JPH04266845A - ジヒドロジヒドロキシフタル酸の抽出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、種々のポリマーの原料
モノマーや種々の化合物の合成中間体として有用なジヒ
ドロジヒドロキシフタル酸を、これを含有する水溶液か
ら効率的に抽出する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】フタル酸の誘導体は、種々のポリマーの
原料モノマーや種々の化合物の合成中間体として広く利
用されているが、近年のポリマー合成の多様化に伴い、
さらに新たなフタル酸誘導体の開発が望まれている。か
かる実状において、本発明者らは先にフタル酸を原料と
し、シュードモナス属に属し、４，５−ジヒドロ−４，
５−ジヒドロキシフタル酸および／またはその塩の分解
活性が消失もしくは低下している微生物を用いれば、フ
タル酸および／またはその塩から有用な４，５−ジヒド
ロ−４，５−ジヒドロキシフタル酸および／またはその
塩が製造できることを見出した（特開平２−１４９５４
０号公報）。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、かかる
ジヒドロジヒドロキシフタル酸を含有する水溶液からの
ジヒドロジヒドロキシフタル酸の単離は容易ではなく、
より効率的な単離手段の開発が望まれている。従って本
発明の目的は、ジヒドロジヒドロキシフタル酸を含有す
る水溶液からジヒドロジヒドロキシフタル酸を効率良く
抽出する方法を提供することにある。

【０００４】

【課題を解決するための手段】すなわち、本発明はジヒ
ドロジヒドロキシフタル酸を含有する水溶液より、無機
酸塩の存在下、次の（１）〜（４）（１）プロピルアル
コール、（２）アセトニトリル、（３）エチルアルコー
ルとブチルアルコール、ジエチルエーテル、メチルエチ
ルケトンおよび酢酸エチルから選ばれる少なくとも１種
との混合溶媒、ならびに（４）ジオキサンとブチルアル
コールおよびメチルエチルケトンから選ばれる少なくと
も１種との混合溶媒から選ばれる有機溶媒を用いてジヒ
ドロジヒドロキシフタル酸を抽出することを特徴とする
ジヒドロジヒドロキシフタル酸の抽出方法を提供するも
のである。

【０００５】本発明の抽出対象物であるジヒドロジヒド
ロキシフタル酸としては、例えば４，５−ジヒドロ−４
，５−ジヒドロキシフタル酸、またはそのナトリウム塩
、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩などの塩
（以下、これらを「４，５−ジヒドロ−４，５−ジヒド
ロキシフタル酸」と総称する）が挙げられる。この４，
５−ジヒドロ−４，５−ジヒドロキシフタル酸は、例え
ば４，５−ジヒドロ−４，５−ジヒドロキシフタル酸の
分解活性が消失または低下している微生物を用いて、フ
タル酸および／またはその塩（以下、これらを「フタル
酸」と総称する）から微生物変換法により製造すること
ができる（特開平２−１４９５４０号公報）。

【０００６】本発明に用いられるジヒドロジヒドロキシ
フタル酸を含有する水溶液としては、特に制限されるも
のではないが、例えば上記ジヒドロジヒドロキシフタル
酸産生培養液が挙げられる。当該培養液は、例えば特開
平２−１４９５４０号公報記載によって得られたものが
挙げられるが、具体的には以下の如くして得られる。

