JPH0420594B2

JPH0420594B2 -

Info

Publication number: JPH0420594B2
Application number: JP57094785A
Authority: JP
Inventors: Takashi Sasaki; Masaaki Kogo; Junji Watari; Tomoko Nakajima; Norio Nishikawa; Yoshikuni Matsui
Original assignee: Sapporo Breweries Ltd
Current assignee: Sapporo Breweries Ltd
Priority date: 1982-06-04
Filing date: 1982-06-04
Publication date: 1992-04-03
Also published as: JPS58212779A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、アルコール生産、醸造等の各種発酵
生産を有利にする酵母並にその製造法（創製法）
に関する。従来、ビール、ワイン、ウイスキー、清酒、焼
酎、泡盛等の酒類、味噌、醤油等の醸造、パン、
発酵乳等の食品発酵生産の発酵生産、パルプ廃液
の発酵、糖蜜などの糖質を原料とする各種アルコ
ール発酵生産、食用酵母、飼料酵母、核酸等の工
業原料酵母発酵生産、石油、メタノール、酢酸を
生産培地とする各種の発酵生産等に実用酵母が使
用されているが、その夫々その目的とする生産に
於て、その生産原料培地に存在し、又は外部から
侵入する酵母や細菌により、その良好な発酵生産
性を阻害され、又その結果生産物の品質の低下、
変敗等を生ぜしめる。従てかゝる目的とする発酵
生産を阻害する酵母（以下野生酵母と云う）や細
菌（以下汚染細菌と云う）による影響を防止する
ために、現状では原料培地の比較的高温の加熱殺
菌や生産設備の殺菌等の処理を必要とし、食品等
に於ては、生産物の比較的高温の加熱殺菌又はミ
クロフイルターによる無菌過等の処理を必要と
し、多大の時間と労力や精細な微生物管理を製造
コストの増大をもたらしている欠点を有する。本発明はかゝる従来の不都合を解消し、円滑容
易な高能率且つ経済的な発酵生産に利用される酵
母を提供することを目的とする。本発明者等は、上記目的のため、広く保存菌や
自然界等より汚染細菌を死滅させるような抗細菌
性を有する酵母を鋭意スクリーニングした結果、
上記の目的に適する新酵母を下記のように見出
し、これをそのまゝ実用酵母として利用し得るこ
とも知見した。即ち、醸造工場の廃水処理場の廃水より、常法
により酵母コロニーを分取し、下記の方法でスク
リーニングした。殺菌麦芽汁を分注した試験管に、分取した各供
試酵母を接種し培養発酵後、酵母を除去し、この
各試験管に下記の細菌を10000cells／ml接種し、
25℃で増殖の有無を経日観察した。使用細菌ラクトバチルスブレビス（Iactobacillus
brevis）、ペデイオコツカス・セレビシエ
（Pediococcus cerevisiae）、エンテロバクター・
アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）、クレ
ブシエラ・アエロゲネス（Klebsiella
aerogenes）、バチルス・アスポロゲネウム
（Bacillusu asporogenaus）。次に各発酵液を濃縮し、カツプ法（常法によ
る）により阻止円径を測定した。培地はハートイ
ンフユージヨン培地、シエドラー培地等を使用し
た。かくしてその抗細菌性の強さを測定した所、
特に強力な抗細菌性を有する酵母を見出した。而
してこれにつき、更に詳細に菌学的性質をチエツ
