JPH04507106A - ヒドロキシアパタイト―抗原結合体及びポリ―ｉｇ免疫応答を生成する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒドロキシアパタイト−抗原結合体及びポリーＩＧ免疫応答を生成する方法 ［発明の背景コ 本発明は米国政府からの部分的資金援助によりなされ、米国政府は本発明に一定 の権利を有する。

本発明は受動粘膜免疫保護、及びポリ−１ｇ免疫試薬並びにその手法に関する。

ポリ−１ｇの語は抗体、即ちＩｇＡ及びＩｇＭの重合体クラスを表すのに使用す る。ＩｇＭ抗体は一般に免疫応答の初期段階で産出され、保護的粘膜免疫におい ては重要な要因でない。従って、本発明は一般的には重合体１ｇ抗体に関し、本 発明のあらゆる面における通常の好ましい抗体はＩｇＡクラス抗体であり、この 抗体は通常二量体で、時にはより大きなＩｇＡ重合体として分泌される。

多くの病原性バクテリアやウィルスは胃腸管、呼吸器または生殖器の細胞内層（ 上皮細胞）を通って体内にまず最初入る。特定の抗体クラスであるＩｇＡ抗体は この表面を保護する。ＩｇＡ抗体は上皮細胞表面下の組織に位置する細胞によっ て産出される二量体または重合体分子である。ＩｇＡ抗体は上皮細胞によって粘 膜分泌まで運ばれ、そこでまだ体内に入っていない病原体を架橋または覆ってし まい、病原体が上皮細胞と接触したり付着したりするのを防ぐ。かくしてＩｇＡ 抗体は体の外側にある病原体に作用し、これが上皮細胞表面を通って体内に侵入 するのを防ぐことにより保護する。

自然に起こるＩｇＡ応答は粘膜表面への抗原の接触により引き起こされる。抗原 は特異的サンプリング部位（ミクロフォールドまたはＭ細胞と呼ばれる）を通っ て体内に入り、このサンプリング部位は、粘膜免疫系細胞の特定の組織化された コレクションを含む粘膜内層領域への経上皮抗原輸送に影響を及ぼす。より詳し くは、図１に示すように、腺腔１にある抗原Ａ（黒丸で示したもの）が部位２に おけるＭ細胞の腺腔表面に結合する。抗原は３においてインターナリゼーション され、トランスサイト−シスされて、リンパ球Ｌ（Ｂ及びＴ細胞）や、マクロフ ァージ細胞（Ｍ）のような抗原−処理／提供細胞を含む上皮細胞ポケット４中に 放出される。

自然に免疫された宿主中におけるＩｇＡ抗体は、上皮細胞及び分泌細胞の基底（ 内側）表面上にある特異的レセプター（ポリ−１ｇレセプターと呼ばれる）と結 合することによって、呼吸系、消化器系、生殖器及び乳腺を通じての分泌へと輸 送される。Ｔｈｅ　Ｍａｍｍａｒｙ　Ｇ］ａｎｄ、Ｎｅ１ｖｉｌｌｅ　ａｎｄＤ ａｎｉｅｌ　Ｅｄｓ、、Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｃａｍｂｒｉｄ ｇｅ　（１９８７）に記載の５ｏｌａｒｉ　ａｎｄ　Ｋｒａｅｈｅｎｂｕｈｌ。

”Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ　Ｔｒａｎｓｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　Ｔ ｒａｎｓｐｏｒｔ　ｏｆ　Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ　Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｓ’、ｐ、２６９−２９８；Ｍｅｓｔｅｃｋｙ、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｉｍｍｕｎｏｌ 。

ヱ：　２６５−２７６　（１９８７）を参照されたい。レセプター−ＩｇＡ複合 体はこれらの細胞を通って輸送され、腺腔（外側）細胞表面上にエキソサイト− シスされ、ここでレセプターが酵素的に開裂して、分泌成分（Ｓ　Ｃ）と呼ばれ るレセプター断片と共に、ＩｇＡが分泌される。Ｍｏ５ｔｏｖら、Ｐｒｏｃ、Ｎ ａｔ’ｌ　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７７：７２５７−７２６１　（１９８０ ）：Ｓ。