【０００７】まず、培養に用いられる微生物は、シュー
ドモナス属に属し、４，５−ジヒドロ−４，５−ジヒド
ロキシフタル酸の分解活性が消失または低下しているも
のであり、例えばフタル酸を増殖のための炭素源として
利用し得る能力を有するシュードモナス属に属する微生
物を親株として、４，５−ジヒドロ−４，５−ジヒドロ
キシフタル酸の分解活性が消失または低下するように変
異させられた変異株が挙げられる。ここで、親株の例と
しては、例えばシュードモナス・アシドボランス（Ｐｓ
ｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ　）、シ
ュードモナ・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔ
ｉｄａ）、シュードモナス・テストステロニ（Ｐｓｅｕ
ｄｏｍｏｎａｓｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）が挙げられ
、具体的にはシュードモナス・テストステロニＭ４−１
（微工研条寄第２４４５号）、シュードモナス・テスト
ステロニＮＭＨ７５　（微工研条寄第２４４７号）など
を例示することができる。 親株の変異は、例えば突然変異誘起剤による処理、紫外
線照射、Ｘ線照射、γ線などの放射線照射による処理ま
たはトランスポゾンによる処理を適用することができる
。ここで突然変異誘起剤としては、エチルメタンスルホ
ネート、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグア
ニジン、ジメチルサルフェート、２−アミノプリン、ア
クリフラビン、アクリジンオレンジ、ヒドラジン、４−
ニトロキノリン−Ｎ−オキシド、塩化マンガンなどが挙
げられる。また、放射線のうちでは、通常、紫外線が使
用され、その照射量は１〜９ｍＪ／ｃｍ２　程度である
。さらに、トランスポゾンとしては、例えばＴｎ３〔Ｈ
ｅｆｆｒｏｎ，　Ｆ．，　ＭｃＣａｒｔｈｙ，　Ｂ．　
Ｊ．，　Ｏｈｔｓｕｂｏ，　Ｈ．，　Ｏｈｔｓｕｂｏ，
　Ｅ．，　Ｃｅｌｌ，　１８，　１１５３（１９７９）
〕，　Ｔｎ５〔Ｂｅｒｇ，　Ｄ．　Ｅ．，ａｎｄ　Ｂｅ
ｒｇ，　Ｃ．　Ｍ．，　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
　１，　４１７（１９８３）　〕，　Ｔｎ７〔Ｂａｒｔ
ｈ，　Ｐ．　Ｔ．，　Ｄａｔｔａ，　Ｎ．，　Ｈｅｄｇ
ｅｓ，　Ｒ．　Ｗ．，　Ｇｒｉｎｔｅｒ，　Ｎ．　Ｊ．
，　Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，　１２５，　８００
（１９７６）　〕，　Ｔｎ１０〔Ｋｌｅｃｋｎｅｒ，　
Ｎ．，　Ｆｏｓｔｅｒ，　Ｔ．　Ｊ．，　Ｄａｚｉｓ，
　Ｍ．　Ａ．，　Ｈａｎｌｅｙ−Ｗａｙ，　Ｓ．，　Ｈ
ａｌｌｉｎｇ，　Ｓ．　Ｍ．，　Ｌｕｎｄｂｌａｄ，　
Ｖ．，　Ｔａｋｅｓｈｉｔａ，　Ｋ．，　Ｃｏｌｄ　Ｓ
ｐｒｉｎｇ，　ＨａｒｂｏｒＳｙｍｐ．　Ｑｕａｎｔ．
　Ｂｉｏｌ．，　　４５，　２２５（１９８１）　〕な
どが挙げられる。変異株の確認は、例えば変異を行った
細胞を培養し、形成されたコロニーについて変異の有無
を検討する直接的な方法のほか、この方法を改良したレ
プリカ法、さらにはペニシリンなどの抗生物質を使用す
る濃縮法、特殊な基質を用いる自殺基質処理法ならびに
これらを適宜組合せた方法などが挙げられる。 また、これらの変異株の中から変異株を見出す方法とし
ては、増殖菌体または休止菌体にフタル酸を適当な条件
下で接触させ、そのときの蓄積物を適当な分析手段を用
いて分析する方法を挙げることができる。かくして得ら
れる特定変異株の例としては、親株として前記Ｍ４−１
を用いた紫外線処理による変異株であるシュードモナス
・テストステロニＭ４−１０２６（微工研条寄第２４４
６号）が挙げられる。このシュードモナス・テストステ
ロニＭ４−１０２６の菌学的性質は、親株であるシュー
ドモナス・テストステロニＭ４−１のそれと極めて近似
しているが、フタル酸の資化能を失っている点で親株と
相違する。