クした。 (a) 各培地における生育状態麦芽汁における生育状態発育良好 (b) 錯酸ソーダ培地上胞子を形成する (c) 射出胞子形成しない (d) 各生理学的性質最適生育条件 PH5.0 28℃生育の範囲
PH3.5〜6.8硝酸塩の同化（−）脂肪の分解
（−）尿素の分解（−）ゼラチンの液化
（−）カロチノイドの生成（−）顕著な有
機酸の生成（−）デンプン様物質の生成
（−）ビタミンの要求性（−）抗細菌性 (e) 下記化合物に対する同化性の有無

【表】更に、改めて抗細菌性テストをデイスクアガー
法、液体培養法により行なつた結果、下記の細菌
を死滅させることが分つた。バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）、
バチルス・リヘニフオルミス（Bacillus
licheniformis）、バチルス・メガテリウム
（Bacillus magatheriom）等のバチルス属、コリ
ネバクテリウム属（Corynebacterionspp.）、ミク
ロバクテリウムフラブム（Microbacteriom
flavum）、ザルチナ・ルテア（Sarcina lutea）、
ザルチナ・アルビダ（Sarcina albida）、セラチ
ア・マーセスンス（Serratia marsescens）、ス
タフイロコツカス・アウレウス
（Staphylococcus aureus）、ペデイオコツカス属
（Pediococcus spp.）、ラクトバチルス・ブレビス
（Lactobacillus brevis）、エツシエリキア・コリ
（Escherichia coli）、エンテロバクター・エアロ
ゲネス（Enterobocter aerogenes）、クレブシエ
ラ・アエロゲネス（Klebsiella aerogenes）、ク
レブシエラ・ニユーモニエ（Klebsiella
pneumoniae）、アエロモナス属（Aeromonas
sp.）、アシネトバクター属（Acinetobacter sp.）
ハフニア属（Hafnia spp.）、セラチアマルセセ
ンス（Serratia marcescens）、エツシエリチ
ア・コリ（Escherichia coli）、シユードモナ
ス・アエルギノーザ（Pseudomonas
aeruginosa）、シユードモナス・フラギ
（Pseudomonas fragi）等。上記の菌学的性質を、「ザ、イースツ、ア、タ
クソノミツク、スタデイ」２版（「THE
YEASTS Ａ taxonomic study」2nd edition，
ed.by J.Lodder，1970）に徴し、サツカロミセ
ス・セレビシエと菌学的性質が同じであるが、抗
細菌性を有する点で相異するので、これをサツカ
ロミセス・セレビシエＡ−３と命名した。
（Saccharomyces cerevisiae Ａ−３）以下これを便宜上抗細菌性酵母Ａ−３と称す
る。尚、該抗細菌性酵母Ａ−３は、微工研菌寄受
託番号第6549号として寄託されている。而して、
本発明者等は、該酵母Ａ−３を利用してこれ自体
で各種発酵生産を行ない得ること並に下記の方法
で従来の各種酵母にその抗細菌性を付与せしめた
抗細菌性酵母を得ることを知見した。即ち、本発
明は、該抗細菌性酵母Ａ−３の発見並に該抗細菌
性酵母Ａ−３等の抗細菌性を有する酵母の抗細菌
性因子（遺伝子）を少くとも１回の接合（交配）
法、細胞融合法又はこれらの組み合わせにより所
要の酵母、一般には、実用酵母に導入し得る抗細
菌性酵母に存する。而して、該接合法、細胞融合
法又はこれらの組み合わせは、必要に応じ、２回
以上繰り返し、前記酵母Ａ−３等の抗細菌性を有
する酵母のもつ目的とする特定の生産に於て、マ
イナスとなる因子（遺伝子）があれば、これを適
当に除去するべく、胞子形成、単胞子クローン分
割、単胞子クローン選出を通じ、２回以上繰り返
し、或はこれらの方法を組み合わせて行なうこと
