JPH04500609A

JPH04500609A - 工業的応用条件下で安定性が減少した酵素変異体

Info

Publication number: JPH04500609A
Application number: JP2509464A
Authority: JP
Inventors: ファン　エイク　ヤン　ヘンリクース; クアックス　ウィルヘルムス　ヨハネス; サンダース　ヨハン　ピーテル　マリヌス
Original assignee: ギスト　ブロカデス　ナームローゼ　フェンノートチャップ
Priority date: 1989-06-29
Filing date: 1990-06-27
Publication date: 1992-02-06
Also published as: CA2032518A1; ZA905111B; EP0409299A2; DE69028010D1; DD301645A9; FI910908A0; ES2092488T3; NO910794D0; NZ234297A; HUT56396A; AU629959B2; IL94899A0; IE76723B1; KR920701448A; EP0409299A3; NO910794L; AU5939790A; PT94545A; WO1991000343A2; DE69028010T2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】工業的応用条件下で安定性が減少した酵素変異体（関連分野）本発明は安定性が減少した酵素変異体およびその製造法に関する。

（関連技術および関連文献）製パンに使用される小麦粉のほとんどは製粉所または製パン所でα−アミラーゼを添加されている。従来技術では菌類および穀類α−アミラーゼ調製物がパンの容積を改良するのに使用でき、かつ、細菌性および穀物α−アミラーゼはパンの柔軟化効果も有することが示されてきた。パンの硬化に関する研究でパンの保存中のデンプン質の再結晶がパンの硬化をひき起こすことが示された。結果的にパン柔軟化効果はベーキング工程の際のデンプン質の部分分解によって得られる。

α−アミラーゼの効果的な抗硬化作用はデンプン質の十分量がゼラチン化し加水分解を受け得るまで生パン内で酵素が生存していることを必要とする（ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）等、Ｆｏｏｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　）　、１９５３年１月、ｐ、３８）。

アスペルギラスオリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）により産生される菌類α−アミラーゼの熱安定性は低いのでベーキングの際にデンプンがゼラチンし、酵素の攻撃を受け加水分解する時間にこの酵素は大部分が失活してしまう、それゆえ菌類α−アミラーゼは過デキストリン化する危険なしにパンの容積を改良するのに使用し得るがパンの柔軟性を改善するのは難かしい。

一方線菌性α−アミラーゼは高い熱安定性を特徴としており、ベーキングの際に過剰のデンプンをデキストリン化し得る。過剰の酵素を添加したときそのパンはガム状でかつ粘性が増し消費者に受け入れられなくなる。細菌性アミラーゼはベーキング工程でも部分的に生き残り、かつ特にパンをゆっくりと冷やす間にその作用を持続しつづける。パンの適当な柔軟効果を上げるためには細菌性α−アミラーゼの投与量および製パン工程の条件を非常に厳密にコントロールする必要がある。これら熱安定性酵素を使用する際の問題のため、製パン工業では細菌性アミラーゼを一般に使用していない、パンの柔軟性の改善には容易に過デキストリン化しないような中程度の熱安定性を有する酵素が最も通している。

この理由で菌類と細菌性α−アミラーゼの間の熱安定性を有する麦芽α−アミラーゼが製パン工業で広く使用されている。しかし多くの麦芽調製物にはたんばく賞分解性の副活性が存在するので望ましくない副反応を引き起こす、さらに麦芽から調製した精製α−アミラーゼは製パンに使用するにはコストがかかり過ぎる。

別の可能性はベーキング工程における菌類α−アミラーゼの低い熱安定性を改善す・る方法を示した米国特許４３２０１５１および細菌性α−アミラーゼの高い熱安定性を減少させる化学修飾法を示したヨーロッパ特許出＠ＥＰ−Ａ−０２７３２６８が与えられている０両方の場合、生パンに使用する前にそれらの酵素は中間の熱安定性が得られるよう修正しておかなくてはならない、米国特許に従うと菌類α−アミラーゼは保護媒体中にこの酵素を溶解または分散させることにより熱分解から保護し得る一方、細菌性α−アミラーゼはヨーロンパ特許出願によると生パンに使用する前アセチル化されなければならない、したがって製パン工程のような工業的工程に直接使用するのに適した至適安定性を有する新しい酵素の出現が望まれる。

（発明の概要）本発明は工業的条件で低い安定性を示す変異体酵素を提供する。

この変異体酵素は野生型または天然の酵素の少なくとも１残基を置換することにより得られる。

（図の簡単な説明）第１図ニブラスミドＰＵＣＡ＋＋４の構造バチルスアミロリクエファシェンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｗｙｌｏｌｉｑｕｅ−ｆａｃｒｅｎｓ　）のα−アミラーゼ遺伝子を含む２．２ｋｂのＢａｌ　Ｕ　−ＢａｇＨｒフラグメントをｐＵｃ１８のＢａｍＨ１部位に挿入した。アンピシリン耐性遺伝子をＡＭＰで示しである。

第２図：α−アミラーゼ遺伝子のＤＮＡ配列ｐＵＣＡ■４の挿入物はバチルス・アミロリクエファシェンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｆａｃｉｅｎｓ　）のα−アミラーゼをコードする１５４２ベースの単一の大きいオープンリーディングフレームである。このアミノ酸配列は一文字コードで示しである。

第３図：　ｐＭａＴＢａｃのＥｃｏＲＴ　−ＢａｍＨＩの配列部位３７５３のＥｃｏＲ１部位はｐＭａ５　８の部位３７５３にあるＥｃｏＲ１部位に対応している。

ＴＡＣプロモーターは部位３７５３と３８５８の間に存在する。

α−アミラーゼ遺伝子は一文字コードのアミノ酸配列で示しである。

第４図ニア５℃、１０分間のインキュベーション後の野生型（ＷＴ）および組合せ変異体α−アミラーゼの残余活性変異体は第７表に示しであるものである。

第５図ニア５℃、１０分間のインキュベーション後の野生型（ＷＴ）および変異体α−アミラーゼの残余活性変異体は第８表に示した残基１２３における種々の置換体である。

第６図二Ｂ、アミロリクエファシェンス（ａ曽ｙｌｏｌ　１ｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）Ｈ２ＤＮＡ、５’および３′組込み体およびα−アミラーゼネガティブ株ＢＡＭ１１２の染色体地図。

（特定の態様の説明）適当な安定性を有する酵素はたとえば古典的スクリーニング法または最近の遺伝子およびたんばく賞工学技術によりスクリーニングまたは開発し得る。

望ましい酵素活性を有する生物または微生物のスクリーニングはたとえば微生物またはその培養物上清からの酵素の単離精製、その生化学的性質の測定およびこれらの生化学的性質が特定の用途に適合するかどうかのチェックにより行なわれる。もし同定された酵素が天然の生物から得られないなら組換えＤＮＡ技術を用いてその酵素をコードする遺伝子を単離し、この遺伝子を別の生物内で発現させ、発現した酵素を単離精製し、それが目的に適するかどうかをテストする。

目的に適した新しい酵素を得る別の方法には既存酵素の修正がある。これは化学的修正法で行なうことができる（１．スペントセン　（Ｓｖｅｎｄｓｅｎ）　、　Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ　Ｒｅｓ、Ｃｏｍ５＋ｕｎ、４　４　（１９７６）　２３７−２９１）、−ｆｆｌにこれらの方法は共通する側鎖の全ての受容基を修正してしまうか、または修正すべき適当なアミノ酸の存否に依存する点で非特異的すぎ、またその酵素が変性していない場合には反応しにくいアミノ酸を修飾し得ない。

別に、コードしている遺伝子の突然変異誘発による酵素修正は上述のような非特性がないので秀れていると考えられる。突然変異誘発はランダム突然変異誘発または部位指定突然変異誘発により行ない得る。

