌ）を加え、３０分間攪拌後、室温で
４．５時間攪拌した。反応液を１％食塩水３００ml中
に注ぎ、氷冷下で３０分間攪拌後、沈澱物を濾取し、水
洗後エーテルで洗浄、乾燥して表題化合物１．２３ｇを
得た。

【００３１】ｂ）（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ）₇ 実施例３（ａ）の化合物１．２３ｇを、アニソール６
ml，メチルエチルスルフィド１．５mlの存在下、無水
フッ化水素４０mlを減圧下、−７８℃で加え、実施例
１（ｆ）と同様の処理を行い、表題化合物の粗生成品
７２８mgを得た。この粗生成物７２８mgを逆相ＨＰＬ
Ｃ（カラム：ＹＭＣ−ＯＤＳ３０mmφ×２５０mm，１
５〜３０μ；流速：７ml／ｍｉｎ；検出波長：２２０ｎ
ｍ；溶出液：（Ａ）水−０．１％トリフルオロ酢酸
（Ｂ）アセトニトリル−０．１％トリフルオロ酢酸；グ
ラジェント：（Ｂ）０％→（１８０分）７％→（６０
分）１０％→（１２０分）１４％）によって精製して、
表題化合物１９１mgを得た（ＨＰＬＣ面積百分率９
５．９％）。ＭＳ（ＦＡＢ）ｍ／ｅ３０２５（Ｍ＋Ｈ⁺）アミノ酸分析値：Ａｓｘ（７．１７），Ｇｌｙ^*（７．
００），Ａｒｇ（７．１１），Ｔｈｒ（７．１０）〔Ｇ
ｌｙ^*を基準として算出〕逆相ＨＰＬＣ分析条件は実施例１と同じ保持時間：１４．９２分

【００３２】実施例４（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ）₃の調製ａ）Boc-(Arg(Tos)GlyAsp(OcHex)Thr(Bzl)) ₃-OBzl 実施例２（ａ）の化合物１．８０ｇ（０．８５ｍｍｏ
ｌ）をアセトニトリル１５mlに懸濁し、氷冷下メタンス
ルホン酸１．２３ｇ（１２．８ｍｍｏｌ）を滴下した
のち、室温で３．５時間攪拌した。再び氷冷し、ＤＭＦ
１０mlを滴下し、さらにトリエチルアミン１．２１ｇ
（２１ｍｍｏｌ）を滴下した。つづいてBoc-Arg(Tos)Gl
y-OH ４３３mg（０．９０ｍｍｏｌ），ＨＯＢｔ１３
８mg（１．０２ｍｍｏｌ），ＷＳＣ１５９mg（１．０
２ｍｍｏｌ）を加え、３０分間攪拌後、室温で３時間攪
拌した。反応液を１％食塩水３００ml中に注ぎ、氷冷
下で３０分間攪拌後、沈澱物を濾取、水洗しエーテルで
洗浄、乾燥して表題化合物２．０３ｇを得た。

【００３３】ｂ）（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ）₃ 実施例４（ａ）の化合物１．８０ｇを、アニソール６
ml，メチルエチルスルフィド１．５mlの存在下、無水
フッ化水素４０mlを減圧下、−７８℃で加え、実施例
１（ｆ）と同様の処理を行い、粗生成物１．００ｇを
得た。この粗生成物１．００ｇを実施例３（ｂ）と同
じ逆相ＨＰＬＣを用いて精製（グラジェント条件のみ実
施例３（ｂ）と異なり、（Ｂ）０％→（１８０分）１１
％→（１２０分）１５％）を２回繰り返して行い、表題
化合物１４３mgを得た（ＨＰＬＣ面積百分率９７．４
％）。ＭＳ（ＳＩＭＳ）ｍ／ｅ１３０６（Ｍ＋Ｈ⁺）アミノ酸分析値：Ａｓｘ（３．０３），Ｇｌｙ^*（３．
００），Ａｒｇ（２．９９），Ｔｈｒ（３．０３）〔Ｇ
ｌｙ^*を基準として算出〕逆相ＨＰＬＣ分析条件は実施例１と同じ保持時間：７．７５分

