HUT56396A - Process for producing mutant enzyme having reduced stability under circumstances of industrial application - Google Patents

Description

A kenyér készítéséhez használt legtöbb lisztet ce-amilázzal egészítik ki a malomban vagy a pékségben. A technika mai állása szerint a gomba és gabona eredetű -amiláz készítményeket fel lehet használni a kenyércipó méretének a javítására. Tudjuk továbbá, hogy a baktérium és gabona eredetű ec-amilázoknak kenyérbél lágyító hatásuk is van. A kenyér állottá válásának tanulmányozásakor kiderült, hogy a kenyér tárolása folyamán a keményítő frakció újra kristályosodik, és ez okozza a kenyérbél tömöttségét. Ebből következik, hogy a sütés folyamán a keményítő részleges bomlásának a kenyérbélre lágyító hatása van. Hogy az ee-amiláz megfelelően hasson a tömöttség ellen, ahhoz az szükséges, hogy a kenyértésztában az enzim hatékony maradjon mindaddig, amíg a keményítő frakció egy része annyire el nem csirizesedik, hogy hidrolízise lehetővé váljék [Miller és mtsai, Food Technology, 1953 január, 38. oldali. Az Aspergillus oryzae által termelt gomba eredetű ee-amiláz alacsony hőstabilitása következtében mire a pékáruban a keményítő elcsirizesedik, és az enzim ekkor megtámadhatná és hidrolizálhatná, addigra az enzim nagymértékben inaktiválódik· így tehát a gomba eredetű 6e.amilázok aligha javítják a kenyér-bél lágyságát, bár a kenyércipó térfogatának javítására felhasználhatók anélkül, hogy fennállna a túlzott dextrinképződés veszélye.

I · · 3 *·

Ezzel szemben a bakteriális oc-amilázokat olyan nagyfokú hőstabilitás jellemzi,hogy túl sok keményítőből képződik dextrin asütés alatt· Ha túl sok enzimet adagolunk, a kenyérbél nagyon nyúlós és ragadó lesz, és a kenyér minősége elfogadhatatlanná válik a fogyasztó számára* A bakteriális amilázok részben túlélik a sütési folyamatot, és a sütés után is kifejtik hatásukat, főként a kenyér lassú lehűlése folyamán· Annak érdekében, hogy elfogadható kenyérbél lágyító hatást érjün el, a bakteriális «-amiláz adagolását és a kenyérkészitési eljárás feltételeit nagyon szigorúan kell szabályozni· Ezen hőstabil enzimekkel kapcsolatos problémák miatt a sütőipar általában nem használja a bakteriális amilázokat· Úgy tűnik, hogy a közepes hőstabilitásu &-amilázok a legalkalmasabbak a kenyérbél lágyságának a javítására, mivel ezeknek az enzimeknek a nagy adagjai sem könnyen csirizesitik el a kenyérbelet· A sütőipar ezért kiterjedten al kalmazta eddig a maláta «-amilázt, amelynek az a jellemzője, hogy hőstabilitása a gomba eredetű és a baktérium eredetű «-amilázok hőstabilitása közötti, A legtöbb maláta készítményben azonban a proteolitikus mellékreakciók nemkivánt mellékhatásokat okoznak· Ezenkívül a malátából előállított tisztított «-amiláz túl drága ahhoz, hogy sütésnél alkalmazzák·

Más lehetőségeket ismertet a 4 320 151 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leirás, amely eljárást ad a gomba eredetű «-amilázok alacsony hőstabilitásának a * · · · javítására a sütés folyamán és az EP.A-0273268 számú nyilvánosságra hozott európai szabadalmi bejelentés, amely kémiai módositási eljárást ir le a bakteriális «-amiláz hőstabilitásának a csökkentésére. Mindkét esetben szükség van az enzimek módosítására kényértászában való felhasználás előtt, a közepes hőstabilitás elérése érdekében, A gomba eredetű «-amilázt úgy védhetjük meg a hődenaturációval szemben, hogy az amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás szerint egy védő oldatban oldjuk vagy diszpergáljuk az enzimet, mig az európai szabadalmi bejelentés szerint a bakteriális «-amilázt acilezni kell a kenyértész.fába való felhasználás előtt. Tehát még mindig szükség van olyan optimális stabilitású uj enzimekre, amelyek alkalmasak ipari eljárásban ilyen a sütés - a közvetlen alkalmazásra,

A találmány olyan mutáns enzimekre vonatkozik, amelyek ipari alkalmazási körülmények között csökkent stabilitást mutatnak. Az ilyen mutáns enzimekhez úgy jutunk, hogy a vad tipusu vagy natív enzim legalább egy csoportját szubsztituáljuk.

Az alábbiakban az ábrák rövid leírása következik,

1, ábra: a pUCAm4 plazmid szerkezete,

A Bacillus amyloliquefaciens «-amiláz génjét hordozó 2,2 kb méretű BglII-BamHI fragmentumot beépítjük a PUC18 BamHI helyére. Az ampicillin rezisztenciáért felelős gén jele: AMP.

I k

2. ábra: az «-amiláz gén DNS szekvenciája

A pUCAm4 inszertum egy 1542 bázisból álló egyetlen nagy nyitott leolvasási keretet tartalmaz, amely a Bacillus amyloliquefaciens «-amilázát kódolja. Az aminosav-szekvenciát egybetűs kóddal jelöljük.

3. ábra: a pMaTBac plazmid EcoRI-BamHI frag- mentuának szekvenciája

A 3753-as helyzetben lévő EcoRI hely megfelel a pMa5-8 plazmid 3753-as helyzeténél lévő EcoRI helynek. A TAC promoter a 3753-as és 3858-as helyzetek között helyezkedik el. Az «-amiláz gén aminosav szekvenciáját egybetűs kóddal jelöljük.

4. ábra: A vad tipusu (WT wild-type) és a kombid nált «-amiláz mutáns maradék-aktivitása 75 °C-on 10 percig tartó inkubálás után

A mutánsokat a 7. táblázat tartalmazza.

5. ábra: A vad tipusu (WT = wild-type) és mutáns «-amiláz maradék aktivitása 75 °C-on 10 percig tartó inkubálás után

A mutánsok különböző szubsztituenseket tartalmaznak a 123. csoportnál. Lásd a 8. táblázatot.

6. ábra: A H2 B. amyloliquefaciens DNS, az

5*-nál és 3*-nél integrált szekvenciák és a BAM112 «-amiláz negativ törzs kromoszómális térképezése.

·· ··· · · · * ····· ······ · • · · · · «

Alkalmas stabilitású enzimek kifejlesztése vagy felkutatása többféle módon történhet, például klasszikus szűrési módszerekkel vagy modern genetikai és protein technológiai technikák alkalmazásával.

A kivánt enzimaktivitást kifejtő organizmusokra és mikroorganizmusokra való szűrést úgy végezhetjük, hogy például egy mikroorganizmusból vagy egy mikroorganizmus tenyészetének a felüluszójából izoláljuk és tisztítjuk az enzimet, meghatározzuk biokémiai tulajdonságait, és megvizsgáljuk, hogy ezek a biokémiai tulajdonságok egy bizonyos alkalmazás esetén megfelelnek-e a kivánalmaknak. Ha az azonosított enzimet nem lehet az ezt természetesen termelő mikroorganizmusból izolálni, rekombináns DNS technikákat használhatunk az enzimet kódoló gén izolálására, a gént egy másik szervezetben fejezzük ki, a kifejeződött enzimet izoláljuk és tisztítjuk, és ellenőrizzük, hogy alkalmas-e a kivánt felhasználási célra.

Kivánt felhasználásra szolgáló uj enzimek előállításának egy másik módja az, ha a meglévő enzimeket módosítjuk. Ezt többek között kémiai módosító eljárásokkal érhetjük el [I.Svendsen, Carlsberg Rés. Comm., 44, 237-291 (1976)], Általában ezek a módszerek nem túl specifikusak, ugyanis minden megtámadható azonos oldalláncú csoportot módosítanak, függnek továbbá a módosítandó megfelelő aminosavak jelenlététől, és gyakrari nem képesek azokat az aminosavakat mó• · • · ··· ·· ♦ <

····· ·«···· · • · · · ·«

- 7 dositani, amelyekhez nehezen férnek hozzá, hacsak az enzim molekula nincs kigombolyodva.

Egyébként a kódoló gén mutagenezise révén végzett enzim módosításnál nem áll fenn a fent említett aspecifltás, és Így azt gondoljuk, hogy ez az alternatív módszer sokkal jobb. A mutagenezis vagy találomra (random) végzett mutagenezis vagy helyre-irányuló mutagenezis lehet.

A random mutagenezis, vagyis amikor az egész mikroorganizmust kémiai mutagénekkel vagy mutagenizáló besugárzással kezeljük, természetesen eredményezhet módosított enzimeket. Ebben az esetben szigorú szelekciós technológiákat kell alkalmazni a speciális és kivételes mutánsok felkutatására. A random mutagenezissel kapdott mutáns enzimek izolálásának nagyobb az eshetősége, ha a kódoló gént - klónozása után - in vitro vagy in vivő mutagenizáljuk, és ha a kódolt enzimet a mutagenizált gén újra klónozása révén egy alkalmas gazdasejtben kifejezzük, A módosított enzimek termelésére alkalmas gazdasejtek lehetnek baktériumok (E. coli, Bacillus), élesztők vagy gombák (Aspergillus)· Ebben az esetben is megfelelő biológiai szelekciós technológiával kell rendelkeznünk a kívánt mutáns enzimek kiválasztásához. Ezek a biológiai szelekciós módszerek nem szelektálják feltétlenül közvetlenül azokat az enzimeket, amelyek az ipari alkalmazásra megfelelnek.