が好ましい。次にその発酵生産に使用する１例を示せば、こ
れを廃糖蜜、パルプ廃液等の糖質含有原料に、適
当量接種して、従来のアルコール酵母を使用する
場合と同様の発酵条件で発酵させることにより、
アルコール発酵を行ないエタノールを得られる
が、この場合、本発明酵母を使用して有利なこと
は、前記原料培地を加熱殺菌するに当り、汚染細
菌を加熱殺菌するに必要な温度に加熱する必要が
なくそれよりも低温の例えば50〜70℃で野生酵母
の加熱殺菌を行なえば足り、燃費がそれだけ安価
である。更には、従来のミクロフイルターによる
細菌過を不要とし、除酵母だけで足り有利であ
る。尚、前記抗細菌性酵母Ａ−３は発酵生産用実
用酵母として利用することが出来、上記はアルコ
ール発酵生産の場合で説明したが、その菌学的性
質からみて、他のアルコール発酵にも利用できる
ことは明らかである。次に本発明の抗細菌性酵母の実施例と、該抗細
菌性酵母を発酵生産に利用する一例につき説明す
る。下記に実用酵母サツカロミセス・ウバルム
（Saccharomyces uvarum）〔旧称サツカロミセ
ス・カールスベルゲンシス（Saccharomyces
carlsbergensis）〕属、サツカロミセス・セレビ
シエ（Saccharomyces cerevisiae）に属するビ
ール醸造その他の実用酵母に抗細菌性を付与する
実施例につき添付図面の第１図を参考に説明す
る。抗細菌性因子１ａを核内に有する前記の抗細菌
性酵母Ａ−３１と抗細菌性因子を付与すべくサツ
カロミセス・セレビシエ（Saccharomyces
cerevisiae）BSRI−YB9−５（（財）醸造科学研
究所保存菌株）（参照符号２）を用意し、その
夫々につき、常法に従つて胞子形成を行ない夫々
の１倍体の単胞子クローンα及びａを作成する。このように準備した酵母Ａ−３１の単胞子株α
と実用酵母サツカロミセス・セレビシエ２の単胞
子株ａとを常法により交配し、接合子２′を得る。
即ち、この接合子２′はその核中に酵母Ａ−３１
のもつ抗細菌性因子１ａが導入された抗細菌性実
用酵母を得る。該抗細菌性実用酵母につき菌学的
性質を調べたが、抗細菌性が付加された以外は、
従来のビール酵母、サツカロミセス・セレビシエ
と同じであり、即ち、その菌学的性質は、酵母Ａ
−３と全く同じであつた。従て、上記の文献に徴
し、抗細菌性を有する点でサツカロミセス・セレ
ビシエと異なるので、サツカロミセス・セレビシ
エMAと命名した。これを用いて、ビール醸造、
アルコール発酵等を試験したが、低温殺菌培地で
足り、培地の細菌を死滅させ、良好な状態で発酵
生産が得られることを確認した。又、特に前記し
たように、従来必要とするミクロフイルターによ
る汚染細菌の除去いわゆる無菌過や、発酵生産
品の高温加熱殺菌を要しないので作業の省力化、
設備コストの低下等の利点をもたらす。尚、必要に応じ、抗細菌性酵母の特定の目的の
発酵生産の適性を向上せしめるため、その発酵生
産に実用の酵母との胞子接合（交配）法、細胞融
合法等を繰り返し行なうことが出来る。例えば、
ビール醸造の適性を向上せしめるため、ビール酵
母、との交配法等を繰り返し行なうことができ
る。即ち、図示の例では、該抗細菌性サツカロミセ
ス・セレビシエMAにつき、胞子形成と単胞子分
離を行ない１倍体の単胞子クローンを得、図面で
模写的にあらわした各クローン３〜６につき夫々
ビール試醸を行ない、そのうちビール醸造性劣化
因子１ｂの最小のクローン５を選出して例えば、
サツカロミセス・ウバルムIAM4206（参照符号
７）との細胞融合を行ないビール醸造性の向上し
た抗細菌性実用酵母MAを得た。これにつき菌学
的性質をチエツクした。これによれば抗細菌性酵
母Ａ−３と同じ抗細菌性を有する以外は、サツカ
ロミセス・ウバルム4206と同じ菌学的性質を有し
て居た。但し、西川らによる血清学的所見「J.