【００３４】実施例５（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ）₉の調製ａ）Boc-(Arg(Tos)GlyAsp(OcHex)Thr(Bzl)) ₉-OBzl 実施例１（ｄ）の化合物６２９mg（０．３２ｍｍｏｌ）
と、実施例２（ｄ）の化合物１．５１ｇ（０．３０ｍｍ
ｏｌ）をＤＭＦ４０mlに溶解し、氷冷下、ＨＯＢｔ
４９mg（０．３６ｍｍｏｌ），ＷＳＣ・ＨＣｌ６９mg
（０．３６ｍｍｏｌ）を加え、室温で４時間反応した。
反応液を、１％食塩水３００ml中に注ぎ、氷冷下で３
０分間攪拌後、沈澱物を濾取し、水洗後エーテルで洗
浄、乾燥して表題化合物１．８３ｇを得た。

【００３５】ｂ）（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ）
₉ 実施例５（ａ）の化合物１．５０ｇを、アニソール６
ml，メチルエチルスルフィド１．５mlの存在下、無水
フッ化水素４０mlを減圧下、−７８℃で加え、実施例
１（ｆ）と同様の処理を行い、粗生成物９４０mgを得
た。この粗生成物４４０mgを実施例３（ｂ）と同じ逆相
ＨＰＬＣを用いて精製（グラジェント条件のみ実施例３
（ｂ）と異なり、（Ｂ）０％→（１８０分）８％→（１
８０分）１７％）を行い、表題化合物７４mgを得た
（ＨＰＬＣ面積百分率１００％）。ＭＳ（ＦＡＢ）ｍ／ｅ３８８４（Ｍ＋Ｈ⁺）アミノ酸分析値：Ａｓｘ（９．２４），Ｇｌｙ^*（９．
００），Ａｒｇ（９．３２），Ｔｈｒ（９．３９）〔Ｇ
ｌｙ^*を基準として算出〕逆相ＨＰＬＣ分析条件は実施例１と同じ保持時間：１６．０６分

【００３６】実施例６３，４−ビス−メトキシポリエチレングリコールハイ
ドロ桂皮酸修飾（ArgGlyAspThr) ₁₁ 実施例２（ｆ）で調製した (ArgGlyAspThr) ₁₁ ３００
mgを、０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８．２１）３０mlに
溶解させた後、３，４−ビス−メトキシポリエチレング
リコールハイドロ桂皮酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイ
ミドエステル（平均分子量約１００００）２．５３ｇ
（アミノ基に対して４ｅｑ．）を加え、室温で２時間攪
拌した。１Ｎ塩酸でｐＨ５．０に調製したのちメンブラ
ンフィルター（０．４５μｍ）で不溶物を濾去後、蒸留
水で希釈し、全容量を１５０mlとして、この溶液を実施
例１（ｈ）で使用したのと同じ逆相ＨＰＬＣを用いて精
製（但し、グラジェント条件は次のとおり。：（Ｂ）０
％→（６０分）３０％→（１８０分）３５％→（１２０
分）４０％→（６０分）４５％）を行い、目的のフラク
ションを凍結乾燥して、表題化合物４９５mgを得た。

【００３７】アミノ酸分析値：Ａｓｘ（１１．０），Ｇ
ｌｙ^*（１１．０），Ａｒｇ（１０．８），Ｔｈｒ（１０．３）＊基準アミノ酸逆相ＨＰＬＣカラム：ＹＭＣ−ＯＤＳ，５μ ４．６mmφ×２５０mm 溶出液：グラジェントＡ液：水−０．１％トリフルオロ酢酸Ｂ液：アセトニトリル−０．１％トリフルオロ酢酸初期Ｂ液濃度：３０％濃度勾配：１％／分流速：１ml／分検出波長：１０ｎｍ保持時間：１６．３５分ＧＰＣカラム：ＴＳＫｇｅｌＧ３０００ＳＷ７．５mmφ×６００mm（東ソー社製）溶出液：０．２Ｍ食塩水（５％エタノール含有）流速：０．６ml／分検出波長：１０ｎｍ保持時間：２５．６３分

