JPH04208861A - 免疫試薬用担体の製造方法及び免疫試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

［０００１１

【産業上の利用分野］本発明は、乳化重合法を利用した
免疫試薬用担体の製造方法及び免疫試薬に関する。 ［０００２］ 【従来の技術】近年、各種検出法の進歩により血漿中の
微量蛋白成分が定量的に測定し得るようになってきた。 この検出法の一つが免疫比濁法である。免疫比濁法では
血漿蛋白のうち比較的血中濃度の高い、ＩｇＧ、ＩｇＡ
、ＩｇＭ等の抗体、Ｃ３、Ｃ４、ＣＲＰ、ＲＦ等が測定
されるが、感度面から低濃度血漿蛋白の測定には限界が
ある。 ［０００３］こういった背景から低濃度の各種血清蛋白
の測定法として、ポリスチレンなどの担体粒子に抗原を
感作し、血中の抗体と反応凝集させる免疫ラテックス凝
集法が広く用いられるようになってきた。 ［０００４］担体粒子は水中で表面電荷による粒子同志
の反発及びブラウン運動により、凝集せずに安定に分散
している。血清が注入されると血清中の抗体が粒子表面
の抗原と結合し、抗体による粒子間の架橋が生じ、凝集
する。この時、担体粒子が剛直であると一度凝集した粒
子の再分散が生じるので、担体粒子としては柔軟である
ことが好ましい。即ち、柔軟性により粒子間架橋の後フ
ァンデルワールス力で粒子同志が接近しやすくなり、更
に粒子の接点で樹脂が相溶することにより、強固な凝集
物を得る。 ［０００５］一方、担体粒子としては主に乳化重合して
得られたポリスチレンラテックスが用いられている。乳
化重合では界面活性剤により形成されるミセル中にモノ
マーが可溶化し、水中で熱分解等で発生したラジカルが
そのミセルに飛び込むことにより、重合が開始する。重
合が開始すると水中に分散しているモノマー滴から拡散
によりモノマーが供給され、ラテックス粒子に成長する
。重合は、再び粒子中に飛び込んだラジカルが、ポリマ
ー鎖のラジカルと結合することにより終了する。ラジカ
ルが微小な粒子に飛び込む確率は低いため、乳化重合で
は懸濁重合、溶液重合、塊状重合等に比べ、分子量が高
くなり、得られる粒子は剛直である。したがって、乳化
重合により得られた粒子を担体として用いると、凝集が
強固でなく、再分散により感度が低下する傾向にある。 ［０００６］

【発明が解決しようとする課題】柔軟な粒子を得る方法
として、重合時に連鎖移動剤等を添加することにより分
子量を下げる方法や、ガラス転移温度を低くする方法が
考えられるが、このような場合は、保管時の分散安定性
が低下したり、粒子が反応用のセルに付着する等の問題
が発生する。したがって、従来の方法では血清反応時の
凝集力と保管時の安定性に優れた担体粒子は得られなか
った。 ［０００７］

【課題を解決するための手段】本発明はこのような乳化
重合法により得られる免疫試薬用担体にかかわる課題を
解決するものである。すなわち本発明は、重合性単重体
を２段で乳化重合する方法であって、まず１段目として
重合開始剤を重合性単重体１１当り、０．００５モル以
上用い、かつ該重合開始剤の分解の半減期が２時間とな
る温度以上の温度で重合させて低分子量の重合体を得、
次いで、２段目として重合性単量体を添加し、１段目で
得られる重合体より高分子量の重合体を生成させること
により分子量分布の広い乳化重合体粒子を得ることを特
徴とする免疫試薬用担体の製造方法、及び該製造方法に
より得られる免疫試薬用担体に抗原又は抗体を感作して
得られる免疫試薬に関する。 ［０００８１本発明における重合性単重体の乳化重合は
、２段で行うが、１．２段共に乳化剤を含有する水性媒
体中に重合性単重体を乳化分散させて重合させることに
よって行われる。 ［０００９］この乳化重合に際して油溶性及び／又は水