化学的変異原または変異性照射による微生物全体の処理によるランダム突然変異はもちろん修正した酵素を生ずる。この場合これら特定で稀れな変異体を探す強力な１沢技術を使用しなければならない、ランダム突然変異誘発により変異体酵素を単離する可能性はコード遺伝子のクローニング後それをインビボ、またはインビトロでの変異および適当な宿主細胞での変異遺伝子の再クローニングによる該酵素の発現により高くし得る。修正酵素の産生に適した宿主にはたとえば細菌（大腸菌、バチルス）、イーストまたは菌類（アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　）がある、またこの場合適当な生物学的選択法が望しい変異体酵素を選択するのに使用可能でなければならない、これらの生物学的選択法は必ずしも工業的応用に適した酵素を直接選択する必要はない。

本発明は野生型酵素と少なくとも１つのアミノ酸が異なるアミノ酸配列を有する酵素をコードする遺伝子の発現により得られ、かつ工業的条件下で低い安定性を示す新しい変異体酵素を提供する。いくつかの変異体酵素は実験条件下でより低い安定性を有することが知られているが、テスト条件下と応用条件下の差のために（温度、ｐｔ＋、基質等）工業的条件下では安定性に小さな変化しか得られなかった。まず我々は工業的条件下安定性が減少した変異体を得ることに成功した。

１つ以上のアミノ酸の任意のアミノ酸による特異的置換を可能にする部位指定突然変異誘発を用い性質を改良した酵素を構築し、選択し得る。

本発明の１つの特徴として同定された突然変異を組合せて望むように精密に安定性を調節し得る。変異体酵素の安定性の微調整は適当な変異体を合せることにより可能となる。

たとえば熱安定性、ｐｕ安定性、攪拌時の安定性、または基質、塩、インヒビター等の化学物質存在下での安定性などあらゆる種類の酵素の安定性を変化させ得る。

コード化遺伝子またはコード化遺伝子の融合体の突然変異誘発は酵素活性が変化したα−アミラーゼ変異体を構築する技術としてすでに応用されてきている。最近の特許出願において（ＥＰ０２０８４９１）、Ｂ、リチェニホルミス（ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｓｉｓ　）およびＢ、ステアロサーモフィラス（Ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｓｏｐｈｉｌｕｓ）由来の融合α−アミラーゼ遺伝子を構築することにより細菌性α−アミラーゼハイブリッド酵素の構築法が記載されている。　Ｎ、Ａ、スミルノヴｙ　（Ｓｍｉｒｎｏｖａ）　等　（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ＡｂｓｔｒａｃｔｓＳ　８　７　、？　（１９８９）　。

アブストラクト番号７０１２７および７０１２８）は実験室テスト条件下、熱安定性の低いＢ、アミロリフエフアシアンス（ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ　）α−アミラーゼ変異体を構築した。このテスト条件は製パン条件とは全く異なりｐｏ値がかなり低く　（ｐｌ＋５−５．５）、一方デンプン含量および粘性は非常に高いものである。

参照例に示したように、実験室テスト条件下で低い熱安定性を示した全ての変異体α−アミラーゼが製パン条件で至適熱安定性を示したわけではない０本発明は工業的条件下で望ましい安定性を示す変異体酵素の調製法を提供し製パンに最も適した変異体を選゛訳する操作により変異体製パン酵素の調製法を例示している。製パン酵素とは生パン製造に関する、または使用する酵素を意味している。

変異体酵素とは野生型酵素と１つ以上のアミノ酸が異なる酵素である。変異体酵素をコードする遺伝子は野生型遺伝子と少なくとも１残基、好ましくは１〜１０残基が異なるＤＮＡ配列を有する。変異体酵素は微生物の醗酵工程およびそこからの酵素の単離精製により生産される０本発明に従かう変異体酵素は工業的条件下望ましい安定性を存し、かつさらに化学修飾することなしに使用し得る。たとえばこの変異体酵素は製パン条件下で低い熱安定性を存するα−アミラーゼである。アミロース分解、ヘミセルロース分解、たんばく賞分解、脂肪分解または酸化還元酵素活性を有する他の製パン酵素も同様にパンの質を同上するのに応用し得る（たとえばＡ　Ｉ　Ｂ　Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ　（１９８０）νｏ１．　ＩＩ、１０．１１１２のレヴユー参照）、熱安定性、ｐＨ１基質特異性、活性など既存の酵素の性質は製パン酵素として応用するのに常に至適なものとは云えない０本発明は製パンへの応用により適したものにする既存酵素の性質の至適化法を提供する。たんばく質工学を用いて製パン工程の１つで最も高い活性を有する酵素を構築し得る０本発明の特徴の１つとして、製パン工程のうちのベーキング工程間ではα−アミラーゼ活性の大部分を保持し、かつその工程の後には消失する至適安定性を有するα−アミラーゼが提供される。たんばく賞工学により既存の製パン酵素を改良する別の例には変異体たんばく質分解酵素の調製がありこの酵素は製ノくン工程の混合操作中に失活し、それゆえ混合のときだけ活性をもつ混合時間短縮剤として働く。

修正したα−アミラーゼは野生型酵素と少なくとも１つの選らばれたアミノ酸が異なるアミノ酸配列を有している。上述の突然変異は後に詳細に説明されるようにバチルスアミロリクエファシェンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）α−アミラーゼから得られる。たとえば野生型酵素と少なくとも１つのアミノ酸がＢ、アミロリクエファシェンス（Ｂ、　ａＩＩｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｊｅｎｓ）のアミノ酸番号１１３．１１４．１１６．１２３．１６３．１６４．１６６．２３８．３１６．３２２．３４５．３４９．３５６．３８６．３９４または３９８の部位または相同的α−アミロースの相同的部位で異なるアミノ酸配列を有する細菌性α−アミロースがある。

アミノ酸番号１２３に変異をもつα−アミラーゼはうまく応用し得る。当業者は適当な酵素がアミノ酸配列の他の部分に対応するアミノ酸に変異をもつものも同様に得られることが理解できよう。

本発明の別の特徴として修正したα−アミラーゼのアミノ酸配列が少なくとも２つのアミノ酸番号の個所で修正を受けている。

このことは単一の変異の各々の寄与以上に安定性を減少させた酵素を生ずる。このように変異体α−アミラーゼは至適安定性をもつよう調製することができる。

修正したα−アミラーゼの生産に適した宿主には大腸菌、枯草１　（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ　＞　、バチルスリチェニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｉｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）およびバチルスアミロリクエファシェンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）がある、この遺伝子は宿主に組込まれることが望ましい。

修正α−アミロースはたとえば製パン工程など工業的用途において性質の向上を示す、変異体α−アミロースと合せて本明細書で用いられている改善した性質とはベーキングにおける野生型酵素と比べてより低い熱安定性を意味している。

本発明に従かい変異体酵素は、ベーキング条件下における細菌性α−アミラーゼの熱安定性等、本来の酵素の安定性の注意深い生化学的研究と合せた野生型酵素のｌＩａの注意深い考察とそれにつづく野生型遺伝子配列の合理的修正に基づき設計される。工業的条件下での設計酵素の研究により至適性質を有する変異体が同定される。

本発明の１つの特徴に従かいたとえばベーキング工程などの用途において低い安定性を有する変異体α−アミラーゼは生パンまたは製パン（または関連産物）工程で使用し得る。関連産物とは水および粉末穀物の混合物からなる生パンを焼いてできる産物を意味する。

（材料と方法）１、一般的クローニング技術クローニング法はＴ、マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）等のハンドブック、１９８２、分子クローニング、コールドスプリングハーバ−ラボラトリ−；　Ｆ、Ｍ、オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ　）等、１９８７　、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、ジョンウイリーアンドサンズ社版、ニューヨーク：Ｂ、バーパル（Ｐｅｒｂａｌ）　、１９８８　、Ａｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、第２＆Ｗ、ジツンウイリーアンドサッズ社版、ニューヨークに記載されているものを使用した。これらのハンドブックには組換ＤＮＡ分子の構築および増殖法、遺伝子ライブラリーの作製法、ＤＮＡの配列決定法および変異法およびＤＮＡ分子の酵素的取扱い法が記されている。

