JPH04134265A - カブトガニ・アメボサイト・ライセートの調製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野コ カブトガニ・アメポサイト・ライセードの調製法に関す
る。

［従来の技術１ カフ’　ｌ−カニの血球細胞抽出液（以下、ＬＡＬと記
す。）か、細菌性発熱物質である内要素（以下、エンド
トキシンと記す。）と反応して凝固することが広く知ら
れている。

コノ反応を基礎として、種々のエンドトキシン検出方法
か開発されている。

最近になって、第１図に示すような段階的反応でコアギ
ュロゲンかコアギュリンとなって凝固（ゲル化）すると
言う上記凝固反応の機構が解明されｔ二　Ｓ　　、　　
Ｉ　　ｗａｎａｇａ　　ｅｔ　　ａｌ−、Ｔｈｅ　　ｈ
ｅｍｏｌｙｍｐｈ　　ｃｏａｇｕｌａｔ＋ｏｎ　ｓｙｓ
ｔｅｍ　＋ｎ　＋ｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ　ａｎｉｍａ
ｌｓ、　Ｊ、　ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｅｍ、、　５．２５
５　２６８　（１９８６）。この機構によれば、ＬＡＬ
の凝固は、エンドトキシンによって、開始する系（Ｃ因
子系）と、（１−３）−β−Ｄ−グルカン（例えば、カ
ードラン、部分カルボキンメチル化（１→３）−β−Ｄ
−グルカンなど）によって開始する（Ｃ因子系）とが存
在することが理解される。

本発明者等は、先に特定の分子量を有する（１−３）−
β−Ｄ−グルカン構造体は、ＬＡＬの（１−３）−β−
Ｄ−グルカンによって反応か開始する系（Ｇ因子系）の
活性化を阻害することを発見し、カプトカニ・アメポサ
イト・ライセ〜トＧ因子活性化阻害剤どして特許出願を
行った（特願昭６３−２１６３４１号及びｗｏ　　９０
１０２９５１号）。

しかし、ユンドトキシンに特異的なＬＡＬを得る目的で
、この阻害剤をＬＡＬに添加した場合、ＬＡＬ中には阻
害剤とＧ因子の複合体か残されており、加える検体によ
っては複合体が解離し、遊離したＧ因子がＧ因子活性化
物質によって活性化される危険性がある。

［発明が解決しようとする課題］ 本発明は、ＬＡＬの凝固機構において、（１−３）−β
−Ｄ−グルカンによって最初に活性化されるＧ因子を含
まないＬＡＬの提供をその目的とするものである。

［課題を解決するための手段］ すなわち、本発明によれは、式［Ｉ］ （式中、ｎは２〜３７０の数を表す） で示される（１−３）−β−Ｄ−ゲルコンド構造体を不
溶性担体に固定化して得られる不溶性固定化物に、カプ
トカニ・アメポサイト・ライセードを接触させることを
特徴とする、エントドキノンＩこ特異的に反応するカブ
トガニ・アメポサイト・ライセードの調製法を要旨きす
るものである。

本発明において使用される（１→３）−β−Ｄグルコシ
ド構造体は、下記式 で示される（１−３）−β−Ｄ−グルコシド構造単位（
分子量：１６２）が連続して２〜３７０個、好ましくは
３〜３１０個、より好ましくは４〜１８０個結合したポ
リ−（１→３）−β−Ｄ−ゲルコンド構造部分１以下、
ポリ（１−３）ゲルコンド構造部分という］を１分子中
に少なくとも１つ含有するポリグリフシトである。

かくして、本発明で使用されるポリグリコンドは、ポリ
（１−３）ゲルコント構造部分を１分子中に少なくとも
１つ含有することが必要である。

例えば、本発明で使用されるポリグリコシドは、突貫的
に１つのポリ（ｌ→３）ゲルコンド構造部分のみからな
るもの、例えば下記式 ゲルコント構造部分に、下記式 し−」 で示される（１−４）−β−Ｄ−グルコシド構造単位の
１つもしくはそれ以上又は下記式で示される（１−６）
−β−Ｄ−グルコシド構造単位の１つもしくはそれ以上
又は下記式式中、 ｎは２〜３７０、好ましくは３〜３１０、より好ましく
は４〜１８　０の整数である、で示されるポリ−（ｌ→
３）−β−Ｄ−グルコシドであることができ、また１つ
のポリ（１→３）ＣＨ，，０１１ ＯＲ。

