PT94545B

PT94545B - Processo para a preparacao de um enzima mutante com estabilidade reduzida em condicoes de aplicacao industrial

Info

Publication number: PT94545B
Application number: PT94545A
Authority: PT
Inventors: Jan Henricus Van Eijk Wil Quax; Johan Pieter Marinus Sanders
Original assignee: Gist Brocades Nv
Priority date: 1989-06-29
Filing date: 1990-06-29
Publication date: 1997-02-28
Also published as: ATE141103T1; IE76723B1; HUT56396A; DE69028010T2; WO1991000343A2; FI910908A0; JPH04500609A; AU629959B2; PT94545A; AU5939790A; DE69028010D1; DD301645A9; EP0409299B1; KR920701448A; ES2092488T3; NO910794L; EP0409299A3; IE902367L; ZA905111B; CA2032518A1

Description

Descrição referente à patente de invenção de GIST-BROCADES N.V., Holandesa, industrial e comercial, com sede em Wateringseweg 1, P.O. Box 1, 2600 MA Delf, Países Baixos, (inventores: Jan Henricus Van Eijk Wilhelmus Johannes Quax e Johan Pieter Marinus Sanders, residentes na Holanda), para 'PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE HM ENZIMA' MUTANTE

OOM ESTABILIDADE REDUZIDA EM CONDIÇÕES

DE APLICAÇÃO INDUSTRIAL·

DESCRIÇÃO

Memória descritiva:

Âmbito técnico

PS.—

A invenção refere-se a um enzima mutante com estabilidade reduzida e a um método para a sua preparaÇ SlO ·

Fundamento e literatura relevante

A maiore parte das farinhas usadas para o fabrico de pão são suplementadas na moagem ou na padaria com

-amilase. Os antecedentes mostram que se pode usar preparações de z^-amilase de fungos e de cereais para melhorar o volume do pão e que as o(-amilases bacterianas e de cereais têm tam

2>

bém um efeito amaciador. Estudos de endurecimento do pão mostraram que a recristalização de fracção amido durante o armazenamento do pão causa o aumento da duseza do miolo. Consequentemente , pode obter-se um efeito amaciador da massa degradando parcialmente a fracção amido durante o processo de panificação. Para uma acção anti-endurecimento efectivado ot-amila se é necessário que o enzima sobreviva na massa a panificar até que uma parte suficiente da fracção amido esteja gelatinizada, para permitir a ocorrência da hidrólise (Miller et al., Food Technology, Janeiro 1955» ρ·58). A baixa termoestabilidade dao4-amilase fúngica produzida por Aspergillus oryzae é tal que este enzima é largamente inactivado pelo tempo que o amido leva a gelatinizar na massa e pode ser atacado e hidrolisado por ele. Por isso, as (Λ-amilases fúngicas dificilmente melhorarão a maciez do miolo, embora se possam, usar para melhorar o volume do pão sem sualquer perigo de causarem exces so de dextreinação.

Por outro lado, as o(-amilases bacterianas caracterizam-se por uma termoestabilidade de tal modo elevada que permitem uma dextrinização demasiada do amido durante a panificação. Se se adicionar de masiado enzima o miolo do pão ficará demasiado elástico e compacto tornando a qualidade do pão inaceitável pe^ra o consumidor. As amilases bacterianas sobrevivem parcialmente ao processo de panificação e continuam a sua acção após a cozedura, especialmente durante o arrefecimento lenco do pão. Para obter um efeito de amaciamento do miolo aceitável é necessário controlar muito estreitamente a dosagem da ç\-amilase bacteriana e as condições de fabrico do pão. Devido aos problemas associados com o uso destes enzimas termoestáveis, as amilases bacterianas não se usam geralmente na industria de panificação. As o-amilases de termoestabilidade intermédia parecem mais adequadas para melhorar a maciez do miolo, uma vez que os miolos de pão são menos facilmente extradextrinizados por doses elevadas destes enzimas. Por esta razao as j(-amilases de malte que se caracterizam por uma tei

moestabilidade enrre a das tf-amilases de fungos e de bactérias, se usam ainda largamente na industria de panificação. Contudo a presença de actividades secundárias proteolíticas em muitas preparações de malte causam efeitos secundários indesejáveis. Além disso, uma ç^-amilase purificada preparada a partir de mal_ te é demasiado dispendiosa para aplicação em panificação.

Outras possibilidades são as mencionadas na patente U.S. 4, 520, 151» que descreve um processo para o melhoramento da baixa termoestabilidade da o(-amilase fúngica durante o processo de panificação, e no registo de patente europeu EPA-0275268, que descreve um.processo de modificação química para diminuir a elevada termoestabilidade da oC-amilase bacteriana. Em ambos os casos os enzimas têm de ser modificados antes do seu uso na massa para pão, de modo a obter-se uma termoestabilidade intermédia. A c^-amilase fúngica pode proteger-se contra a desnaturação térmica solubilizando ou dispersando o enzima num meio protector, de acordo com a Patente U.S., enquanto que a ^-amilase bacteriana tem de ser acilada antes da incorporação na massa, de acordo com o registo da Patente Europeu. Nestas circunstâncias, continua a haver necessidade de novos enzimas com uma estabilidade õpti ma, que sejam adequados para uma utilização directa num proces so industrial como o de panificação.

Resumo da invenção

A presente invenção refere-se a um enzima mutante que apresente uma estabilidade reduaida em condições de aplicação industrial. Este enzima mutante pode obter-se substituindo pelo menos um residuo do enzima nativo.

Breve descrição das figuras

Eigura 1: Estrutura de plasmídeo pUCAm4

- 5 ‘»1

Inseriu-ze um fragmento BglII-BamHI de

2,2 kb contendo o gene da D<-amilase de Bacillus amyloliquefaciens na posição BamHI de pUC18. 0 gene de resistência à ampicilina é indicado por AMP.

Figura 2: Sequência de DNA do gene de

A inserção de pUCAml4 revelou um único código de leitura aberto (open reading frame) largo de 1542 base que codifica a p<-amilase de Bacillus amyloliquef aciens.

A sequência de aminoácidos indica-se pelo código de letra única.

Figua 3: Sequência do fragmento EcoRI-BamHI de pMaTBac

A posição EcoRI na posição 3755 corresponde à posição EcoRI no pMa 5-θ na posição 3755· 0 promotor

TAC está situado entre as posições 5755 θ 3858. 0 gene da X-amilase encantra-se indicado pela sequência de aminoácidos no código de letra única.

Figura 4: Actividade residual do enzima nativo (WT) e do mutante de combinação da <X,-amilase após incubação a 75°0 durante 10 minutos

Os mutantes são os indicados na Tabela

Figura 5! Actividade residual do enzima nativo (MT) e do mutante de pl-amilase após incubação a 75°0 durante 10 minutos

Os mutantes são diferentes substituições no resíduo 123, como indicado na Tabela 8.

Figura 6: Parta cromossomal do DNA de B. amyloliquefaciens H2, dos integrantes 5’ s j¹ e da cadeia negativa

BAIii 112 da Ot-amilase.

Descrição àas farias ãe concretização específicas da invenção

Podem criar-se ou encontrar-se enzimas com estabilidade adequada de várias formas, por exemplo por métodos de selecção (Screening) clássicos ou usando técnicas modernas de engenharia genética e proteica.

A selecção de organismos ou microorganismos que possuam a actividade enzimática desejada, pode efec tuar-se por exemplo isolando e purificando o enzima a partir de um microorganismo ou de um sobrenadante de cultura desses microorganismos, determinado as suas propriedades bioquímicas e verificando se estas propriedades bioquímicas correspondem às exigências de um uso específico. Se o enzima identificado se não puder obter a partir do organismo natural que o produz, podem usar-se técnicas de DNA recombinante para isolar o gene que codifica o enzimas, exprimir o gene noutro organismo, isolar e purificar o enzima expresso e testar-se ele é adequado para o fim em vista.

Um outro método de obter novos enzimas para um determinado uso é a modificação de enzimas já existentes. Isto pode conseguir-se inter alia por métodos de modificação química (vide I. Svendeen, Carlsberg Res. Commun. 44 (1976), 257-291)· Em geral estes métodos são demasiado não especificos uma vez que modificam todos os resíduos acessíveis com cadeias laterais comuns, ou dependem da presença de determinados aminoácidos para serem modificados, e são muitas vezes incapazes de modificar aminoácidos difíceis de alcançar, a não ser que a molécula do enzima não esteja dobrada.