２、化学的突然変異誘発クローン化したＤＮＡをインビトロで化学物質で処理しそのＤＮＡに突然変異を導入し得る。これらの突然変異がアミノ酸をコードしているトリプレットコドンに生じたならばこの変異したクローン化ＤＮＡにより変異たんばく質が生成し得る。

亜Ｐ−ｔａナトリウムを用いた化学的突然変異誘発法はジョートル（Ｓｈｏｒｔｌｅ　）およびボスティン（ＢｏｔｓＬｅｉｎ）によって報告されている（Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｗ’ｏ１．、］　９８３、上ｏｏ、４５７）、フォーク（Ｆｏｌｋ）およびホフステタ−（Ｈｏｆｓｔｅｔｔｅｒ）により好ましい方法が報告されている（Ｃｅｌｌ、１９８３．３３．５８５）、突然変異誘発の他の方法はスミス（Ｓ■１ｔｈ）により報告されている（Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｇｅｎｅｔ、、１９８５　％１度、４２３）、特に有用な方法はオースベル（Ａｕｓｂｅｌ）等により報告されている（上述）（第８章参照）。

３、ギャンブ二本１ｉＤＮＡの突然変異誘発ギャップ二本鎖に基づく方法（クレーマー（Ｋｒａ■ｅｒ）等、１９８４、Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１２．９４４１）およびプラスミド（プラスミド／ファージハイブリッド）を用いた。基本的にこの方法は抗生物質耐性マーカーを含むギャソプ二本鎖Ｄ　Ｎ　Ａ中間体および抗生物質に対する耐性を付与する遺伝子中にマンバー変異を有するテンプレート鎖（＋鎖）に鱈るものである。アニーリング後、インビトロギャップフィリングおよびシーリング反応を介して変異原性オリゴヌクレオチドをギヤツブ鎖に取り込ませる。生成した分子は目的の変異と抗生物質耐性の結合が保持されているミスマツチ修復能欠損（Ｍｕｔ　Ｓ）宿主のトランスホームに使用する。この株から単離した混合ファスミド集団をサプレッサーネガティブ宿主株中で分離させる。トランスホーマントを抗生物質含有培地上にブレーティングし、ギヤツブ鎖由来の子孫を選択する。

Ｐ、スタンセンズ（Ｓｔａｎｓｓｅｎｓ　）等により報告されたツインベクターシステムｐＭａ／ｃ　５−８　（“たんばく賞工学および部位指定突然変異誘発 ”、１９８５、第２４回ハーデン会議、プログラムと概要、＾、Ｒ，ファースト（Ｆｅｒｓｈｔ）およびＧ、ウィンター（Ｗｉｎｔｅｒ）編）は以下の要素を含んでいる。

ｐｏｓｌｌ−１０５；バクテリオファージｆｄ、ターミネータ−ｐｏｓ１２１− ２１５；バクテリオファージｆｄ、ターミネータ−ｐｏｓ２２１−３０７；プラスミドｐＢＲ３２２（ｐｏｓ　２０６９ｐｏｓ３１３−７６８；バクテリオファージｆｄ、複製オリジン（ｐｏｓ　５４８２−５９４３　）ｐｏｓ７７２　２５７１；プラスミドｐＢＲ３２２、複製オリジンおよびβ−ラクタマーゼ遺伝子ｐｏｓ　２５７２−２６８５　；　）ランスボゾンＴｎ９０３ｐｏｓ　２７１９ −２７７２　；　）リプトファンターミネータ−（ダブル）ｐｏｓ　２７７３−３７２９；　）ランスポゾンＴｎ９、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子ｐｏｓ　３７３０−３８０３　；多重クローニング部位この配列は公表されている（スタンセンズ（Ｓｔａｎｓｓｅｎｓ　）等、１９８７、Ｅ　Ｍ　Ｂ　Ｏ−ｃｏｕｒｓｅ、マーチンスリード；スタンセンズ（Ｓｔａｎｓｓｅｎｓ　）等、１９　Ｂ　９　、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、上１．４４４１−４４５４＞。

ｐＭａ型ベクターではヌクレオチド３４０９はＧからＡに変っており、ｐＭｃ型ベクターではヌクレオチド２２３８がＧからＣに変っており各々アセチルトランスフェラーゼ遺伝子およびβ−ラクタマーゼ遺伝子中にアンバーストップコドンができて各遺伝子が不活性になっている。

これら全ての配列はＧｅｎｂａｎｋ　”　（ナショナルヌクレイフクアシソドシーケンスデータバンク、ＮＩＨＵＳＡ）から入手し得る。

プラスミドｐＭｃ５−８は登録されている（０３Ｍ４５６６）、突然変異誘発を行うため目的のＤＮＡフラグメントをｐＭａ５　８の多重クローニング部位にクローニングする。つづいて目的ＤＮＡを含むｐＭａ５−８とｐＭｃ５−８の間にギャップ二重鎖を構築する。

目的ＤＮＡを含む一本鎖のギャップに対し変異原オリゴヌクレオチド、低いレベルのヌクレオチド取り込みミスをもつ長い合成オリゴヌクレオチド、化学物質またはヌクレオチドの酵素的取り込みミスによる突然変異誘発を行う、詳細な説明はオースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ　）等、上述またはバーパル（Ｐｅｒｂａｌ）上述を参照せよ。

インビトロ突然変異誘発の代替法としてＵＶ光または化学物質または大腸菌のミューチーター株を用いたインビボ突然変異誘発を使用し得る（ホーマー（Ｆｏｗｌｅｒ）等、Ｊ、　Ｂａｃｔｅｖｉｏｌ、１９８６．１エエ、ｐ、１３０）。

変異原性ヌクレオチドはアブライドバイオシステムズから入手し得る装置を用いて合成し得る。

４．ヌクレオチドの酵素的取り込みによるランダム突然変異誘発ｐＭａ／ｐＭｃギャフブニ重鎖に対し最初ンヨートル（Ｓｈｏｒｔｌｅ　）等（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｈ、　Ａｃａｄ、　ｏｆ　５ｉｅｎｃｅ　７９−１ｐ−１５８８−１５９２）およびカニンガム（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ）およびウエルス（Ｈｅｌ１ｇ　）（Ｐｒｏｔ、　Ｅｒ＋ｇ、、１９８７、上、ｐ、３１９）により報告された方法、または好ましくはレトバーラ（Ｌｅｈｔｏｖａａｒａ）等（Ｐｒｏｔ、　Ｅｎｇ、、１９８８．２、ｐ、６３）により報告された方法によりプライマー伸長および取り込みミス突然変異誘発を行った。

この方法はポリメラーゼを制御して使用することに基づ＜、４種のＤＮＡ分子をｐＭａ／ｐＭｃのギャフブニ重鎖のプライマー伸長により生成し、ギャップの中でランダムであるが必ず既知の塩基（各々Ａ、Ｃ，Ｇ、ＺたはＴ）の前で停止するようにする。４種のＤＮＡを正しい塩基を除いた別の取り込みミス反応で変異をかける。この方法ではギャップ中の全ての個所に全ての型の塩基置換突然変異を生成し得る。レソバーラ（Ｌｅｔｈｏνａａｒａ）の方法を修正してクレノーＤＮＡポリメラーゼの代りにンークエネースＴＮ（ユナイテソドステーンバイオケミカルコーポレーション、クリーブランド、ＯＨ）およびへＭＶ逆転写酵素の代りに１０−〇しν逆転写酵素（Ｂ　ＲＬ）を使用した。またより高１度の逆転写酵素を使用するとしばしば連続的突然変異が生ずることが観察された。これは不安定な酵素を作る上で都合がよいと考えられる。