式（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＴ）中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ１
の少くとも１つはメチル基、ヒドロキシメチル基、カル
ボキシメチル基、アセチル基、硫酸基、リン酸基等化学
的に導入し得る官能基およびそれらの金属塩、アンモニ
ウム塩及び有機アミン塩から選ばれる残基を表わし、そ
して残りは水素原子を表わす、 で示される修飾されたβ−Ｄ−グルコシド構造単位の１
つもしくはそれ以上から構成される糖鎖が結合した［こ
の糖鎖は前記ポリ（１→３）グルコシド構造部分に分岐
鎖として結合していてもよい］構造のものであってもよ
い。

さらにまた、本発明で使用するポリグリコンドは、２つ
又はそれ以上の前記ポリ（１−３）ゲルコンド構造部分
か、他の糖鎖構造部分を挾んで下記式 ％式％ 式中、 Ａ１、Ａ２、・・・・・はそれぞれ前記式（Ｉ）で示さ
れる（ｌ→３）−β−Ｄ−ゲルコンド構造単位か連続し
て２〜３７０個、好ましくは３〜３１０個、より好まし
くは４〜１８０個結合しｌ：ボリ−（１−３）−β−Ｄ
−グルコシド構造部分を表わし、Ａｏ、Ａ２、・・・・
・の各構造部分を構成する式（１）の単位の数は互に異
なっていてもよく、そしてＢ４、Ｂ２、・・・・・は各
々同一もしくは相異なる他の糖鎖構造部分を表わす、 で示されるように連結した構造のものであってもよい。

ここで、Ｂ１、Ｂ２、・・・・・によって表わされる他
の糖鎖構造部分としては、例えば前記式（ｎ）、（Ｉ［
）、（ＩＶ）、（Ｖ）又は（ＶＩ）で示される構造単位
の１個又は２個以上のブロックからなる構造部分が挙げ
られる。

さらにまた、本発明で使用するポリグリコシドは、前記
ポリ（１−３）ゲルコンド構造部分か、上記ＢＩ、Ｂ２
、・・・・・によって表わされる如き他の糖鎖構造を挾
んで前記式（Ｊ）で示される（１−３）−β−Ｄ−グル
コ７ド構造単位か連続して３７１個以上結合した長鎖の
ポリ−（１→３）β−Ｄ−グルコシド構造部分か連結し
た構造のものであってもよい。

従って、本発明で使用されるポリグリコシドは前記ポリ
（１−３）ゲルコンド構造部分を１分子中に少なくとも
１つ含をするものであることを必須とするものであって
、その分子量は特に制約されるものではない。

また、本発明で使用されるポリグリコシドは前記のポリ
（１−３）グルコシド構造部分を１分子中に少なくとも
１つ含有するものから実質的になることが好ましいが、
しかし必ずしもそうである必要はなく、例えば、前記式
（Ｉ）で示される（ｌ＝３）−β−Ｄ−ゲルコント構造
単位か連続して３７１個以上結合した高分子量・のポリ
−（１−３）−β−Ｄ−ゲルコンド構造部分を含有する
他のポリグリコントか混在していてもよい。何んとなれ
は、本発明によるポリグリコシドは、ＬＡＬのＧ因子活
性化系の開始因子であるＧ因子に、Ｇ因子活性化物質で
ある高分子量のポＩＪ−（１→３）−β−Ｄ−ゲルコン
ドよりも速く強く結合して活性化Ｇ因子への活性化を阻
害し、かかる高分子量のポリ−（１→３）−β−Ｄ−ゲ
ルコンドの存在によってその阻害作用に実質的な影響が
ないからである。

なお、本明細書においてポリグリコシドの分子量は、分
子量既知の標準物質を用い下記の条件でゲルパーミエイ
ションクロマトグラフイーを行ない標準曲線を作成し、
次に供試試料について同じ条件でクロマトグラフィーを
行ない、その結果を標準曲線と対比することにより求め
た値である。

カラム：　ＴＳＫｇｅｌ　Ｇ−ＰＷＸＬシリーズ（東ソ
ー株式会社）７−８Ｘ　３００ｍｍ数種数本 移動相：　Ｑ、３ＭＮａＯＨ 流　速：　０．５ｍｌ／　ｍｉｎ 試料溶液濃度：　０．１−５ｍｇ／　ｍｌ試料溶液注入
量：　Ｏ，１ｍ カラム温度：室温 検出法：示差屈折計（Ｌ　Ｋ　Ｂ社）による測定又はフ
ェノール硫酸法による糖定量 標準物質：　ＴＳＫ標準ポリエチレンオキシド（東ソ株
式会社）およびポリエチレングリコ ール（半井化学薬品株式会社）の重量平均分子量が１．
０００から８６０，０００の１０種を使用。