【０００８】さらに、特定変異株の他の例としては、親
株として前記ＮＭＨ７５　を用い、トランスポゾンＴｎ
５により変異させたシュードモナス・テストステロニＮ
ＭＨ７５０１　（微工研条寄第２４４８号）が挙げられ
る。上記特開平　２−１４９５４０　号公報の方法では
、このような特定変異株を用い、液体培養法、休止菌体
法、固定化菌体法などにより、フタル酸から４，５−ジ
ヒドロ−４，５−ジヒドロキシフタル酸を製造する。液
体培養法は、フタル酸の存在下に特定変異株を培養しな
がら４，５−ジヒドロ−４，５−ジヒドロキシフタル酸
を生成させる方法である。この方法で用いられる培地に
は炭素源として酢酸、コハク酸、クエン酸などの有機酸
および、これらの塩、安息香酸、ｍ−ヒドロキシ安息香
酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸およびこれらの塩などの芳
香族化合物、グルコースなどの糖類が用いられ、窒素源
としてアンモニウム塩、硝酸塩などの無機窒素化合物、
ペプトン、肉エキス、酵母エキス、尿素などの有機窒素
源などが用いられ、無機塩類として、リン酸カリウム、
硫酸マグネシウム、塩化カリウム、塩化第二鉄、塩化カ
ルシウムなどが用いられる。フタル酸の培地への添加は
、一括添加または逐次添加が採用されるが、全添加量は
通常、培地の５重量％以下である。また、逐次添加する
場合に、その添加周期は４，５−ジヒドロ−４，５−ジ
ヒドロキシフタル酸が充分生成し、培地中に蓄積される
範囲内で適宜選定され、１回の添加量は、通常、培地の
０．０１〜０．５　重量％である。また培養温度は、通
常、２５〜３７℃、ｐＨは５〜９であり、好気的条件下
で行われる。休止菌体法は、予め培養しておいた特定変
異株を用いて、フタル酸を４，５−ジヒドロ−４，５−
ジヒドロキシフタル酸に変換させる方法である。この方
法では、特定変異株の培養は、液体培養法と同様にして
行うことができる。培養後、特定変異株は遠心分離また
は凝集法によって集められ、適当な緩衝液（例えばリン
酸緩衝液あるいはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメ
タン緩衝液）中に再懸濁される。再懸濁された液中での
４，５−ジヒドロ−４，５−ジヒドロキシフタル酸の産
生反応（以下単に「産生反応」という）はフタル酸の添
加により開始され、温度２５〜３７℃、ｐＨ５〜９の範
囲で好気的に行われる。また、固定化菌体を用いる方法
の場合、特定変異株の担体への固定化方法としては包括
法、吸着法、マイクロカプセル法などいずれも適用する
ことができる。包括用の担体としてはカラギーナンなど
の多糖類、ポリアクリルアミドなどの合成高分子等があ
り、吸着用担体としてはＤＥＡＥセルロースなどがある
。この固定化菌体の場合の産生反応の条件は、液体培養
で行う方法または休止菌体を用いる方法の場合と同様で
ある。上記の培養または産生反応終了後、菌体等の不溶
物を濾別すれば、ジヒドロジヒドロキシフタル酸を含有
する水溶液が得られる。

【０００９】一方、本発明方法に用いられる抽出溶媒は
、前記（１）〜（４）から選ばれる有機溶媒（以下、「
特定溶媒」という）であり、これらの特定溶媒は、水と
自由な割合で相溶しかつ塩を添加することにより水層と
有機層との２層に分離するものであるが、このうち２−
プロピルアルコール、エチルアルコールとメチルエチル
ケトンとの混合溶媒、エチルアルコールと酢酸エチルと
の混合溶媒、ジオキサンと１−ブチルアルコールとの混
合溶媒またはジオキサンとメチルエチルケトンとの混合
溶媒が特に好ましい。またこれらの特定溶媒は１種単独
でも２種以上を混合しても使用することができる。なお
、上記特定溶媒中の各混合溶媒の混合割合は特に限定さ
れないが、エチルアルコールまたはジオキサンに対する
、ブチルアルコールまたはメチルエチルケトンの混合割
合；およびエチルアルコールに対するジエチルエーテル
または酢酸エチルの混合割合は重量比で３：７〜７：３
程度が好ましい。さらに、特定溶媒には、抽出を阻害し
ない範囲で、他の有機溶媒を混合してもよい。