Ferment.Tech.57、No.５、364（1979）」では抗原
構造１，１０，１８を示した。かくして、前記文
献ザ、イースツに徴し、サツカロミセス・ウバル
ムMAと命名した。（微工研菌寄受託番号第6550
号）該酵母MAを使用しビール醸造した場合の抗細
菌性テストにつき以下説明する。ラクトバチルス属、ペデイオコツカス属、アエ
ロモナス（Aeromonas）属、エンテロバクター
（Enterobacter）属、クレプシエラ（Elebsiella）
属、ハフニア（Hafnia）属、アシネトバクター
（Acinetobacter）属、コリネバクテリウム
（Corynebacterium）属、バチルス（Bacillus）
属に属するビール汚染細菌の11種の菌株を、前記
の改質酵母菌株を1500万cells／mlづつ接種した
11°Bgの各麦芽汁に夫々１万cells／mlづつ添加し
て、その主発酵をその夫々につき８℃、10℃、17
℃に分けて行なつた。然る所、発酵温度で多生の
長短はあるものの３〜10日間で全ての細菌は死滅
し、その夫々につきその後無菌的に良好なビール
醸造をもたらした。又、麦芽汁５を用いて、前記改質酵母を使用
して常法によりビールを試醸し、過後、330ml
のびんに分注し、カーボネーシヨンしてびん詰ビ
ールとする際に、前述の11種の細菌各菌株
10000cells／ml添加し、その各びん詰を30℃に保
ち、菌の増殖を経日観察したが、全く増殖は認め
られなかつた。従来の改質しない通常の酵母７を
使用し試験し、その各びん詰時前述の11種の細菌
の各菌株10000cells／mlを添加し、その各びん詰
を30℃に保つた所、いづれのびん詰も３〜７日後
混濁を生じビールを変敗させた。更に、本発明は上記従来の欠点を解消し、前記
の低温加熱殺菌すら要せずに、無殺菌で発酵生産
を行ない得る抗細菌性と抗野生酵母性（キラー
性）とを有する抗汚染菌性酵母を提供することを
目的とし、抗細菌性を有する酵母又は抗細菌性因
子を導入されて得られた抗細菌性を有する酵母ろ
キラー性を有する酵母（いわゆるキラー酵母）と
のみを素材とし、或は更に両因子を導入すべき所
定の酵母とを素材とし、少くとも１回の接合（交
配）法、細胞融合法、又はこれらの組み合わせを
通じて、該両因子の導入された抗細菌性並にキラ
ー性を有する酵母を酵母とすることができる。次
に第２図を参考に本発明実施例を詳述する。抗細
菌性因子を導入する酵母素材として、抗細菌性を
有する酵母である前記のサツカロミセス属に属す
る酵母例えば酵母Ａ−３を使用するか抗細菌性因
子を導入されて得られた抗細菌性酵母である前記
の製造法で得られたサツカロミセス・セレビシエ
MAやサツカロミセス・ウバルムMAその他適宜
得られる抗細菌性の発酵生産用実用酵母を使用す
るが、第２図示の例では、酵母Ａ−３を使用し
た。これと交配又は細胞融合させるとキラー因子を
導入する素材としてキラー酵母は公知のものとし
て、サツカロミセス属に属するサツカロミセス・
セレビシエG706、仝NCYC1006、仝NCYC738、
仝NCYC235、キヤンデイダ（Candida）属、デ
バリオミセス（Debaryomyces）属、ハンゼヌラ
（Hansenula）属、ピヒア（Pichia）属、トルロ
プシス（Torulopsis）属、クルイフエロミセス
（Eluyveromyces）属のいずれかに属するキラー
酵母を使用する。キラー酵母の判定は、クロスス
トリーキング法、カツプ法等によつた。第２図示
ではキラー酵母としてG706を使用した。該G706
は、アルコール、酒類等の発酵生産を阻害する野
生酵母サツカロミセス・ジアスタテイクス
（Saccharomyces diastaticus）、サツカロミセ
ス・パストリアヌス（Saccharomyces
pastorianus）、サツカロミセス・エリプソイデウ
ス（Saccharomyces ellipsoideus）等のサツカ
ロミセス属、トルロプシス属、ハンゼヌラ属等の
野生酵母を死滅させる性質を有する。このように抗細菌性を有する酵母Ａ−３とキラ