本発明において用いられる上記の如き特性をもつポリグ
リコシドは、天然に由来するものであってもよく、或い
は合成されたもの又は前記式（１）で示される（１−３
）−β−Ｄ−グルコシド構造単位を３個以上含有するポ
リ（１−３）−β−Ｄグルコシドの一部を化学的に修飾
したものであってもよい。通常は天然に由来するものの
方が入手容易である。そのようなポリグリコシドの具体
例としては以下に記載するものか挙げられる。

（１）前記式（Ｉ）で示される（１−３）−β−Ｄ−ゲ
ルコント構造単位のみから実質的になる実質的に直鎖状
のポリグルコント二例えは、アルカリ土類金属（Ａ　ｌ
ｃａｔｉｇｅｎｅｓ）　／＜クチリア由来の（ｌ−３）
−β−Ｄ−グルカン：Ｗ毛藻（Ｅ　ｕｇｉｅｎａ）由来
のパラミロン；高等植物の繊維組織のβ−グルカン又は
篩管から抽出されるカロース：上記（１−３）−β−Ｄ
−グルカンやＬ　ａｍｉｎａｒｉａ（’：］　７ブ属）
、Ｅ　１ｓｅｎｉａ　（アラ金属）等の褐藻類由来のラ
ミナラン゛類等の部分氷解物中に含まれる高重合度の（
ｌ→３）−β−結合からなるＤ−グルコース重合体９ラ
ミナリデキストリン（重合度１０〜２０のもの）、ラミ
ナリオリゴ糖（重合度１０以下のもの）、等。

（２）前記式（Ｉ）で示される（２−３）−β−Ｄ−グ
ルコシド構造単位と前記式（ｎＩ）で示される（１→６
）−β−Ｄ−グルコシド構造単位の両者を含有するポリ
グリコシド：例えば、ａ）（１−３）−β−結合からな
る主鎖にｌ〜数個の（１−６）−β−結合か連鎖したグ
ルコース又はグルコース重合体か組込まれたもの、例え
は、Ｅ　１ｓｅｎｉａ　（アラ金属）褐藻類由来のラミ
ナラン類。

ｂ）上記ａ）の（１−３）−β−結合で連鎖したグルコ
ース又はグルコース重合体にさらに（１→３）−β−結
合の糖鎖が（１−６）−β−結合で分岐し、また特に糖
鎖の一部に他の糖部分を含みうるもの、例えば、Ｌ　ａ
ｍｉｎａｒｉａ　（コンブ属）褐藻類由来のラミナラン
類、Ｏｃｈｒｏｍｏｎａｓ、　Ｐ　ｈａｅｏｄａｃラン
類、Ｐｏｒｉａ（ブクリヨウ菌）由来のバキマン等。

Ｃ）さらに多くの分岐をもち、樹状構造を有する子嚢菌
、担子菌、および藻菌類の細胞壁を形成するβ−グルカ
ン、例えばＰ　ｈｙｔｃｐｈｔｈｏｒａの細胞壁由来の
グルカン、等。

ｄ）（１→３）−β−結合よりなる直鎖状グルカンに（
］−６）−β−結合でグルコースが連結しているもの、
例えはグルコース単位３残基当り１残基の割合で分岐の
あるＳ　ｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ由来のス米のグリ７オラ
ンＬ　Ｅ　Ｓ　ｃｌｅｒｏｔｉｕｍ、　Ｃｏｒｔｉｃｉ
ｕｍ。

Ｓ　ｔｒｏｍａシ１ｎｉａ等に由来するスクレログルカ
ン類等。

また、（１−３）−β−結合よりなる直鎖状グルカンの
グルコース単位５残基当り２残基の割合で（１−６）−
β−結合でグルコースが結合しているもの、例えは、Ｌ
ｅｎｔｉｎｕｓ　（シイタケ）のレンチナン、等。

ｅ）（１−６）−β−結合よりなる直鎖状グルカンのグ
ツしコースのＣ−３位から（■→３）−β−結合でグル
コース鎖が複数分岐しているもの、例えば、Ｓ　ａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓ　（パン酵母）の細胞壁由来のβ−
グルカン、等。（３）前記式（１）で示される（１→３
）−β−Ｄ−グルコシド構造単位と前記式（ｒＬ）で示
される（１−４）−β−Ｄ−グルコシド構造単位の両者
を含有するポリグリコシ由来するりヒエチン類、オオム
ギ胚乳中に含まれるβ−グルカン等の（１−４）−β−
オリゴゲルコツトが（１−３）−β−結合により連結し
た糖鎖構造からなるもので、所々に（１−３）−β−オ
リゴグルコシド構造を含むもの。