溶性の重合開始剤を添加することができる。その他、乳
化分散を助ける安定剤及び連鎖移動剤を適宜添加するこ
とができる。 ［００１０１乳化重合に際して、重合性単重体を水性媒
体に乳化分散させる方法としては、重合性単重体、乳化
剤及び水性媒体を同時に撹拌混合してもよく、乳化剤を
溶解させた水性媒体に重合性単重体を添加し撹拌混合し
てもよい。 ［００１１］ｆｆｉ合開始剤として、油溶性の重合開始
剤を使用する場合には、これを重合性単重体に予め溶解
しておくのが好ましいが、水溶性の重合性開始剤を使用
する場合には乳化分散時に添加しても、乳化分散後に添
加してもよい。これらの重合開始剤は、１段目に重合性
単重体ＩＩに体して、０．００５モル以上、好ましくは
０．１〜１モル加える。ここで０．００５モル未満では
試薬とした後の測定の際、非特異反応を生じる。また、
１段目の重合性単重体に連鎖移動剤を予め溶解しておき
、連鎖移動剤の助けで、更に分子量を下げてもよい。こ
の場合、連鎖移動剤は２段目ではこれを全く添加しない
か、ごく少量添加する。 ［００１２］乳化重合は、上記乳化分散の後又は乳化分
散させつつ、１段目の重合は、重合開始剤の分解の半減
期が２時間となる温度以上の温度で行い、２段目の合成
温度は１段目の合成温度と同じか、或いは０〜５０℃低
い温度で行う。このような方法によれば、１段目の乳化
重合では、多量の重合開始剤を用い、高温で行われるた
め、重合中、開始剤ラジカルが大量に発生し、低分子量
の重合体が得られる。一方、２段目の重合は既に大部分
の重合開始剤が分解したあとであるため、高分子量の重
合体を生成する。このようにして分子量分布を広げるこ
とができる。尚、２段目の重合を完結させるために、２
段目の重合中に重合開始剤を適宜少量追加添加しても良
い。具体的には、１段目の重合は７０〜１５０℃で行う
のが好ましく、２段目の重合は、２０〜１５０℃で行う
のが好ましい。また、重合温度が８５℃以上の場合は、
加圧下で行うのが好ましい。 ［００１３１２段目の重合性単量体の添加は１段目の単
重体の重合率が７０重量％以上、特に９０重量％以上と
なったところで行われるのが好ましい。７０重量％未満
で添加した場合は、分子量分布が狭くなり特異性を十分
に上げることができなくなる。 ［００１４］１段目で生成させる低分子量の重合体は、
数平均分子量が５０００〜５万であるのが好ましい。５
０００未満では、担体の保存安定性が低下し、５万を超
えると非特異反応が生じてくる。 ［００１５］なお、本発明でいう分子量は、ゲルパーミ
ェーションクロマトグラフィー法により測定し、標準ポ
リスチレン検量線を用いて換算した値である。２段目の
重合性単量体の添加は徐々に滴下しても良いし、比較的
高速撹拌下で一度に仕込んでも良い。 ［００１６１１段目の重合性単量体と２段目の重合性単
量体の比率は、使用する連鎖移動剤や重合開始剤の量や
重合温度によって異なるが、１段目／２段目＝０４２〜
５．０（重量比）であるのが好ましい。 ［００１７］上記乳化分散における撹拌混合は、普通の
撹拌機を用いて比較的高速で撹拌してもよいが、ホモミ
キサー等を使用して高速剪断による撹拌により行うのが
好ましい。 ［００１８］２段目の乳化重合は、重合率が９９重量％
以上になるまで進めるのが好ましく、特に９９．９重量
％以上になるまで進めるのが好ましい。重合率が低く、
残存重合性単量体が多くなると、保存安定性の低下や担
体粒子のセルへの付着が生じる傾向がある。重合率が低
く、特に残存重合性単量体が多くなると、トナーの特性
、特に保存安定性が劣る傾向がある。 ［００１９］また、得られる乳化重合体粒子のガラス転
移温度は、好ましくは６０〜１５０℃、特に好ましくは
８０〜１２０℃である。ガラス転移温度が低すぎると、
保存安定性が低下しやすく、高すぎると凝集が低下しや