A találmány tehát olyan uj mutáns enzimekre vonatkozik, amelyeket az adott enzimet kódoló gén expressziója * ·

- 8 révén állíthatunk elő, továbbá amelyekben az aminosav-szekvencia legalább egy aminosavban különbözik a megfelelő vad tlpueu enzimhez képest, és amelyek csökkent stabilitást fejtenek ki az ipari alkalmazás körülményei között. Jóllehet egyes mutáns enzimekről tudjuk, hogy kevéssé stabilak laboratóriumi körülmények között, azonban ipari alkalmazási körülmények között csak kis változás észlelhető stabilitásukban, ami a vizsgálat és alkalmazási feltételek közötti különbségnek (hőmérséklet, pH, szubsztrátum, stb.) tulajdonítható. Nekünk sikerült először olyan mutánsokat előállítani, amelyek az ipari eljárás feltételei mellett csökkent stabilitást mutatnak.

Egy vagy több aminosavnak bármilyen más kívánt aminosavval való specifikus szubsztitúcióját biztosító helyre-irányuló mutagenezist használhatunk javított tulajdonságokkal rendelkező enzim szerkesztésére és további szelekciójára.

A találmány egyik iránya szerint az azonosított mutációk kombinációit állíthatjuk elő abból a célból, hogy a kívánt stabilitási jellemzőket pontosan tudjuk modulálni. A mutáns enzimek stabilitását finoman beszabályozhatjuk a megfelelő mutánsok kombinálásával.

Az enzim mindenféle stabilitási formája megváltoztatható, ilyenek a következők például: hőmérséklettel szembeni stabilitás, a pH stabilitása, a keverés folyamán

- 9 kifejtett stabilitás vagy a kémiai v'egyűletek - mint a szubsztrátúrnak, sók, inhibitorok, stb, - jelenlétében mutatott stabilitás,

A megváltoztatott enzimatikus tulajdonságokkal rendelkező «-amiláz mutánsok szerkesztésére már eddig is használták a kódoló gén mutagenezisének vagy a kódoló gének fúziójának a technikáját. Egy legújabb szabadalmi leírás (EP 0208491) módszert ismertet bakteriális ec-amiláz hibrid enzimek szerkesztésére, amikoris megvalósították a B, lichenif ormis-ból és a B. stea rőt he rmophilusból származó «-amiláz gének fúzióját, N,A. Smirnova és mtsai CBiological Abstracts, 87, 7, szám (1989), 70127 és 70128 számú kivonat] olyan B, amyloliquefaciens ««amiláz mutánsokat szerkesztettek, amelyek laboratóriumi vizsgálati feltételek mellett csökkent hőstabilitást mutattak. Ezek a vizsgálati körülmények meglehetősen különböznek a sütési feltételektől, ahol a pH inkább alacsony (pH a 5 - 5,5) mig a keményítő tartalom és a viszkozitás nagyon magas. Mint a referencia példa mutatja, nem mindegyik mutáns «-amiláz, amelyeknek laboratóriumi vizsgálati körülmények között csökkentett a hőstabilitása, mutat a sütés körülményei között optimális hőstabilitást, A jelen találmány eljárást ismertet olyan mutáns enzim előállítására, amely a kívánt stabilitást fejti ki az ipari alkalmazás körülményei között. Az eljárást mutáns sütőipari enzimek előállításával szemléltetjük. Az eljárás a kenyérkészitésben használt legmegfelelőbb mutáns ····

- 10 kiválasztására irányul. Sütőipari enzimek alatt olyan enzimeket értünk, amelyek a kenyértészta készítésénél jönnek számításba, illetve amelyeket erre a célra alkalmazunk.

Mutáns enzim alatt egy olyan enzimet értünk, amelynek egy vagy több aminosava a vad tipusu enzim aminosavaitól különbözik, A mutáns enzimet kódoló gén DNS szekvenciájának legalább egy, előnyösen 1-10 csoportja különbözik a vad tipusu génben lévőkhöz hasonlítva. A mutáns enzimet mikrobiális fermentációs eljárással termeljük, ami után az enzim izolálható és tisztiható. A találmány szerinti mutáns enzim a kívánt stabilitást mutatja az ipari alkalmazás körülményei között és további kémiai módositás nélkül használható. Mutáns enzim lehet például egy olyan «-amiláz, amely csökkent hőstabilitást mutat a sütés körülményei között, Más sütőipari enzimek, amelyeknek amilolitikus , hemicellulolitikus, proteolitikus, lipolitikus vagy oxidoreduktáz hatásuk van, szintén használhatók a sütőipari termékek minőségének a javítására [lásd például az AIB Technical Bulletin-ben megjelent összefoglalást, II. kötet, 10, 11, 12 (1980)1. A rendelkezésre álló enzimek tulajdonságai, mint a hőstabilitás, pH optimum, szubsztrátum specifitás, aktivitás, stb. nem mindig optimálisak sütőipari enzimek gyanánt való alkalmazáshoz. A találmány egy olyan eljárást ismertet, amely optimalizálja a meglévő enzimek tulajdonságait s igy ezek az enzimek alkalmasabbá válnak a kenyérgyártásban • ·

- 11 való felhasználásra. Protein technológiával olyan enzimeket szerkeszthetünk, amelyek a kenyérkészités folyamatának egy fázisában a legnagyobb aktivitást fejtik ki. A találmány egyik megvalósitási formája szerint olyan «-amilázt állítunk elő, amelynek pontosan optimális a hőstabilitása, s ez azt jelenti, hogy az «-amiláz leginkább a kenyérkészités sütési fázisa folyamán fejti ki hatását, és nem ezután. A rendelkezésre álló sütőipari enzimek protein technológia alkalmazásával való javításának egymásik példája, hogy mutáns proteiolitikus enzimet állitunk elő, amely a kenyérkészités keverési fázisa alatt inaktiválódik, s igy mint keverési idő csökkentő működik, azaz csak a keverés alatt hatásos.

A módosított «-amiláz aminosav szekvenciájának legalább egy kiválasztott aminosava különbözik a vad tipusu enzimétől. A fent említett mutációkat a Bacillus amyloliquefaciens «-amilázánál végeztük el, .mint ezt a későbbiek folyamán leírjuk. Ilyen például az a bakteriális «-amiláz, amelynek az aminosav-szekvenciájában legalább egy aminosav különbözik a B. liquefaciens eredetű vad tipusu enzim 113«,

114., 116., 123., 163,, 164., 166., 238., 316., 322., 345.,

349., 356., 386., 394. vagy 398. számú aminosaxá tói, vagy egy homológ «-amiláz homológ pozicióiban lévő aminosavtól. Előnyösen alkalmazható az az «-amiláz, amelyben a 123. aminosavnál van mutáció. A gyakorlott szakemberek tudják, hogy alkalmas enzimekhez juthatnak akkor is, ha egy olyan amino- savat mutagenizálnak, amely az aminosav szekvencia más részén található.

A találmány egy másik szempontja szerint a módosított öc-amiláz aminosav szekvenciáját legalább két aminosavnál módosítjuk. Ez olyan enzimet eredményezhet, amely erősebben csökkentett stabilitást fejt ki, mint ami az egyes mutációk összegezésével érhető el. így olyan cc-amiláz mutáns készíthető, amelynek optimális a stabilitása.

Módosított K-amiláz termeléséhez alkalmas gazdafejtek a következők: E. coli, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis és Bacillus amyloliquefaciens. Előnyös, ha a gén a gazdasejtbe integrálódik.

A módosított ce-amiláz jobb tulajdonságokat mutat ipari alkalmazás folyamán, például a kenyérgyártásban. Egy mutáns ee-amilézzal kapcsolatos előiratban használt jobb tulajdonságok kifejezés alatt a sütés folyamán a megfelelő vad tipusu enzimhez viszonyított 'csökkent hőstabilitást értjük.

A találmány szerint egy mutáns enzim megtervezhető a vad tipusu enzim szerkezetének gondos tanulmányozására alapozva, kombinálva az eredeti enzim stabilitásának gondos biokémiai vizsgálatával, például a bakteriális ec-amiláz hőstabilitásának a vizsgálatával a sütés körülményei között, s e vizsgálatokat a vad tipusu génszekvencia ésszerű módosítása követi. A megtervezett mutánsok vizsgálata az ipari alkalmazás körülményei között optimális tulajdonságokkal rendelkező mutánsok azonosítását eredményezi·

A találmány szerint a felhasználás során - például a sütésnél - csökkent hőstabilitást mutató mutáns cc-amiláz felhasználható tészta vagy a kenyér (vagy rokon termékek) gyártásának folyamatában· Rokon termékek alatt olyan termékeket értünk, amelyek viz és őrölt gabonaliszt keverékéből álló tészta vagy kenyértészta sütése révén keletkezik.