Em alternativa, a modificação de enzimas através de mutagénese do gene codificante não é afectada pelas especificidades acima mencionadas, pensando-se por isso que é superior. Pode efectuar-se a mutagénese quer por mutagénese aleatória quer por mutagenese dirigida.

A mutagénese aleatória, tratando todo o microorganismo com um agente mutagénico químico ou com uma radiaçao mutagenizante pode conduzir obviamente a enzimas modificados. Neste caso são necessários protocolos de selecção apertados para procurar os mutantes específicos e raros desejados. Pode conseguir-se uma maior probabilidade de isolar enzimas mutantes por mutagenese aleatória, após clonagem do gene codificante, mutagenizando-o in vitro ou in vivo e exprimindo o enzima codificado por reclonagem do gene mutacionado numa células hospedeira adequada. Hospedeiros adequados para a produção de enzimas modificados são, por exemplo, bactérias (E. coli , Bacillus) , leveduras ou fungos (Aspergillus). Também neste caso aão necessários protocolos de selecção biológica adequados para seleccionar os enzimas mutantes desejados. Estes protocolos de selecção biológica nem sempre seleccionam directamente os ensimas mais adequados para aplicação industrial .

A presente invenção refere-se a gora a novos enzimas mutantes, que se podem obter por expressão de um gene que codifique o referido enzima, que tenha uma sequência de aminoácidos que difira pelo menos em um aminoácido do enzima nativo correspondente, e que apresente uma estabilidade reduzida durante as condições de aplicação industrial. Embora se saiba que alguns enzimas mutantes são menos estáveis em condições laboratoriais, em condições de aplicação industrial apenas se notou uma pequena variação na estabilidade devido a diferenças nas condições de teste e de aplicação (temperatura, pH, substrato, etc.). Conseguiu-se pela primeira vez obter mutantes que apresentam uma estabilidade reduzida nas condições de um processo industrial.

Pode usar-se mutagenese dirigida que permite a substituição específica de um ou mais aminoácidos por qualquer outro aminoácido desejado, para construir e selec cionar posteriormente um enzima compropriedades melhoradas.

De acordo com um dos aspectos da presen te invenção, podem fazer-se combinações de mutações identificadas de modo a modular precisamenue as caracteristicas de estabilidade desejadas, E possivei o afinamento da estabilidade dos enaimas mutantes combinando os mutantes apropriados.

Podem alterar-se todas as formas de estabilidade de um enzima, por exemplo a estabilidade à temperatura, a estabilidade ao pH, a estabilidade durante a mistura, ou a estabilidade na presença de compostos químicos como substratos, sais, inibidores, etc.

A mutagenese do gene codificante ou a fusão dos genes codificantes têm já sido aplicadas como técnicas de construção de mutantes de o/-amilase com propriedades enzimáticas alteradas. Num registo de patente recente (EP 0208491) descreve-se um método para a construção de enzimas híbridos de ^-amilase bacteriana construindo genes de j^-amilase de fusão de 3. licheniformis e B. stearolhermophilus.

N.A. Smirnova et al. (Biological Abstracts, 87, N27(1988) abstract N2 70127 e abstract Νδ 70128) construiram mutantes de (%-amilase de B. amyloliquefaciens com reduzida termoestabilidade em condições de teste laboratorial. Estas condições de teste são muito diferentes das condições de panificação em que o pH é bastante baixo (ρΗ=5-5·5), enquanto que o teor em amido e a viscosidade são muito altos. Como se demonstrará no exemplo de referência, nem todas as o(-amilases mutantes que têm uma reduzida termoestabilidade em condições de tes te laboratorial terão uma termoestabilidade óptima em condiçõe de aplicação na panificação. A presente invenção refere-se a um método para a preparação de um enzima mutante que tem a estabilidade desejada em condições de aplicação industrial, que é exemplificado pela preparação de enzimas de panificação mutantes por um processo de seleção dos mutantes mais adequados para aplicação em panificação. Por enzimas de panificação entendem-se os enzimas envolvidos ou aplicados na preparação da massa.

Por um enzima mutante entende-se um enzima que cLifere em um ou mais aminoácidos do enzima nativo.

gene que codifica o enzima mutante tem uma sequencia de DNA que difere em pelo menos um, de preferência 1 a 10, resíduos do gene nativo. 0 enzima mutante prepara-se num processo de fermentação microbiano, após o qual o enzima pode ser isolado ou purificado. 0 enzima mutante, de acordo com a presente invenção, tem a estabilidade desejada em condições de aplicação industrial e pode usar-se como tal sem modificação química posterior. Por exemplo, o enzima mutante pode ser uma ^-amila se com uma reduzida termoestabilidade em condições de panificação . Podem usar-se também outros enzimas de panificação com actividades amilolitica, liemicelulolítica, proteolítica, lipolítica ou de oxidoreductase, para melhorar a qualidade dos pro dutos de panificação (vide p. ex. a revisão em AIB Technicol Bulletin (1980) vol. II, 10, 11, 12). As propriedades dos enzimas existentes como a termoestabilidade, o pH óptimo, a especificidade do substrato, a actividade, etc., nem sempre são as melhoras para a sua aplicação como enzima de panificação.

A presente invenção refere-se a um método para optimizar as propriedades dos enzimas existentes, tornando-os mais adequados para aplicação em panificação. Por meio da engenharia proteica podem construir-se enzimas que terão a sua actividade máxima durante uma das fases do processo de panificação.

De acordo com um dos aspectos da invenção, a ^-amilase tem exactamente a estabilidade óptima que corresponde à sua actuação principalmente durante, e não após, a fase de cozedura do processo de panificação. Outro exemplo de melhoria dos enzimas de panificação existentes por enganharia de proteína é a preparação de um enzima proteolítico mutante, que se torna inactivo durante a fase de mistura do processo de panifi cação actuando assim como um redutor do tempo de mistura, que apenas é activo durante a mistura.

A (/-amilase modificada terá uma sequên cia de aminoácidos que difere pelo menos em nm determinado aminoácido do enzima nativo. As mutações acima mencionadas

são obtidas a partir da οζ-amilase do Bacillus amyloliquefaciens como será descrito en detalhe seguidamente. Por exemplo, a ft -amilase bacteriana que tem uma sequência de aminoácidos que difere pelo menos em um aminoácido do enzima nativo nos aminoácidos N2s 115, 114, 116, 125» 165» 164, 166, 256» 516, 522, 545, 549, 556, 586, 594 ou 598 de B. amyloliquefaciens ou numa posição homóloga numa oí-amilase homóloga. Aplica-se com vanta gem a o(-amilase com a mutação no aminoácido R2 125. 0 especia lista nesta área verificará também que se podem obter enzimas adequados com mutação de um aminoácido correspondente a outras partes da sequência de aminoácidos.

De acordo com outro aspecto da invenção, a sequência de aminoácidos de o(-amilase modificada foi alterada em pelo menos dois aminoácidos. Isto pode resultar num enzima com um efeito de estabilidade reduzida que é superior a cada uma das contribuições das mutações simples. Pode deste modo preparar-se uma o(-amilase mutante com uma estabilidade óptima.

Hospedeiros adequados para a produção de ^-amilase modificada são E. coli, Bacillus subtilis, Bacillus licbeniformis e Bacillus amyloliquefaciens. Integra-se de preferência o gene no hospedeiro.

A o(-amilase modificada tem propriedades melhoradas durante a aplicação industrial, p. ex., no processo de panificação. Por propriedades melhoradas como usado na especificação selacionada com uma o<ramilase mutante, entende-se termoestabilidade reduzida durante a cozedura, em relação ao enzima nativo correspondente.

De acordo com a presente invenção, pode projectar-se um enzima mutante com base num exame cuidadoso da estrutura do enzima nativo, combinado com uma investigação bioquímica cuidadose da estabilidade do enzima original, p.ex.

da termoestabilidade da p(-amilase bacteriana em condições de

panificação, seguido por uma modificação racional da sequência do gene nativo. Uma investigação exaustiva dos mutantes preparados, em condições de aplicação industrial, levou à identificação dos mutantes com propriedades optimizadas.

De acordo com um aspecto da presente invenção, a ^(-amilase mutante com termoestabilidade reduzida durante a aplicação, p. ex., no processo de panificação, pode utilizar-se no processo de preparação da massa ou do pão (ou de produtos relacionados), for produtos relacionados entende-se os produtos que resultam da cozedura de uma massa feita de uma mistura de água e farinha de um cereal moido.