１ａｒｉ、Ｒａｎｄ　Ｋｒａｅｈｅｎｂｕｈｌ、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５ ６・１２４９０−１２４９５　（１９８１）参照。分泌成分はタンパク質分解を ｋａ、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、４９：１３７４　（１９７４）］一般的に 、抗原注入を含む現存の免疫方法は、全身を循環して、病原体が体内に入った後 にこれを中和するようなＩｇＧクラスの抗体産出を引き起こす。抗原の注入は一 般に本質的なＩｇＡ応答を引き起こさない。

粘膜関門におけるＩｇＡ産出の利点を得るための各種試みには、免疫された哺乳 動物の能動保護のための、または免疫された哺乳動物の粘膜分泌を用いる異種ｍ ｍｕｎｏ＋、、１１１　（２）：３９５−４０３　（１９７３）］。病原体侵入 から保護する試みでは、モノクローナルＴｇＡ抗体を産出し、呼吸粘膜表面に直 接適用した［Ｍａｚａｎｅｃら、Ｊ、Ｖｉｒｏ！、、６エ：　２６２４−２６２ ５（１９８７）　コ。

能動免疫は完全な（死亡）バクテリアまたはウィルスを粘膜表面でチャレンジす ることを含む。ある種の病原体にこの方法を用いることに関連する危険性を避け るために、病原体の免疫原表面成分のような成分抗原を粘膜表面で用いる。また 、抗原を大きな分子と結合させることもある。例えばコレラ毒素Ｂサブユニット を抗原と結合する。コレラ毒素Ｂサブユニットと結合した連鎖球菌抗原の経口性 の中心体（ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ）も抗原担体として用いられた。例えば、る 。乾燥タンパク質抗原をコポリマーマトリックスに化学結合させることなく分散 させる。

口発明の開示］ 我々は水酸化リン酸カルシウム（ｈｙｄｒｏｘｙｌａｔｅｄ　ｃａｌｃｉｕｍｐ ｈｏｓｐｈａｔｅ　：ＨＣＰ）粒子が粘膜表面を通して行う治療に特に有用な担 体であることを発見した。ＨＣＰと治療的に活性な成分（例えば抗原または医薬 のような生物的に活性な物質）との結合体は上皮細胞を通して輸送され、そこで 所望の治療的応答、例えばポリＩｇ免疫応答の増強をもたらす。

本発明は最も一般的な形では、水酸化リン酸カルシウムと活性成分との複合体を 哺乳動物の粘膜表面に適用することにより、哺乳動物に活性成分を投与すること を特徴とする。

本発明に特有の実施態様は一般的に、抗原感作１ｇＡ−産出性リンパ芽球を哺乳 動物に産出させるための方法を特徴とする。この方法においては、抗原または抗 原混合物と水酸化リン酸カルシウム（ＨＣＰ）粒子とからなる免疫原を哺乳動物 の粘膜表面に投与する。本発明のこの第１の面における好ましい態様では、抗原 感作リンパ芽球が回復して不死となり、ｒｇＡ産出性ハイブリドーマを生産する ようになる。

本発明に特有の第２の実施態様は、上記の免疫原を哺乳動物の粘膜表面に投与す ることからなる、哺乳動物（特にヒト）を予防接種する方法を特徴とする。

他の実施態様は、粘膜を通しての治療物（例えば医薬）の配達を特徴とする。

本発明はまた、活性成分と上皮細胞を通過する輸送のために適したサイズの水酸 化リン酸カルシウム粒子とを含む組成物を特徴とする。

本発明のいずれの好ましい実施態様においても、水酸化リン酸カルシウムは上皮 細胞を通過する輸送に適した微粒子である。また好ましくは、抗原はウィルスコ ート、エンベロープタンパク質のような、病原体または精子の外的に入手可能な 抗原決定基、リポ多糖、或いは細胞表面のタンパク質からなる。ＨＣＰの一つの 形はヒドロキシアパタイト（ＨＡ）であり、これは以下に記載する市販の結晶水 酸化リン酸カルシウムである。