【００３８】実施例７３，４−ビス−メトキシポリエチレングリコールハイ
ドロ桂皮酸修飾 (ArgGlyAspThr) ₅ 実施例１（ｈ）で調製した (ArgGlyAspThr) ₅１４１mg
を、０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８．２１）１４．１ml
に溶解させた後、３，４−ビス−メトキシポリエチレン
グリコールハイドロ桂皮酸Ｎ−ヒドロキシスクシン
イミドエステル（平均分子量約１００００）１．９６
ｇ（アミノ基に対して３ｅｑ．）を加え、室温で２時間
攪拌した。１Ｎ塩酸でｐＨ５．０に調製したのち、メン
ブランフィルター（０．４５μｍ）で不溶物を濾去後、
蒸留水で希釈し、全容量を１００mlとした。この溶液を
実施例１（ｈ）で使用したのと同じ逆相ＨＰＬＣを用い
て精製（但し、グラジェント条件は次のとおり。：
（Ｂ）０％→（６０分）３３％→（１２０分）３９％）
を行い、目的のフラクションを凍結乾燥して、表題化合
物４９５mgを得た。

【００３９】アミノ酸分析値：Ａｓｘ（５．０３），Ｇ
ｌｙ^*（５．００），Ａｒｇ（５．０８），Ｔｈｒ
（４．７６）＊基準アミノ酸逆相ＨＰＬＣ分析条件は実施例６と同じ保持時間：１７．６５分ＧＰＣ分析条件は実施例６と同じ保持時間：２６．００分

【００４０】実施例８３，４−ビス−メトキシポリエチレングリコールハイ
ドロ桂皮酸修飾 (ArgGlyAspThr) ₃ 実施例４（ｂ）で調製した (ArgGlyAspThr) ₃２００mg
を、０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８．２１）２０mlに溶
解させた後、３，４−ビス−メトキシポリエチングリコ
ールハイドロ桂皮酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
エステル（平均分子量約１００００）４．５９ｇ（ア
ミノ基に対して３ｅｑ．）を加え、室温で３時間攪拌し
た。１Ｎ塩酸でｐＨ５．０に調製したのちメンブランフ
ィルター（０．４５μｍ）で不溶物を濾去後、蒸留水で
希釈し、全容量を１６０mlとした。この溶液を実施例１
（ｈ）で使用したのと同じ逆相ＨＰＬＣを用いて精製
（但し、グラジェント条件は次のとおり。：（Ｂ）０％
→（６０分）３０％→（１２０分）３７％→（６０分）
４０％→（６０分）５２％）を行い、目的のフラクショ
ンを凍結乾燥して、表題化合物２５０mgを得た。アミノ酸分析値：Ａｓｘ（２．８１），Ｇｌｙ^*（３．
００），Ａｒｇ（２．８８），Ｔｈｒ（２．７２）＊基準アミノ酸逆相ＨＰＬＣ分析条件は実施例６と同じ保持時間：１８．６５分ＧＰＣ分析条件は実施例６と同じ保持時間：２６．２８分

【００４１】実施例９３，４−ビス−メトキシポリエチレングリコールハイ
ドロ桂皮酸修飾 (ArgGlyAspThr) ₇ 実施例３（ｂ）で調製した (ArgGlyAspThr) ₇１９２mg
を、０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８．２１）１９．２ml
に溶解させた後、３，４−ビス−メトキシポリエチレン
グリコールハイドロ桂皮酸Ｎ−ヒドロキシスクシン
イミドエステル（平均分子量約１００００）２．５４
ｇ（アミノ基に対して４ｅｑ．）を加え、室温で２時間
攪拌した。１Ｎ塩酸でｐＨ５．０に調製したのち、メン
ブランフィルター（０．４５μｍ）で不溶物を濾去後、
蒸留水で希釈し、全容量を７０mlとした。この溶液を実
施例１（ｈ）で使用したのと同じ逆相ＨＰＬＣを用いて
精製（但し、グラジェント条件は次のとおり。：（Ｂ）
０％→（６０分）３５％→（３００分）４５％）を行
い、目的のフラクションを凍結乾燥して、表題化合物
１８８mgを得た。アミノ酸分析値：Ａｓｘ（７．０１），Ｇｌｙ^*（７．
００），Ａｒｇ（７．０２），Ｔｈｒ（６．８１）＊基準アミノ酸逆相ＨＰＬＣ分析条件は実施例６と同じ保持時間：１７．２１分ＧＰＣ分析条件は実施例６と同じ保持時間：２５．８８分