【００１０】また、本発明方法に用いられる無機酸塩は
、原料であるジヒドロジヒドロキシフタル酸を含有する
水溶液と前記特定溶媒との混合物を２層に分離するもの
であれば特に限定されないが、例えば塩化ナトリウム、
塩化カリウム、塩化アンモニウム、硫酸ナトリウム、硫
酸カリウム、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、硝酸
カリウムまたは硝酸アンモニウム等を挙げることができ
る。これらの無機酸塩は、通常水層におけるこれらの無
機酸塩の飽和量が添加される。

【００１１】本発明方法を実施するには、例えばジヒド
ロジヒドロキシフタル酸を含有する水溶液に、前記特定
溶媒を加え、これに無機酸塩を添加して混合物を２層に
分離せしめ、次いで有機層を分取することにより行われ
る。当該抽出操作を行うにあたり、ジヒドロジヒドロキ
シフタル酸を含有する水溶液のｐＨは通常２以下、好ま
しくは１．５　以下に調整されるが、ジヒドロジヒドロ
キシフタル酸は酸性条件下で比較的不安定であるので、
この状態で長時間放置、または加熱しないよう注意する
必要がある。また抽出操作は、０〜４０℃、特に０〜２
０℃で行うのが好ましい。

【００１２】抽出液からのジヒドロジヒドロキシフタル
酸の分離方法としては、抽出液を濃縮後、例えば酢酸エ
チル、ジエチルエーテル、トルエン、クロロホルム、ヘ
キサンなどの溶媒中で４，５−ジヒドロ−４，５−ジヒ
ドロキシフタル酸を晶析させる方法が挙げられ、さらに
精製を必要とする場合には、イオン交換体などを用いる
クロマトグラフィーやセファデックスＬＨ−２０などを
用いるゲル濾過法などが適用される。

【００１３】

【実施例】次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明する
が、本発明はこれら実施例により何ら制限されるもので
はない。

【００１４】実施例１ シュードモナス・テストステロニＭ４−１０２６（特開
平２−１４９４５０号公報）１白金耳を液体培地５０ｍ
ｌで培養した培養液を、５ｍＭのフタル酸ナトリウムを
含む液体培地２ｌに添加し、３０℃で２０時間振とう培
養を行った。次いで遠心分離によりシュードモナス・テ
ストステロニＭ４−１０２６を集菌し、５０ｍＭトリス
−酢酸緩衝液（ｐＨ７．５　）２００ｍｌ　で２回洗浄
を行った後、２．５ｍＭ　のフタル酸ナトリウムを含む
５０ｍＭトリス−酢酸緩衝液１ｌに再懸濁した。その後
、回転振とうを行いながら、３０℃で４８時間産生反応
を行い、遠心分離によりシュードモナス・テストステロ
ニＭ４−１０２６を除去した。得られた上澄液を４８℃
で回転蒸発法により５０ｍｌに濃縮し、硫酸アンモニウ
ムを飽和に達するまで加え、濃塩酸でｐＨ１．５　に調
整した。続いて２−プロピルアルコール１００ｍｌ　に
よる抽出を５回行い、得られた抽出液を集め、４０℃で
回転蒸発法により濃縮し、約０．５ｍｌ　とした。さら
に濃縮液全量をメチルアルコール５ｍｌに溶解し、次い
で酢酸エチル２００ｍｌ　を添加し、不溶物を濾過によ
り除去し、４０℃で再度回転蒸発法により１０ｍｌに濃
縮した。濃縮により晶析した物質を濾別し乾燥し、４，
５−ジヒドロ−４，５−ジヒドロキシフタル酸の粗粉末
３１６ｍｇ　を得た。この粗粉末２００ｍｇ　を２０容
量％メチルアルコール水溶液５ｍｌに溶解し、２０容量
％メタノール水溶液で平衡化したセファデックスＬＨ−
２０のカラム（カラムサイズ　３．５×４０．５ｃｍ）
に充填し、２０容量％メチルアルコール水溶液で溶出し
、２６０ｎｍに吸収を持つフラクションを集めた。集め
たフラクションを凍結乾燥し、４，５−ジヒドロ−４，
５−ジヒドロキシフタル酸の精製粉末５５ｍｇを得た。 このようにして得られた精製粉末は、マススペクトルで
２０１（Ｍ＋Ｈ＋）　のピークを与え、重水素ジメチル
スルホキシド中での１Ｈ−ＮＭＲ　では、δ４．１２（
Ｈ−ｅ，Ｈ−ｆ），　　δ５．１０（Ｈ−ｇ，Ｈ−ｈ）
，　　δ６．５８（Ｈ−ｃ，Ｈ−ｄ）　およびδ１２．
５２（Ｈ−ａ，Ｈ−ｂ）においてシグナルを与え、また
、重水素ジメチルスルホキシド中での１３Ｃ−ＮＭＲ　
ではδ６６．５（Ｃ−１，Ｃ−２），δ１２８．８（Ｃ
−４，Ｃ−５），　δ１３７．６（Ｃ−３，Ｃ−６）お
よびδ１６６．９（Ｃ−７，Ｃ−８）においてシグナル
を与えるものであった。また元素分析値も理論値と一致
することから、本物質は４，５−ジヒドロ−４，５−ジ
ヒドロキシフタル酸であることが示された。