ー酵母G706とを組み合せ素材として、先づ該酵
母Ａ−３１につき胞子形成、単胞子分離を行ない
１倍体のα型単胞子クローンを得た。これを細胞
質内にキラー因子１０ａを有するａ型１倍体のキ
ラー酵母G706と交配を行ない抗細菌性因子１ａ
とキラー因子１０ａの両因子が導入された接合子
を得る。こゝに得られた酵母は、両親株の夫々も
つ抗細菌性とキラー性とを併せ有する（之を抗汚
染菌性と以下略称する）以外は、その菌学的性質
はサツカロミセス・セレビシエに同じで、これを
サツカロミセス・セレビシエMAKと命名する。
この抗汚染菌性酵母は、アルコール発酵等の発酵
生産に於て、加熱殺菌しない糖蜜等の糖質原料に
接種し、発酵生産を行なつた所、その抗汚染菌性
により野生酵母、汚染細菌を死滅させ良好な状態
で発酵生産を行なうことが出来た。尚、抗汚染菌性酵母は、必要に応じ、その特定
の目的の発酵生産の適性を向上せしめるため、例
えば、ビール醸造の適性を向上せしめるため、そ
の発酵生産に実用の酵母との胞子接合（交配）
法、細胞融合法等を繰り返し行なうことができ
る。例えば、ビール醸造の適性を向上せしめるた
め、ビール酵母との交配法等を繰り返し行なうこ
とができる。即ち、図示の例では、前記のサツカ
ロミセス・セレビシエMAKを胞子形成、分割し
て１倍体の単胞子クローンとし、その単胞子クロ
ーンF₁（１）〜F₁（４）の中から、ビール醸造性
劣化因子１０ｂの最も少ないF₁３株〔１ｂ因子
は１０ｂ因子より劣化付与性が小さい〕を選出
し、これを親株αとして別個に用意したビール酵
母サツカロミセス・ウバルム、サツカロミセス・
セレビシエ（参照符号２）の単離胞子クローンａ
株とを接合（交配）させる。ビール醸造適性の向
上した抗汚染菌性接合子を得た。この接合子株に
つき、菌学的特性を調べたが、前記第１次交配に
より得られたサツカロミセス・セレビシエMAK
と同じであつた。従て、この抗汚染菌性酵母もサ
ツカロミセス・セレビシエMAKであり、このビ
ール醸造に使用し、香味の良い良質のビールが得
られることが試験により確認された。この場合、
この酵母MAKの胞子形成、分割を行ない多数の
単胞子クローンの中から醸造性劣化因子の最小の
ものを選出しこれをビール醸造に用いることが最
も好ましい。而してこのビール醸造に於て、麦芽
汁培地は加熱殺菌せず、その主発酵、後発酵は、
無菌状態で良好に行なわれ、その後ミクロフイル
ターを使用せず、除酵母を分離後、びんに分注し
た後も加熱殺菌せずにびん詰品として、経日観察
したが、良好な香味をもつ初期のビールが長期間
維持された。尚、上記のようにして得られた抗汚染細菌性サ
ツカロミセス・セレビシエMAKのビール醸造性
を更に向上せしめるため、該MAKにつき胞子形
成、分割を行ないその単胞子クローンF₂（１）〜
F₂（４）の中から最もその劣化因子の最小の単離
胞子株F₂(3)を選出し、この選出株とサツカロミ
セス・ウバルムIAM4206（ATCC9080）株との細
胞融合を行ないビール醸造性の更に改善された抗
汚染菌性酵母を得た。この菌学的性質を調べた
所、ザ、イースツ記載のサツカロミセス・ウバル
ムと一致した。即ち、その詳細を下記する。 (a) 各培地における生育状態麦芽汁（４〜６）×（５〜10）μ円形又は
卵形、皮膜形成弱、下面酵母麦芽汁寒天培地円形又は卵形単又は２
連コロニー表面平滑 20ppm クリスタルバイオレツト添加麦芽
汁寒天培地発生せず (b) 子襄胞子の形成酢酸ソーダ培地上殆んど形成せず (c) 射出胞子の形成なし (d) 各生理的性質最適生育条件 PH4.5〜6.5 28℃ 生育の範囲 PH3.8〜6.8 ０〜35℃ 硝酸塩の同化 − 脂肪の分解 − 尿素の分解＋ゼラチンの液化 − 好浸透圧性又は耐浸透圧性 − カロチノイドの生成 − 顕著な有機酸の生成 − デンプン様物質の生成 − ビタミン要求性ビオチン、パントテン酸
カルシウムイノシトール要求性弱 (e) 炭素源化合物に対する発酵性と同化性

【表】その抗細菌性性とキラー性については、夫々前
記した酵母Ａ−３のもつ抗細菌性とキラー酵母
G702のもつキラー性とをそのまゝ有していた。