Anyagok és módszerek

1. Általános klónozó technikák

A következő kézikönyvekben ismertetett klónozó technikákat használtuk: T. Maniatis és mtsai, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory (1982)j F.M.Ausubel és mtsai, Current Protocols in Molecular Biology, Oohn Wiley and Sond Inc., New York (1987)j B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, 2, kiadás, Oohn Wiley & Sons Inc·, New York (1988). Ezek a kézikönyvek részletesen leírják a rekombináns DNS molekulák szerkesztésének és szaporításának a technológiáját, a géntárak készítésére szolgáló eljárásokat, valamint a DNS szekvenálás és mutagenizálás technikáit és a DNS molekulák enzimes kezelésének módszereit·

2, Kémiai mutagenezis

A klónozott DNS-t kémiai anyagokkal kezelhetjük in vitro abból a célból, hogy a DNS-be mutációkat vi-

gyünk be. Ha e mutációk aminosavat kódoló triplát kodonokra irányulnak, a mutáns klónozott DNS egy mutáns proteint termelhet, A nátrium-biszulfit segítségével végzett kémiai mutagenezis módszerét Shortle és Botstein irta le EMethods Enzymol, , 100, 457 (1983)], Előnyős módszert ismertetett Főik és Hofstetter ECell, 33, 585 (1983)]. Más módszereket ismertetett Smith [Ann, Rév, Génét, , 19. 423 (1985)], Különösen hasznos technológiát ismertetettek Ausubel és mtsai (lásd fentebb és a 8, fejezetet),

3, Hézagos-duplex DNS-en végzett mutagenezis

Az eljárás a hézagos-duplex (gapped-duplex) technikán [Kramer és mtsai, Nucl, Acids Rés, , 12, 9441 (1984)] és egy fazmid (plazmid/fág hibrid = plasmid/phage hybrid) használatán alapul, A módszer lényegében egy hézagos-duplex DNS köztiterméken nyugszik, amely egy vad tipnsu antibiotikum rezisztencia markert és egy templát szálat (+ szál) tartalmazó hézagos szálból (- szál) áll. A + szál amber mutációt tartalmaz az antibiotikum elleni rezisztenciáért felelős génben, [Az UAG nonszensz kodont hordozó mutánsokat és szuppresszorokat illetik amber jelzővel» az amber mutáns terminátor hatású UAG kodonnal rendelkezik]. Egymáshoz illesztés után a mutagén oligonukleotid beépül a hézagos szálba az in vitro hézag-kitöltő és a lezáró reakció folyamán, A kapott molekulákkal egy olyan téves párosodás javításra (mismatch repair) nem képes gazdasejtet (Műt S) • ·

- 15 transzformálunk, amelyben megmaradt a kötés a kívánt mutáció és az antibiotikum rezisztencia markor között. A törzsből izolált kevert fazmid populációt ezután egy szuppresszor negativ gazda törzsben szétválasztjuk, A transzformált sejteket lemezre visszük, antibiotikumot tartalmazó táptalajra, s így késztetjük szelekcióra a hézagos szál eredetű szaporulatot.

A pMa/c5-8 iker vektor rendszer, amelyet P, Stanssens és mtsai ismertettek [Protein Engineering and Site-directed Mutagenesis, 24, Harden konferencia, 1985; Programmá and Abstracts, A.R.Fersht és G.Winter szerk.l , a következő elemekből áll:

- 105 póz, fd bakteriofág, terminátor 121- 215 póz, fd bakteriofág, terminátor 221- 307 póz. pBR322 plazmid (2069-2153 póz.) 313- 768 póz. fi bakteriofág, replikációs origó (5482-5943 póz.)

772- 2571 póz. pBR322 plazmid, replikációs origó és fi-laktamáz gén

2572-2685 póz, Tn903 transzpozon

2719-2772 póz, triptofán terminátor (kettős) 2773-3729 póz, Tn9 transzpozon, kloramfenikol-acetil-transzferáz gén

3730-3803 póz. sokszoros klónozó hely.

- 16 A szekvenciát a szakirodalom közölte: Stanssens és mtsai, EMBO-course, Martinarled (1987); Stenssens és mtsai, Nucl. Acids Rés·, 17, 4441-4454 (1989)·

A pMa tipusu vektorban a 3409-es nukleotid G-ről A-ra cserélődik, mig a pMc vektorban a 2238-as nukleotid G-ről C-re változik, s Így amber stop kodonok képződnek az acetiltranszferáz génben, illetve a β-laktamáz génben, ami a géneket inaktívvá változtatja.

Minden ismertetett szekvenciát a Genbank™ intézménytől (National Nucleic Acid Sequence Data Bank, NIH, USA) kaptunk. A pMc5-8 plazmidot letétbe helyeztük (DSM 4566)· A mutagenezis végrehajtása érdekében a cél DNS-fragmentumot beklónoztuk a pMa5-8 sokszoros klónozó helyére. Ezután egy hézagos-duplexet szerkesztettünk a cél DNS-t tartalmazó pMa5-8 és pMc5-8 között.

A cél DNS-ből álló hézagos egyszálu szekvenciát (single strand gap) vagy egy mutagén oligonukleotiddal vagy kevés tévesen beépült (misin.corporated) nukleotidot tartalmazó hosszú szintetikus oligonukleotidokkal vagy kémiai anyagokkal vagy nukleotid enzimetikusan előidézett téves beépülése révén mutagenizálhatjuk. A részletes leírást lásd Ausubel és mtsai (lásd fent) vagy Perbal (lásd fent) közleményeiben. Az in vitro mutagenezis alternatívájaként használhatunk in vivő mutagenezist vagy UV fény segítségével vagy kémiai anyagokkal vagy egy E.coli mutátor törzs alkalmazásával EFowler és mtsai, □. Bacteriol., 167, 130 (1986)3,

- 17 A mutagén oligonukleotidokat az Appliad Biosystemstői beszerezhető készülékkel szintetizálhatjuk.

4. Random mutaqenezis nukleotidok enzimatikus téves beépítésével

A pMa/pMc hézagos-duplex indító szekvencia meghosszabbítással (primer extenslon) és téves beépítéssel (misincorporation) mutagenizálható, Az alkalmazott eljárást eredetileg Shortle és mtsai (Proc, Natl. Acad. Sci. , 79, 1588-1592 (1982)], valamint Cunningham és Wells [Prot, Eng, , 319 (1987)1 Írták le. A reakciót a Lehtovaara és mtsai EProt. Eng., 2, 63 (1988)1 által leirt eljárás módosításával végezhetjük el előnyösen.

Ez az eljárás a polimerázok ellenőrzött használatán alapszik. Először négy DNS molekula populációt hozunk létre a pMa/pMc hézagos-duplex-ből az indító szekvencia hosszabbításával úgy, hogy ezek a hézagban találomra végződjenek, de mindig éppen egy ismert tipusu bázis előtt (az A, C, G, illetve T előtt). Ezután a négy populáció mindegyikét külön mutagenizáljuk a téves-beépités reakcióval (misincorporation reaction), amelyből most kihagyható a korrekt bázis, Ezzel a módszerrel a bázis szubsztituciós mutációk minden tipusát előidézhetjük a hézag minden pozíciójában· A Lehtovaara féle eljárást módosítva Sequenase -t (US Biochemical Corpocation, Cleveland, OH ) használtunk a Klenow polimeráz helyett és MoMuLV reverz transzkriptázt (BRL) az AMV reverz transz>»·· *

- 18 kriptáz helyett (MoMuLV = Moloney Murine Leukémia Vírus; AMV = Avian Myeloblastosis Vírus). Megfigyeltük, hogy nagyobb reverz transzkriptáz koncentrációk gyakran sokszoros egymásutáni mutációkat eredményeztek. Ez előnyösnek tekinthető labilis enzimek keletkezése szempontjából.

Másrészt, hogy az egy helyen végbemenő szubsztitúciókat biztosítsuk, Lehtovaara és mtsai (lásd fentebb) technikáját a következőképpen módosítottuk, A reverz transzkriptáz puffer nem három, hanem csak egy téves beépítésre szánt nukleotidot tartalmazott. Például az A-specificitásra korlátozott bázis hosszabbító keveréket három külön reakcióban, 250 /umol dCTP-vel, ill. 250 yumol dGTP-vel ill. 250 /mól dTTP-vel inkúbáltulf. A négy különböző bázis specifitásra korlátozott hosszabbító keverékekből álló teljes sorozathoz összesen 12 egyedi téves beépítésen alapuló reakció-sorozatot végzünk, A reakcióelegyeket 42 °C-on

1,5 órán át inkubáljuk, ezután mind a négy dezoxinukleotidból - 0,5 mmol koncentrációban - készítünk egy adagot és hozzáadjuk a reakcióelegyhez, amelyeket tovább inkubálunk legalább 20 percig 37 °C-on, A mintákat a továbbiakban Lehtovaara és mtsai (lásd fent) szerint dolgozzuk fel azzal a módosítással, hogy nem uracil-tartalmú DNS szálra végezzük az ellenszelekciót, hanem a pMa/c vektorra alapozzuk az ellenszelekciót.

5. Mutáns oamiláz izolálása

A pMaTBac plazmidot tartalmazó E.coli WK6 sejteket a megfelelő szelektiv anyaggal kiegészített BHI táptalajon tenyésztjük. Az egy éjszakás tenyészetből 10 ml-t lecentrifugálunk, és 1 ml 20 % szaccharóz és 1 mM EDTA tartalmú oldatban szuszpendáljuk. A sejteket 15 percig inkubáljuk 20 °C-on, és újra centrifugálunk. A sejt-üledéket ezután 1 ml vízben (MilliO HgO) reszuszpendáljuk, és 0 °C-on tartjuk 10 percig. A szferoblasztok centrifugálása után az oo-amilázt tartalmazó felüluszót 2 mM kalcium-klorid 0,7 mM magnézium-klorid és 2,5 mM nátrium-hidrogén-karbonát tartalomra állítjuk be. Amennyiben szükséges, az «-amilázt a szokásos biokémiai módszerekkel tisztíthatjuk,

6. «-amiláz aktivitás

Az «-amiláz aktivitásokat rutinszerűen a

TM

Pharmacia cég által gyártott Phadebas tablettákkal határozzuk meg. A módszer abból áll, hogy a színezékkel jelzett keményítőt az «-amiláz oldja - pH 5,5-ös pufferben 15 percig 30 °C-on - s az oldat színét spektrofotometriásán mérjük. Az cc-amíláz aktivitását Phadebas Egységekben (Phadebas Unit = PU) fejezzük ki. Belső standardként egy Aspergillus oryzae gomba eredetű 10.000 PU/g értékű «-amiláz készítményt használunk. Egy Phadebas egység - Így megállapítva - körülbelül 10 SKB egységgel egyenlő» az SKB egység a sütőiparban használatos.