【００１５】実施例２ 抽出溶媒をエチルアルコール：メチルエチルケトン＝１
：１（重量比）の混合溶媒に変更した以外は、実施例１
と同様に抽出を行ったところ、４，５−ジヒドロ−４，
５−ジヒドロキシフタル酸の粗粉末３２９ｍｇ　が得ら
れた。

【００１６】実施例３ 抽出溶媒をエチルアルコール：酢酸エチル＝１：１（重
量比）の混合溶媒に変更した以外は、実施例１と同様に
抽出を行ったところ、４，５−ジヒドロ−４，５−ジヒ
ドロキシフタル酸の粗粉末３１７ｍｇ　が得られた。

【００１７】実施例４ 抽出溶媒をジオキサン：１−ブチルアルコール＝１：１
（重量比）の混合溶媒に変更した以外は、実施例１と同
様に抽出を行ったところ、４，５−ジヒドロ−４，５−
ジヒドロキシフタル酸の粗粉末３３１ｍｇ　が得られた
。

【００１８】比較例１ 抽出溶媒をジエチルエーテルに変更した以外は、実施例
１と同様に抽出を行ったが、得られた４，５−ジヒドロ
−４，５−ジヒドロキシフタル酸の粗粉末は、２．４ｍ
ｇ　であった。

【００１９】比較例２ 抽出溶媒を酢酸エチルに変更した以外は、実施例１と同
様に抽出を行ったが、得られた４，５−ジヒドロ−４，
５−ジヒドロキシフタル酸の粗粉末は、２４．２ｍｇで
あった。

【００２０】比較例３ 抽出溶剤をクロロホルムに変更した以外は、実施例１と
同様に抽出を行ったが、４，５−ジヒドロ−４，５−ジ
ヒドロキシフタル酸は抽出されなかった。

【００２１】比較例４ 抽出溶剤をトルエンに変更した以外は、実施例１と同様
に抽出を行ったが、４，５−ジヒドロ−４，５−ジヒド
ロキシフタル酸は抽出されなかった。

【００２２】比較例５ 抽出溶剤をイソアミルアルコールに変更した以外は実施
例１と同様に抽出を行ったところ４，５−ジヒドロ−４
，５−ジヒドロキシフタル酸の粗粉末９７ｍｇが得られ
た。

【００２３】

【発明の効果】本発明によれば、耐熱性ポリマー、導電
性ポリマーなどの種々のポリマーの原料モノマーや種々
の化合物の合成中間体として有用なジヒドロジヒドロキ
シフタル酸を効率よく抽出することができる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　ジヒドロジヒドロキシフタル酸を含有
   する水溶液より、無機酸塩の存在下、次の（１）〜（４
   ）（１）プロピルアルコール、（２）アセトニトリル、
   （３）エチルアルコールとブチルアルコール、ジエチル
   エーテル、メチルエチルケトンおよび酢酸エチルから選
   ばれる少なくとも１種との混合溶媒、ならびに（４）ジ
   オキサンとブチルアルコールおよびメチルエチルケトン
   から選ばれる少なくとも１種との混合溶媒から選ばれる
   有機溶媒を用いてジヒドロジヒドロキシフタル酸を抽出
   することを特徴とするジヒドロジヒドロキシフタル酸の
   抽出方法。