一方車一部位の１襖を保証するためにレトバーラ（Ｌｅｈ　ｔｏｖａａｒａ）等（上述）の方法を以下のように修正した。逆転写酵素バッファ中には３種ではなく唯一個の取り込みミスヌクレオチドを存在させる。たとえばＡ特異的制限塩基伸長混合物は各々２５０μ門ｄＣＴＰ、２５０μ−ｄＧＴＰおよび２５０ｇＭ　ｄＴＴＰを含む３１１別々の反応液中でインキュベートする。４種塩基特異的制限伸長混合液全てに対し、総計１２組の取り込みミス反応を行う。

４２℃】、５時間のインキュベーション後、全４種デオキシヌクレオチドを０．５ｍＭとなるように添加し、反応をさらに３７℃で少なくとも２０分間インキュベートする。さらにそのサンプルをウラシル含有ＤＮＡ鎖に対してではな（ｐＭａ／ｃベクターに基づく逆選択を用いるように修正を行ったレトバーラ（Ｌｅｈｔｏｖａａｒａ）等の方法に従って処理した。

５、変異体α−アミラーゼのＪｌ１Ｍ１１ＭプラスミドルＢａｃを宿す大腸菌ＷＫ６細胞を適当な選択試薬を含むＢＨＩ培地で増殖する。−晩培養物１０ｍｊを遠心で落とし】層ｌの２０９Ａスクロース、１％Ｍ　ＥＤＴＡｔ容液に懸、濁する。

２０℃で１５分間のインキュベーション後再び細胞を遠心で落とす、細胞ペレットをｌ■ｐのミリＱ水に懸濁し０℃に１０分間維持する。スフェロプラストを遠心で落とした後α−アミラーゼを含む上清を２ｗｒＭ　ＣａＣＩＢ　、０．７ｍＭ　ＭｇＣｆｔおよび２．５ｍＭ　ＮａＨＣＯｉ　とする、必要なときはα−アミラーゼを従来の生化学的手法で精製し得る。

６、α−アミラーゼ活性 α−アミラーゼ活性はファルマシアから市販されているフェードバス７″を用いてルーチンに測定した。この方法ではバッファｐＨ５，５における３０℃、１５分間の色素標識デンプンの可溶化が分光学的に測定される。α−アミラーゼ活性は内部標準として１００００ＰＵ／ｇのアスペルギラスオリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌ　１ｕｓｏｒｙｚａｅ）菌のα−アミラーゼ調製物を用いたフェードバスユニット（Ｐ　ｔＪ）で表現される。１フエードバスユニットは製パン業界で用いられているＳＫＢユニット約１０ユニットに等しい。

パンの中の残余α−アミラーゼ活性は若干異なる操作を用いて測定する。パン１０ｇと４０ｍｌのバッファｐＨ５，５からウェアリングブレンダーを１分間フルスピードで使用してパン懸濁液を作る。そのパン懸濁ｆｉｏ、１〜１．０ｓｊ！をフェードハステスト中３０℃で一晩（１８時間）インキュベートした。パン中の残余活性はパン懸濁液中の無処理アミラーゼ活性を細菌性α−アミラーゼなしで調製したコントロールのパンのパン懸濁液に添加した未処理酵素の活性と比較して計算した。

７、応用（ベーキング）テストにおけるα−アミラーゼの熱的不安定性選択したα−アミロース変異体の熱不安定性をパブローフベーキングテストで試験した。パブローフは２００ｇ小麦粉（１００％）、１１０ｍｊ’水（５５％）　、３ｍｇ７スコルヒンｅｌ！　（１５ｐｐｓン、１．４ｇインスタントドライイースト（０，７％ファーミバンＴＭ）、４ｇ塩（２％）、３ｇ砂糖（０，２％）、ＩＯＢ菌類α−アミラーゼＰ２゜。（２２５０５ＫＢ／ｋｇ小麦粉）および種々の量の野生型および変異体細菌性α−アミラーゼを混合して得られる１５０ｇの生パンを焼いて作る。ピンミキサー中５２ｒ、ｐ、ｍ、で６分１５秒間混合した後生パンを子分けし、３０℃で４５分間ブルーフし、穴をあけた後再びもう２５分間ブルーフしてから型に入れた。

３０℃で７０分間の最後のブルーフを行った後その生パンを２４０℃のオーブンで２０分間焼きそのパンの容積をなたね種子置換法で測定した。スチーブンステキスチャアナライザーを用い、室温で７２時間プラスチック容器中に保存しておいたパブローフの中央からの２片のパンの柔軟性を測定した。パンの硬度の債は直径１．０インチのプローブと０．５ｍｍ／ｓｅｃの圧縮速度を用いたときの２ｃ謡厚のパンスライスを５ｍ＋＋（２５％）圧縮するのに必要な力（ｇ）として表現される０種々の細菌性α−アミロースサンプルの熱不安定性は過デキストリン化を起こさない条件で至適パン柔軟性を得るのに必要なα−アミラーゼユニット（ＰＵ）数で表現したく硬度値の２０〜３０％減）。

８、細菌性α−アミラーゼ変異体のベーキング性能の評価１、パン容積の改善効果（変異体）細菌性α−アミラーゼのパン容積改善効果は操作法のうちＣａＣ１！、菌類α−アミラーゼおよびシラトニングを省くこと以外は先に述べたパブルーフ製造法で測定した。

２、パン柔軟化効果生パンを３５００ｇ小麦粉（１００％）、１９６（１ｗ１水（５５％）、８７．５ｇ圧縮イースト（２，５％）、５２．５ｇ砂糖（１，５％）、７０ｇ塩（２％）、２１０Ｂ菌類α−アミロースＰ２゜。（２７００３ＫＢ／ｋｇ小麦粉）、１７．５ｇショートニング（０，５％）　、１０　ｓｍｇ’ｙスコ７レヒンｔａ（３０ｐｐｍ）　、９４．５ＩＩｇシスティン（２７，５ｐｐ園）および種々の量の野生型または変異体細菌性α−アミラーゼから調製した。ケンバースパイラルミキサー（スピード１の３５０回転とつづくスピード２０１２００回転）による混合後、９００ｇの生パン片をまるめ、３０℃で３５分間ブルーフし、穴あけ、型入れ３４℃、６５分間のプルーフし最後に２２０℃のオーブンで３０分間焼いた。パン容積はナタネ種子置換法で測定し、パンの粘性は４段階の消費者による分類で判定した（０：粘性なし、過デキストリン化されていない；　Ｏ／＋　：粘性なし、わずかにデキストリン化（最適性能）；＋：わずかに粘性、わずかに過デキストリン化；　＋＋＋　Ｈ非常に粘性あり、著しく過デキストリン化）、パン硬度を測定するため中央部から２ｃｍ厚の２片のパンを直径１．５インチのプローブ、圧縮深度５６１１（２５％）および圧縮速度０．５ｍｍ／ｓｅｅを用いたスチーブンステキスチ中アナライザーで分析した。

本明細書で引用している全ての出版物および特許出願は各出版物または特許出願が特別にかつ個別に参考として組込まれていると明示されているのと同様に参考として組込まれている。

これまで述べてきたように本発明の明確化および理解を目的とした説明および例によりある程度詳細に本発明を説明してきたが本発明の内容を見て請求項の精神および範囲を逸脱することなしに特定の変化および修正を行ない得ることは当業者にとって明白であろう。