7. Az «-amiláz hőlabilitásának vizsgálata felhasz- nálási (sütési) tesztben.

A kiválasztott «-amiláz mutánsok hőlabilitását cipó sütési tesztben vizsgáljuk. A kenyértészta 150 g-os adagjaiból cipókat sütünk. A tésztát úgy készítjük, hogy a következő anyagokat keverjük össze: 200 g liszt (100 %), 110 ml víz (55 %) , 3 mg aszkorbinsav (15 ppm), 1,4 g azonnal oldódó száraz élesztő (0,7 % Fermipan™), 4 g só (2 %), 3 g cukor (1,5 %), 1 g növényi zsiradék (shortehingj 0,5 %), 400 mg kalcium-klorid-dihidrát (0,2 %), 10 mg gomba eredetű «-amiláz P₂qq (2.250 SKB/kg liszt) és változó mennyiségű vad tipusu és bakteriális eredetű mutáns «-amiláz, A tészta bedagasztását dagasztó gépben, 52 ford./perc mellett, 6 perc 15 másodperc alatt végezzük, ezután a tésztát elosztjuk, 45 percen át 30 °C-on pihentetjük, átgyurjuk, újabb 25 percig pihentetjük, formázzuk, és sütőformába tesszük. Utoljára a tésztát 70 percig 30 °C-on utókeiesztjűk, majd sütőben 240 °C-on 20 percig sütjük, A cipó térfogatát repcemag kiszoritásos módszerrel határozzuk meg. Műanyag zacskókban 72 órán át szobahőmérsékleten tárolt cipók közepéből vett 2 szeletből származó kenyérbél lágyságának a meghatározásához a Stevens féle szerkezet analizátort (Stevens Texture Analyzer) használjuk. A kenyérbél rugalmassági értékét azzal az erővel (g) fejezzük ki, amennyi szükséges ahhoz, hogy egy 2 cm vastag kenyér-szeletet 5 mm-re (25 %) összenyomjon. A használt szonda átmérője 1,0 inch (2,54 cm) és a nyomás se21 bessége 0,5 mm/sec. A különböző bakteriális «-amiláz minták hőlabilitását annyi «-amiláz egység (PU) fejezi ki, amenyi szükséges ahhoz, hogy a kenyér tésztában optimális lágyító hatást érjünk el túlzott dextrin képződés nélkül (a rugalmassági értékek 20-30 %-os csökkenése).

8. Bakteriális «-amiláz mutánsok sütőipari teljesít- ményének kiértékelése

1. Cipó-térfogat javító hatás

A mutáns bakteriális «-amiláz cipó-térfogat javító hatását a fent leírt kis cipó alakú kenyér készítésénél határoztuk meg azzal a különbséggel, hogy a recepturából kihagytuk a kalcium-kloridot, a gomba eredetű «-amilázt és a növényi zsiradékot.

2. Kenyérbél lágyító hatás

Kenyértésztást készítünk a következő anyagokból: 3500 g liszt (100 %), 1960 ml viz (55 %), 87,5 g préselt élesztő (2,5 %), 52,5 g cukor (1,5 %), 70 g só (2 %), 210 mg gomba eredetű «-amiláz θ₂00 (²·⁷⁰⁰ SKB/kg liszt), 17,5 g növényi zsiradék (0,5 %), 105 mg aszkorbinsav (30 ppm),

94,5 mg cisztein (27,5 ppm) és változó mennyiségű vad tipusu vagy bakteriális eredetű mutáns κ-amiláz. Egy Kemper féle spirál keverőben (1-es sebességnél 350 fordulat, 2-es sebességnél 1200 fordulat) való bedagasztás után 900 g-os kenyértészta darabokat formázunk, amelyeket 35 percig 30 °C-on pihentetünk. A tésztát átgyurjuk, formázzuk.

sütőformába tesszük, 65 percig 34 °C-on utókelesztjük, és sütőben 30 percig sütjük 220 °C-on. A cipó térfogatát repcemag kiszoritásos módszerrel határozzuk meg. A kenyérbél nyulóságát egy fogyasztókból álló bizottság 4 kategóriába osztotta be:

: a kenyérbél nem nyúlós, nincs túlzott dextrin képződés i

0/+ ; a kenyérbél nem nyúlós, enyhén eldextrinasedett (optimális teljesítmény);

+ : a kenyérbél enyhén nyúlós, kissé tuldextrinesedettj +++ : a kenyérbél nagyon nyúlós, erősen eldextrinesedett,

A kenyérbél tömöttségének a méréséhez a cipó közepéből 2 db 2 cm vastagságú szeletet vizsgálunk a Stevens féle szerkezet analizátorral, 1,5 inch (3,81 cm) átmérőjű, 5 mm nyomás mélységű (25 %) és 0,5 mm/sec sebességű nyomással működő szonda használatával.

Minden ismertetett közlemény és szabadalmi bejelentés, amelyet e szabadalmi leírás referenciaként tartalmaz olyan, mintha minden egyes közleményt vagy szabadalmi bejelentést speciálisan és egyedileg lenne szükséges referenciaként alkalmazni.

Bár a találmányt az előzőekben bizonyos részletességgel ismertettük ábrák és példák segítségével a talál mány megvilágítása és megértése érdekében, mégis, a találmányból levonható tanulság fényében rögtön nyilvánvalóvá válik az ezen szakterületen általános gyakorlattal rendelkezők számára, hogy bizonyos változtatásokat és módosításokat végezhetnek anélkül, hogy a csatolt igénypontok szellemétől és oltalmi körétől eltérnének.

Az alábbi példák a találmány további magyarázatául szolgálnak, anélkül azonban, hogy korlátoznák a találmány oltalmi körét.

1, példa

A Bacillus amyloliquefaciens «-amiláz génjének molekuláris klónozása

A Bacillus amyloliquefaciens H2 törzsből, amely a Η IÁM Bacillus törzs egy származéka EHartley, Biochemistry, 7, 2401-2408 (1968)] kromoszómális DNS-t izolálunk. A DNS-t Bell restrikciós enzimmel emésztjük, és a pUN121 plazmid ENilson és mtsai, Nucl, Acids Rés. , 11 , 8019 (1983)] Bell helyére ligáljuk. Ez a plazmid ampicillin rezisztencia gént, tetraciklin rezisztencia gént és egy c1 represszor gént hordoz, A tetraciklin gén transzkripcióját a c1 represszor gén terméke gátolja. Ha a c1 represszor gén egyetlen Bell helyére idegen DNS-t építünk be, ez a tetraciklin rezisztencia aktiválódását eredményezi, mely a rekombináns sejtek pozitív szelekcióját segíti elő ampicillin/tetraciklin tartalmú agar lemezeken, A li.

gációs keverékkel E.coli HB1O1 sejteket (ATCC 33694) transzformálunk. Az ampicillin/tetraciklin rezisztens telepeket cc-amiláz termelésre teszteljük 0,4 g/1 Zulkowsky féle keményítővel (Merek) kiegészített LB-lemezeken (Ausubel, lásd fentebb). Tenyésztés és jód gőzzel való inkubálás után egy nagy üres udvarral körülvett pozitiv E.coli telepet választunk ki a további vizsgálatokhoz. Kimutattuk, hogy a pUNH2 összeillesztett plazmid egy olyan 5,5 kb Bcll-Bcll inszertumot tartalmaz, amely a B_acillus amyloliquefaciens H2 törzsből származik, A pUNH2-ből egy 2,2 kb BglII-BamHI fragmentumot izoláltunk Gene Clean (beszerezhető: BIO 101, La Oolla, LA, USA) segítségével és a pUC18 (Pharmacia) plazmid BamHI helyére ligáltuk. A kapott pUCAm4 plazmidot az 1. ábrán mutatjuk be, A pUCAm4 inszertumát Sanger módszerével CProc. Natl. Acad. Sci,, 74, 6463 (1977)] szekventáltuk. Megállapítottuk, hogy a DNS szekvencia egy 1542 bázisból álló nyilt leolvasási keret (2. ábra), amely 31 aminosavból álló szignál szekvenciát és 483 aminosavból álló érett proteint kódol. A protein szekvenciája azonos volt a Bacillus amyloliquefaciens ee-amiláz szekvenciával Takkinen és mtsai meghatározása szerint [Trakkinen és mtsai, □. Bioi. Chem. , 258, 1007 (1983)1.