Materiais e métodos

1· Técnicas gerais de clonagem

Tem-se usado técnicas de clonagem como as descritas nos manuais de T. Maniatis et al . , 1982, ...olecular Cloning, Gold Spring Harbor Laboratory; F.M. Ausubel et al., 1987» Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc., New York; B. Perbal, 1988, A Practical Guide to Molecular Cloning, 24 Edição, John Wiley & Sons Inc., New York. Estes manuais descrevem em detalhe os protocolos para a construção e propagação de moléculas de DNA recombinante, os processos para a preparação de bibliotecas de genes, os processos para a sequênciaçâo e mutação do DNA e os protocolos para o tratamento enzimático das moléculas de DNA.

2. Mutagénese química

DNA cionado pode tratar-se in vitro com reagentes químicos para introduzir mutações nesse DNA. Se essas mutações foram dirigidas para os codões tripleto que codificam os aminoácidos pode preparar-se uma proteína mutante a partir do DNA cionado mutacionado. Encontra-se descrito . por Shortle e Botslein (Methods Enzymol., 1985 , 100, 457)

η τη método para a mutagenese química por meio de bissulfito de sódio. Um método preferencial é o descrito por Eolk e Hofstetter (Cell, 1985, 55, 585)· Outros métodos de mutagénese encontram-se descritos por Smith, Ann. Rev. Genet., 1985, 19,

425 · Um protocolo particularmente útil é o descrito por Ausubel et. al., referência acima (vide capítulo 8).

. Mutagénese em DNA de cadeia dupla aberta

Usou-se um método baseado na técnica da cadeia dupla aberta (gapped-duplex) e de um plasmídeo (híbri do plasmídeo/fogo). Essencialmente o método baseia-se num intermediário de DNA de cadeia dupla aberta constituída por uma cadeia aberta (cadeia-) contendo um marcador de resistência a antibióticos do tipo nativo e uma cadeia de templato (cadeia+) contendo uma mutação no gene que confere a resistência ao antibiótico. Após tratamento térmico, o aligonndleótido mutagénico fica incorporado na cadeia aberta durante a reacção in vitro de enchimento da abertura e de selagem. As moléculas re sultantes usam-se para transformar um hospedeiro deficiente em reparação de erro (Mut S) no qual a ligação entre a mutação de sejada e o marcador de resistência ao antibiótico se encontra preservada. A população de plasmídeo mista, isolada a partir desta cadeia, deixa-se então segregar numa cadeia hospedeira negativa de supresso.r. Cultivam-se os transformantes num meio contendo antibiótico, impondo-se assim uma selecção aos descendentes derivados da cadeia aberta.

sistema vector géneo pMa/c 5-8, descri, to por P. Stanssens et al. (em Protein Engineering and Sitedirected Mutagenesis, 1985, 24th Harden Conference , Programme and Abstracts, A.R. Fersht e G. Winter eds.), é composta pelos seguintes elementos:

posição 11-105í bacteriofago fd, terminador posição 121-215: bacteriofago fd, terminador posição 221-507: plasmídeo pBR522 (posição 2069-2155)

posição 313-^68: bacterioíago f 1, ori₀en de replicação (posição 5432-5943) posição 772-257I: plasmideo p3R322, origem de replicação e gene de /5-lactamase posição 2572-2885: transposão Th 983 posição 2^12-77^2: tarninador de triptofano (duplo) posição 2775-3729: transposão tn9, gene de acetil-transferase do cloranfenicol posição 3730-3803: sítio de clonagem múltipla

A sequência encontra-se publicada (Stanssens et al, 1987» EMBO-course, Martinsried; Stanssens et al; 1989, Nucleic Acids Res., 17, 4-4-4-1-44-54).

No vector tipo pMa o nucleótido 3409 está alterado de G para A, enquanto que no vector tipo pMc o nucleótido 2238 está alterado do G para C. criando codoes de paragem no gene de acetiltransferase e no gene de y^-lactamase, respectivamente, tornando os referidos genes inactivos.

Todas as sequências referidas foram obTIvI tidas do banco de genes , National Nucleic Acid Sequence Data Bank, NIH USA. 0 plasmideo pMc 5-8 está registado (DSM 4566). Rara se consequir a mutagénese clona-se 0 fragmento de DNA em causa no sítio de clonagem múltipla do pMa 5-8. Subsequentemen te constroi-se uma cadeia aberta entre o pMa 5-8 contendo o DNA em causa e o pMc 5-8.

fragmento de cadeia simples, constitu do pelo DNA em causa, pode sujeitar-se a mutagénese com um oli gonucleótido mutagénico, com oligonucleôtidos sintéticos compridos com um baixo nível de nucleótidos mal incorporados, com reagentes químicos ou com mal incorporação enzimática de nucle ótidos. Para uma descrição detalhada vide Ausubel et al. , • ibid. ou Perbal, ibid. Como alternativa à mutagénese in vitro

pode usar-se mutagénese in vivo, quer por meio de luz ultravio leta, quer âe reagentes químicos, quer por aplicação âe uma caâeia mutante âe E. qoli (Eowler et al., J. Bacterial. 1986, 167, p. 130).

Os nucleótiâos mutagénicos podem sintetizar-se usando o equipamento fornecido por Applied Bio Systems.

4. Mutagénese aleatória por mal incorporação enzimática de nucleótiâos

Pode sujeitar-se uma cadeia duplex de pMc a extensão primer e mutagénese de mal incorporação, do modo descrito inicialmente por Shortle et al., 1982, Proc.

Nat. Acad. of Science 22» P· 1588-1592, e por Cunningham e Wells (Prot. Eng., 1987, 1, P· 319) ou, de preferência, por uma modificação do processo descrito por Lehtovaara et al; (Prot. Eng. 1988, 2, p. 63).

Este método baseia-se no uso controlado de polimerases. Geram-se em primeiro lugar quatro populações de moléculas de DNA por elongação primer de uma cadeia duplec de pMa/pMc de modo que terminem aleatoriamente no fragmento mas sempre imediatamente antes de um determinado tipo de base (antes de A, C, G ou T, respectivamente); Mutageniza-se entãc cada uma das quatro populações numa reacção separada de mal in corporação em que se pode omitir agora a base correcta. Deste modo podem gerar-se todos os tipos de mutação por substituição de base em qualquer posição do fragmento. Como modificação do método de Lethovaara usou-se Sequenase™ (United States Biochemical Corporation, Cleveland, OH) em vez de DNA polimerase de Klenow e transcriptase reversa MoMuLV (BRL) em vez de trans criptase reversa AMV. Observou-se também que 0 uso de concentrações mais elevadas de transcriptase reserva resultava frequentemente em mutações consecutivas múltiplas. Isto pode ser considerado como uma vantagem para obter enzimas Lábeis.

Por outro lado, para assegurar substi-i tuições num só sítio, introduziu-se a seguinte modificação no protocolo descrito por Lebtovaara et al., ibid. No tampão de transcriptase reversa está presente não três mas apenas um nucleótido mal incorporado. Por exemplo, a mistura de elongação de base limitada especificamente a A incuba-se em tfês reacções separadas com 250 pM dTTO , 250 /iMdGTP e 250 /iM dTTP , respectivamente. Para um conjunto completo de mistura de elon gação limitada especificamente às 4 base efectua-se um total de 12 reacções de mal incorporação separadas. Após 1,5 horas de incubaçao a 42 C adiciona-se uma carga de todos os quatro desoxinucleótidos numa concentração ãe 0,5 mM e incubam-se as misturas reaccionais durante pelo menos mais 20 minutos a 37°C ’ Continuam depois a processar-se as amostras de acordo com o método de Lebtovaara et al. (ibid.). com a modificação de se aplicar não uma contra-selecção a uma cadeia de DNA contendo uracilo mas uma contra-selecção baseada no vector plvía/c .

5. Isolamento da 0(-amilase mutante

Cultivam-se células de E. coli. WE6 contendo o plasmideo pMaTBac em meio BHI contendo o agente de selecção apropriado. Centrifugam-se 10 ml de uma cultura de uma noite e resolve-se em 1 ml de sacarose a 20 %, 1 mM EDTA. Após 15 minutos de incubação a 20°C centrifugam-se de novo as células. Ressuspende-se então o peleti zado celular em 1 ml de H₂0 MilhiQ e conserva-se a 0°C durante 10 minutos. Após centri fugar os esferoblastos, adapta-se a camada sobrenadante contendo a ot-amilase a 0a01₂ 2 mM, Mg01₂ 0,7 mM e NaHCO^ 2,5 mM, Sempre que necessário pode purificar-se a oÇ-amilase por meio de métodos bioquímicos convencionais.