以下に例を用い本発明をさらに説明する。

例　１バチルスアミロリクエファシェンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａ＊ｙｌｏｌｉｑｕｅ −ｆａｃｉｅｎｓ）α−アミラーゼ遺伝子の分子クローニングバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）　ＨＩ　ＡＭ　１５２１株（ハートレー（Ｈａｒｔｌｅｙ）　、１９６８、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　７．２４０１−２４０８）の誘導体であるバチルスアミロリクエファシェンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）　Ｈ２から単離した染色体ＤＮＡを制限酵素Ｂｅ１］で消化しプラスミドｐＵＮ１２１にルソン（Ｎｉｌｌｓｏｎ）等、１９８３、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、土工、８０１９）のＢｃ１１部位にライゲーションした。このプラスミドはアンピンリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子および０１−リプレッサー遺伝子を有している。テトラサイクリン遺伝子の転写はＣ１−リプレッサー遺伝子産物により■止される。外来ＤＮＡの０１−リプレッサー遺伝子中の唯一のＢｃ１］部位への挿入はテトラサイクリン耐性を活性化する。このことがアンビンリン／テトラサイクリン含有寒天プレート上での組換え体のポジティブ選択を可能にする。このライゲーション混合物を大腸菌ＨＢ　１０１　（ＡＴＣＣ３３６９４）にトランスホームした。アンピシリン／テトラサイクリン耐性コロニーについて０．４　ｇ　／　１のデンプン（メルク製）を補ったＬＢプレート（オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）、上述）上でのα−アミラーゼ産生をテストした。増殖およびＩ、蒸気とのインキュベーシッン後、大きい透明ハローを作るポジティブ大腸菌コロニーを選択してさらに特性を調べた。対応するプラスミドｐＵＮＨ２はバチルスアミロリクエファシェンス　（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｗｙｌｏｌｉ−ｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）　Ｈ２由来の５．５ｋｂ　Ｂｃｌ　Ｉ　−Ｂｃｊ！　Ｉ挿入物を含んでいることが示された。ノーンクリーンＣＢＩＯ１０１から入手可能、ラジッラ、ＬＡ、ＵＳＡ）を用いｐＵＮＨ２から２．２ｋｂ・ＢｇＩＩＩ−ＢａｓＨＩフラグメントを単離し、ｐＵｃ１８　（ファルマシア）のＢａｍＨ１部位にライゲーションした。生成したプラスミドｐＵｃ、Ａ＋４を第１図に示す、ｐＵｃＡｍ４の挿入物をサンガー法で配列決定した（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、ｌ　９７７゜ユ↓ 、６４６３）、このＤＮＡ配列は３１個のアミノ酸からなるシグナル配列と４８３個のアミノ酸からなる成熟たんばく質をコードする１５４２塩基長のオープンリーディングフレームを明らかにした（第２図）、このたんばく質の配列はタキネン（丁ａｋｋｉｎｅｎｎ）等により決定されたバチルスアミロリクエファシェンスのα−アミラーゼ配列（Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、１９８３．　２５８゜１００７）と同一であった。

例２突然変異誘発／発現ベクターｐＭａＴＢａｃの構築ｐＵｃＡｍ４から２．２　ｋｂ　Ｓｅａ　ｌ　−ＢａｍＨＩフラグメントを取り出しシーンクリーン法で精製した。このフラグメントをＳｍａｌ　−ＢａｍＨｌで消化したｐＭｃ５−８にライゲーションした。生成したプラスミドｐＭｃＡｍは大腸菌ＷＫ６　（ＣＢＳ４７３．８８）（ゼル（Ｚｅｌｌ）　、　Ｒ，およびフリフッ（Ｆｒｉｚｚ）　Ｈ，Ｊ、、ＥＭＢＯＪ、１９８７，６．ｐ、１８０９））ランスホーメーンヨンにより得た。ファージＭ１３ＫＯ７の感染後−末鎖ｐＭｃＡｓを製造業者（ファルマシア）の指示に従って単離した。二本鎖プラスミドｐＭａ５−８をＳｍａｌおよびＢａｍＨＩで消化し一本鎖ＤＮＡ−にアニールすることによりギャップ二重鎖を作った（クレーマーＣＫｒａｗＩｅｒ　）等、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１９８４　、　１２　、　９４４１　）　＠このギャップ二重鎖に対し開始コドンから−１８の部位にＸｂａ１部位を導入するように設計したオリゴヌクレオチドを用いた部位指定突然変異誘発を行った（クレーマー（Ｋｒａｍｅｒ）等、上述、ゼル（Ｚｅｌｌ）、　Ｒ，およびフリフッ（Ｆｒｉ　ｔｚ）　Ｈ、Ｊ　、上述）、このオリリボヌクレオチドの配列は：５　’　−ＴＴＣＣＴＣＴＣＣＣＴＣＴＡＧ　ＡＴＴ　ＴＣＴ　ＴＡＴ　ＡＣである。

突然変異誘発後そのプラスミドをＤＡＭ−大腸菌（大腸菌ＧＭ４８、ファバゲン、アトレフチ）を介してから、そのＥｃｏＲＩ−Ｘｂａｌフラグメントを部分消化で取り除きｔａｃプロモーターを１コピー含む合成ＥｃｏＲＩ　−Ｘｂａ　Ｉフラグメントと置換する。このフラグメントの配列は生成したｐＭａＴＢａｃ　（ＣＢＳ２８７．８９）のα−アミラーゼをコードする挿入物とともに第３図に示した。

このプラスミドはＩ　ＰＴＧ誘導可能なＴａｃプロモーターの制御子大腸菌中で α−アミラーゼを生成する。さらにこのベクターの挿入物はｐＭａおよびｐ　Ｍ　ｃ型ＤＮＡ分子間の適当なギャップ二重鎖分子を作製することにより突然変異を誘発し得る。各々の分子に対応する一本鎖ＤＮＡは供給元（ファルマシア社）の指示に従かいファージＭ１３に０７を大腸菌ＷＫ６に感染することにより得られる。

例３（ｐＭａＴＢａｃの亜硫酸による突然変異誘発）−末鎖のｐＭａＴＢａｃをＫｐｎｌ−Ａｐａｒで消化したｐＭｃＴＢａｃとアニールさせ、部位４９１５〜５１４６　（第３図Ａ−Ｃ参照）にギャップをもつヘテロ二重鎖を得る。このヘテロ二重鎖に対し亜硫酸による突然変異の誘発を行う（実験参照）、大腸菌ＷＫＳＭ　ｕ　ｔ　Ｓ株（ＣＢＳ４７２．８８）（ゼル（Ｚｅｌｌ）、　Ｒ，およびフリフッ（Ｆｒｉｔｚ）、Ｈ，Ｊ、、上述）へのトランスホーメーションおよびクロラムフェニコール含有寒天プレート（２５μｇ／ｍｌ）における選択後プラスミドプールを単離し、大腸菌ＷＫ６へトランスホームした。生成したトランスホーマントを２．ＯｗＩＭ　ＣａＣｆｇ、２５μｇ乙ｉクロラムフェニコールおよび０．１５ｓＭ　Ｉ　ＰＴＧ（シグマ社）を含むＢＨＩ培地（ディフコ社）中３７ ℃で２４時間生育させた。この上清の３つのサンプルを８０℃で各々０．７および１４分間インキュベートし、その後そのα−アミラーゼ活性を検定した。これは各サンプル（５〜１０μｌ）を０．２％のデンプンを含むＢＨＩプレート上にスポットし、５５℃で１時間インキュベートした後、Ｉｚ温溶液３ｇＩｚ／ｊ！および７ｇＫＩ／ｌ）でプレートを発色させた。８０℃における長時間インキュベーシヨンの結果、野生型コロニーと比較してハローサイズおよび強度の減少を示すコロニーを熱的不安定α−アミラーゼ変異体として選択した。

第１表に典型的実験で得られた変異の配列を示す、ＤＮＡ配列決定はｐＭｃＴＢａｃ変異体の一本鎖ＤＮＡの単離後ギャップ領域の配列を決定することにより行った。変異体ｐＭｃＴＢａｃプラスミドをＢＨＩ培地中大腸菌ＷＫ６株で増殖し、浸透圧ショフク法で細胞周辺校のα−アミラーゼを放出させて酵素調製物とした（オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）等、上述、材料と方法）。

第２表にα−アミラーゼ変異体の至適投与量とベーキングの結果を示す。

パン容積は各ベーキング実験毎に異なり得るので、全ての実験で行ったコントロール酵素調製物（野生型：ＷＴ）との相対値で比較した。このＷＴ酵素は非変異プラスミドｐＭａＴＢａｃを大腸菌ＷＫ６を用いて増殖させることにより調製した。