• · * · a • « · · · ·· · · ···« · · ···· · · « ·· · * · ²t. ,P,él±a

A pMaTBac mutagenezis/expresszíós vektor szerkesztése

A pUCAm4 plazmidből származó 2,2 kb Smal-BamHI fragmentumot Gene Clean módszerrel tisztítjuk, A fragmentumot a Smal-BamHI-gyel emésztett pMc5-8-ba ligáljuk. A kapott pMcAm plazmiddal E.coli WK6 (CBS 473.88) sejteket transzformálunk [R, Zell és H.O.Fritz, EMBO , 6, 1809 (1987)]. M13K07 fággal való fertőzés után egyszálu pMcAm plazmidot izolálunk a szállító cég (Pharmacia) előírása szerint. A kétszálu pMa5-8 plazmidot Smal-gyel és BamHIgyel emésztjük és össze illesztjük az egyszálu pMcAm-mal, hogy hézagos duplexet (gapped duplex) kapjunk [Kramer és mtsai, Nucl, Acids Rés., 12, 9441 (1984)], A hézagos duplexen helyre irányuló mutagenezist végzünk (Kramer és mtsai, lásd ugyanitt és R.Zell és H.O.Fritz, lásd ugyanitt) egy oligonukleotíddal, amelyet úgy terveztünk, hogy bevezethessük egy Xbal helyre, a start kodonhoz viszonyított -18-as pozícióba. Az oligonukleotid szekvenciája:

5*- TTC CTC TCC CTC TAG ATT TCT TAT AC,

A sikeres mutagenezis után a plazmidot egy DAM E,coli törzsön (E.coli GM48, Phabagen, Utrecht, Hollandia) passzáljuk és ezután az EcoRI-Xbal fragmentumot részleges emésztéssel eltávolítjuk, majd egy tac promoter másolatot hordozó szintetikus EcoRI-Xbal frag- 26 mentummal szubsztituáljuk. Ennekja frag meritumnak a szekvenciáját a kapott pMaTBac plazmid (CBS 287.89) M-amilázt kódoló inszertumával együtt a 3. ábrán ábrázoljuk. Ez a plazmid idézi elő E.coliban az k-amiláz szintézisét az IPTG-vel indukálható tac promoter szabályozása alatt. Ezenkívül ennek a vektornak az inszertumát úgy mutagenizálhatjuk, hogy alkalmas hézagos-duplex molekulákat készítünk a pMa és pMc tipusu DNS molekulák között. Egyszálas DNS-t úgy kapunk az illető DNS molekulákhoz, hogy E.coli WK6 sejteket M13KC7 fággal fertőzünk a szállító cég (Pharmacia) előírása szerint.

3. példa

A pMaTBac biszulfitos mutagenezise

Az egyszálu pMaTBac-t összeillesztjük a Kpnl-Apal-gyel emésztett pMcTBac-vel, igy heteroduplexet állítunk elő olyan hézaggal, ami a 4915-ös pozíciótól az 5146-os pozícióig terjed (lásd a 3 A-C ábrát). Ezt a heteroduplexet biszulfitos módszerrel mutagenizáljuk (lásd a kísérleti részt). A heteroduplex-szel E.coli WK6 Műt S törzset (CBS 472.88) (R.Zoll és H.J. Fritz, lásd a már idézett közleményt) transzformálunk és a szelektálást kloramfenikolt (25 /ug/ml) tartalmazó agar lemezeken végezzük. Ezután plazmid poolokat izolálunk, amelyekkel E.coli WK6 sejteket transzformálunk. A kapott transzfor27

« « «

máit sejteket 2,0 mmol CaCl₂, 25/ug/ml kloramfenikol és

0,15 mmol IPTG (Sigma) tartalmú BHI táptalajon (Difco) tenyésztjük 24 órán át 37 °C-on, A felüluszó három mintáját 0, 7, illetve 14 percig 80 °C-on inkubáljuk, majd ezután cí-amiláz aktivitásra vizsgáljuk. A vizsgálatot úgy végezzük, hogy a mintákat (5-10/ul) 0,2 % keményítőt tartalmazó BHI lemezekre cseppentjük, a lemezeket 1 órán át 55 °C-on inkubáljuk és a lemezeket jód oldattal (3 g 3/1 és 7 g KO/1) színezzük. Azokat a telepeket választjuk ki, mint hőlabilis cc-amiláz mutánsokat, amelyek körül az udvar nagysága és intenzitása a vad tipusu telepekhez képest csökkent a 80 °C-os hosszas inkubáció eredményeképpen.

Az 1, táblázatban egy tipikus kísérletben kapott mutációs szekvenciákat mutatunk be, A DNS szekvenciákat a hézagos szakasz szekvenálásával határozzuk meg, miután a pMcTBac mutánsokból izoláltuk az egyszálu DNS-t, A mutáns pMcTBac plazmidokat BHI táptalajon tenyésztjük E,coli WK6 törzsben és az enzim készítményeket ozmo-shock módszerrel (Ausubel és mtsai, lásd fenti Anyagok és módszerek fejezet), a periplazmatikus cc-amiláz kiválasztódása révén állitjuk elő,

A 2. táblázat a mutáns ee-amilázok optimális adagolását és a sütési eredményeket foglalja össze.

Minthogy a cipó térfogata sütési kísérletenként különbözhetnek, minden összehasonlitást olyan kontroll enzim

- 28 *« · * · · · « 4 « ··· 4 ··· •44« · · ···· ·· ·4 t>·♦ készítményhez (WT) viszonyítottuk, amelyet minden külön kísérlet tartalmazott, A WT enzimet nem mutagenizált pMaTBac plazmid tartalmú E,coli WK6 törzs fermentálásával állítottuk elő.

1, táblázat

A biszulfitos mutagenizálás után kapott hőérzékeny oc-amiláz mutánsok

Mutáns	Aminosav (AS) száma	Kodon -ról	változás —-ra	AS -	AS
A8	394	CCG	TCG	Pro	Ser
	386	TAC	TAT	Tyr	Tyr
B10	345	CCG	TCG	Pro	Ser
E12	398	CCC	TCC	Pro	Ser
G2	385	CCG	CTG	Pro	Leu
3	349	GCC	GCT	Alá	Alá
	322	ACA	ATA	Thr	Ile
4	345	CCG	TCG	Pro	Ser
6	322	ACA	ATA	Thr	Ile
	316	CAT	TAT	His	Tyr
7	356	TCC	TTC	Ser	Phe

·· ·

2, táblázat

Sütési próbák biszulfitos mutáns ec-amilázokkal

Mutáns Optimális adagolás Cipó térfogat (PU/200 g liszt) (ml)

WT (eredeti törzs)	4,25	563
A8	14	574
B10	9	596
E12	14	577
G2	8,5	591
3	7,8	526
4	9,6	557
6	6,4	543
7	11 ,1	550

4. példa

A pMaTBac mutaqenizálása enzimatikus téves beépítéssel

Az egyszálu pMaTBac-t (lásd a 2, példát) és az EcoRV-KpnI-gyel emésztett pMcTBac-t egymáshoz illesztjük, miáltal egy olyan heteroduplexet kapunk, amelyben a hézag a 4018-as pozíciótól a 4915-ös pozícióig terjed (lásd a

3. ábrát). A hézagos duplexet az enzimatikus téves-beépités módszerével mutagenizáljuk, a kísérleti fejezetben leirt módon.

Egy mintát, amelyet A-val határolt inditó-szekvencia meghosszabbítás után kapunk, három részre hasítunk és reverz transzkriptáz jelenlétében dCTP-vel, dGTP-vel, illetve dTTP-vel inkubáljuk 37 °C-on 10 percig. Ezután mind a négy dNTP-ből, Klenow polimerázból és T4 DNS ligázból álló elegyet adunk a reakcióelegyhez, hogy a hosszabbitás befejeződjék és teljes kétszálu molekulákat kapjunk. Ezekkel a molekulákkal E.coli WK6 Műt S sejteket transzformálunk és plazmid poolokat izolálunk. A plazmid poolokkal E.coli WK6 sejteket transzformálunk és a telepeket kloramfenikol (25/ug/ml) tartalmú agar lemezeken szelektáljuk.

A kapott mutánsokat hőérzékeny oc-amilázra szűrjük a 3. példában leirt módon.

A 3, táblázatban egy tipikus kísérletben kapott néhány α-amiláz szekvenciáját mutatjuk be. A pMcTBac mutánsok egyszálu DNS-ének izolálása után meghatároztuk a DNS szekvenciákat a hézagos részek szekvenálásával.

A 4. táblázat a mutáns cc-amilázokat optimális adagolását és a sütési eredményeket foglalja össze.

3. táblázat

Mutáns	Aminosav (AS) száma	-ról	-ra	AS —>	AS
A-val	határolt
12	116	GTC	GAC	VAL	ASP
13	113	GTA	GGA	VAL	GLY
	114	ACT	ACC	THR	THR
	116	GTC	GCC	VAL	ALA
14	163	TGG	CGG	TRP	ARG
	164	GAT	GAG	ASP	GLU
	166	TCC	CCC	SER	PRO
17	238	TTT	CTT	PHE	LEU
25	116	GTC	GCC	VAL	ALA
26	116	GTC	GGC	VAL	GLY
29	113	GTA	GCA	VAL	ALA
	114	ACT	ACG	THR	THR
	116	GTC	GCC	VAL	ALA
T-vel	határolt
15	123	AGA	TGT	ARG	CYS

I (

4, táblázat

Sütési próba A-val vagy T-vel határolt hosszabbitás révén kapott «-amilázzal

Mutáns Optimális adagolás Cipó térfogat (PU/200 g liszt) (ml)

WT (eredeti törzs)	4,4	566
12	13,4	525
13	19,5	564
14	11	542
15	>100	560
17	4,25	545
25	5,4	558
26	12,5	561
29	14,6	558

···· · · ····

5. példa

A vad tipusu és a mutáns B. amyloliquefaciens eredetű «-amiláz összehasonlítása kenyérkészitésnél

Az 5. táblázat bemutatja a gomba eredetű, a vad tipusu bakteriális eredetű és a mutáns B. amyloliquefaciens eredetű 15-ös számú «-amiláz cipó térfogat javító hatását kis cipókon.