以上に述へたポリグリコンドの成る種のものは市販品と
して入手することかでき、それらはそのまま利用するこ
とができるが、必要に応じて、糖類を部分的に分解し及
び／又は分別処理に付して、前記式（Ｉ）で示される（
１−３）−β−Ｄ−ゲルコンド構造単位を前記特定量で
含有するポリグリコンドに冨む画分を調製し、それを利
用してもよい。

かかる糖鎖の部分的分解及び分別処理はそれ自体既知の
方法で行なうことができる。例えば、糖鎖の部分分解は
酸またはアルカリ、β−グルカナーゼを用いる加水分解
、加酢分解、音波処理等により行うことができる。また
分子量分画は、アルコール、アセトン、エーテル等の有
機溶媒や塩類を用いる分別沈澱法、分子篩剤や分子篩膜
を用いる分画により行うことかできる。

また、上記（１）〜（３）に例示した如きポリグリコン
ドは、糖鎖の一部を、メチル基のようなアルキル基、ヒ
ドロキノメチル基のようなヒドロキシアルキル基、カル
ボキンメチル基の如きカルボキンアルキル基、アセチル
基、硫酸基、リン酸基なとの酸基、その他の官能基によ
って化学的に修飾されていてもよい。それらはそれ自体
既知の方法でかかる官能基を導入することによって調製
することかできる［例えば、（１）安藤、寺山、西沢、
山用編、生化学研究法Ｉ、２８４〜３０３（１９６７）
、朝食書店、（２）Ｗｈｉｓｔｌｅｒ、　Ｒ，Ｌ、　ｅ
ｄ、；　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａ
ｔｅ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｎ［、ｌ　９３−２６７　
、２７１−３３１　（１９６４）、　Ａｃａｄｅｍｉｃ
　Ｐｒｅｓｓ等参照１゜特に、Ｇ因子活性化作用をもつ
分子量が約６０゜０００以上の（１−３）−β−Ｄ−グ
ルカンは部分的な化学的修飾によって、そのポリ−（１
−３）β−Ｄ−ゲルコンド構造部分における前記式（１
）で示される（１−３）−β−Ｄ−グルコシド構造単位
の連続結合数を３７０個以下にすることにより、使用で
きるようになる。

しかして、本発明において好適に使用しうるポリグリコ
シドの具体例を示せば次のとおりである。

・分子量３４２〜１，６３８のラミナリオリゴ糖、・分
子ｆｆ１１．８００〜３，２５８のラミナリデキストリ
ン、 ・平均分子量２，０００〜６０，０００の（ｌ→３）−
β−Ｄ−グルカン、・平均分子量３．０００〜２３．０
００のラミナラン、 ・平均分子量３．０００〜２０，０００のスクレロタン
、 ・平均分子量５００．０００以下のシゾフイラン、・平
均分子量１，１００．０００以下のレンチナン、・平均
分子量１２，０００以下のパン酵母グルカン水可溶物、 ・平均分子量３３．０００以下のりヒエナン、・平均分
子量２００，０００以下の大麦β−グルカン、 ・例えばカードランの部分カルボキシメチル化により得
られる平均分子　量４０．０００〜２４ｏ、ｏｏｏの部
分力ルポキ／メチル化（ｌ→３）β−Ｄ−グルカンおよ
びその塩（置換度。

０．００３〜１．０）、 ・平均分子量２３，０００以下の部分カルボキシメチル
化うミナランお　よびその塩（置換度：１．０以下）、 ・平均分子量ｇｏ、ｏｏｏ以下の部分メチル化（ｌ→３
）−β−Ｄ−グ　ルカン（置換度＝０．００３〜１．０
）、 ・平均分子量２３，０００以下の部分硫酸化ラミナラン
およびその塩（置　換度＝１．０以下）。

以上に述べたポリ（ｌ→３）グルコシド構造部分をは有
する（１−３）−β−Ｄ−ゲルコンド構造体を固定化す
るために用いられる不溶性担体としては水酸基やカルバ
モイル基などの親水性の基を有する不溶性担体であれば
何れも使用可能である。これら不溶性担体としてはセル
ロース（例工ばセルロースパウダー（アトバンチツク東
洋販売）セルロファイン（生化学工業販売）、アビセル
（フナコシ薬品販売）、セレンクス（バイオランド販介
）なと）、アカロース（例えはセファロース（ファルマ
ノア販売）、バイオゲルＡ（／＼イオラツト販売）、ク
ロマゲルＡ（同位化学販売）、サカ／・ツタ（セラバッ
クラボラドリース販売）、ゲラロース（リテツクス販売
）、Ｐ−Ｌアカロース（ＰＬバイオケミカルス販売）な
と）、架橋デキストラン（例えはセファデックスＧ１セ
フアクリル（ファルマンア販売）、Ｐ−Ｌデツクス（Ｐ
−Ｌバイオケミカルス販売）なと）、ポリアクリルアミ
ド（例えばバイオゲルＰ（バイオラッド販売）、クロマ
ゲルＰ（同位化学販売）なと）、多孔質ガラス（例えば
バイオグラス（バイオランド販売）など）、親水性ポリ
ビニル系合成ポリマー（例えばトヨパール（東ソー販売
）なと）などが挙げられる。