第　１　表亜！Ａｒ１１突然変異誘発後の熱感受性α−アミラーゼ変異体変異体　アミノ酸番号　ヌクレオチド変化　アミノＩＩｌ変化Ａ８　３９４　ＣＣＧ　ＴＣＧ　Ｐｒｏ　５ｅｒ３８６　ＴＡＣＴＡＴ　Ｔｙｒ　ＴｙｒＢＩＯ３４５ＣＣＧ　ＴＣＧ　Ｐｒｏ　５ｅｒＥ１２　３９８　ＣＣＣＴＣＣＰｒｏ　５ｅｒＧ２　３８６　ＣＣＧ　ＣＴＧ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ３　３４９　ＧＣＣＧＣＴ　Ａｈａ　Ａｌａ３２２　ＡＣＡ　ＡＴＡ　Ｔｈｒ　ｌ１ｅ４　３４５　ＣＣＧ　ＴＣＧ　Ｐｒｏ　５ｅｒ６　３２２　ＡＣＡ　ＡＴＡ　丁ｈｒ　１ｉｅ３］６　ＣＡＴ　ＴＡＴ　）ｌｉｓ　Ｔｙｒ７　３５６　ＴＣＣＴ丁ＣＳｅｒ　Ｐｈｅ第　２　表亜硫酸変異体α−アミラーゼを用いたベーキングテストＡ８　１４　５７４ＢＩＯＳ　５９６Ｅ１２　１４　５７７Ｇ２　８．５　５９１７　１１．１　５５０例　４（酵素的取込みミスによるｐＭａＴＢａｃの突然変異誘発）−末鎖ｐＭａＴＢａｃ　（例２参照）をＥｃｏＲＶ　−Ｋｐｎ　Ｉで消化したｐＭｃＴＢａｃとアニールし部位４０１８〜４９１５にギヤツプをもつヘテロ二重鎖を得た（第３図参照）、このギャンブニ重鎖について実験セクノッンで述べた酵素的取り込みミスによる突然変異誘発を行った。

Ａ制限のプライマー伸長後に得られるサンプルを３つに分け、逆転写酵素の存在下各々ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰとインキュベートした。３７℃、１０分間のインキュベートの後４種すべてのｄＮＴＰおよびクレノーポリメラーゼおよびＴ４−ＤＮＡリガーゼを用いて完全な二本鎖分子へと伸長させた。この分子を大ｌ！菌ＷＫＳＭｕｔ株にトランスホームし、そのプラスミドブールを回収した。このプラスミドブールを大腸菌ＷＫ６株にトランスホームし、クロラムフェニコール（２５μｇ１０＋１）含有寒天プレートでコロニーを選択した。

生成した変異体について例３で述べた方法を用い熱感受性ｚ　−アミラーゼをスクリーニングした。

第３表は典型的実験で得られたいくつかの熱感受性α−アミラーゼの配列を示している。ＤＮＡ配列はｐＭｃＴＢａｃ変異体の一本ｔＡＤＮＡを単離後ギャップをシーケンシングすることにより決定した。

第４表は変異体α−アミラーゼの至適投与量およびベーキングテストの結果を示している。

第３表制限伸長後に得られた熱感受性アミラーゼ変異体Ａ−ＡＡ”　ヌクレオチド・　アミノ　−１２　１１６　ＧＴＣＧＡＣＶＡＬ　ＡＳＰ１３　１１３　ＧＴＡ　ＧＧＡ　ＶＡＬ　ＧＬＹ１１４　ＡＣＴ　ＡＣＣＴ）ＩＲＴＨＲ１１６ＧＴＣＧＣＣＶＡＬ　ＡＬＡ１４　１６３　ＴＧＧ　ＣＧＧ　ＴＲＰ　Ａｌ１Ｇ１６４　ＧＡＴ　ＧＡＧ　ＡＳＰ　ＧＬυ１６６　丁ＣＣＣＣＣＳＥＲＰＲＯ１７２３８７７丁　ＣＴＴ　ＰＩＩＥ　ＬＥＵ２５　１１６　ＧＴＣＧＣＣＶＡＬ　ＡＬＡ２６　１１６　ＧＴＣＧＧＣＶＡＬ　ＩＩ；ＬＹ２９　１１３　ＧＴＡ　ＧＣＡ　ＶＡＬ　ＡＬＡ１１４　ＡＣＴ　ＡＣＧ　Ｔ［ｌｉｌ　ＴＯ！？１１６　ＧＴＣＧＣＣＶＡＬ　ＡＬＡ第３表（続き）Ａ　’　ＡＡ　ヌクレオチドヒ　アミノ　゛ヒ制限１５　１２３　ＡＧＡ　ＴＧＴ　ＡＲＧ　ＣＹＳ第４表ＡまたはＴ制限伸長により得られたα−アミラーゼの１２　１３．４　５２５１３　１９．５　５６４１５　＞１００　５６０１７　４．２５　５４５２５　５．４　５５８２６　１２．５　５６１２９　１４．６　５５８例５（製パンにおける野生型および変異体Ｂ、アミロリクエファシェンスα−アミラーゼの比較）第５表においてパブルーフのパン容積改善効果を菌類、野生型細菌類および変異体第１５番Ｂ、アミロリクエファシェンス（ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）　α〜アミラーゼについて比較した。

この結果から最大のパン容積を得るのに必要なα−アミラーゼユニソ）ｌ＆は菌類、野生型Ｂ、アミロリクエファシェンス（ａｍｙｌｏ−１ｉｑｕｅｆａｃｒｅｎｓ）および変異体第１５番Ｂ、アミロリクエファシェンス（ａ＋５ｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）α−アミラーゼについてはたいへん一致していた（〜５０ＰＵ／２００ｇ小麦粉）、菌類または細菌変異体第１５番α−アミラーゼを用いたときパンの中味の過デキストリン化を起こすことなく約１５％のパン容積の増加が得られた。

しかしパン容積の改良のために野生型Ｂ、アミロリクエファシェンス（ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）　α−アミラーゼを用いたときは著しい過デキストリン化を起こして適当なパン容積の改善は見られなかった。

第６表では野生型および細菌変異体第１５番（Ａｒｇ１２３−Ｃｙｓ１２３）α −アミラーゼのパン柔軟化効果を小麦粉瞳光り菌類α−アミラーゼ２７０３ＫＢを含む精パンの標準的処決で比較した。

第６表から野生型の細菌性α−アミラーゼは非常に有効なパン柔軟剤であることが明らかである。至適パン柔軟効果は小麦粉ｋｇ当り３．９〜１３ＰＵの投与量ですでに得られている。しかし、３９ＰＬｌ／ｋｇ小麦粉というわずかに高い投与量ですでにパン中味の著しい過デキストリン化が観測される。変異体酵素で至適パン柔軟効果を得るのに約７４ＰＵ／ｋｇ小麦粉という高い投与量が必要とされ、またパンの過デキストリン化が起こる前に７４０ＰＵ／ｋｇが投与される。

したがってパン柔軟剤として野生型Ｂ、アミロリクエファシェンス（ａｓｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）　ａ−アミラーゼの代りに変異体第１５番を用いるとき過デキストリン化の危険がかなり軽減される。

また、細石性変異体第１５番α−アミラーゼの熱安定性の減少はパン中に残存するアミラーゼ活性からも明白である。野生型細菌性α−アミラーゼの大部分はベーキング工程で生き残るが（５０〜７５％残存活性）、細菌性変異体第１５番α −アミラーゼを含む生パンから調製したパン中にはα−アミラーゼの残存は検出できなかった。