Az eredményekből úgy tűnik, hogy a maximális cipó térfogathoz szükséges «-amiláz egységek számértéke nagyon hasonló (^50 Pü/200 g liszt) a gomba eredetű, a vad tipusu B. tiquefaciens és a mutáns B. amyloliquefaciens eredetű 15-ös számú «-amiláznál. Ha a gomba vagy a mutáns 15-ös számú bakteriális eredetű κ-amilázt használjuk, a cipó térfogatban egy körülbelül 15 %-ös maximális növekedést kapunk anélkül, hogy ez a kenyérbél bármilyen túlzott eldextrinesedését okozná. Amikor azonban a B. amyloliquefaciens eredetű vad tipusu «-amilázt használjuk a cipó térfogat javítására, mégsem érünk el maximális cipó térfogatot anélkül, hogy ez ne okozna erős eldextrinesedést,

A 6. táblázatban a vad tipusu és a bakteriális 15-ös mutáns w-amiláz (Arg 123 -4 Cys 123) lágyító hatását hasonlítjuk össze olyan standard kenyérkészitési recepturát használva, amely 2.700 SKB gomba eredetű «-amilázt tartalmaz 1 kg lisztre számítva.

A 6. táblázatból kitűnik, hogy a vad tipusu bakteriális cc-amiláz nagyon hatékony kenyérbél lágyító hatású. Már 3,9 - 13 Pu/kg liszt közötti adagolásoknál optimális lágyító hatást kapunk. Azonban a kenyérbél súlyos eldextrinesedése figyelhető meg már kissé magasabb, 39 PU/kg liszt adagolásnál. Egy sokkal magasabb, körülbelül 74 PU/kg liszt adagolás szükséges a mutáns enzimből, hogy optimális kenyérbél lágyító hatást kapjunk és 740 PU/kg adható még mielőtt a kenyérbél enyhe eldextrinesedése lenne észrevehető. Tehát a túlzott dextrin képződés veszélye jelentősen csökken, ha a 15-ös mutánst használjuk a vad tipusu B, amyloliquefaciens oc-amiláz helyett, kenyérbél lágyító gyanánt,

A 15-ös számú bakteriális mutáns cc-amiláz csökkent hőstabilitása a kenyérbélben maradt amiláz aktivitásból szintén megállapítható. Amíg a vad tipusu bakteriális cc-amiláz jócskán túléli a sütési folyamatot (50-75 %-os maradék aktivitás), nem lehetett maradék cc-amiláz aktivitást kimutatni olyan kenyérben, amely a 15-ös számú bakteriális mutáns cc-amilázt tartalmazó tésztából készült.

Γ-. 36

táblázat «

in c © x in ·© P •Η

N •Φ -X

U ·© > c

Φ -X ra ra » ·©

Ti r-l

C o

®.

KJ X © N ©

W :O © .

s:

O. Ti P

X © C·© •Hu USQ •P N X cl ©·© Q Jí

I r-i u ε ·© P

P Ό «3 Q- CT •Η O O«P

P

N © ri. r-i

CT •©O HO o w cnx .«>□ U 0.

< ·“*

4-	+	4-	+
X	4·	4-	X
0 0 0 0 0 0 4-	4-	4- O	o o o

IO

ί-

o

o

O

IO

O

o

o

o

o

O

o

•4·

α»

r-i

r4

r-i

CO

r4

H

m

Ό

r4

r-i

•4*

in

in

m

<4·

V

in

in

•4<

in

in

in

N	in	o	o	<4* O	o	o tn	CO	04	o
O 04	•4·	c\	co	rd	•4·	o	c—{	in	co
			r4			r-i			rd

N ·© -I Ti ε .

© i a ·.

>						w	U)	©	©
c						c	c	c	c
OJ						©	©	©	©
						•rd	•rd	•rd	•ri
•ffi		r-i U)	W	U)	in	u	ü	υ	ü
z		=3 £	c	c	c	©	©	©	©
	©	©	©	©	<P	<P
	rd -rd	•rd	•rd	•rd	©	©	©	©
	•Φ o	ü	0	υ	g	g	g	P
	c ©	©	©	©	b	b	b	CT
	<P	<P			•rd	•rd	•rd	•H
	© ©	©	©	©	rd	rd	rd	rd
	•ra 5	g	p	g	0	o	o	0
	r-i Ö	b	5	b	r—1	rd	rd	rd
	Ο -H	•rd	•rd	•rd	>			>1
	CT <-H	rd	rd	r-d	g	g	g	g
	© 0	0	0	0	©	ro	©	©
	“□ r-(	i—(	rd	rd
	ra .. >	>		>	•	•	•	•
	g	g	g	g	«1 PQ( CQ
©	N · ©	©	©	©	,<o <n m m
	•ra				c	c	c	c
© Ό	H ffl’l ®l »| ®| p 2 *2
©	ε				. ±	3	S	3
L	ra □	3	. 3	3	ε	ε	ε	ε
©	« OT	m	©	©	' · 1	»· * ·
	5 x _ j 3	□	3	3	is	N h	N
ε	-U C3 (0 (0 (Ö Q	Q	Q	Q	© ©	©	• ©
Ti	E J3 D D Ό .H	•rí	•H	Ti
N	ο ε ε ε ε p	P	P		© © © ©
C	CT o o o o				:O	:O	:Q	:O
Ili	CT CT CT CT xj	u	XJ	TJ		1	1	1
	©	©	©	<c	in	in	in	in
	>	>	>	>	V*	T“	τ-	V

CT © ε © P r-i Φ P T<

CT •CO ©

P	·«
P
o
N		c
•ri		·©
		ε
		P
•ri		•ri
•O		m
P		©
N		•rí
©		r-l
ra		©
X		P
CT
O		©
H-		tí
		r—i
P		•ra
P		ε		*
O		T<		m
r—i		P	*·	•ra
U		CL	P	Ί3
o		O	P	ϊΟ
-X			©	N
ra	·*		u	Q.
x	©	P	©	•ra
CT	·©	P	n
	u	©	©
X	©	u	c	c
CT	©	©	•ri	•H
©	©	©	U	l.
	c	©	P	P
P	•ri	c	X	X
•ri	U	tí	©	©
ra	P	U	u	Ό
CT	X	P	r-i
•KJ	©	X	©	P
n	Ό	©		P
c	r—i	σ	•ra	O
o	©		©	N
u		c	©	r-i
•n	©	·©	TÍ	3
ra	υ	X	-X	P
r-i	c	>·
3	Ti	c		*
P	c	©	©	©
			Ό	Ό
r-i	*		r-i	r-l
·©	©	»	3	3
X	-o	Ό	X	X
u	r-i	r-l	c	c
•ra	3	3
>	>		c	c
c	C	C	•ra	©
©			X	©
	ε	ε	>	Ό
	©	©	c	u
<	c	c	©	©
		··		« ·
		+		+
	• ·	X	« ·	+
	o	o	+	4-

··· · «« · »· ♦ · *« · · ♦· «· « · ·

- 37 táblázat

c 0) XJ m ·© p •rí N <n ·© 3£ u JÖ X

•Λ Doxtrinképződés

0

0

+ X O

+

+ + +

0

+ X 0

+ X 0

+ X 0

+

• O

C

1

©

®

**“X

E

t ct

u<—·

Φ

©

Ό

P

x©

aj

c ct

·©

0)

. © o

±4

«©

3Í CJ

•H

4·*

p

σ>

H

« p

0

0

O

0

0

0

0

0

0

0

xo

H

*<QO

r4

0

lű

M*

co

0

CJ

0

CD

C

u ε

in

in

n<

J·

CJ

in

J*

·*

n·

M·

4-»

o

•o o

4-»

©

P

0

X

(ü

CJ

N

c

X

|S <—{

•rl

*©

©

ffl

X3

ε

N

<-Q

P

«

•H

•rl

CD

Ό

©

:©

©

P

N

Ό

N

<0

CD

l-J

*C0

CT

©

©

r4 •H

o

0

0

0

O

O

0

0

0

0

O

P

g

L**

io

rH

CJ

O

σι

lű

CJ

0

O

.0

(0

«ejd

03

co

σι

cn

O

co

CO

σι

σι

σι

0

CD

1

íJs,

cn

ΓΊ

cn

ΓΊ

Ί*

cn

cn

cn

cn

cn

<+-

•H rH

ö

P

*©

Ό

P

ε

©

a.

0

•rt

CD

•H

•rl

P

·©

rH

o

L.

IX

P

TJ

xo

O

0

P

SO

x-x

©

N

•-S

©

·*

Ό

a.