すくなる。ガラス転移温度の調整は、主に使用する重合
性単量体の選択により行うことができる。 ［００２０１以上のように、２段で乳化重合して得られ
る乳化重合体粒子は、分子量分布の広いものとなるが、
全体として数平均分子量（Ｍｎ）が好ましくは５０００
以上、特に好ましくは１万以上、分子量分散度（Ｍ量平
均分子量／数平均分子量、Ｍｗ／Ｌｉｎ）が好ましくは
３以上に調整される。 ［００２１］ここで数平均分子量が５０００未満では、
試薬中の担体の安定性が低下したり、セルへの付着が生
じ、分子量分散度が３未満では、非特異反応が増加する
。 ［００２２］また、得られる乳化重合体粒子の平均粒径
（数平均粒径）は、２０〜５００　ｎｍに調整されるの
が好ましい。この範囲外では、免疫試薬用の担体粒子と
しては適さない。こうして得られる乳化重合体粒子は、
免疫試薬用担体とされる。 ［００２３１次に、本発明において、乳化重合に使用す
る材料について説明する。本発明に使用する重合性単量
体としては、スチレン、０−メチルスチレン、ｍ−メチ
ルスチレン、ｐ−メチルスチレン、ｐ−エチルスチレン
、２，４−ジメチルスチレン、ｐ−ｎ−ブチルスチレン
、ｐ−ｔｅｒｔ−ブチルスチレン、ｐ−ｎ−ヘキシルス
チレン、ｐ−ｎ〜オクチルスチレン、ｐ−ｎ−ノニルス
チレン、ｐ−ｎ−デシルスチレン、ｐ−ｎ−ドデシルス
チレン、ｎ−メトキシスチレン、ｐ−フェニルスチレン
、ｐ−クロロスチレン、３，４−ジクロロスチレン等の
スチレン及びスチレン誘導体、エチレン、プロピレン、
ブチレン、イソブチレン等のエチレン性不飽和モノオレ
フィン類、塩化ビニル、塩化ビニリデン、臭化ビニル、
フッ化ビニル等のハロゲン化ビニル類、酢酸ビニル、プ
ロピオン酸ビニル、安息香酸ビニル、酪酸ビニル等のビ
ニルエステル、アクリル酸メチル、アクリル酸エチル、
アクリル酸プロピル、アクリル酸ｎ−ブチル、アクリル
酸イソブチル、アクリル酸ｎ−オクチル、アクリル酸ド
デシル、アクリル酸２−エチルヘキシル、アクリル酸ス
テアリル、アクリル酸２−クロロエチル、アクリル酸フ
ェニル、α−クロロアクリル酸メチル、メタクリル酸メ
チル、メタクリル酸プロピル、メタクリル酸ｎブチル、
メタクリル酸イソブチル、メタクリル酸ｎ−オクチル、
メタクリル酸ドデシル、メタクリル酸２−エチルヘキシ
ル、メタクリル酸ステアリル、メタクリル酸）ェニル、
アクリル酸ジメチルアミンエチルメタクリル酸ジメチル
アミノエチル等のα−メチレン脂肪族モノカルボン酸エ
ステル類、アクリロニトリル、メタクリロニトＪル、ア
クリルアミド、メタクリルアミド、アクリル酸２−ヒド
ロキシエチル、メタクリル酸２−ヒドロキシエチル、メ
タクリル酸２−ヒドロキシプロピル等のアクリル酸若し
くはメタクリル酸の誘導体、場合によってはアクリル酸
、メタクリル酸、マレイン酸、フマール酸等も使用でき
る。また、ビニルメチルエーテル、ビニルエチルエーテ
ル、ビニルイソブチルエーテル等のビニルエーテル類、
ビニルメチルケトン、ビニルへキシルケトン、メチルイ
ソプロペニルケトン等のビニルケトン等のビニルケトン
類、Ｎ−ビニルピロール、Ｎ−ビニルカルバゾール、Ｎ
−ビニルインドール、Ｎ−ビニルピロリドン等のＮ−ビ
ニル化合物、ビニルナフタリン等を１種若しくは２種以
上組合せて使用できる。 ［００２４］また、本発明の重合性単量体として、架橋
剤となる重合性の二重結合を２個以上有する化合物を一
部用いることもできる。例えば、ジビニルベンゼン、ジ
ビニルナフタリン及びそれらの誘導体のような芳香族ジ
ビニル化合物、エチレングリコールジメタクリレートジ
エチレングリコールジメタクリレート、トリエチレング
リコールトリアクリレート、トリメチロールプロパント
リアクリレート等のジエチレン性カルボン酸エステル、
Ｎ、Ｎ−ジビニルアニリン、ジビニルエーテル、ジビニ