本発明の活性成分を投与する好ましい方法は、経口、経膣、経鼻、経直腸、経眼 または中耳への投与である。経口投与は腸管粘膜を含む他のＧ、１．粘膜への配 達を可能にする。

本発明は粘膜に付着し、その生物的効果、例えば粘膜免疫系への提供を行うため に上皮細胞関門を効果的に通過しうる効率的な多価複合体を提供する。活性成分 、特にタンパク質のＨＣＰへの吸着は比較的簡単、迅速かつ安価で本発明を経済 的に容易なものとする。さらに、ＨＣＰはタンパク質や他の抗原を含む、目的の 抗原に対する親和性が一般に高く、このため本発明は適用範囲が広い。ＨＡが骨 の必須成分であり、また全身の免疫系が正常な骨の再吸収（これは健康な個体で 顕微鏡的レベルで常に起こる過程である）中にＨＡと日常的に出会うという事実 からも明らかなように、ＨＣＰは一般に非毒性である。従って、純粋ＨＡは宿主 免疫応答を引き起こすことなく、恐らくは安全に投与することができ、また抗− 賦形剤免疫応答を引き起こすことなく同一のまたは異なる抗原用に賦形剤として 繰り返し投与できる。さらにＨＣＰ、特にＨＡはＭ細胞による経上皮輸送に適し たサイズに容易に小さくでき、このような小さいサイズは細胞内皮組織系のマク ロファージ及び他の細胞による食作用には好適であり、免疫応答を増強する。

最後に、本発明によるＭ細胞数り込み及び輸送は比較的選択性がある。

本発明のその他の特徴及び利点は以下に記載する最良の形態により明らかとなる であろう。

［発明を実施するための最良の形態１ 図面 図１はＭ細胞を通過する抗原のトランスサイト−シスを表す図である。

試薬 一般に、以下に述べる方法と材料はＩｇＡ保護のための方法の一部として用いる ことができ、この方法については本出願と同時に出願したＮｅｕｔｒａ、Ｋｒａ ｅｈｅｎｂｕｈ　］及びＷｅｌｔｚｆｎの”合成ポリ−１ｇレセプター、レセプ ター−抗体複合体、その製造及び使用“と題する共有特許出願（参照により本明 細書に包含される）にさらに詳しく記載されている。特に、本発明の免疫原及び 方法は、受動免疫のためのポリＩｇ試薬を作るために上記参照出願に記載された 安定剤タンパク質と共に使用することができる。

本発明の好ましい態様はヒドロキシアパタイト−抗原結合体及びその使用を特徴 とする特定すれば、ヒドロキシアパタイトは結晶性リン酸カルシウムの修飾形、 Ｃａ、＋。（ＰＯ＜）ａ　（ＯＨ）２である。これは、その一般的なタンパク質 結合能の故にタンパク質分画試薬として用いられているものである。市販のＨＡ は一般に正常な骨組織に存在する無機ＨＡの化学的及び物理的類似体である平板 状結晶からなる。粉末の骨に由来する栄養性カルシウム／リン酸補助剤が食用と して存在していることを考えると、出発物質が不純物を含んでいない限り、ＨＡ を食することは比較的安全である。

市販の高溶解性ＨＡ　（Ｃａ　ｌ　ｂ　ｉ　ｏｃｈｅｍより入手）は各種のサイ ズの結晶からなる。製造者から提供されるＨＡ結晶は、上皮細胞を効果的に通過 するには全体的に大きすぎる。例えば、長さが１μｍ以上の結晶はＭ細胞によっ て取り込まれそうにない。従って、本発明に用いるには、市販のＨＡ結晶を例え ば音波処理によって、小さな、比較的均一な結晶性断片に破砕する。

音波処理した結晶はいくらかサイズにバラツキがあるものの、そのサイズは一般 に１μｍを越えない。好ましくはＨＡの実質的部分が約０．０１−０．１μｍの 断片として存在する。断片度は標準手法を用いて、電子顕微鏡または光散乱によ り測定できる。