尚、前記の西川らの血清学的分類によれば、抗原
構造は、「１，10，18」であつた。而して、上記抗汚染性酵母をサツカロミセス・
ウバルム（旧称サツカロミセス・カールスベルゲ
ンシス）MAKと命名した。これは微工研菌寄受
託番号第6551号として寄託されている。該サツカロミセス・ウバルムMAKにつき抗細
菌性とキラー性とを下記のように試験した。被検
菌として、ラクトバチルス属、ペデイオコツカス
属、アエロモナス属、エンテロバクター属、クレ
ブシエラ属、ハフニア属、アシネトバクター属、
コリネバクター属、バチルス属、シユードモナス
属の各属より選んだ10株の汚染細菌とサツカロミ
セス属、トルロブシス属、ハンゼヌラ属等から選
んだ10株の野生酵母を夫々１種づつを１組みとし
た混合菌を10組つくり、この各組につき各菌種
250万cells／mlを、前記と同様に前記サツカロミ
セス・ウバルムMAKを夫々1500万cells／ml接種
した各麦芽汁サンプルにつき前記と同様に主発酵
かせた所、各サンプル中の混合菌は３〜10日の間
に完全に死滅した。又貯酒後のびん詰ビールにつ
き前記と同様に、混合菌各500cells／ml添加し、
25℃に保温して経日観察したが全く菌の増殖は認
められなかつた。上記の試験に於て、野生酵母と汚染細菌の生存
の有無は、TTC染色法によりシクロヘキシミド
添加培地による培養で毎日確認し、生存率０％を
完全死滅とした。上記の実施例から容易に理解させるように、抗
細菌性因子とキラー性因子とを実用酵母に導入す
る方法として、色々な他の組み合わせが考えられ
る。例えば、（）実用酵母に対して、抗細菌性因
子を有する酵母（酵母Ａ−３や抗細菌性因子を導
入された酵母）とキラー因子を有する酵母（キラ
ー酵母やキラー因子を導入された実用酵母）の交
配又は細胞融合を順次行なうこと。（）キラー
酵母と酵母Ａ−３又は抗細菌性酵母MAとの細胞
融合後、この融合体と実用酵母との細胞融合又は
交配、等々である。次に上記のサツカロミセス・ウバルムMAKを
使用しビール醸造法の１例を詳述する。常法によつて調製した冷麦汁を該MAK酵母を
適当量接種し、８〜15℃の範囲で主発酵を約１週
間行ない、その後０〜２℃の範囲で約30日間後発
酵を行ない熟成する。次で該MAK培養酵母を
過した後、従来必要としていたセラミツクフイル
ター、メンプランフイルター等のミクロフイルタ
ーによる細菌の無菌過を行なうことなく、直ち
に生ビール製品とし、或はびんに分注し、カーボ
ネーシヨンし打栓しびん詰製品とし、この間従来
必要とするびん詰め後の60℃、20〜30分殺菌処理
を全く行なわれなかつた。かくして、その製品後
長期に亘り、貯蔵し細菌汚染によるにごりの発生
の有無を経日観察したが、異常なく、而も香味の
良い品質を維持していることが確認された。このように、本発明の抗汚染菌性酵母を使用す
れば、全く無菌状態で安定した良質の発酵生産に
利用することができる。上記実施例の全ての抗細菌性酵母はビール醸造
以外の酒類、アルコール発酵、その他の発酵生産
に利用できることは云うまでもない。上記本発明の抗細菌性因子の導入、又は該因子
とキラー因子の両因子の導入は、各種の発酵生産
に夫々用いられている各種実用酵母に適用される
ことは云うまでもなく、又かくして得られる夫々
の抗細菌性実用酵母、又は抗汚染菌性実用酵母を
その対応する各発酵生産に使用するときは、従来
に比し低温殺菌で済み、或は全く加熱殺菌や細菌
過等を行なう必要がなく極めて有利な発酵法を
もたらす。次に本発明が適用される実用酵母を例示する。
サツカロミセス属、シゾサツカロミセス属、チゴ
サツカロミセス属、ピヒア属、チゴピヒア属、デ
バリオミセス属、ハンデヌラ属、エンドミコプシ
ス属、ハンゼニアスポラ属、スポロボミセス属、
クリプトコツカス属、クレツケラ属、トルコプシ
ス属、ロドトルラ属、ミクロトルラ属、ブレタノ
ミセス属、キヤンデイダ属、オイデイウム属、ク
ルイフエロミセス属、クラドスポリウム属のいづ
れかに属する各種発酵生産用実用酵母である。而
してこれら実用酵母をその発酵生産の種類との関