これらの不溶性担体に（１−３）−β−Ｄ−ゲルコンド
構造体を固定化するためには不溶性担体を活性化する必
要がある。この方法としては、種々のものであり、例え
ば、水酸基を有する担体に対しては、臭化シアンによる
方法（Ｒ，Ａｘ６ｎ、　Ｊ。

Ｐｏｒａｔｈ、、ａｎｄ　　Ｓ、Ｅｒｎｂａｃｋ、Ｎａ
ｔｕｒｅ、　　２　１　４　、　１３０２　（１９６７
））やオキフラン類による方法Ｏ，Ｐｏｒａｔｈ　　ａ
ｎｄ　　Ｎ、Ｆｏｒｎｓｔｅｄｔ、　　Ｊ−Ｃｈｒｏｍ
ａｔｏｇｒ−。

５１．４．７９（１９７０）およびり、　Ｓｕｎｄｂｅ
ｒｇ　ａｎｄＪ、　ＰｏｒａＬｌ〕、　Ｊ、Ｃｈｒｏｍ
ａｔｏｇｒ、、９０　、　８７　（１９７４））、又、
カルバモイル基を有する担体に対しては、アルキルシア
ミンを用いてアミノアルキルアミン誘導体とする方法や
ヒドラジンを用いてヒドラジド誘導体とする方法（共に
、Ｊ、　Ｋ、　ｌｎｍａｎａｎｄ　Ｈ，Ｍ、　Ｄｉｎｔ
ｚｉｓ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　８　、４０７
４（１９６９））なとか挙げられるか、安定でかつ非特
異的吸着の少ない方法としては、エビクロルビトリンや
ビスオキシラン類を用いてエポキシ活性化し、得られた
エポキシ活性化不溶性担体を更に抱水ヒドラジンあるい
はジヒドラジド化合物と反応させて得たヒドラジン誘導
体またはヒドラジド誘導体を活性化体として用いる方法
（松本勲武ら、特開昭５９〜１５４０１）が優れている
。

本発明の調製法におい使用するＬＡＬとしては、カブト
ガニの血球から抽出されたものでエンドトキ／ンとの反
応でそのＣ因子系か活性化されるものであれは特に限定
されることなく挙けられる。

これには、ＬＡＬの／ｉ１！結乾燥品やＬ　Ａ　Ｌに合
成基質を加えたものの凍結乾燥品なとの市販されている
ものも挙けることかできる。

各種市販のライセードを示せは次のとおりである。プレ
ゲル、プレゲル−５１プレゲル−Ｍ１パイロデインク、
トキンカラー（以上、生化学工業販売）、リムルス■−
テストワコー　リムルス■−ンングルテストワコー　リ
ムルスＨ５ｎ−テスＩ・ワコー　リムルスＨ５ｎ−ンン
グルテストワコリムルスＳ■−ンングルテストワコー、
カブトガニ血球抽出物■（凍結乾燥品）、カブトガニ血
球抽出物−Ｈ３Ｉ［（凍結乾燥品）（以上、和光純薬販
売）、パイロチル（ケープコツト社販売）、パイロセー
ド（ヘマケム社販売）、パイロジエント［Ｆ］、パイロ
ジエン］・■プラス、パイロジエント［Ｆ］シアンルテ
スト、パイロジエント■マルチテスト、ＬＡＬシングル
テストキット、ＱＣＬ−１０００、カイ不ティックＱ　
ＣＬ　Ｔｌ″（ウイツテーカーハイオプロタクン社販売
）、コーチスト■エンドトキソン（カヒーヒトラム社販
売）。

以下、本発明に使用する（１−３）−β−Ｄグルコシド
構造体の調製法についてさらに詳細に説明する。

本発明に使用する（１−３）−β−Ｄ−ゲルコンド構造
体は、例えは、以下の調製例に示す方法により調製でき
る。また、市販品の（１−３）−β−Ｄ−グルカンのう
ち、本発明の範囲にあるものは、そのまま使用すること
が出来る。