ＨＡは低い、生理的に安全な濃度で、タンパク質と高い結合活性と速度で結合す る。結合はカルシウム部分とタンパク質の酸性及びリン酸基との相互作用、並び にリン酸とタンパク質の塩基性基との相互作用によると考えられる。高分子量の タンパク質はＨＡによりしっかりと吸着される傾向があるが、タンパク質の電荷 も役割を果たしている。例えば、ＨＡ、１ｇはウソ血清アルブミン約３０ｍｇと 結合できる。かくして、ＨＡは架橋剤を加えることなく、激しい、変成化条件を 用いることなく、しかも貴重な純粋抗原を浪費することなく、希釈溶液中からタ ンパク質抗原を効果的に捕捉することができる。

里塗 ＨＡ吸着した抗原はヒトまたは他の哺乳動物の予防接種に用いることができる。

本発明は特にシュウトモナス・アエルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａ、ｅ ｒｕｇｉｎｏｓａ）、　ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ 　１ｎｆｌｕｅｎｚａ）、ビブリオ−コレラエ（Ｖｉｂｒｉｏ　ｃｈｏｌｅｒａ ｅ）。

ボルデテラ・ペルッシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ　ｐｅｒｔｕｓｓｊｓ）、：Ｉ リネバクテリウム・ジフテリアｚ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｄｉｐｈ ｔｈｅｒｉａｅ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）、サルモネラ ・チフィおよびチフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉ及びｔｙｐ ｈｉｍｕｒｉｕｍ）、クロストリジウム・ベルフリンゲン（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉ ｕｍ　ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）並びに腸のクロストリジウム（ｃｌｏｓｔｒｉ ｄ±且旦）、シゲラ・ヂセンテリアｚ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ　ｄｙｓｅｎｔｅｒｉ ａり、シゲラ・フレクスネリイ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ　ｆｌｅｘｎｅｒｉｉ）、ネ １ａｍｂ１１ａ）、ストレプトコッカス（Ｓｔ　ｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）　、 呼吸シンチウムウィルス、ロタウィルス、レオウィルス、ヒト免疫不全ウィルス 、ヒトＴ細胞リンパ趨向性ウィルス、タイプＩ及び■、ポリオウィルス、リノウ イルス、インフルエンザウィルス、ヘルペスウィルス、ヒトパピローマウィルス 、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓ　ｔ　ｉ　ｓのようなＡＩＤＳ　２°病原体、及びｍｏｎ ｉｌｉａのような酵母菌に対する保護として有用である。本発明はまた呼吸系ま たは消化系粘膜表面と接触するアレルゲンに対する保護としても有用である。さ らに膣中で精子と架橋して、これが頚管及び子宮を通って移動するのを防ぐこと により、避妊剤としても用い得る。

いずれの場合でも、適当な既知の抗原、例えばウィルスコートタンパク質、バク テリア細胞表面タンパク質のような全病原体または外的に提供される抗原、刺毛 タンパク質、リポ多糖、ウィルスキャプシドまたはエンベロープタンパク質、原 虫類原形質膜表面成分、精子表面タンパク質、または呼吸アレルゲンを用い得る 。Ｕｃｈｉｄａら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２４８：３８３８−３８４４（１ ９７３）に記載の、ＣＲＭ−１９７のようなトキソイド及び不活性化ジフテリア 毒素も用いつる。所望の保護性抗体を分泌するハイブリドーマを産出するために 、上記の方法に従って抗原を用いる。−例として、ｗｏ８８１０８４３７（参照 として本明細書に包含される）は抗−Ｖ、ｃｈｏｌｅｒａｅモノクローナルポリ −１ｇ抗体を生成するのに適したｔｃＰＡ刺毛タ刺毛タンパ間質する。米国特許 第４．７２５．６６９号は抗−ＨＩＶポリ−１ｇモノクローナル抗体を生成する のに適したＨＩＶ　（ＨＴＬＶ−Ｉ［［）エンベロープ糖タンパク質を開示する 。