係でその具体例を示せば、シゾサツカロミセスポ
ンベ（Schizosaccharomyces pombe）、サツカ
ロミセス・デルブルツキー（Saccharomyces
delbruechii）等のアルコール発酵酵母、サツカ
ロミセス・セレビシエ等のウイスキー酵母、サツ
カロミセス・サケ等の清酒酵母、サツカロミセ
ス・エリプソイデウス等のワイン酵母、サツカロ
ミセス・ルーキシー（Saccharomyces rouxie）
等の醤油酵母、トルロプシス・ミソ
（Torulopsis miso）、チゴサツカロミセス・ミソ
（Zygosaccharomyces miso）、等の味噌酵母、サ
ツカロミセス・アワモリ（S.awamori）等の泡
盛酵母、サツカロミセス・セレビシエ等の焼酎酵
母、サツカロミセス・セレビシエ、シゾサツカロ
ミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces
pombe）等のパン酵母、クルイフエロミセス・
ラクテイス（Kluyveromyces lactis）等の発酵
乳酵母、キヤンデイダ・ロプスタ（Candida
robusta）、クラドスポリウム・レジナエ
（Cladosporium resinde）、トルロプシス・フア
マタ（Torulopsis famata）等の石油、メタノー
ル、酢酸を原料培地とする発酵生産酵母、サツカ
ロミセス・セレビシエ等の食用飼料用酵母、オイ
デイウム・ラクテイス（Oidium lactis）、ハンデ
ヌラ・アノマラ（Hansenula anomala）、トルロ
プシス・ユテイリス（Torulopsis utilis）、等の
工業原料酵母生産用酵母。本発明を夫々の上記発酵生産用実用酵母に適用
するときには、その抗細菌性酵母又は抗汚染細菌
性酵母が得られ、又その夫々の発酵生産に使用す
るときは、その発酵生産の能率の向上、容易な生
産管理で低コストの生産が得られる。尚、本発明で使用する抗細菌性を有する酵母Ａ
−３やキラー酵母、或はこれを導入する実用酵母
については、夫々その変種や変異株を使用し得る
ことは云うまでもない。次に本発明の抗汚染菌性酵母MAKの詳細な実
施例につき記載する。実施例１抗細菌性酵母サツカロミセス・セレビシエＡ−
３株を常法により胞子形成させ、その単胞子をマ
ニピユレーターにより分割してα型１倍体の単胞
子クローン15株を得た。これらのアクリフラビン
処理し、呼吸欠損変異株〔ρ^-〕とした。次にこれ
らとキラー酵母サツカロミセス・セレビシエ
G706a型ハプロイド株（his4、leu2、thr2
〔killer〕）とを接合させる。即ち、その１白金耳
づつ菌体を各別にYEPD培地４mlに加え、25℃、
24時間培養し混合する。遠心後段階希釈したの
ち、0.1mlをMin.glycerol培地を用いて塗布培養
する。25℃、３日間培養し接合によるコロニーを
釣菌する。このようにして得た接合子株F₁を胞
子形成、単胞子分離を行ない栄養要求性his4、
leu2、thr4のいづれか１つ以上を持ち、且つキラ
ー性及び抗細菌性を持つ子株F₁90株を分離取得
した。これらの中から比較的醸造性劣化性形質の
少ない株を選出し、これと別個に胞子形成と単胞
子クローン分離とを行なつて準備した通常のビー
ル酵母サツカロミセス・セレビシエ１倍体との接
合を行なつた。このようにして得られた接合子株F₂につき、
胞子形成、単胞子分割により110株の単胞子クロ
ーンを分取した。これらにつきビール試醸性をチ
エツクし、この中から醸造性に最適の接合子F₂
株を選出し、この選出株と優れた醸造性をもつビ
ール酵母サツカロミセス・ウバルムIAM4206
（ATCC9080）株とのプロトプラスト融合を次の
ように行なつた。即ち、その両株につき、１白金耳をYEPD（イ
ーストエキス１％、ペプトン２％、グルコース２
％）液７mlに植菌し、８時間振とう培養（30℃）
した培養液を100mlのYEPDに植菌し、更に16時
間振とう培養する。次に遠心で集めた菌体を新し
いYEPD培地100mlに植菌し、更に３〜４時間振