【００４２】実施例１０コハク酸モノメトキシポリエチレングリコール修飾 (Ar
gGlyAspThr) ₁₁ 実施例２（ｆ）で調製した (ArgGlyAspThr) ₁₁３５０mg
を、０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８．２１）３５mlに溶
解させた後、コハク酸モノメトキシポリエチレングリコ
ールＮ−ヒトロキシスクシンイミドエステル（平均分
子量約５０００）１．８５ｇ（アミノ基に対して５ｅ
ｑ．）を加え、室温で２時間攪拌した。１Ｎ塩酸でｐＨ
５．０に調製したのち、メンブランフィルター（０．４
５μｍ）で不溶物を濾去後、蒸留水で希釈し、全容量を
７０mlとした。この溶液を実施例３（ｂ）で使用したの
と同じ逆相ＨＰＬＣを用いて精製（但し、グラジェント
条件は次のとおり。：（Ｂ）０％→（６０分）３０％→
（１２０分）３６％→（１２０分）４６％）を行い、
目的のフラクションを凍結乾燥して、表題化合物４９
５mgを得た。アミノ酸分析値：Ａｓｘ（１０．２），Ｇｌｙ^*（１
１．０），Ａｒｇ（１０．３），Ｔｈｒ（１０．１）＊基準アミノ酸逆相ＨＰＬＣ分析条件は実施例６と同じ保持時間：１２．８３分ＧＰＣ分析条件は実施例６と同じ保持時間：２８．６２分

【００４３】実施例１１コハク酸モノメトキシポリエチレングリコール修飾（Ar
g Gly Asp Thr)₅ 実施例１（ｈ）で調製した（Arg Gly Asp Thr)₅３００
mgを、０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８．２１）３０mlに
溶解させた後、コハク酸モノメトキシポリエチレングリ
コールＮ−ヒトロキシスクシンイミドエステル（平均
分子量約５０００）３．４８ｇ（アミノ基に対して５ｅ
ｑ．）を加え、室温で２時間攪拌した。１Ｎ塩酸でｐＨ
５．０に調製したのち、メンブランフィルター（０．４
５μｍ）で不溶物を濾去後、蒸留水で希釈し、全容量を
１００mlとした。実施例１０で使用したのと同じ条件で
逆相ＨＰＬＣを用いて精製後、目的のフラクションを凍
結乾燥して、表題化合物５８１mgを得た。アミノ酸分
析値：Ａｓｘ（４．５３），Ｇｌｙ^*（５．００），Ａ
ｒｇ（４．５１），Ｔｈｒ（４．６２）＊基準アミノ酸逆相ＨＰＬＣ分析条件は実施例６と同じ保持時間：１４．２３分ＧＰＣ分析条件は実施例６と同じ保持時間：２９．２８分

【００４４】実施例１２コハク酸モノメトキシポリエチレングリコール修飾（Ar
g Gly Asp Thr)₃ 実施例４（ｂ）で調製した（Arg Gly Asp Thr)₃１２０
mgを、０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８．２１）１２mlに
溶解させた後、コハク酸モノメトキシポリエチレングリ
コールＮ−ヒトロキシスクシンイミドエステル（平均
分子量約５０００）２．３０ｇ（アミノ基に対して５
ｅｑ．）を加え、室温で３時間攪拌した。１Ｎ塩酸でｐ
Ｈ５．０に調製したのち、メンブランフィルター（０．
４５μｍ）で不溶物を濾去後、蒸留水で希釈し、全容量
を１００mlとした。実施例３（ｂ）で使用したきと同じ
逆相ＨＰＬＣを用いて精製（但し、グラジェント条件は
次のとおり。：（Ｂ）０％→（６０分）３５％→（１２
０分）４１％→（１２０分）５１％）を行い、目的のフ
ラクションを凍結乾燥して、表題化合物２３６mgを得
た。アミノ酸分析値：Ａｓｘ（２．８８），Ｇｌｙ^*（３．
００），Ａｒｇ（２．９２），Ｔｈｒ（２．８３）＊基準アミノ酸逆相ＨＰＬＣ分析条件は実施例６と同じ保持時間：１６．５５分ＧＰＣ分析条件は実施例６と同じ保持時間：２９．５８分