6. Actividade da <A-amila.se

As actividades da íA-amilase determinaram

-se como rotina usando comprimidos Phadebas™ da firma Pharmacz.a, •s

Ueste método mediu-se espectrofotometricamente a solubilizaçãc ae amido marcado com corante pelas^-amilase num tampão a pH=5,5, durante 15 minutos a 50°G . A acrividade da <-amilase exprime-se em unidades Phadebas (PU) usando uma preparação de ç(-amila se fúngica de Aspergillus oryzae de 10 000 PU/g como padrão ir. terno. Uma unidade Phadebas assim definida equivale a cerca de 10 unidades SKB usadas na industria de panificação.

À acitvidade residual da ος-amilase no miolo do pão determinou-se usando um processo ligeiramente diferente . Preparou-se uma suspensão de miolo de pão a partir de 10 g de miolo de pão e 40 ml de tampão de pH=5»5 usando um misturador Waring à velocidade máxima durante 1 minuto. Incubou-se 0,1 a 1,0 ml de suspensão de miolo, durante a noite (18 horas) a 50°G num teste Phadebas. Calculou-se a actividade residual no miolo do pão comparando a actividade da amilase tratada pelo calor na suspensão de miolo de pão com a activids de do enzima não tratado, adicionado a uma suspensão de miolo de pão de um pão de controle , preparado sem o(-amilase bacteriana .

7.

Teste da termolabilidade da o(-amilase em teste de aplicaçã (panificação)

Testou-se a termolabilidade de mutantes de OÇ-amilase seleccionados num teste de panificação de carcaças. Confeccionaram-se as carcaças a partir de pedaços de massa de 150 g obtida misturando 200 g de farinha (100 %) , 110 ml de água (55 %), 5 mg de ácido ascôrbico (15 ppm), 1,4 g de fermento seco instantâneo (0,7 % de Fermipan™) , 4 g de sal (2 %) , g de açúcar (1,5 %) , 1 g de gordura (0,5 %) , 400 mg de GaGlg. 2H₂0 (0,2 %) , 10 mg de d^amilase P_2oQ Fúngica (2250 SKB/kg de farinha) e quantidades variaveis de ^-amilase bacteriana nativa e mutante. Após mistura durante 6 minutos e 15 segundos a 52 r.p.m. num misturador, dividiu-se a massa, testou-se durante 45 minutos a 50°G, amassou-se, testou-se durante mais 25 minutos, moldou-se e panou-se. Após um teste final de 70 minu - 15 ro:

a 50°C,

lozeu-se a massa durante 20 minutos num forno a

240°C e determinou-se o volume do pão pelo método da deslocação das sementes. Utilizou-se um analisador do Stevens Texture para determinar a maciez do miolo de duas fatias do centro das carcaças, que tinham sido armazenadas em sacos plásticos durante 72 horas à temperatura ambiente. Os valores de firmeza do miolo exprimem-se como a força (g) necessária para comprimir de 5 mm (25%) uma fatia de pão de 2 cm de espessura usando uma superfície de 1,0 polegada de diâmetro e uma velocidade de compressão de 0,5 mm/seg. A termolabilidade das várias amostras de tfc-amilase bacteriana exprimiu-se como o número de unidades de ^-amilase (PU) necessário para obter um efeito óptimo de amaciamento do miolo sem causar superdextrins. ção (20-50 % de redução dos valores de firmeza).

8. Estimativa da capacidade de panificação de mutantes de

X-amilase bacteriana

1. Efeito de melhoramento do volume do pão efeito de melhoramento do volume do pão de oQ-amilase bacteriana (mutante) determinou-se no processo de fabrico de carcaças acima descrito, com a excepção de se ter omitido na receita CaCl^, dç-amilase fúgica e gordura.

2. Efeito de amaciamento do miolo

Preparou-se uma massa a partir de 5500 g de farinha (100 %), 1960 ml de água (55 %), 87,5 g de Fermento comprimido (2,5 %)» 52,5 S de açúcar (1,5 %) , 70 g de sal (2 %) , 210 ml de ^-amilase P_20Q fúgica (2?00 3KB/Kg de farinha), 17,5 g Ge gordura (0,5 %), 105 mg de ácido ascórbico (50 ppm), 94,5 mg de cisteína (27,5 ppm) e quantidades variáveis de ç(-amilase do tipo nativo ou mutante. Após mistu ra num misturador espiral Kemper (550 rotações à velocidade 1, seguido por 1200 rotações à velocidade 2) , retiraram-se pe16 ♦

daços de nassa de 900 g, testaram-se durante 55 minutos a 50 C cortaram-se, moldaram-se e pararam-se, testaram-se durante 65 minutos a 54°C e cozeram-se durante 50 minutos num forno a 22d' Determinou-se o volume do pão por deslocamento de sementes e julgou-se a elasticidade do pão por um painel de consumidores em 4 categorias: (0: miolo não elástico, não superdextrinizado 0/+: miolo não elástico, ligeiramente dextrinizado (qualidade óptima); +: miolo ligeiramente elástico, ligeiramente superdextrinizado; +++: miolo muito elástico, fortemente superdextrinizado). Para medir a firmeza do miolo analisaram-se 2 fatias de 2 cm de espessura do centro do pão, através de um analisador de textura Stevens, usando uma superfície de 1,5 polegadas de diâmetro, uma profundidade de compressão de 5 nim (25%) e uma velocidade de compressão de 0,5 mm/seg.

Todas as publicações e registos de patente citados nesta especificação são aqui incluídos como referência como se cada publicação ou registo de patente individual fosse especificamente e individualmente indicado para ser incluído como referência.

Embora a presente invenção tenha sido descrita com algum detalhe como ilustração e sexemplo para fins de clareza e compreensão, será evidente para o especialis ta na matéria, à luz das descobertas desta invenção, que se podem fazer certas alterações e modificações ao que foi descrito sem se afastar do espírito e do âmbito das reivindicações juntas.

Os exemplos seguintes destinam-se a ilus trar melhor a invenção.

Exemplo 1

Clonaqem molecular do gene da o(-amilase de Bacillus gmylolique· faciens

Digeriu-se DNA cromossomal isolado de j Bacillus amyloliquefaciens K₂, um derivado da cadeia de Bacillus H IAMl> 21 (Hartley, 1968, Biochemistry 7, 2401-2408), com o enzima de restrição Bell e ligou-se na posição Bell do plasmídeo pUN121 (Nilcson et al.; 1983, Nucleic Acids Res. 11,

8019). Este plasmideo contem um gene resistente à ampicilina. um gene resistente à tetraciclina e um gene Cl-repressor. A transcripção do gene de tetraciclina é impedida pelo gene produto do gene Cl-repressor. A inserção do DNA estanho no único sítio Bell do gene Cl-repressor conduz à activação da resistência à tetracidina. Isto permite a selecção de recombinantes em placas de agar contendo amplicilina/tetraciclina.

A mistura de ligação transformou-se era E. coli KB 101 (ATCC 33694). As colónias resistentes à ampicilina/tetraciclina testaram-se em relaçao à produção de (/^amilase em placas LB (Ausubel, ibid.) suplementadas com 0,4 g/1 de amido, de acordo com Zulkowsky (Merch). Após crescimento e incubação com vapor de I₂, seleccionou-se uma colónia positiva de E. coli que produzim uma larga área limpa, para posterior caracterização. 0 plasmideo adequado, PUNH2, mostrou conter uma inserção Bcll-Bcll de 5,5 kb, resultante do Bacillus amyloliquefaciens ,H2. Isolou-se um fragmento BglII-BamHl de 2,2 kb a partir de pUNH₂, usando Gene Clean (obtido de B10 101, La Jolla LA, USA) e ligou-se na posição BamEl de pUC18 (Pharmacia). 0 plasmideo resultante, pUCAm4, apresenta-se na Figura 1. Sequen ciou-se a inserção de pUCAm4 pelo método de Sanger (Proc. Natl Acad. Sei. USA, 1977 > 74, 6463). A sequência ie DNA revelou um código de leitura aberto de 1542 bases (Figura 2) codixican do uma sequência de sinal de 31 aminoàcidos mais uma proteína madura de 483 aminoàcidos. A sequência da proteína era idêntica à sequência de ^-amilase de Bacillus amyloliquefaciens, tal como determinada por Takkinen et al. (J. Biol. Chem.,

1983, 258, 1007).