©

>

©

P

©

·©

4->

N

CT

·©

P

n

<0 <0

TJ

©

©

<0

© Ή

>

©

T3

c

c

X

rH r4

cn

σι

o

cn

CT

©

©

•rt

•H

0

•

•

•

•

•

©

©

©

L

co

CTCT

0

c—í

cn

cn

σι

>

CJ

cn

CJ

c

©

P

4-»

c

αχ

H

cn

CJ

CJ

n·

P

•d

c

X

X

so

gx

CJ

•H

u

•H

©

0

V

< ö

©

P

U

Ό

·©

Π

P«

CT

X

4-»

rH

ε

X5

©

X

©

P

©

©

©

©

©

·©

©

P

©

c

c

c

c

- C

r-4

Ό

•Φ

0

K0

OJ

KO

*©

O

©

©

N

p

fJ

U

P

TJ

c

©

rH

*3

z—s

3

O

3

3

3

•m

©

*©

•H

3

0)

r-4

E

c

,E

E

E

©

0

x:

P

X3

:3

·©

<—1

c

X

CL.

z

ω

0)

©

n

©

p

©

©

©

3

•H

c

*

*

•H

rH

3

3

□

2

•H

3

•d

t-I

•H

P

c

©

©

©

&

SD

Q.

0.

Q.

Q.

r-|

E

rH

tH

r-1

*0

0

c

•H

•H

•rt

Ή

*©

OJ

KO

K0

rH

H

rH

Ό

• 4-<

P

P

P

•rf

©

•d

•d

•d

O

©

©

3

3

Cd

Oi

u

Ή

t_

L.

L

XJ

Ό

Ό

X

X

>

OJ

TJ

a

Ό

u

©

r4

©

©

©

L.

r-H

r-J

c

c

r-í

aj

©

©

©

4J

·©

P

*©

3

3

<

0

0

>

>

>

>

rt

-X

Oí

JZ

X

X

X

c

c

P

CT

©

t_

©

©

©

c

c

c

©

©

©'

©

©

©

©

XJ

©

XJ

X)

XJ

©

x:

©

Ί3

*a

•H

•rl

•rt

•rl

P

3£

g

E

X

0

©

aj

rH

rH

r*H

rH

•

•

•

•

©

©

c

u

U

OJ

<0

*©

·©

N

©

N

N

N

<

c

C

©

©

©

N

•H

•H

•rl

©

X>

©

©

©

OJ

i U

t_

U

L

e

r-4

i ®

©

©

©

©

10

©

©

©

•H

•H

4J

P

4-»

P

:O

:O

•O

:O

:O

+

4-

NI

6

.X

-X

1

1

t

1

1

• ·

X

e ·

C

©

: aj

©

©

©

in

in

in

in

in

<K

0

0

+

4-

111

0

CD

aj

m

co

v·

r·

t—

6, példa

Az cc-amílázok hőlabilitásának modulálása különböző egyedi mutációk kombinálásával A 3, és 4, példában leirt számos mutánsról megállapítást nyert, hogy túl nagy stabilitást mutatnak a kenyér készítésben való optimális felhasználhatóságuk szempontjából, Amióta az egyes mutáns cc-amilázok egyedi aminosav szubsztitúciói ismertek, meg tudunk tervezni a kenyér készítéshez egy optimális stabilitásu/labilitásu mutánst oly módon, hogy az egyedi aminosav szubsztitúciókat kombináljuk, Ezt úgy valósíthatjuk meg, hogy a mutált pMaTBac megfelelő restrikciós fragmentumait kicseréljük vagy hogy a tervezett aminosav szubsztitúciót helyre irányuló mutaenezissel vezetjük be (3, fejezet. Anyagok és módszerek), A 7, táblázat számos kombinációt mutat be, A kombinációs mutánsok stabilitási vizsgálatát úgy végezzük, hogy a felülúszó mintákat 10 percig 75 °C-on inkubáljuk, majd a fennmaradó cc-amiláz aktivitást BHI keményítős lemezek használatával, 1 órán át tartó 55 °C-on való inkubálással teszteljük (lásd a 3. példát),

A nem hevített WT és mutáns cc-amiláz megfelelő hígításainak összehasonlításával határoztuk meg a fennmaradó aktivitás százalékát (4, ábra). Az ábrán látható, hogy az összes kombinációs mutáns sokkal hőlabilisabb volt, mint a megfelelő szülő mutánsok, A hőlabilitás finom beállitá tását tehát úgy oldhatjuk meg, hogy a megfelelő egy-hely mutánsokat kombináljuk.

7. táblázat

Kombinációs mutánsok

Mutáns A mutánsok kombi- Aminosavak nálása

34	E12	+	12 ·	P398S V116D
35	E12	+	13	P398S V113G/V116A
36	E12	+	14	P398S T163R/D164E/S166P
37	E12	+	26	P398S V116G
38	7	+	12	S356F V116D
39	7	+	13	S356F V113G/V116A
40	7	+	14	S356F T163R/D164E/S166P
41	7	+	26	S356F V116G
)	ezeknek az	«-amiláz	mutánsoknak a kifejeződése nagy-
	mértékben i	csökkent	volt,	feltehetően az instabilitás

vagy a proteáz érzékenység miatt.

7. példa

Hőlabilitás modulálása a kiválasztott pozíciókban szubsztituált különböző aminosavakkal

A 3« és 4. példában alkalmazott eljárásokkal olyan csoportok pozícióit azonosítottuk, amelyek az «-amiláz stabilitása/labilitása szempontjából fontosak. Azonban a mutagenezises eljárás speciális természetéből kifolyólag csak korlátozott számú szubsztitúció várható bizonyos pozíciókban. Annak érdekében, hogy a mutációk és a megfelelő stabilitási/labilitási jellemzők tartományát kiszélesítsük, lehetőségűnk van egy olyan csoport szubsztituálására , amelyről megállapítottuk, hogy fontos a stabilitás/labilitás szempontjából. Ez a megállapítás minden lehető természetes aminosavra nézve vonatkozik. A szubsztitúciót helyre irányuló mutagenezissel érhetjük el egy oligonukleotid és a négy lehetséges nukleotid keverékének a használatával az illető kodonnál (lásd a 3, fejezetet: Anyagok és módszerek). Tehát oligonukleotid keveréket használunk abból a célból, hogy több olyan különböző «-amilázt kapjunk, amelyekben a 123-as csoport mutáns. Az oligonukleotid szekvenciája;

CGAAGTTTCCTGATTgNNATTGGCCGGATTGAC

Az N a négy lehetséges nukleotid valamelyikét jelenti (8. táblázat).

A 6, példában leirt módszerrel meghatároztuk a megmaradt aktivitás százalékát (5, ábra). Látható, hogy minden vizsgált 123-as pozícióban mutáns enzim a vad tipusu enzimhez (R123) képest kevésbé stabil. Ezenkívül egyértelmű, hogy ha a 123-as pozícióban különböznek az aminosavak, ez különböző hőlabilitási viselkedéshez vezet. Tehát a 3, és 4, példa szerinti módszerrel kiválasztott pozíciókban végzett random mutagenezis egy kívánt stabilitási/labilitási viselkedést mutató mutáns ec-amiláz kiválasztására vagy megtervezésére használható,

8, táblázat

Random mutagenezis azonos pozícióban lévő csoportnál

Mutáns Aminosav szubsztitúció

R123C

R123H

R122V

R123L

R123A

R123P

R123D

8. példa

A kromoszómáiis vad tipusu «-amiláz gén cseréje mutáns génre

Mutáns «-amiláz előállításához választhatjuk az expressziós gazdasejtben való újra klónozás módszerét. Az előnyös gazdasejt a szóbanforgó «-amilázt előállító mikroorganizmus. Azonban használat előtt az endogén «-amiláz gént inaktiválni vagy törölni kell. Ebben a példában a B, amyloliquefaciens «-amiláz génjének delécióját ismertetjük. Ezt követően a mutáns «-amiláz gént a gént hordozó plazmidból (például: pUBnO) vagy a gén kromoszómálisan integrált másolatából fejezhetjük ki. Ez utóbbi termelési célokra előnyösebb, mivel a gazdasejt nem tartalmaz heterológ DNS-t.

A B. amyloliquefaciens kromoszómális «-amilázának inaktiválását úgy érjük el, hogy a génbe beviszünk egy olyan plazmidot (a pE194 eredetű pE194neo), amely egy hőérzékeny replikációs origót tartalmaz, A kromoszómálisan integrált gén szelekcióját úgy érjük el, hogy az illető antibitikum jelenlétében megnöveljük a hőmérsékletet, s igy a plazmid replikációja szempontjából nonpermissziv körülményeket teremtünk. A plazmid egy olyan «-amiláz gén másolatot tartalmaz, amelynek·^ középső része deletált (lásd a 6. ábrát). Rekombináció mindkét határoló szekvenciánál létrejöhet. Ha a két különböző határoló szekvenciánál • · • · · *

- 43 rekombináció.révén beépülés és kimetszés történik, csak ez eredményezi az «-amiláz gén végleges elvesztését. Ezeket a potenciális integráns sejteket 37 °C-on neomicin nélkül tenyésztjük, hogy stimuláljuk a kiejtő rekombinációt (outrecombination) és a plazmid kijavítását. Három «-amiláz negatív kiónt kaptunk, s az egyiket behatóan analizáltuk kromoszóma térképezéssel. A 6. ábrán a kromoszómális integráció és a kimatszés látható. Ilyen módon egy «-amiláz negatív B.amyloliquefaciens törzset kaptunk, a neve BAM112, Ez a törzs egy 735 bp deléciót tartalmaz a belső amiláz génben EcoRV-től HindlII-ig,

A BAM112 «-amiláz negativ törzset használí juk ezután a mutáns «-amilázok termelésére. A 15-ös mutáns (R123C) kódoló DNS-ét először beklónozzuk a pE194neo plazmid ba és ezzel transz formáljuk a BAM112 törzset protoplaszt transzformáció (Chang és Cohen, Molecular and Generál Genetics, 168, 111-115 (1979)]segítségével. A mutáns w-amiláz gén (R123C) kromoszómába való beépülését 50 °C-on 20 ^ug/ml neomicin mellett végzett szelektálás után értük el. Számos integránst izoláltunk és miután megtörtént a rekombináció mindkét oldalon a szomszédos szekvenciáknál, akkor vált lehetségessé, hogy az R123C «-amiláz gén beépülésére nézve szelektáljunk. A 6. ábrán látottakhoz hasonló módon értük el a plazmid kihasitását a kromoszómából, amikoris egy «-amiláz pozitív, neomicin érzékeny kiónt szelektáltunk, A kiónt - neve: BAM115 - kromoszóma térképezéssel analizáltuk.