例６（種々の単一突然変異を合せることにょるα−アミラーゼの熱安定性の調節）例３および例４で述べている変異体のいくつがは製パンに使用するには安定性が高すぎることが分った。各変異体α−アミラーゼの個々のアミノ酸置換が知られているので主通安定性／不安定性を有する変異体は個々のアミノ酸を合せることにより設計し得る。後者は変異したｐＭａＴＢａｃの適当な制限フラグメントを交換するか、または部位指定突然変異誘発によりアミノ酸Ｗ換を行うことにより行なわれる（材料と方法、セクション３）、第７表はいくつかの組合せを示している。これらの組合せ変異体についいてその上清サンプルを７５℃で１ｏ分間インキュベーションし、ついでＢＨＩデンプンプレートを用い５５℃、１時間インキユベーシッンすることにより残存α−アミラーゼ活性を測定することでその安定性をテストした（例３参照）。

非加艶ＷＴおよび！異体α−アミラーゼの適当な希釈物を比較することにより残存活性を測定した（第４図）。

すべての組合せ変異体；；対応する親変異体よりも熱的に不安定であることが分る。それゆえ熱不安定性の微調整は適当な箪一部位変異体を組合せることにより得ることが出来る。

第７表組合せ変異体・　゛　の　４せ　アミノ３４　Ｒ１２＋　１２　Ｐ３９８Ｓ１１６Ｄ３５　Ｒ１２＋　１３　Ｐ３９８ＳＶ１１３Ｇ／Ｖ１１６Ａ３６　Ｒ１２＋　１４　Ｐ３９８Ｓ　”Ｔ１６３Ｒ／Ｄ１６４Ｅ／５１６６Ｐ３７　、　Ｒ１２＋２６　Ｐ３９８Ｓ　リ１１６Ｇ３８　７　＋　１２　５３５６Ｆす１１６Ｄ３９　７　＋　１３　５３５６ＦＶ１１３Ｇ／Ｖ１１６Ａ４０　７　＋１４　５３５６Ｆ丁１６３１１１／Ｄ１６４Ｅ／５１６６Ｐ４１　７＋２６　５３５６Ｆ１１６Ｇ °ゝこれらのα−アミラーゼ変異体の発現はおそらく不安定性またはプロテアーゼ感受性のために非常に減少している。

例７（指定部位における種々のアミノ酸置換にょる熱不安定性の調節）例３および例４で使用した方法でα−アミラーゼの安定性／不安定性に重要な残基部位が同定されている。しかし突然変異誘発法の特性により特定の部位では限られた数の置換しか期待できない、突然変異の範囲、すなわち安定性／不安定性の範囲を拡げるために安定性／不安定性に重要であることが分っている残基を全ての天然アミノ酸に置換し得る。このことは問題とするコドンに４種のヌクレオチド混合物を含むオリゴヌクレオチドを用いた部位指定突然変異誘発により行い得る（材料と方法、セクション３参照）。

この目的のため以下の配列をもつ混合オリゴヌクレオチドを用残基１２３に変異をもつ種々のα−アミラーゼを得た。Ｎは４種のヌクレオチドを示す（第８表）。

例６と同し方法で残存活性を測定した（第５図）。

試験した全ての残基１２３変異体は野生型酵素（Ｒ１２３）よりも不安定であったことが分る。さらに、部位１２３におけるアミノ酸変化は種々の熱不安定性を伴うことが明らかである。それゆえ、例３および例４の方法により選択された部位におけるランダム突然変異誘発を用い望ましい安定性／不安定性をもつ変異体 α−アミラーゼを選択または設計することが可能である。

第　８　表単−残基部位におけるランダム突然変異誘発゛　アミノ１５　Ｒ１２３Ｃ４２１？１２３）１４３　Ｒ１２３Ｖ４４　Ｒ１２３Ｌ４５　Ｒ１２３Ａ４６　Ｒ１２３Ｐ４７　Ｒ１２３Ｄ例８（染色体の野性型α−アミラーゼ遺伝子の変異体遺伝子による置換）変異体α−アミラーゼを生産するための発現ホストにおける再クローニングを選択した。宿主には問題としているα−アミラーゼの親微生物が好ましい、しかし、使用する前に内在するα−アミラーゼ遺伝子を不活性化または欠失させておかなければならない０本例ではＢ、アミロリクエファシェンス（ａ＠ｙｌｏｌ　ｊｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）のα−アミラーゼ遺伝子の欠失について説明する。

さらに、変異体α−アミラーゼ遺伝子をその遺伝子を有するプラスミド（たとえばｐＵＢｌｌｏ）または染色体中に組込まれた遺伝子コピーから発現する。異種ＤＮＡが宿主中に存在しないことから生産には後者の方が好ましい。

Ｂ、アミロリクエファシェンスの染色体性α−アミロースの不活性化はその遺伝子中に熱感受性複製オリジンをもつプラスミド（ｐＥ１９４起源のｐＥ１９４ｎｅｏ、ＥＰＯ２８３０７５参照）の組込みによって行なった。染色体組込み体の選択は関連抗生物質の存在下温度を上げてプラスミド複製不能条件にすることによって行った。このプラスミドは中央が欠失したα−アミラーゼ遺伝子１コピーを含んでいた（第６図参照）０組換えは両隣りの配列で起こり得る。２つの異なる隣接配列で組換えにより組込みおよび切除が起ったときだけα−アミラーゼ遺伝子が起こることになる。これらの潜在的組込み体をアラトリコンビネーションの刺激およびそのプラスミドの敦済のためネオマイシン非存在下３７℃で増殖させた。３つのα−アミラーゼネガティブクローンが得られた。その１つは染色体地図を作ってより詳しく分析した。またそのα−アミラーゼネガティブクローンの親組込み体を染色体地図で分析した。第６図に染色体組込みおよび切除の制限地図を示す。

α−アミラーゼネガティブのＢ、アミロリクエファシェンス（ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）株が得られ、ＢＡＭ１１２と命名じた。この株はＥｃｏＲＶからＨｉｎｄｎｌまでの内部アミラーゼ遺伝子上の７３５ｂｐの欠失がある。

α−アミラーゼ２ガテイブ株ＢＡＭ１１２を用いて変異体α−アミラーゼを生産した。まず変異体１５（Ｒ１２３Ｃ）のコードＤＮＡＧｐ　Ｅ　１９４ｎｅｏにクローン化しブロトプラストトランスホーメーシラン法を用いて（チャン（Ｃｈａｎｇ）およびコーエン（Ｃｏｈｅｎ）、　１９７９　、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１６８　。

１１１−１１５）、ＢＡＭ１１２株にトランスホームした。変異α−アミラーゼ遺伝子（Ｒ１２３Ｃ）の染色体組込みは５０℃、２０μｇ／ａｌネオマイシン存在下での選択後に行なった。いくつかの組込み体を卓翻し、両隣接配列で組換えが起った後、１２３Ｃα−アミラーゼ遺伝子の組込みを選択し得る。第６図と同様に染色体からプラスミドを切り出した。α−アミラーゼポジティブ、ネオマイシン感受性クローン、ＢＡＭ１１５を選択し染色体地図で解析した。

例９（参考例）Ｎ、　Ａ、スミルノバ（Ｓｍｉｒｎｏｖａ）等（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ａｂｓｔｒａｃｔｓ、　８７　。

隘７（１９８９）アブストラクト番号７０１２７および７０１２Ｂ　）で報告されているＢ、アミロリクエファシェンス（ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅ−ｆａｃｉｅｎｓ）　α−アミラーゼ変異体ＴＳ１４１およびＴＳ　１９１を実験室条件および応用条件でテストした。例３で述べたプレートテスト法を用い、これら変異体の熱安定性の低下を確認した。フェートバス法を用いｐＨ５，５＃よび６．５でＴＳ１４１および野生型、酵素の活性を比較したときＴＳ１４１変異体α−アミラーゼはｐＨ６，５で通常の活性をもつがｐ　Ｈ５，５でそのほとんどの活性はほぼ失なわれる。この理由でＴ　Ｓ　１４１　（Ａｓｐ”’　−Ａｓｎ”’　）１　変異体α−アミラーゼはベーキングに適していない、製パンにおいてＴ　Ｓ　１９１　（Ｇｌｕ”’　＝Ｌｙｓ”’　）変異体α７　ミ７−　セ（７）熱安定性は至適柔軟効果に必要な投与量から判定した。応用条件下におけるこの変異体酵素の熱安定性は野生型酵素の熱安定性と同しである。それゆえこの変異体は有用発現型を示していない。