カードラン（和光純薬工業、試薬、Ｌｏｔ　　Ｎｏ。

ＰＥＱ　　９０８０、Ｍｎ＞１３６，０００、Ｍｗ／Ｍ
ｎ＞　２−７６　）試料Ｎｏ、１０１の１ｇを０−３　
Ｍ　Ｎ　ａ○Ｈに５ｍｇ／ｎ＋ｆ２の濃度に溶解して、
１００μαづつ、室温下、以下の条件下でゲルパーミエ
イションクロマトグラフイ−（以下ＧＰＣ）を行なった
。

（カラム：　Ｔ　Ｓ　Ｋ　ｇｅｌＧ　６０００　Ｐ　Ｗ
ＸＬとＧ５０００　Ｐ　ＷｘＬ（ともに７．８ｘ３００
ｍｍ）とを直列に連結、移動相：０．３ＭＮａＯＨ１流
速：０−５ｍＱ、７７ｍ＋ｎｌ　ｏ溶出してきた低分子
画分（Ｎｏ、４４〜４６）を採取し、再クロマトグラフ
ィーにかけ、数平均分子量が３，０５０、多分散度が１
．２９の試料０．０１５ｍｇを得た（試料Ｎｏ、１）。

上記ＧＰＣ分画パターンを添付の第２図に示す。更に第
２図中Ｎｏ、４４〜４６画分を再クロマトした分画パタ
ーンを添付の第３図に示す。

本試料Ｎ０１１をβ−１，３−グルカナーセ（ザイモリ
エイスー１００Ｔ、生化学工業製）で消化し、該酵素消
化液をＧＰＣ（カラム：ＴＳＫｇｅ（２Ｇ４０００ＰＷ
ＸＬ、ｃ３０００ｐｗ、、Ｇ２５００ＰＷＸＬ直列；移
動相：蒸留水、流速：０．６ｍ１２／ｍ１ｎ）で分析し
、酵素消化液中の糖組成（グルコース４０％、ラミナリ
ビオース３０％、ラミナリトリオース２０％、ラミナリ
テトラオース８％、ラミナリペンタオース２％、回収率
９４％）が確認出来た。このことから本試料（Ｎｏ、ｌ
）の糖構造は（１→３）−β−Ｄ−グルコシド構造部分
を含有するβ−ポリグルコシドであることがわかる。

調製例２：カ トランの水に対する溶解度差によ る分画 市販カートラン（試料Ｎｏ、Ｉ　Ｏｌ）　５０ｇを蒸留
水に懸濁し、下記のフローノートに示す操作により分画
を行った。

試料Ｎｏ、　１０１　（５０ｇ）／蒸留水２−５Ｑ。

↓ 撹拌、室温下、１時間 ↓ 洗浄　□減圧濃縮 乾燥 限外濾過膜濾過（０，２２μｍ） 水可溶画分−試料ＮＯ１２ 調製例３：カードラン水水不溶精糖分のギ酸分解による
調製 試料Ｎｏ、１０２の４５ｇをＫ　、　Ｏｇａｗａらの方
法［Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ、　Ｒｅｓ、、　２９　、３９
７−４０３（１９７３）］によりギ酸分解を行った。操
作内容を下記の７０−シートに示す。

試料Ｎｏ、　ｌ　０２ ４５ｇ１ｌＯ分を要し添加 ４９０％ギ酸ＩＱ（８５〜９０°Ｃ） 撹拌２０分（８５〜９０°Ｃ） ｐｔ 濾液 Ｎｏ、３）０．１５ｇを蒸留水３０ｍＱに溶解しＧＰＣ
（カラム：ＴＳＫ　ｇｅＱＧ３０００ＰＷ、ＬＸ２、Ｇ
２５００ＰＷ、Ｌｘｌ、移動相：蒸留水、流速０゜５　
ｍＱ／　ｍ１ｎ）により各０．５ｍ１ｉ宛分画採取し、
再クロマトにより分子量の異なる６種の試料（Ｎｏ、１
ｌ−１６）を得た。

ボイル 再懸濁 ２ｈｒ・・・脱ホルミル化 試料Ｎｏ、　３ 調製例３で得た水不溶性画分（試料Ｎｏ、４）の０．２
ｇを４０ｍ（２の０．３ＭＮａＯＨ溶液に溶解し、ＧＰ
Ｃ（カラム：　Ｔ　Ｓ　Ｋ　ｇｅ１２　ｃ　３０００　
ＰＷＸＬ×２、Ｇ２５００ＰＷ！Ｌ×１、移動相：Ｑ、
３ＭＮａＯＨ溶液、流速０　、５　ｍＱ／　ｍ１ｎ）を
用い上記調製例４−１と同様の操作にて分画、再クロマ
トを行い溶出液に０．３ＭＨ（ｌ溶液を加えて中和し、
分子量の異なる２種の試料（ＮＯ，１７及び１８）を得
た。