ルスルファイト等のすへてのジビニル化合物及び３個以
上のビニル基を持つ化合物等を単独又は混合物として使
用できる。架橋剤の使用量は、重合性単量体の総量に対
して０〜２０重量％であるのが好ましく、特に０〜５重
量％であるのが好ましい。これらの中では、特にスチレ
ンモノマーが緒特性に優れるので好ましく使用される。 ［００２５］乳化重合に使用される水性媒体は、主に、
水である。上記重合性単量体と水性媒体との割合は、前
者／後者の重量比で６０／４０〜１０／９０であるのが
好ましい。この割合が大きすぎると、乳化重合しにくく
なり、小さすぎると、収率が低下する。 ［００２６］乳化剤としては、アニオン系界面活性剤、
カチオン系界面活性剤、両性イオン界面活性剤及びノニ
オン系界面活性剤を使用することができる。 ［００２７］アニオン系界面活性剤としては、オレイン
酸ナトリウム、ヒマシ油カリ等の脂肪酸塩、ラウリル硫
酸ナトリウム、ラウリル硫酸アンモニウム等のアルキル
硫酸エステル類、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウ
ム等のアルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキルナフタ
リンスルホン酸塩、ジアルキルスルホコハク酸、アルキ
ルリン酸エステル塩、ナフタリンスルホン酸ホルマリン
縮合物、ポリオキシエチレンアルキル硫酸エステル塩等
がある。 ［００２８１ノニオン系界面活性剤としては、ポリオキ
シエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアル
キルフェノールエーテル、ポリオキシエチレン脂肪酸エ
ステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシソルビ
タン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルアミ
ン、グリセリン、脂肪酸エステル、オキシエチレン−オ
キシプロピレンブロックポリマー等がある。 ［００２９］力チオン系界面活性剤としては、ラウリル
アミンアセテート、ステアリルアミンアセテート等のア
ルキルアミン塩、ラウリルトリメチルアンモニウムクロ
リド、ステアリルトリメチルアンモニウムクロリド等の
第四級アンモニウム塩がある。 ［００３０１両性イオン界面活性剤としては、ラウリル
１へりメチルアンモニウムクロリド等がある。 ［００３１１乳化剤の使用量は、重合性単量体の総量に
対して０．０１〜１０重鳳％、特に、０．５〜５重量％
であるのが好ましい。乳化剤の使用量が少なすぎると、
安定な乳化重合が困難になる。また、多すぎると、得ら
れる免疫試薬の感度が低下する。 ［００３２１安定化剤としては、ポリビニルアルコール
、デンプン、メチルセルロース、カルボキシメチルセル
ロース、ヒドロキシエチルセルロース等の水溶性高分子
物質があり、これらは、重合性単量体に対して０〜１重
量％使用されるのが好ましい。 ［００３３１本発明に使用しうる重合開始剤としては、
例えば過硫酸カリウム、過硫酸ナトリウム、過硫酸アン
モニウム等の過硫酸塩、過酸化水素、４，４′−アゾビ
スシアノ吉草酸、２．２′−アゾビス（２−アミジノプ
ロパン）二塩酸塩、ｔ−ブチルヒドロペルオキシド、ク
メンヒドロペルオキシド等の水溶性重合開始剤を用いる
のが好ましい。特に、過硫酸塩を用いた場合には、開始
活性部位となるサルフェートアニオンラジカル（ＳＯ２
−）がモノマー表面に存在し、５Ｏ４−基の親水性及び
帯電により粒子が安定化され、比較的均一な粒径を有す
る乳濁液が得られやすい。重合開始剤の使用量は、重合
性単量体に対して０．０１〜５重量％であるのが好まし
い。特に０．１〜３重量％であるのが好ましい。重合開
始剤が少なすぎると、重合性単量体が完全に重合せず、