工＝Ｆｉｇ、　２ＡＣＡＧＧＣＧＡＣＧＧＣＡＡＡＡＧＡＡＡＴＧＴｒＴＡＣＧＣ；ＴＴＧＣＧＧＡＧＴＡＴｒＧＯＣＡＧＡＡＴＡＡＴＧＣＣＧＧＧＡＡＡ３７６３　３７７３　３７８３　３７９３　３＆）３　３８１３ＧＡＡＴｒＣＧＡＧＣＴＣＧＡＧＣＴＴＡＣＴＣＣＣＣＡＴＣＣＣＣＣ℃Ｔ■込ＣＡＡＴｒＡＡＥＡＴＣＧＧＣ’ｒＣＣｒＡＴＡＦｉｇ、３Ｂ５４’１３　５帖３　５４６３ＡＡＧＣ’ｒＡＡＴＡＡＡＡＡＡＡＣＡＣＣＴＣＣＡＡ−荏ＣＧＧＧＴＡＴＣＡＧＣＴＴＧＧＡ語ＧＣＣＴ１’ＴＡＴＴＴＴＴｒＣＡＧＣＣＧｉＴＡＴＧＡＣＡＡＧＧＴ′ＣＧＧＣＡＴＣＡＧＧｉＴＧＴＣＡｇＡＡＡＴＡＣＧＧＴＸ？ｕＡＴ八ＧｇＮ鳴πＣ辺面知Ｃ−諒４Ａｇ廟シ零πＡ♀潔ＣＡＡＣＡＣｔ；ＣＡＣＧＣＡＧＣＣＧＧＡＡＴＣＴＴＴＣ需諭ＪＴＡＡＱＣＧＧＣＧＡＴＣ（ｉＴ＾ＪＣＣＡＡＴＡＴＧＧＡＴＴｃＴｒＣＡＴＣＧＧＧＡＴＣＧＣＴＧＣｍＴＡＡＴＣＡＣＡＡＣＧＴＧＧＱＡＴＣＣＦｉｇ、３Ｃ組合せ変異体％ｗｔＥ１２　７　１２　１３　１４　２６３４３５３６　３７　３８３９４０　４１０％　活性Ｒ１２３変異体％ｗｔ　１５　４２　４３　４４　４５　４６　４７際忽忽％　活性５°組込み３・岨込みアウトリコンビネーシ叢ン □−染色体性Ｂ、アミロリクエファシェンス　ＤＮＡ＝＝コ′ネオマイシン耐性遺伝子一−−−−菅　プラスミド配列Ｆｉｇ、６国際調査報告 −、１’ｙｉＡ、−Ｔ６−　ＰＣＴ／ＮＬ　９０１０００９１−副１−一綱＾帥鴫麹−Ｉ亀　Ｐｌ’：Ｔ／ＮＩ　Ｑｎ／１ＷＩ９１国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．微生物発酵工程の産物であり、かつ工業的応用条件下対応する野生型酵素に比べて安定性が低い変異体酵素。
２．野生型酵素の１つ以上の所定の突然変異によって得られ、結果的に工業的応用条件下で安定性の減少を示す変異体酵素。
３．べーキング条件下でのバンの性状を改善する請求の範囲１または２記載の変異体酵素。
４．べーキング酵素、好ましくは細菌性α−アミラーゼである請求の範囲１または２記載の変異体酵素。
５．べーキング条件下対応する野生型酵素に比べ低い熱安定性を示す細菌性α− アミラーゼである請求の範囲１または２記載の変異体酵素。
６．野生型酵素と比較して１〜１０個のアミノ酸が異なるアミノ酸配列を有する修正酵素をコードする遺伝子の発現によって得られる請求の範囲１乃至５のいずれか１項記載の修正酵素。
７．野生型酵素のＡｒｇ１２３をＣｙｓ１２３に置き換えたアミノ酸配列を有する請求の範囲５記載の修正細菌性α−アミラーゼ。
８．Ｂ．アミロリクェファシエンスの野生型α−アミラーゼのアミノ酸番号１１３、１１４、１１６、１２３、１６３、１６４、１６６、２３８、３１６、３２２、３４５、３４９、３５６、３８６、３９４または３９８または相同的α−アミラーゼの相同的部位の少なくとも１つのアミノ酸が異なるアミノ酸配列を有する請求の範囲５記載の修正細菌性α−アミラーゼ。
９．前記α−アミラーゼがバチルスα−アミラーゼ、より好ましくはＢ．アミロリクェファシエンスα−アミラーゼである請求の範囲７または８項記載の修正細菌性α−アミラーゼ。
１０．請求の範囲３乃至９のいずれか１項記載のバン改善性を有する変異体酵素の使用を含む生バンまたは同様の産物の生産工程。
１１．請求の範囲３乃至９のいずれか１項記載のバン改善性を有する変異体酵素を含む生バンまたは同様の産物。
１２．生バンヘの請求の範囲３乃至９のいずれか１項記載のバン改善性を有する変異酵素の包含を含むバンまたは関連産物の生産工程。
１３．請求の範囲１２記載の工程により生産されるバンまたは関連産物。
１４．請求の範囲１乃至９記載の変異体酵素を生産し得る微生物。
１５．内在性α−アミラーゼの発現の消失または不活性により変異体細菌性α− アミラーゼの生産に適合させた微生物。
１６．請求の範囲１乃至９のいずれか１項記載の変異体酵素をコードする遺伝子を含む微生物、好ましくは細菌、イーストまたは菌類、より好ましくは大腸菌、バチルスまたはアスベルギラス、好ましくは枯草菌、バチルスアミロリクェファシエンス、またはバチルスリチェニホルミス。
１７．野生型遺伝子と比べ１〜１０残基が異なるＤＮＡを有する請求の範囲１乃至９記載の変異体酵素をコードする遺伝子。
１８．第２図のＤＮＡ配列を有する野生型遺伝子と比べ１〜１０残基が異なる細菌性α−アミラーゼをコードする請求の範囲１４記載の遺伝子。
１９．請求の範囲１７または１８記載の遺伝子を含むベクターまたはプラスミド。
２０．請求の範囲１９記載のベクターまたはプラスミドでトランスホームした微生物。
２１．請求の範囲１４乃至１６または２０記載の微生物の発酵を含み、かつ場合によっては生成した変異体酵素を分離または精製することを含む請求の範囲１乃至９のいずれか１項記載の変異体酵素の生産法。
２２．工業的応用条件下望ましい安定性を有する変異体酵素の調製法であって、ａ）野生型酵素をコードする遺伝子の変異、ｂ）安定性が変化した変異体の選択、ｃ）野生型酵素に対する対応するアミノ酸置換の測定、および、ｄ）選択した各アミノ酸置換を合せた変異体酵素をコードする変異遺伝子の形成以上ａ）〜ｄ）のステップを含む方法。
２３．工業的応用条件下望ましい安定性を有する変異体酵素をコードする遺伝子をクローン化した微生物の調製法であって、ａ）野生型酵素をコードする遺伝子のクローニング、ｂ）野生型酵素をコードする遺伝子の変異、ｃ）安定性が変化した変異体の選択、ｄ）野生型酵素に対する対応するアミノ酸置換の測定、ｅ）選択した各アミノ酸置換を合せた変異体酵素をコードする変異遺伝子の形成、およびｆ）適当な宿主における変異遺伝子の再クローニング、以上ａ）〜ｆ）のステップを含む方法。
２４．請求の範囲２３記載の方法で調製した微生物の発酵を含む工業的応用条件下望ましい安定性を有する変異体酵素の生産法。
２５．活性成分として請求の範囲３乃至９のいずれか１項記載のバン改善性を有する変異体酵素を含むバン改良組成物。