先に示した調製例３で得た水可溶性画分（試料 試料Ｎｏ、１０２の１ｇを約１００ｍｆｆの５ｍＭＮａ
ＯＨ溶液に懸濁し、水冷下音波発生機、ソニケータ−Ｔ
Ｍ　（大量製作所、型式５２０２ＰＺＴ。

東京）により２０ＫＨｚ、８０Ｗで１２分間音波処理に
より低分子化を行った。

処理液を５ＭＮａＯＨを用い、最終０．３ＭＮａＯＨ溶
液とし、上記調製例４−２に準じクロマト分画を行い分
子量の異なる８種類の試料（Ｎｏ川用〜２２及び１０３
〜１０６）を得た。

Ｔ、ＵｓｕｉらＡｇｒｉｃ、　　Ｂ　ｉｏｉ、　　Ｃｈ
ｅｍ、　　４３．６０３〜６１１　（１９７９）の方法
に従い市販アラメ乾燥藻体（東京、吹田商店）１００ｇ
を粉砕後、８０％エタノールにより低分子可溶画分を抽
出除去し、残渣から、２％ＣａＣＱｚ水溶液を用いラミ
ナラン画分を抽出する。次いで該抽出液にエタノール９
５％を用い終濃度７５％溶液とし、生じた沈澱を遠沈に
より集め、エタノール洗浄後、粗うミナラン試料を得る
。該粗試料を蒸留水に再溶解し、陰イオン交換体（ＤＥ
ＡＥ−）ヨパール）により夾雑する酸性物質（アルギン
酸等）及び色素類を除き、エタノール再沈澱から試料ト
。、２５を得ｊ：、。

調製例６−２・海藻由来の阻害物質の調製（ＩＩ）マコ
ンブＬ　ａｍｉｎａｒｉａ　ｊａｐｏｎｉｃａ由来の試
料はＪ。

Ｊ　、Ｃｏｎｎｅｌｌら、Ｊ　、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、、
　　３４９４　　（１９５０）の方法に従い、市販マコ
ンブ乾燥藻体（東京、吹田商店）ｌｏｎｇを粉砕後、ｌ
）、０９ＭＨＣＱ溶液にて約３日間静置抽出し、不溶物
を濾別し、濾液を更に１日静置し、生ずる少量の沈澱を
遠心分離により除去し、上溝に３倍容のエタノールを加
え、約７５％溶液とし、生ずる沈澱を遠沈により集め、
アルコール洗浄、乾燥後水溶性ラミナラン画分（試料・
Ｎｏ−２７）を得た。

菌）由来の試料スクレロクンは、北原ら、岐大農報　８
．１００〜１０５　（１９５７）の方法に従ってＳ　ｃ
ｌｅｒｏｔｉｎｉａ　１ｉｂｅｒｔｉａｎａの菌核の脱
脂乾燥粉末（３０ｇ）を水で充分に抽出して得た残渣を
７％ＮａＯＨ溶液で抽出し、抽出液に１０％ＣｕＳ○、
溶液を加えて沈澱させ、これを濾別して塩酸酸性メタノ
ールで洗浄して銅を除き、８０％メタツルで洗浄してＨ
Ｃ（ｌを除き、メタノール、エーテルで洗浄乾燥するこ
とを３回繰返して精製し、６ｇの試料Ｎｏ、２８を得た
。

調製例７−２：真菌由来の阻害物質の調製（ＩＩ）真菌
Ｓ　ｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ　ｃｏｍｍｕｎｅ　：ス
エヒロタケ由来の試料は、市販ンゾフイラン（科研製薬
；商品名ソニフイラン、医薬品：ＬｏｔＮｏ、Ｊ６１０
４０）をに、Ｔａｂａｔａら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ−Ｒ
ｅｓ、、　　８９１２１〜１３５（１９８１）の方法に
従い前記調製例５の操作に準じ、水溶液中１０時間音波
処理後、アルカリ条件下分子篩分画により分子量の異な
る３種類の試料（Ｎｏ２９．３０．３１）を得た。

調製例７−３：真菌由来の阻害物質の調製（ＩＩＩ）酵
母Ｓ　ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅ　：パン酵母由来のβ−グルカン試料は、市販パン酵
母グルカン（シグマ社Ｌｏｔ　Ｎｏ、５６Ｆ−４０２７
）９０ｍｇに蒸留水５Ｑｍ１２を加え、室温で２時間撹
拌後、遠心分離上溝約５０ｎ＋＋２を、減圧濃縮により
１ｍＱとし不溶物を再度遠心除去し、上清から０．６４
ｍｇの試料（Ｎｏ、３３）を得た。