Exemplo 2

Construção do vector de mutagénese/expressão pMaTBac

2,2 kb le pUCAm4 e purificou-se pelo método uene Clean. Ligou-se este fragmento em pile 5~8 digerido com Smal-BamKI. 0 plasmídeo resultante, plácAm, obteve-se por transformação de E. coli WK6 (CBS 4-75.88) (Zell, R. e Pritz H.J., ElfflO J.,

1987, 6, 1309)· Após infecção com o fo.go M15KO7 isolou-se pilcAn de cadeia simples, do modo descrito pelo fornecedor (Pharmacia) . 0 plasmídeo pila 5-8 de cadeia dupla digeriu-se com Smal e Bam HI e tratou-se com pMcAm de cadeia simples de modo a obter uma cadeia dupla aberta (gapped duplex) (Kramer et al. , Nucleic Acids Res., 1984-, 12 94-41). Sujeitou-se esta cadeia dupla aberta a mutagénese dirigida (Kramer et al., ibid; Zell, R. e FritzH.J., ibid.) com um oligonucleótido projectado para introduzir um sitio Nbal na posição 18 em relação ao codão de início. A sequência deste oligonucleótido é:

5'-TTC CTG TCC CTC TAG ATT TGT TAT AC.

Após mutagénese bem sucedida, passou-se o plasmídeo através de uma cadeia de E. coli DALI (E. coli.

G1I48, Phabagen, Utrecht) e removeu-se então o fragmento EcoRI-Xbal por meio de digestão parcial e substituiu-se por um fragmento EcoRI-Nbal sintético contendo uma cópia do promotor tac. A sequência deste fragmento está representada na Figura 5 juntamente com a inserção do pl&a TBac resultante que codifica a ^-amilase (CBS 237-89). Este plasmídeo dá origem à síntese da ^-amilase em E. coli sob a influência do promotor tao induzido por IPTG. Além disso, a inserção deste vector pode submeter-se a mutagénese fazendo moléculas de cadeia dupla aberra adequadas entre moléculas de ANA do tipo pka e pile. Rode obter-se DNA de cadeia simples para as respectivas moléculas por infecção de E. coli WK6 com o fogo 1I15KO7, como descrito pelo fornecedor (Pharmacia) .

- 19 Exemplo 3

mutagenese de plia TBac pelo bissulfito

Tratou-se ( annealing) pIvíaTBac de cadei simples com pKícTBac digerido com Kpnl-Apal para se obter um heteroduplex com uma abertura da posição 4915 à 5146 (ver Figura 3A-c). 3ujeitou-se este heteroduplex a mutagénese pelo bissulfito (ver parte experimental) . Após transformação em E.coli. WK6 MutS (GBS 472.88) (Sell, R. e Eritz H.J., ibid) e selecção em placas de agar contendo cloranfenicol (25 jag/ml) isolaram-se amostras de plasmídeo e transformaram-se em E.coli WK6. Os transformantes resultantes desenvolveram-se em meio BHI (DIFOO) contendo 2.0 mM de CaCl^, 25/pg/nil õe cloranfenicol e 0,15 niM de IPTG (SIGMA) , durante 24 horas a 37°C. Incubaram-se três amostras da camada sobrenadante durante 0,7 © 14 minutos a 80°C, respectivamente, e testaram-se então em relação à actividade da o(-amilase . Tal efectuou-se colocando as amostras (5-10 μΐ) em placas BHI contendo 0,2 % de amido, incubando durante 1 hora a 55°G e corando as placas com uma solução de Ig/l e 7 g de KI/1). Seleccionaram-se como mutantes de 0(-amilase sensíveis ao calor as colónias que mostravam uma diminuição do tamanho e intensidade da área livre em relação às colónias ;ipo nativo, como resultado da incubação prolon ao

c.

gada a 80 0.

A Tabela 1 mostra a sequência das mutações obtidas numa experiência típica. As sequências de DNA determinaram-se por sequência da região aberta após isolamento do DNA de cadeia simples dos mutantes pHcTBac . Desenvolveram-se os plarmédeos pMcTBac mutantes em meio BHI na estirpe E. coli 'ΛΈ6 e fizeram-se preparações de enzimas pelo método osmo-chocn (Ausubel et al., ibid., Materiais e Métodos) para libertar a ol-amilase periplasmática.

A Tabela 2 mosrra a dosagem óptima das

V^-amilases mutantes e os resultados na panificação.

Uma vez que o volume do pão pode diferir de uma experiência de panificação para outra, todas as comparações se fazem em relação a uma preparação de enzima de controle (7/T) que se inclui em cada experiência separada. Este enzima WT prepara-se por fermentação do plasmideo pmaTBac não mut age ni zado em E. coli WK6.

TABELA 1

METANTE3 DE ^-AI»IILASE TERMO-SENSÍVEIS OBTIDOS APÓS MUTAGENESE PELO BIS8ULFIT0

AMINOÁCIDO

MUTANTE	(AA) no	DE —	—>PARA	AA	—>AA
A8	394	CCG	TCG	Pro	Ser
	386	TAC	TAT	Tyr	Tyr
BIO	345	GCG	TCG	Pro	Ser
E12	398	CCO	TCC	Pro	Ser
G2	386	CCG	CTG	Pro	Leu
3	349	GOC	GCT	Ala	Ala
	322	ACA	ATA	Tlor	Ile
4	345	COG	TCG	Pro	Ser
6	322	AOA	ATA	Thr	Ile
	316	CAT	TAT	His	Tyr
7	356	TCC	TTC	Ser	Phe

JABELA 2

TESTES DE PANIFICAÇÃO COu 0C-AMILA3E iúUTÂCIONADAS PELO BISSUL PITO

MUTANTE

DOSE ÓPTIMA (PU/200 g DE

PAPINHA)

VOLUME DO PÃO (ml)

WT (ESTIRPE PAI) 4.25

A8 14

B1O 9

EI 2 14

G2 8.5

7.8

9.6

6.4

11.1

565

574

596

577

591

526

557

545

550

Exemplo 4

Mutagénese de pMaTBac por malincorporação enzimática

Tratou-se (annealing) pivIaTBac de cadeia simples com pMcTBac digerido com EcoRV-Kpnl para se obter um heteroduplex com uma abertura da posição 4018 à 4915 (ver Eigura 5)· Sujeitau-se o duplex aberto a mutagénese por malin corporação enzimática, como descrito na Parte experimental.

Dividiu-se em três partes uma amostra obtida por elongação primer A- limitada e incubou-se na presença de transcriptase reversa com dCTP, dGTP e dTTP, respectivamente. Após incubação a 37°O durante 10 minutos adicionou-se uma carga de todos os quatro dNTP’s e polimerase de Klenow e 14 - DNA ligase para acabar a elongação a moléculas de cadeia dupla completas. Estas moléculas transformaram-se em Ξ. coli. WK6 Muts e recolheram-se amostras de plasmideos. Estas amostras de plasmideos transformaram-se em E. coli WK6 e seleccionaram-se as colónias em placas de agar contendo cloranfenicol (25 jig/ml) .

Seleccionaram-se (screening) os mutantes resultantes em relação à vQ-amilase termo-sensitiva, pelo método descrito no exemplo 5·

A Tabela 3 mostra a sequência de várias ρζ-amilases termo-sensitivas obtidas num exemplo típico. As sequências de DNA determinaram-se por sequenciação da abertura após isolamento do DNA de cadeia simples dos mutantes pMcTBac.

A Tabela 4 mostra dosagem óptima das ç^-amilases mutantes e os resultados de panificação.