粒子中に残り、試薬の特性を悪くする。また、多すぎる
と、分解残渣が試薬の特性に影響を与える。 ［００３４１重合開始剤として、過酸化ベンゾイル、過
安息香酸ｔｅｒｔ−ブチル等の過酸化物、アゾビスイソ
ブチロニトリル、アゾビスイソブチルバレロニトリル等
のアゾ系化合物等の油溶性の重合開始剤を併用すること
ができる。油溶性重合開始剤は、水溶性の重合開始剤に
対して１００重量％以下で使用されるのが好ましい。 ［００３５］上記の水溶性重合開始剤は、還元剤と組合
せて使用しても良い。還元剤としては、メタ重亜硫酸ナ
トリウム、塩化第−鉄等、一般に知られているものを使
用することができる。還元剤は、必ずしも使用する必要
はないが、使用するときは、水溶性の重合開始剤に対し
て当量以下で使用するのが好ましい。 ［００３６］連鎖移動剤としては、ｔ−ドデシルメルカ
プタン等のアルキルメルカプタン、ジイソプロビルキサ
ントゲシ等の低級アルキルキサントゲン類、四塩化炭素
、四臭化炭素等があり、重合性単量体に対して０〜２０
重鳳％使用するのが好ましい。 ［００３７］続いて、本発明の免疫試薬について説明す
る。得られた免疫試薬用担体をまず希釈し、固形分が０
．１〜５重量％、特に０．５〜２重量％とするのが好ま
しい。また、必要に応じて透析操作を行い、不要な重合
開始剤残渣等のイオン類を除去する。 ［００３８］希釈液にはリン酸緩衝液等の各種緩衝液を
用い、必要に応じ牛血清アルブミン等の蛋白質、塩化ナ
トリウム等の塩類、アジ化ナトリウム等の防腐剤を添加
する。 ［００３９］次いで、抗原又は抗体を感作するが、用い
る抗原や抗体の種類や量に制限はない。感作の方法は、
常法に従って行うことができる。例えば、抗原又は抗体
液とラテックス液を混合し１０〜３７℃で３〜１８０分
間撹拌した後−晩インキユベーションし、遠心して上清
を捨て、緩衝液で再分散させる。以上のようにして得ら
れる免疫試薬は目的とする抗原又は抗体の検出又は定量
を免疫比濁法により行う試薬として使用される。 （００４０１（実施例） 次に、本発明を実施例により説明するが、本発明はこれ
により限定されるものではない。実施例中、　「％」は
、特に断らない限り、　「重量％」を意味する。 ［００４１１（１）乳化重合液の製造 （ａ）実施例１〜３；３１のステンレスビーカーで、イ
オン交換水１３００ｇ中に、乳化剤としてアニオン性界
面活性剤であるドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム
６ｇを溶解して水溶液とした。 ［００４２］次いで、１段目として、スチレン２１０ｇ
を、乳化剤等の水溶液に加え、ホモミキサーで３００Ｏ
ｒｐｍの回転数で１分間乳化させて、プレエマルジョン
を得た。 ［００４３１次いで、撹拌器、窒素導入口、温度計及び
コンデンサを付けた３１の４つロセパラプルフラスコに
プレエマルジョンを移し、窒素気流下で、フラスコの温
度を８０℃に上げ、これに重合開始剤として過硫酸ナト
リウム６ｇ（重合性単量体１１あたり約０．１３モル）
を加え、温度１００℃（過硫酸ナトリウム半減期８８分
）で３０分間重合させた。３０分後に２段目としてさら
にスチレン２１０ｇを加えて表１に示す所定の温度で５
時間重合させた後、冷却して乳化重合液を得た。 ［００４４］　　（ｂ）比較例１〜３；スチレンの量を
４２０ｇとした他は（ａ）に示したと同じ方法で得たプ
レエマルジョンを３１の４つロセパラブルフラスコに移
した後重合開始剤として過硫酸ナトリウム６ｇを加え、
各々表１に示す所定の温度で５時間重合させ、冷却して
乳化重合液を得た。 ［００４５］　　（２）感作工程 上記各重合液と０．０５Ｍグリシン、水酸化ナトリウム
緩衝液（ｐＨ８，５０）４０ｍｌを遠心管に入れ、ヒト
γ−グロブリンを加えて２ｍｇ／ｍｌ液とし、更に各重