以下の特許及び特許出願は連鎖球菌感染、特にＳｔ　ｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、 　タイプＢによる感染に対する保護に用いる抗原の調製を開示する：米国特許第 ４゜３６７．２２１；４，３６７．２２２；４，３６７．２２３：４，３５６． ２６３：４．２０７．４１４　（ＲＥ３１．６７２）：及びＷｏ　８７１０６２ ６７゜その他の適した抗原はＢａｃｔｅｒｉａｌ　Ｖａｃｃｉｎｅｓ　ａｎｄ　 Ｌ。

ｃａｌ　Ｉｍｍｕｎｉｔｙ　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　５ｃｌａ ｖｏ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｎｆ、、５ｉｅｎａ、Ｉｔａｌｙ　１ ７−１９　Ｎｏｖｅｍｂｅｒ　１９８６に開示されている。ＨＩＶ抗原に適した 特別の試薬が５ＩＤＳ　Ｒ，ｅｓｅａｒｃｈ　ａｎｄ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｒ ｅａｇｅｎｔ　Ｐｒｏｇｒａｍ、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｊｕｎｅ　１９８９に開示されている。例えばｇｐ　１２０がＭ ｙｃｒｏＧｅｎｅＳｙｓ、Ｉｎｃ、から販売されている。ＬＤＨ−Ｃ４のような 精子細胞表面抗原も公知である。例えばＳｈ、ａｈａ　ａｎｄ　Ｔａｌｗａｒ、 Ｖ本発明を実施するための抗原の選択で特に重要なことは、粘膜保護が体内への 侵入を防ぐための架橋を含み、このメカニズムは重合体抗体が病原体を殺したり 、または”中和”する必要がないということである。これとは対照的に、全身性 （ＩｇＧ）保護は、これを効果的なものとするには、一般に病原体を中和しなけ ればならない結合を含んでいる。従って、Ｖｉｂｒｉｏ　ｃｈｏｌｅｒａｅと特 異的に結合するモノクローナル抗体の存在から明らかなように、病原体と結合す る全てのＩｇＧ抗体が保護的であるという訳ではな（、宿主中で病原体がコロニ ーを作り、成長し、臨床症状をあられすのを防ぐという意味においては、病原体 を中和するものではない。そこで保護性ＩｇＡ抗体を高めるために用い得る抗原 及び決定基の普遍性がとりわけ増す。

特定すれば、ＨＡ−吸着抗原は、上記した方法に従って、大量生産用に適当な修 飾を施して調製する。ＨＡ−吸着抗原または抗原混合物は生理的に受容し得る賦 形剤と混合し、例えば口、鼻、直腸及び／または肺表面のような粘膜表面組織に 直接投与するか、あるいは配達する。調製物はエアロゾル、懸濁液、カプセル及 び／または座薬で投与する。当業者には公知の技術を用いてかかる賦形剤を製造 することは容易である。

里塗 本発明はまたＩｇＡ−産出性ハイブリドーマの製造にも特に有用である。例えば 上記の組成物を粘膜表面に投与することによって哺乳動物をチャレンジし、次い でリンパ組織に富むバイエル板粘膜または他の粘膜からリンパ球を回収し、次い で公知技術により該リンパ球をミエローマと融合させることによって、かかるノ ゾブリドーマは容易に生産できる。例えば先に引用した共有の、本願と同時出願 の米国特許出願第０７１５１０，１６１号を参照されたい。

以下に実施例を記載するが、これは本発明の範囲を限定するものではない。

実施例　Ｉ ＰＢＳ　２０ｍ１に懸濁したＨＡ　（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）　２ｇをＭｉｃｒ ｏｓｏｎ　ｃｅｌｌ　ｄｉｓｒｕｐｔｅｒ（Ｈｅａｔ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　Ｕｌｔ ｒａｓｏｎｉｃｓ、Ｉｎｃ、、Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ、ＮＹ）の”ＨＩＧＨ″ 目盛り（１４０，８０％　ｄｕｔｙ　ｃｙｃｌｅ）を用いて、室温で、３０分間 、ブローブソニケーターで音波処理する。電子顕微鏡で測定した音波処理後の平 均の結晶サイズは約０．０１ｘＯ，１μｍである。適切な音波処理を分光光度吸 収によってモニターする。例えば、音波処理まえの懸濁液２ｍｇ／ｍｌの吸収（ ６５０ｎｍで読み取り）は０．　１０８　０．　Ｄ、ユニットであり、上記の結 晶サイズの減少後は２．　０６０　０．　Ｄ、に増加した。