【００４５】実施例１３コハク酸モノメトキシポリエチレングリコール修飾（Ar
g Gly Asp Thr)₇ 実施例３（ｂ）で調製した（Arg Gly Asp Thr)₇１６９
mgを、０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８．２１）１６．９
mlに溶解させた後、コハク酸モノメトキシポリエチレン
グリコールＮ−ヒトロキシスクシンイミドエステル
（平均分子量約５０００）１．４０ｇ（アミノ基に対
して５ｅｑ．）を加え、室温で３時間攪拌した。１Ｎ塩
酸でｐＨ５．０に調製したのち、メンブランフィルター
（０．４５μｍ）で不溶物を濾去後、蒸留水で希釈し、
全容量を１００mlとした。実施例３（ｂ）で使用したの
と同じ逆相ＨＰＬＣを用いて精製（但し、グラジェント
条件は次のとおり。：（Ｂ）０％→（６０分）３０％→
（３６０分）４２％→（６０分）４８％）を行い、目的
のフラクションを凍結乾燥して、表題化合物２０４mgを
得た。アミノ酸分析値：Ａｓｘ（７．２８），Ｇｌｙ^*（７．
００），Ａｒｇ（７．０９），Ｔｈｒ（６．７２）＊基準アミノ酸逆相ＨＰＬＣ分析条件は実施例６と同じ保持時間：１３．９２分ＧＰＣ分析条件は実施例６と同じ保持時間：２９．０１分

【００４６】実施例１４ (Arg-Gly-Asp-Thr)_n(n=1,3,5,7,9,11)およびpoly(Arg-
Gly-Asp-Thr) の癌転移抑制作用。分子量の明確な (Arg-Gly-Asp-Thr)_n(n=1,3,5,7,9,11)
および、特開平２−１７４７９８号公報記載の方法と同
様の方法で調製したＲＧＤＴのポリマーであるpoly(Arg
-Gly-Asp- Thr)の癌転移抑制活性について、済木らの方
法( 特開平２−１７４７９８号公報）に従い検討を行っ
た。即ち、実施例１，２，３，４，５で合成したペプチ
ドおよび poly(Arg-Gly-Asp-Thr)を用い、これらの化合
物の癌転移抑制作用をマウスのＢ１６−ＢＬ６メラノー
マ細胞で検討した。まず、これらの化合物を各々５００
μｇと非常に転移性の強い癌細胞としてＢ１６−ＢＬ６
メラノーマ細胞（２４時間対数増殖期にあるもの，３×
１０⁴個）を各々ＰＢＳ中で混合後、その０．２mlを一
群５匹のＣ５７ＢＬ／６の雄マウスに静脈注射した。投
与１４日後にマウスの肺の癌コロニー数を数えて、対照
のＰＢＳ投与群と比較した。その結果を第１表に示す。
この結果によれば、(Arg-Gly-Asp-Thr) _n(n=3,5,7,9,1
1)およびpoly(Arg-Gly-Asp-Thr) の投与により、肺への
癌転移は顕著に抑制された。また、(Arg-Gly-Asp-Thr)
_n(n=5,7,9,11)においては、poly(Arg-Gly-Asp-Thr) に
比べ、より強力に肺への癌転移を抑制した。

【００４７】

【表１】

【００４８】実施例１５ (Arg-Gly-Asp-Thr) ₁₁および、その高分子修飾体の癌転
移抑制作用実施例２，６および１０で合成したペプチドおよび高分
子修飾ペプチドを用い、これらの化合物の癌転移抑制作
用を、マウスのＢ１６−ＢＬ６メラノーマ細胞で検討し
た。まず、これら化合物の４０，２００および１０００
μｇ（蛋白含量）を、それぞれ３×１０⁴個のＢ１６−
ＢＬ６メラノーマ細胞とＰＢＳ中で混合後、実施例１４
に示したのと同様の方法でマウスＣ５７ＢＬ／６に投与
して、癌の転移抑制作用を調べた。その結果を、第２表
に示す。同表から明らかなとおり、(Arg-Gly-Asp-Thr)
₁₁に比べ、その高分子修飾体の投与により肺への癌転移
は極めて強力に抑制された。