合液１ｍｌを加え、１０分間振とうした後、３７℃の恒
温槽で一晩インキユベーションした。翌日２８０Ｏｒｐ
ｍで遠心して上清を捨て、再び０．０５Ｍグリシン、水
酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８，５０）４０ｍｌを加え
、免疫比濁用試薬を得た。 ［００４６］　　（３）試薬の評価 塩化ナトリウム１％、ポリエチレングリコール６０００
１％、牛血清アルブミン０．１％含有の０．０５Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ６，５）を作成して希釈液とした。 ［００４７］まず反応キュベツトに試料（リュウマチ患
者又は健常人血清）３ｍｌ及び希釈液３５０ｍ１を加え
、混合撹拌後３７℃で５分間加温した後、波長５７０ｎ
ｍにおける吸光度（Ａ１）を求めた。次に、得られた免
疫比濁用試薬５０μＩを加え３７℃で５分間保持した後
波長５７０ｎｍにおける吸光度（Ａ２）を求めた。求め
た吸光度の差から式（Ａ２　　ＡＩ　Ｘ　３５３／　４
０３）［３５３／４０３は容量差を補正するための係数
、係数＝（検体量＋希釈液量）／（検体量＋希釈液量＋
試薬液量）１によって求めた値をその試料の吸光度とし
た。なお測定には日立７３６形自動分析機（（株）日立
製作新製）を用い、７０　Ｉ　Ｕ／ｍ　Ｉの標準血清を
用いて検量線を作成し、３０ＩｔＪ／ｍ１以上を陽性、
３０１　Ｕ／ｍ　１未満を陰性として判断した。即ち、
前記式で求めた試料の吸光度＞　（３０／７０）Ｘ　（
標準血清の吸光度）の場合を陰性とした。なおこれらの
吸光度は試薬ブランクとして生理食塩水の吸光度を測定
した吸光度から差し引いたものである。 ［００４８］実施例１〜３及び比較例１〜３の乳化重合
液配合、ゲルパーミェーションクロマトグラフィーによ
り標準ポリスチレンによる検量線を用いて得られた分子
量、乳化重合体粒子の平均粒径（コールタ−エレクトロ
ニクス（株）製、Ｎ４Ｍサブミクロン粒子分析装置によ
る）及び評価結果を表１に表す。 ［００４９１ここで、陽性一致率とはリュウマチ患者２
０名の血清での陽性率、陰性一致率とは健常人２０名の
血清での陰性率、保存安定性とは３７℃で１週間保管し
た後の陽性一致率及び陰性一致率である。 ［００５０１

【表１］ ［００５１１ 【発明の効果】本発明により、２段の乳化重合によって
製造された分子量分布の広い乳化重合体粒子を含む免疫
試薬用担体を使用すると、凝集感度、特異性、保存安定
性、セル付着防止効果に優れた免疫試薬を得ることがで
きる。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】重合性単重体を２段で乳化重合する方法で
   あって、まず１段目として重合開始剤を重合性単量体１
   １当り０．００５モル以上用い、かつ該重合開始剤の分
   解の半減期が２時間となる温度以上の温度で重合させて
   、低分子量体の重合体を得、次いで、２段目として重合
   性単量体を添加し、１段目よりも０〜５０℃低い温度で
   重合を行い、１段目で得られる重合体より高分子量の重
   合体を生成させることにより分子量分布の広い乳化重合
   体粒子を得ることを特徴とする免疫試薬用担体の製造方
   法。
2. 【請求項２】得られる乳化重合体粒子の平均粒径が２０
   〜５００ｎｍであることを特徴とする請求項１記載の免
   疫試薬用担体の製造方法。
3. 【請求項３】得られる乳化重合体粒子の数平均分子量が
   ５０００以上、分子量分散度が３以上である請求項１ま
   たは２記載の免疫試薬用担体の製造方法。
4. 【請求項４】請求項１、２または３記載の製造方法によ
   り得られる免疫試薬用担体に抗原又は抗体を感作して得
   られる免疫試薬。