AO-SENSÍVEIS 03TID03 APÓS ELONGAÇÃO

AUTAETES DE ^-AAILASE TaDa

LiUxAi·; -J±J

A— Jjl.dl TADu	AA no .	DE	—>?ÀRÀ	AA —
12	116	GTC	GAC	VAL	ASP
15	115	GTA	GGA	VÁL	GLP
	114	ACT	ACC	THR	THR
	116	GTC	GCC	VAL	ALA
14	165	TGG	CGG	TRP	ARG
	164	GAT	GAG	ASP	GLU
	166	TCC	CCC	SER	PRO
17	25S	TTT	CTT	PHE	LEU
25	116	GTC	GCC	VAL	ALA
26	116	GTC	GGC	VAL	GLY
29	115	GTA	GCA	VAL	ALA
	114	ACT	AGG	THR	THR
T-limibalo	116	GTC	/¹ π 'sJ -3 Lj	VAL	ALA
15	125	AGA	m ± JA	í T~) /1	CY3

TABELA 4

TESTE DE PANIFICAÇÃO COM «(-AMILASE OBTIDA POR ELONGAÇÃO A- OU T-LIMITADA

mUTANTE	DOSE ÓPTIMA (PU/200 g DB PAjtíiNHa)	VOLUME DO (ml)
UT (ESTIRPE PAI)	4.4	566
12	13 .4	525
13	19.5	564
14	11	542
15	>100	560
17	4.25	545
25	5.4	558
26	12.5	561
29	14.6	558

- 25 Exemplo 5

Comparação da ^-amilase de 3. amyloliquefaciens nativa e mutante no fabrico de pão

Na labela 5 compara-se o efeito de aumento do volume de pão em carcaças para a «j^-amilase de B. amyloliquef aciens fúngica, bacteriana do tipo nativo e mutante n°15 ·

Pelos resultados conclui-se que o númerc de unidades de o(-amilase necessário para obter um volume máximo de pão é muito semelhante PU/2OOg de farinha) para a ^-amilase de B. amyloliquefaciens fúngica, do tipo nativo e mutante n215· Quando se utiliza a q^-amilase fúngica ou o mutar. te bacteriano n21> obtém-se um aumento máximo de volume de pão de cerca de 15% sem causar excesso de dextrinação do miolo do pão. Não e possivel, contudo, obter um volume máximo de pão sem causar um gronde excesso de dextrinação quando se usa ΰζ-amilase de B. amyloliquefaciens do tipo nativo para melhorar o volume do pão.

Na Tanela 6 compara-se o efeito de amaciamento do miolo da ^-amilase do tipo nativo e do mutante bac teriano n°15(Arg 125—>Oys 125) numa receita de panificação padrão contendo 2700 SKB de ^-amilase fúngica por Kg de farinha .

Na Tabela 6 conclui-se que a lase bacteriana do tipo nativo é muito aficiente como amaciador do miolo. Obtém-se logo um efeito óptimo de amaciamento do miolo a dosagens entre 5 »9 e 15 PU/Eg de farinha. Contudo, observa-se logo uma grave superdextrinação do miolo do pão a uma dosa gem ligeiramente superior de 59 PU/Eg de farinha. È necessária uma dosagem muito maior do enzima mutante, de 74 PU/Iíg de fari nha, para se obter um efeito óptimo de amaciamento do miolo, e

pode adicionar-se uaa dosagem, de ^40 PU/Kg antes de se observar uma ligeira superfexrrinação do miolo do pão. Deste modo, o perigo de superdextrinação é consideravelmente reduzido quan do se usa o mutante KS 15 da ç>(-amilase em vez da ç(-amilase do tipo nativo de amyloliquefaciens como amaciador do miolo.

A termoestabilidade reduzida do mutante ps 15 da <)(-amilase bacteriana é também evidente pela actividade residual da g(-amilase no miolo do pão. Enquanto que a ^-amiinse bacteriana do tipo nativo sobrevive largamente ao processo de panificação (50-75 % θ-e actividade residual) , não se conseguiu detectar actividade residual de ^amilase no pão preparado a partir de massas contendo o mutante ns 15 de pç-ami lase bacteriana.

nuação da Tabela

***»&5§ ί,Ίί'-Ρ.. .....

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CD	ι—I	CM	o	OA	cD	Cd	o	o
CO	OA	O''	o	00	CO	OA	oa	OA
NA	NA	NA	3·	NA	NA	NA	NA	NA

	NA •	OA •	O •	3- •	NA •
O	<—1	NA	«λ	OA	CM	Od	3^-	NA	CM
			1—1	NA		Cd	Cm	CM	3-

CM I>-

					o	o	o	o	o
					3	3	3	3	3
					rt	rt	rt	rt	rt
	o	o	o	o		•rt
	3	3	3	3	3	rt	3	rt	3
	rt	cd	rt	rt	Φ	Φ	Φ	Φ	Φ
	Ή	•rt	•rt	•rt	23	P	P	P	P
	3	3	3	3	ó	υ	O	o	O
	Φ	Φ	Φ	<D	rt	rt	rt	rt	rt
	P	P	P	P	P	P	P	P	P
	O	o	O	υ
	rt	rt	rt	rt	MA	UA	MA	MA	MA
/--χ	P	3	P	P	1—1	!—1	1-1
Φ
rt	O	O	o	O	•	•	•	•	•
d	>	!>	>	>	Ol	Ol	Ol	os	Cl
!-1	•rt	•rt	•rt	•rt	3	3	3	3	3
•rt	-P	P	P	13
	rt	rt	rt	rt	φ	φ	o	φ	Φ
co	3	3	3	3	P	P	J3	13	.3
					3	3	3	3	tí
a	o	o	o	o	rt	rt	rt	cd	rt
φ	P	3	P	Pd	ίο	P	.13	P	23
ω	Ή	•rt	•rt	•rt	3	3	3	3	3
	P	P	P	P	cd	a	a	a	a

Uxemplo 6 modulação da termolabilidade de c^-amilase por combinação de mutações simples diferentes

Descobriu-se que vários dos mutantes descritos nos exemplos 3 e 4 retinham uma estabilidade demasiado elevada para uma utilização óptima na panificação. Uma vez que se conhecem as substituições individuais de aminoácidos de cada mutante de -amilase pode projectar-se um mutante com uma estabilidade/labilidade óptima para aplicação na panificação combinando as substituições individuais de aminoácidos. Isto pode conseguir-se tocando qs fragmentos de restrição apropriados do pMa TBac mutacionado ou introduzindo a substituição do aminoácido em causa por mutagénese dirigida (materiais e métodos, secção 3)· A Tabela 7 mostra as combinações efectuadas. Testaram-se estes mutantes de combinação em relaçao à sua estabilidade incubando amostras da camada sobrenadante a 75°G durante 10 minutos e testando a actividade remanescente da oÇ-amilase usando placas de amido BHI e incubando durante 1 hora a 55°0 (ver exemplo 3).

Determinou-se a percentagem de actividade residual comparando diluição apropriadas de o(-amilase WT (nativa) e mutante, não aquecidas (Figura 4). Pode verificar-se cue rodos os mutantes de combinação são mais termolábeis eto cue os mutantes pais correspondentes. Pode assim consequir-se uma optimização da termolabilidade combinando os mutantes de mutação simples apropriados.

ϊabela 7 utante

Mutantes de Combinação Combinação de mutantes Aminoácidos

El2 + 1<

P398S

V116D

E12 + 15

E12 +

E12 + 26

P5983 *)

V113S/V116A

P598S *)

T165R/D164E/3166P

P398S

V116G + 13

S356F

V116D

S356P

V113&/V116A

S356P

T163R/D164E/S166P

S356F

VI160 ) Á espressão destes mutantes de ^-amilase foi altamente reduzida possivelmente devido à instabilidade ou à sensibilidade à protease.

Exemplo 7

Modulação da termolabilidade por substituição de deferentes aminoácidos en posições seleccionadas

Pelos métodos aplicados nos exemplos 3 e 4 identificaram-se as posições importantes para a estabilidade /labilidade da o(-amilase. Conrudo, devido à natureza específica do método de mutagénese apenas se pode esperar um número limitado âe substituição numa determinada posição.

De modo a alargar a goma de mutações e o correspondente comportamento estabilidade/labilidade pode substituir-se um resíduo que seja importante para a estabilidade/labilidade per todos os a'.', ή no áci dos naturaus possíveis. Isto pode efectuar-se por mutagénese dirigida usando um oligonucleótido com uma mistura de todos os quatro nucleótidos possíveis no codão em causa (ver Materiais e métodos, secção 3)· Gom este objectivo usou-se um oligonucleótido misto com a seguinte sequência

GGAAuTTTGGTGATT^ENATT&GGGGGATTGAC para obter um certo número de ç%-amilase diferences mutacionadas no resíduo 123· N representa qualquer do 4 nucleótidos possíveis (Tabela 8).