【００４９】

【表２】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者池田善治大阪市此花区春日出中３丁目１番98号住友製薬株式会社内 (72)発明者小野圭一大阪市此花区春日出中３丁目１番98号住友製薬株式会社内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】式（Ｉ）【化１】〔式中、ｎは３以上２０以下の整数を表す。〕で表さ
れ、高純度であることを特徴とするペプチドおよびその
薬学的に許容される塩。
【請求項２】ＨＰＬＣによる純度が９０％以上である
請求項１記載のペプチドまたはその薬学的に許容される
塩。
【請求項３】式（Ｉ）のｎが３以上１１以下の整数で
ある請求項１記載のペプチドまたはその薬学的に許容さ
れる塩。
【請求項４】式（Ｉ）のｎが３である請求項１記載の
ペプチドまたはその薬学的に許容される塩。
【請求項５】式（Ｉ）のｎが５である請求項１記載の
ペプチドまたはその薬学的に許容される塩。
【請求項６】式（Ｉ）のｎが７である請求項１記載の
ペプチドまたはその薬学的に許容される塩。
【請求項７】式（Ｉ）のｎが９である請求項１記載の
ペプチドまたはその薬学的に許容される塩。
【請求項８】式（Ｉ）のｎが１１である請求項１記載
のペプチドまたはその薬学的に許容される塩。
【請求項９】式（ＩＩ）【化２】〔式中、ｎは３以上２０以下の整数を、Ｒ₁およびＲ₂
は同一または異なる低級アルキル基を、ｐおよびｑは各
ポリエチレングリコール部分の平均分子量が約１０００
〜１２０００となる同一または異なる任意の正の整数
を、ｔは０または任意の正の整数を表す。〕で表される
高分子修飾ペプチドおよびその薬学的に許容される塩。
【請求項１０】式（ＩＩ）のｎが３以上１１以下の整
数である請求項９記載の高分子修飾ペプチドまたはその
薬学的に許容される塩。
【請求項１１】式（ＩＩ）のｎが３である請求項９記
載の高分子修飾ペプチドまたはその薬学的に許容される
塩。
【請求項１２】式（ＩＩ）のｎが５である請求項９記
載の高分子修飾ペプチドまたはその薬学的に許容される
塩。
【請求項１３】式（ＩＩ）のｎが７である請求項９記
載の高分子修飾ペプチドまたはその薬学的に許容される
塩。
【請求項１４】式（ＩＩ）のｎが９である請求項９記
載の高分子修飾ペプチドまたはその薬学的に許容される
塩。
【請求項１５】式（ＩＩ）のｎが１１である請求項９
記載の高分子修飾ペプチドまたはその薬学的に許容され
る塩。
【請求項１６】式（ＩＩＩ）【化３】〔式中、Ｒ₃は低級アルキル基を、ｋはポリエチレング
リコール部分の平均分子量が約１０００〜１２０００と
なる任意の正の整数を、ｎは３以上２０以下の整数を、
ｕは任意の正の整数を表す。〕で表される高分子修飾ペ
プチドおよびその薬学的に許容される塩。
【請求項１７】式（ＩＩＩ）のｎが３以上１１以下の
整数である請求項１６記載の高分子修飾ペプチドまたは
その薬学的に許容される塩。
【請求項１８】式（ＩＩＩ）のｎが３である請求項１
６記載の高分子修飾ペプチドまたはその薬学的に許容さ
れる塩。
【請求項１９】式（ＩＩＩ）のｎが５である請求項１
６記載の高分子修飾ペプチドまたはその薬学的に許容さ
れる塩。
【請求項２０】式（ＩＩＩ）のｎが７である請求項１
６記載の高分子修飾ペプチドまたはその薬学的に許容さ
れる塩。
【請求項２１】式（ＩＩＩ）のｎが９である請求項１
６記載の高分子修飾ペプチドまたはその薬学的に許容さ
れる塩。
【請求項２２】式（ＩＩＩ）のｎが１１である請求項
１６記載の高分子修飾ペプチドまたはその薬学的に許容
される塩。
【請求項２３】請求項１から８記載のいずれかのペプ
チドまたはその薬学的に許容される塩を含む癌転移抑制
剤。
【請求項２４】請求項９から２２記載のいずれかの高
分子修飾ペプチドまたはその薬学的に許容される塩を含
む癌転移抑制剤。