Λ

9, példa (Referenc példa)

A TS141 és TS191 B.amyloliquefaciens cc-amiláz mutánsokat [N.A.Smirnova és mtsai, Bioi. Abstr, , 87, 7.

szám (1989); kivonatok száma: 70127 és 701281 mind laboratóriumi, mind felhasználási körülmények között vizsgáltuk, Ezeknek a mutánsoknak a csökkent hőstabilitását a 3, példában leirt lemez teszt használatával minősítettük. Amikor összehasonlítottuk a TS141-es mutáns és a vad tipusu enzim aktivátását pH=5,5 és 6,5 mellett 1Phadebas módszerrel, úgy tűnt, hogy a TS141 cc-amiláz mutáns normál aktivitást mutatott pH=6,5-ön, de majdnem teljesen elvesztette az aktivitását pH=5,5 mellett. Emiatt a TS141 (Asp¹⁴¹ —Asn¹⁴¹) mutáns cc-amiláz nem alkalmas sütőipari felhasználásra.

A TS191 (Glu¹⁹¹ —> Lys¹⁹¹) mutáns cc-amiláz hőstabilitását a kenyérkészitésben abból ítéltük meg, hogy mennyit szükséges belőle adagolni optimális kenyérbél lágyító hatás eléréséhez. Úgy tűnt, hogy e mutáns enzim hőstabilitása a felhasználás körülményei között nagyon hasonlított a vad tipusu enzim hőstabilitásához· Ennélfogva ez a mutáns nem jelent használható fenotipust.

Claims (25)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Mutáns enzim azzal jellemezve , hogy mikrobiális fermentációs eljárás terméke és hogy csökkent stabilitást fejt ki az ipari felhasználás körülményei között a megfelelő vad tipusu enzimhez viszonyítva.
2. 2. Mutáns enzim azzal jellemezve, hogy a vad tipusu enzim egy vagy több kiválasztott mutációja révén állítjuk elő és hogy a kívánt csökkent stabilitást fejti ki az ipari felhasználás körülményei között.
3. 3. Az 1. és 2. igénypont szerinti mutáns enzim azzal jellemezve, hogy sütési körülmények között a kenyér minőségét javitó tulajdonságokkal rendelkezik.
4. 4. Az 1. és 2. igénypont szerinti mutáns enzim azzal jellemezve, hogy egy sütőipari enzim, előnyösen bakteriális «-amiláz.
5. 5. Az 1. és 2. igénypont szerinti mutáns azzal jellemezve, hogy egy olyan bakteriális «-amiláz, amely csökkent hőstabilitást fejt ki a sütés körülményei között a megfelelő vad tipusu enzimhez viszonyítva.
6. 6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti módosított enzim azzal jellemezve, hogy az említett módosított enzimet kódoló gén expressziója révén kapjuk meg és hogy e módosított enzim aminosav szekvenciájában 1-10 aminosav a vad tipusu enzim aminosavaitól különbözik.

   • · «· ··· · * ·· 4»*·· ·«·*·· ·

   J 46 -
7. 7, Az 5, igénypont szerinti módosított bakteriális K-amiláz azzal jellemezve, hogy aminosav szekvenciájában a vad tipusu enzim Arg123 aminosavát Cys123-ra cseréljük ki.
8. 8. Az 5, igénypont szerinti módosított bakteriális ec-amiláz azzal jellemezve, hogy aminosav szekvenciájának legalább egy aminosava különbözik a B.amyloliquefaciens eredetű vad tipusu enzim 113, 114, 116, 123, 163, 164, 166, 238, 316, 322, 345, 349, 356, 386, 394 és 398-as számú aminosavától vagy egy homológ ee-amilázban lévő homológ pozíciójú aminosavaktól.
9. 9. A 7. vagy 8.igénypont szerinti módosított bakteriális tsc-amiláz azzal jellemezve, hogy egy Bacillus eredetű «-amiláz, előnyösen B, amyloliquefaciens eredetű ec-amiláz.
10. 10. Eljárás kenyértészta vagy hasonló termék előállítására, azzal jellemezve, hogy a 3-9. igénypont bármelyike szerinti kenyér-minőség javitó tulajdonságokkal rendelkező mutáns enzim használatát tartalmazza.
11. 11, Kenyértészta vagy hasonló termék azzal jellemezve, hogy a 3-9. igénypont bármelyike szerinti egy kenyér-minőség javitó tulajdonságokkal rendelkező mutáns enzimet tartalmaz,
12. 12, Eljárás kenyér vagy rokon termék előállításé ra, azzal jellemezve, hogy a 3-9. igénypont bármelyike » l » · • ·« « ·· • · · * « ·· ··« · * · 4 ···«· »»♦··· ·

    - 47 szerinti egy kenyér-minőség javitó tulajdonságokkal rendelkező mutáns enzimet adunk a kenyértésztához.
13. 13. Kenyér vagy rokon termék azzal jellemezve, hogy a 12, igénypont szerinti eljárással állítjuk elő.
14. 14. Mikroorganizmus azzal jellemezve, hogy az 1-9. igénypont valamelyike szerinti mutáns enzimet termeli.
15. 15. Mikroorganizmus azzal jellemezve, hogy az endogén ec-amilázok expressziójának a megszűntetésével vagy inaktiválásával alkalmassá tettük mutáns bakteriális ec-amiláz termelésére,
16. 16. Mikroorganizmus azzal jellemezve, hogy előnyösen baktérium, élesztő vagy gomba, előnyösebben E.coli, Bacillus vagy Aspergillus, előnyösen Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens vagy Bacillus licheniformis, amely az 1-9. igénypont bármelyike szerinti mutáns enzimet kódoló gént tartalmazza,
17. 17. Az 1-9, igénypont bármelyike szerinti mutáns enzimet kódoló gén azzal jellemezve, hogy DNS szekvenciájában 1-10 csoport a vad tipusu géntől különbözik,
18. 18. A 17, igénypont szerinti bakteriális ec-amilázt kódoló gén azzal jellemezve, hogy 1-10 csoportja a

    2, ábra szerinti DNS szekvenciáju vad tipusu génétől különbözik.

    •t ♦
19. 19. Vektor vagy plazmid azzal jellemezve, hogy a 17. vagy a 18. igénypont szerinti gént tartalmazza.
20. 20. Mikroorganizmus azzal jellemezve, hogy a

    19. igénypont szerinti vektorral vagy plazmiddal transzformáltuk.
21. 21. Eljárás az 1-9. igénypont bármelyike szerinti mutáns enzim termelésére azzal jellemezve, hogy az eljárás a 14-16. vagy a 20. igénypont szerinti mikroorganizmus fermentációját foglalja magába és adott esetben a képződött mutáns enzim elválasztását vagy tisztítását.
22. 22. Eljárás ipari alkalmazási körülmények között a kívánt stabilitást mutató mutáns enzim termelésére azzal jellemezve, hogy a következő lépésekből áll:

    a) mutagenizáljuk a vad tipusu enzimet kódoló gént;

    b) kiválasztjuk a megváltoztatott stabilitási tulajdonságokkal rendelkező mutánsokat;

    c) meghatározzuk a megfelelő aminosav helyettesítéseket, a vad tipusu enzimhez viszonyítva; és

    d) a kiválasztott egyedi aminosav szubsztitúciókat kombináljuk a mutáns enzimet kódoló mutáns gén előállítása céljából.

    ·» V* • · ··· ···· ·
23. 23. Eljárás ipari alkalmazási körülmények kö- zött a kivánt stabilitást kifejtő mutáns enzimet kódoló génnel klónozott mikroorganizmus előállítására, azzal jellemezve, hogy a következő lépéseket tartalmazza:

    a) klónozzuk a vad tipusu enzimet kódoló gént;

    b) mutagenizáljuk a vad tipusu enzimet kódoló gént;

    c) szelektáljuk a megváltoztatott stabilitási tulajdonságokkal rendelkező mutánsokat}

    d) meghatározzuk a vad tipusu enzimekkel való összehasonlításban a megfelelő aminosav helyettesítéseket}

    e) mutagenizáljuk a vad tipusu enzimet kódoló gént} és '

    f) a mutagenizált gént újra klónozzuk egy alkalmas gazdasejtbe,
24. 24, Eljárás mutáns enzim előállítására, azzal jellemezve, hogy az emlitett mutáns enzim az ipari alkalmazás körülményei között a kivánt csökkent stabilitást fejti ki és hogy az emlitett körülmények magukba foglalják a 23, igénypont szerint előállított mikroorganizmus fermentációját.
25. 25. Kenyér-minőség javító készítmény azzal jelle- mezve, hogy aktív ingrediensként egy a 3-9, igénypont bármelyike szerinti kenyér-minőség javító mutáns enzimet tartalmaz.