とう培養する。遠心で集めた菌体を高張バツフア
ー（１ MKC1、10mMTrisHC1、PH7.5）で１
度洗つた後、２−メルカプトエタノール0.2mlを
含む高張バツフアー50mlに懸濁し、30℃20分間処
理する。遠心した細胞をチモリアーゼ−5000（細
胞壁分解酸素）−5000 100〜400μｇ／mlと80μ
の２−メルカプトエタノールを含む高張バツフア
ー20ml中に懸濁し、細胞壁を分解する。プロトプ
ラスト化の進行を10分毎にチエツクし、形成が完
了したら高張バツフアーで３回洗う。（プロトプ
ラスト化工程）。洗浄プロトプラストをPEG40
％、50mM CaCl₂液に懸濁し、30℃15分静置後、
20分間遠心（2000rpm）する。融合したプロトプ
ラストを高張バツフアーに懸濁した後、再生培地
（1MKC1.3％寒天を含む。融解後、45℃に保ち液
状にしておく。）に加え、シヤーレに流し込み固
化させる。25〜30℃で培養し、出現するコロニー
より融合株を取り出す。かくして、キラー性と抗細菌性を有し且つ醸造
性の優れたサツカロミセス・ウバルムMAK株
（微工研菌寄受託番号第6551号）を得た。実施例２抗細菌性酵母サツカロミセス・セレビシエＡ−
３株を常法により胞子形成させ、その単胞子をマ
ニピユレーターにより分割してα型１倍体の単胞
子クローン15株を得た。これらをアクリフラビン
処理し、呼吸欠損変異株〔ρ^-〕とした。次にこれ
らとビール酵母サツカロミセス・セレビシエ
BSRI−YB9−5a型ハプロイド株とを接合させ
る。即ち、その１白金耳づつ菌体を各別にYEPD
培地４mlに加え、25℃、24時間培養し混合する。
遠心後、段階希釈したのち、0.1mlをMin.
glycerol培地を用いて塗布培養する。25℃、３日
間培養し接合によるコロニーを釣菌する。このよ
うにして得た接合子株F₁即ち抗細菌性ビール酵
母サツカロミセス・セレビシエMAを得た。この
接合子株F₁を胞子形成、単胞子分離を行ない栄
養要求性his4、len2、thr4のいづれか１つ以上を
持ち且つ子株F₁50株を分離取得した。これりの
中から比較的ビール醸造性劣化形質の少ない株を
選出し、これと優れた醸造性をもつビール酵母、
サツカロミセス・ウバルムIAM4206
（ATCC9080）株とを前記実施例１と同様にプロ
トプラスト融合を行ない抗細菌性ビール酵母、サ
ツカロミセス・ウバルムMA株（微工研菌寄第
6550号）を得た。このように本発明によれば、抗細菌性を有する
酵母Ａ−３の知見と共にその抗細菌性因子を交配
法、細胞融合法、又はこれらの組み合わせの少く
とも１回を通じて所要の発酵生産用実用酵母に導
入することにより各種の所要の発酵生産用実用酵
母として用いることができる抗細菌性酵母を提供
することが出来、又必要に応じ、キラー因子を有
する酵母、キラー酵母又は実用酵母を併せて導入
することにより、各種の発酵生産用実用酵母とし
て用いることができる抗汚染菌性酵母を提供する
ことが出来、このようにして得られた菌を使用
し、従来の発酵法に比し微生物的管理を著しく容
易にし又無殺的に高能率、低コストの発酵生産が
得られる等の効果を有する。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の抗細菌性酵母を得るための１
実施例、第２図は本発明の抗汚染菌性酵母を得る
ための１実施例を示す。１……抗細菌性を有する酵母Ａ−３、１ａ……
抗細菌性因子、２……実用酵母、MA……抗細菌
性酵母、F₁（３）〜F₂（６）……単胞子クローン
MA株、７……実用酵母、１０……キラー酵母、
１０ａ……キラー因子、MAK……抗汚染菌性酵
母。

Claims

【特許請求の範囲】１抗細菌性を有するサツカロミセス・セレビシ
エＡ−３（微工研菌寄受託番号第6549号）。２サツカロミセス・セレビシエＡ−３を親株と
する抗細菌性サツカロミセス・ウバルムMA（微
工研菌寄受託番号第6550号）。３サツカロミセス・セレビシエＡ−３を親株と
する抗汚染菌性サツカロミセス・ウバルムMAK
（微工研菌寄受託番号第6551号）。