Pelo método descrito no exemplo 6 determinou-se a percentagem de actividade residual (Fi_oura 5). Pode verificar-se que todas os murantes na posição 123 estudados são menos estáveis do que o enzima do tipo nativo (K123). Além disso, é evidente que os diferentes aminoácidos na posição 125 têm diferentes comportamemcos de termolabilidade.

Por isso, pode utilizar-se uma mutagénese oleatória em posições seleccionadas pelo método dos exemplos 3 e 4 para seleccionar ou prcj.ectar uma ol -amilase mutante com o comportamento de estabilidade/labilidade desejado.

Tabela õ

Mutagénese aleatória numa posição de resíduo individual kutante

Substituição de aminoácido

15	S125C
42	R123H
43	R123V
44	R123L
45	R123A
46	R125P
4?	R123D

Exemplo 8

Substituição do _oene cromossomal da «(-amilase do tipo nativo por um gene mutante

Para produzir uma ^-amilase mutante pode efectuar-se uma reclonagem num hospedeiro de expressão.

Um hospedeiro preferencial pode ser α microorganismo pai da <\-amilase em causa. Contudo, antes da utilização tem de se desactivar ou aliminar o gene de o^-amilase endógeno. Este exemplo descreve a eliminação do gene da p(-amilase de B. amyloliquefaciens. Seguidamente pode exprimir-se o gene de amilase mutante, a partir de um plasmideo (p. ex. ρϋΒΙΙΟ) contendo o _oene ou a partir de uma cópia do gene cromossomalmente integrada. Prefere-se esta última, hipótese para fins preparativos devido a não haver DNA heterólogo pctsente no hospedeiro .

A inactivação da ^-amilase cromossomal de B. amyloliquefaciens efectuou-se, por integração de um plasmideo (p pE194neo baseado em pEl94, ver EP 028307?) contendo uma origem de replicação sensivel à temperatura no gene. A selecção de integrantes cromossomais efectuou-se por aumento de temperatura até condições não permissíveis para replica) ção de plasmideos na presença do antibiótico relevante. 0 plasmideo continha uma cópia do gene da ^amilase com a parte central eliminada (ver Figura 6). À recombinação pode ocorrer em ambas as sequências dos flancos. Apenas se a integração e a excisão ocorrerem por recombinação em duas sequências de flancos diferentes tal resultará na eventual perda do gene da ^(-amilase. Desenvolveram-se estes integrantes potenciais a 37°O na ausência de neomicina para estimular a recombinação exterior e a cura do plasmideo. Obtiveram-se três clonos negativos de cZ-amilase, um dos quais se analisou extrensivamente por mapping cromossomal. Também se analisou o integrante-pai do clono negativo de K-amilase por mapping cromos . somai, ha Figura 6 mostram-se os mapas de restrição da inte- 36 graçao cromossomal e da excisão. Obteve-se uma cadeia de o(-amilase negativa de 3. amyloliquefaciens e designou-se por BAA112. Esta cadeia tinha uma falha de 155 bp no gene de ^-amilase interno de EcoRV a HindIII.

Usou-se em seguida a cadeia negativa

0.6 pÇaó :ilase 3AÍM112 para a preparação de X-amilases mutantes. Primeiro clonou-se o DNA codiíicante do murante 15 (R123C) no pEl94neo e transformou-se na cadeia 3AI.Í112 usando transf ormaç ão de protoplasto (Chang e Cohen, 1979j molecular and General Genetico, 168, 111-115)· A integração cromossomal do gene de p(-amilase mutacionado (R 1230) efectuou-se após selecção a 50°6 θ 20 jig/ml de neomicina. Isolou-se um certo número de inregrantes e após ocorrer a recombinação em ambas as sequências de flanco, foi possível seleccionar em relação à integração do _oene de A“^£níí^s-^se 1230. De modo análogo, conforme indica na Figura 6, se obteve a excisão do plasmídeo do cromossoma. Seleccionau-se un clono positivo de oçpani lase, sensível à neomicina, BAMllp, e analisou-se por mapping cromossomal,

Exemplo 9 (exemplo de referência) lestaram-se os mutantes de tfçamilase de B. amyloliquefaciens 13141 e IS191, descritos por N.A. Smirnova et al. (Biological Abstracts, 87, n° 7 (1981), abstract N°. 70127 e abstract N£. 73128) , tanto em condições laboratoriais como de aplicação indusrrial. A termoestabilidade reduzida nestes mutantes confirmou-se usando o método do teste em placa descrito no exe...plo 3. guando se comparou a actividade do mutante 13141 e do enzima do tipo nativo a pH 5,5 e 6,5, pelo método pnadebas, verificou-se que o mutante 13141 da <A-amilase era noranl.oenre activo a pH 6,5 mas tinha perdido quase toda a sua actividade a pH 5,5· For esta razão o mutante de ^-amilase 13141 (Asp -^Asn^^) não é adequado para aplicação em panificação. Galculou-se termoestabilidade do murante de

Γ' ST

141 141x χ-amilase T3191 (Glu ->^LW^S ) ^na pauificaçao a partir da dosagem necessária para um efeito óptimo de amaciamento do miolo. Concluiu-se que a termoestabilidade deste enzima mutante em condições de aplicação industrial era muito semelhante à termoestabilidade do enzima do tipo nativo. Por isso, este mutante não apresenta um fenótipo útil.

Claims

REIVINDICAÇÕES lâ

Processo para a preparação de um enzima mutante resultante de uma fermentação microbiana, apresentando estabilidade reduzida em condições de aplicação industrial em relação ao enzima nativo correspondente, caracterizado por se efectuar a fermentação de um microorganismo adequado e, opcionalmente se separar ou purificar o enzima mutante formado.

- 2â Processo para a preparação de um enzima mutante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o microarganismo utilizado ser adequado para a produção de fiç-amilases bacterianas mutantes, após eliminação da expressão de o(-amilases endógenas.

- 3a _

Processo para a preparação de um enzima mutante, de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizado por se empregar uma microorganismo, de preferência uma bactéris., levedura ou fungo, mais preferencialmente E.coli , um Bacillus ou um Aspergillus, de preferência Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens ou Bacillus licheniformis, que compreende um gene que codifica esse enzima mutante.

- 4ê Processo para a preparação de um enzima mutante, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por se empregar um microorganismo transformado por um vector plasmideo.

- Processo para a preparação de um enzima mutante, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o vector plasmideo utilizado para a transformação do microorganismo conter um gene que codifique o enzima mutante, gene esse que compreende uma sequência de DNA que difere em 1-10 unidades do gene do tipo nativo.

— 6& —

Processo para a preparação de um enzima mutante de acordo com as reivindicações 1 e 5, caracterizado por o gene codificar uma (/-amilase bacteriana e diferir em 1-10 unidades do gene do tipo nativo que tem a sequência de DNA indicada na Figura 2_e

- 39 GAA7

E. rt 10 'pT' Ι'Τ'Γ'.

L S

TCCGAT

S 0 50

10 20 30 40 50 60

AAAACGAAAGCGGACAGTTTCGTTCAGACTTGTGCTTATG7GCACGCTGTTA E R K R Τ V s F R L V L M C ~ E L

70 80 90 100 110 120 iTTTGCCGATTACAAAAACATCAGCCGTAAATGGCACGCTGATGCAGTATTTT !, Ρ I Τ K 7 S A V N G T L M Q Y F

30 140 150 160 170 18O

7ACGCCGAACGACGGCCAGCATTGGAAACGATTGCAGAATGATGCGGAACAT Τ Ρ N D G Q H W K R L Q N D A Ε H

190 200 210 220 230 240

A.TATCGGAATCACTGCCGTCTGGATTCCTCCCGCATACAAAC-GATTGAGCCAA

DTGITAVWIPPAYKGLSQ

250 260 270 280 290

A.CGGATACGGACCTTATGATTTGTATGATTTAGGAGAATTCCAGCA.