実施例　２ ６５ｋＤ　（アルブミン）から４．５０に、Ｄ（フェリチン）までの各種のサイ ズのタンパク質で飽和になるまでコートしたこのサイズのＨＡ結晶を、マウス及 びウサギの腸腺腔に導入すると、）ＩＡ結晶は特異的に結合し、バイエル板のＭ 細胞によって輸送された。この方法は粒子状免疫原の形で粘膜免疫系の細胞にタ ンパク質を効果的に配達する。

２５ｇのマウスを経口予防注射するには、ＰＢＳ　２００μｌ中の少量のタンパ ク質（例えば３０ｇｇ）を、適量の（例えばタンパク質３０μｇに対してＨＡＩ ｍｇ）あらかじめ音波処理して洗浄しておいたＨＡと混合する。混合物を４℃、 で１時間撹拌し、これをミクロヒュージ中で１０．０００ｒｐｍ、２分間スピン することによって錠剤とする。この錠剤を、胃酸を中和するための緩衝液を含む 水２００μｍ中で撹拌、音波処理することにより、再懸濁する。

その他の実施態様は以下の請求の範囲に記載する。

要約書 抗原または抗原混合物と水酸化リン酸カルシウム（ヒドロキシアパタイト）から なる免疫原を哺乳動物の粘膜表面に投与して、抗原感作されたＩｇＡ−産出性リ ンパ芽球を哺乳動物中に生産させる方法。

国際調査報告

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. １．活性成分と水酸化リン酸カルシウムとが組み合わされた複合体を、哺乳動物 の粘膜表面に投与することからなる、活性成分を哺乳動物に投与する方法。
2. ２．水酸化リン酸カルシウムが上皮細胞を通過する輸送に適した粒子形で存在す る請求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．複合体が、抗原または抗原混合物と水酸化リン酸カルシウムとが組合わされ た免疫原である請求の範囲第１項記載の方法。
4. ４．複合体投与によって、抗原に感作された哺乳動物中においてＩｇＡ−産出性 リンパ芽球が生産される請求の範囲第３項記載の方法。
5. ５．免疫原投与によって哺乳動物を予防接種し、粘膜を通して導入された、抗原 を与える物質に対して哺乳動物を保証する請求の範囲第３項記載の方法。
6. ６．抗原が、外的に入手しうる病原体または精子の決定基からなる請求の範囲第 ３、４または５項記載の方法。
7. ７．抗原がウィルスコートタンパク質、ウィルスエンベロープタンパク質、細胞 表面リポ多糖または細胞表面タンパク質である請求の範囲第３、４または５項記 載の方法。
8. ８．疫原を経口、経膣、経鼻、経直腸、経眼または中耳に投与する請求の範囲第 ３、４または５項記載の方法。
9. ９．哺乳動物から複数のリンパ芽球を分離し、これを不死のものとし、不死リン パ芽球の中から、上記抗原と特異的に結合しうるＩｇＡを分泌する少なくとも１ 個の不死リンパ芽球を同定することを更に含む請求の範囲第４項記載の方法。
10. １０．活性成分と、活性成分と共に上皮細胞を通過して輸送されるのに適したサ イズの水酸化リン酸カルシウム微粒子とを組み合わせてなる組成物。
11. １１．複合体が哺乳動物の粘膜免疫応答を高めるための免疫原であって、活性成 分が、免疫応答が所望される抗原決定基からなる請求の範囲第１０項記載の組成 物。
12. １２．抗原決定基が外的に入手しうる病原体または精子の決定基である請求の範 囲第１１項記載の免疫原。
13. １３．抗原決定基がウィルスコートタンパク質、ウィルスエンベロープタンパク 質、細胞表面リポ多糖または細胞表面タンパク質の決定基である請求の範囲第１ ２項記載の免疫原。