NGYGPYDLYDLGEFQQ

300

AAGGG K G

310 320 330 340 350 360

ACGGTCAGAACGAAATACGGCACAAAATCAGAGCTTCAAGATGCGATCGGCTCACTGCAT

TVETKYGTKSELQDAIGSLK

370 380 390 400 410 420

TCCCGCAACGTCCAAGTATACGGAGATGTGGTTTTGAATCATAAGGCTGGTGCTGATGCA S R Ν V Q V Y G D V V L Ν Η K A G A D A

430 440 450 460 470 480

ACAGAAGATGTAACTGCCGTCGAAGTCAATCCGGCCAATAGAAATCAGGAAACTTCGGAG

TEDVTAVEVNPANRNQETSE

110

490 500 510 520 530 540

GAATATCAAATCAAAGCGTGGACGGATnTCGTTTTCCGGGCCGTGGAAACACGTACAGT

EYQIKAWTDFRFPGRGNTYS

13O

550 560 570 500 590 600

GATTTTAAATGGCATTGGTATCATTTCGACGGAGCGGACTGGGATGAATCCCGGAAGATC

DFKWHWYHFDGADWDESRKI

15O

610 620 630 640 650 660

AGCCGCATCTTTAAGITTCGTGGGGAAGGAAAAGCGTGGGATTGGGAAGTATCAAGTGAA

SR I FKFRGEGKAWDWEVSSE

170

Ó70 680 - 69O 700 710 720

AACGGCAACTATGACTATTTAATGTATGCTGATGTTGACTACGACCACCCTGATGTCGTG

NGNYDYLMYADVDYDHPDVV

190

730 740 750 760 770 780

GCAGAGACAAAAAAATGGGGTATCTGGTATGCGAATGAACTGTCATTAGACGGCTTCCGT

AETKKWGIWYANELSLDGFR

210

790 800 810 820 830 840

ATTGATGCCGCCAAACATATTAAATTTTCATTTCTGCGTGATTGGGTTCAGGCGGTCAGA

IDAAKHIKFSFLRDWVQAVR

23O • 4θ -

850 860 870 880 890 900

CAGGCGACGGGAAAAGAAATGTTTACGGTTGCGGAGTATTGGCAGAATAATGCCGGGAAA QATGKEMFTVAEYWQNNAGK 250

910 920 930 940 950 96o

CTCGAAAACTACTTGAATAAAACAAGCTTTAATCAATCCGTGTTTGATGTTCCGCTTCAT

LENYLNKTSFNQSVFDVPLH

270

970 980 990 1000 1010 1020 TTCAATTTACAGGCGGCTTCCTCACAAGGAGGCGGATATGATATGAGGCGTTTGCTGGAC

FNLQAASSQGGGYDMRRLLD

290

1030 1040 1050 1060 1070 1080

GGTACCGTTGTGTCCAGGCATCCGGAAAAGGCGGTTACATTTGTTGAAAATCATGACACA

GTVVSRHPEKAVTFVENHDT

310

1090 1100 1110 1120 1130 1140

CAGCCGGGACAGTCATTGGAATCGACAGTCCAAACTTGGTTTAAACCGCTTGCATACGCC

QPGQSLESTVQTWFKPLAYA

330

II50 1160 1170 1180 II90 1200

TTTATTTTGACAAGAGAATCCGGTTATCCTCAGGTGTTCTATGGGGATATGTACGGGACA

FILTRESGYPQVFYGDMYGT

350

1210 1220 I23O 1240 1250 1260

AAAGGGACATCGCCAAAGGAAATTCCCTCACTGAAAGATAATATAGAGCCGATTTTAAAA KGTSPKEIPSLKDNIEPILK 370

1270 1280 1290 1300 1310 1320

GCGCGTAAGGAGTACGCATACGGGCCCCAGCACGATTATATTGACCACCCGGATGTGATC ARKEYAYGPQHDYIDHPDVI 390

1330 1340 I35O I36O 1370 1380

GGATGGACGAGGGAAGGTGACAGCTCCGCCGCCAAATCAGGITTGGCCGCTTTAATCACG

GWTREGDSSAAKSGLAALIT

4io

1390 1400 1410 1420 1430 1440

GACGGACCCGGCGGATCAAAGCGGATGTATGCCGGCCTGAAAAATGCCGGCGAGACATGG

DGPGGSKRMYAGLKNAGETW

43O

1450 1460 1470 1480 1490 1500

TATGACATAACGGGCAACCGTTCAGATACTGTAAAAATCGGATCTGACGGCTGGGGAGAG

YDITGNRSDTVKIGSDGWGE

45O

I5IO I52O I53O 1540 TTTCATGTAAACGATGGGTCCGTCTCCATTTATGTTCAGAAATAA

FHVNDGSVSIYVQK 470 483

- 4l ·

- 7Ê Processo para a preparação de um enzima mutante, de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado por o enzima ser o resultante de uma ou mais mutações seleccionadas do enzima do tipo nativo, de modo que esse enzima mutacionado tenha a desejada estabilidade reduzida em condições de aplicação industrial.

- 8ê Processo para a preparação de um enzima mutante, de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado por o enzima obtido conferior melhores propriedades ao pão nas condições da panificação.

_ 9& _

Processo para a preparação de um enzima mutante, de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado por o enzima obtido ser um enzima para panificação, de preferência Q(-amilase bacteriana.

- 10S Processo para a preparação de um enzima mutante, de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado por o enzima obtido - a o(-amilase bacteriana exibir uma termoestabilidade reduzida em condições de panificação , em relação ao enzima do tipo nativo correspondente.

- lia Processo para a preparação de um enzima mutante, de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado por se obter um enzima modificado por expressão de um gene que codifica o referido enzima modificado contendo uma sequência de aminoácidos que difere em 1 a 10 aminoácidos do enzima do tipo nativo.

- 12& Processo para a preparação de um enzima mutante, de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado por se preparar uma &(-amilase bacteriana modificada que tem uma sequência de aminoácidos em que a Arg 123 ho enzima do tipo nativo ê substituído por Cys 123·

- 13& Processo para a preparação de um enzima mutante, de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado por se obter uma o(-amilase bacteriana modificada que tem uma sequência de aminoácidos que difere pelo menos em um aminoácido do enzima do tipo nativo no aminoácido número 113, 114, 116, 123, 163, 164, 166, 238, 316, 322, 345, 349, 356, 386, 394 ou 398 do B. amyloliquefaciens ou numa posição homóloga numa ^-amilase homóloga.

- 14ê Processo para a preparação de um enzima mutante, de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado por se obter uma ^-amilase bacteriana que é uma ^-amilase de Bacillus, de preferência uma 0(-amilase de B. amyloliquefaciens.

- 15B Processo para a preparação de um enzima mutante, que apresenta a estabilidade desejada em condições de aplicação industrial, caracterizado por

a) se mutagenizar um gene que codifica para o enzima do tipo nativo,

b) se seleccionarem mutante com propriedades de estabilidade alteradas;

c) sedeterminarem as adequadas substituições de aminoácidos comparado com os enzimas do tipo nativo; e

d) se combinarem as substituições individuais de aminoácidos seleccionadas, de modo a obter-se um gene mutacionado que codifica o enzima mutante.

- 166 Processo para a preparação de um microorganismo clonado com um gene que codifica um enzima mutante que apresenta a desejada estabilidade em condições de aplicação industrial, caracterizado por

a) se clonar um gene que codifica o enzima do tipo nativo;

b) se mutagenizar o gene que codifica o enzima do tipo nativo ;

c) se seleccionarem mutantes com propriedades de estabilidade alteradas;

d) se determinarem as adequadas substituições de aminoácidos comparado com os enzimas do tipo nativo;

e) se combinarem as substituições individuais de aminoácidos seleccionados, formando-se um gene mutacionado que codifica o enzima mutante; e

f) se reclonar o gene mutacionado num hospedeiro adequado.

- 176 Processo para a preparação de um enzima mutante que apresenta a estabilidade desejada em condições de aplicação industrial, caracterizado por se efectuar a fermentação de um microorganismo quando preparado de acordo com a reivindicação 16.

- 44 18ê

Processo para a preparação de uma massa, leveda ou de um produto similar, caracterizado por se utilizai um enzima mutante com melhores propriedades de panificação, quando preparado de acordo com qualquer das reivindicações an teriores.

Processo para a preparação de pão ou de um produto similar, caracterizado por se incluir numa massa leveda um enzima mutante com melhores propriedades de panificação preparado de acordo com qualquer das reivindicações anteriores .

- 20 & Processo para a preparação de uma composição para melhoria de qualidade de pão caracterizado por se incorporar como ingrediente activo um enzima mutante quando produzido de acordo com as reivindicações 8 a 14.

A requerente reivindica a prioridade do pedido de patente europeia apresentado em 29 de Junho de