調製例８：犬麦β−グルカン由来の試料の調製市販大麦
β−グルカン（ングマ社、ＬｏＬＮｏ。

５６Ｆ−０６５２）を０．３ＭＮａＯＨにより５ｍｇ／
ｍＱの溶液とし、前記調製例４−２に準じアルカリ条件
下、分子篩分画により分子量分布の狭いβ−グルカン試
料（Ｎｏ、３６）を得た。

また、上記市販の大麦β−グルカンを５Ｊ／ｍ＋１の濃
度にて熱水に溶解し、その遠心（３，５００ｒｐｍ、１
０分）上溝を前記調製例４−１に準じて蒸留水を移動相
として１００μａづつ５０回ＧＰＣ分画採取し、更に同
条件下にて再分画採取して分子量の異なる２種の試料（
試料Ｎｏ、３７．３８）を得た。

調製例２に準じて得たカードラン水不溶物をＡ。

Ｅ、Ｃ１ａｒｋｅ　　ａｎｄ　　Ｂ、Ａ、５ｔｏｎｅ：
Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　　　ｌ　　。

１７５〜１８８（＋９６２）の方法に従って、カルボキ
ノメチル化した。即ち、１００．？のカードラン水不溶
物を窒素気流下０°ＣてＩＱの５Ｍ苛性ソーダ水溶液に
溶解し、これを撹拌しなから２３６２のモノクロル酢酸
を２００ｍＱの水に溶解したものを滴下して加え、添加
後、６０〜６５°Ｃで２時間撹拌する。生ずるケルを２
．５倍容のエタノル中で強く撹拌し細粉化し濾過する。

７０％のエタノールで充分洗滌してからエタノール、エ
テル、エーテルで洗滌し乾燥する。このものを水７Ｑに
溶解し、ｌ　Ｍ酢酸で中和し、活性炭４０２を加え、室
温で１時間撹拌し、濾過する。濾液を減圧濃縮してＩＱ
とし、３倍容のエタノールを加えて沈澱とし、エタノー
ル、エーテルで洗滌Ｌ、濃硫酸上減圧乾燥し、１１３．
８！ｌを得た。

得られたカードラン部分カルボキシメチル化（ｌ−３）
−β−Ｄ−グルカンは、Ｄ、　Ｆ、　Ｄｕｒｓｏの硝酸
ウラニル法Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｃａｒｂｏｂｙｄｒ
ａｔｅ　Ｃｈｅｍ、■。

１２７−１２９　（１９８０）参照に従って測定すると
エーテル化度（置換度：　Ｄｅｇｒｅｅ　ｏｆ　５ｕｂ
ｓｔｉｔｕｔｉｏｎ：ＤＳ）は０．６３であった。これ
は糖鎖を形成しているグルコース残基１個当りの置換し
得る水酸基３箇のうちの０．６３個か置換されたことを
意味するものである。

得られた部分力ルボキ／メチル化（１−３）β−Ｄ−グ
ルカンの２５ｍ２を５ｍＱの０−ＩＭ酢９７ンモニウム
水溶液に溶解し、ＧＰＣ（カラム：トヨバールＨＷ６５
Ｆ、５Ｘ１００ｃｍ；移動相：　Ｏ，１Ｍ酢酸アンモニ
ウム水溶液：流速：５゜８　ｍＱ／　ｍ１ｎ）により分
画採取し、別のカラムを用いたＧＰＣ（カラム：　Ｔ　
Ｓ　Ｋ　ｇｅ　Ｉ　Ｇ　６０００　Ｐ　Ｗ　ｘ、＋Ｇ　
５０００　ＰＷＸＬ十Ｇ　３０００　ＰＷＸＬを直列に
使用：移動相二０．１Ｍ酢酸アンモニウム水溶液；流速
：　０　、６　ｍＱ／　ｍ１ｎ）により再分画採取し、
分子量分布の狭い試料Ｎｏ−４１（Ｍｎ＝２３１゜００
０）を得た。

また、部分カルボキンメチル化（１−３）−β−Ｄ−グ
ルカンの０．３１を蒸留水３０ｍ１２に溶解し、音波処
理（９ｋＨｚ、１８０−１３０Ｗ、１時間、音波発生機
として久保田製作所、　Ｉｎ５ｏｎａｔｏｒ　Ｍｏｄｅ
ｌ　２０１　Ｍ使用）により低分子化した後、そのうち
４．５ｍＱｉ：　０．５ｍ（２の１Ｍ酢酸アンモニウム
水溶液を加えて混和後、上記の試料Ｎｏ、４１を得るた
めの操作と同様な操作にて、ＧＰＣ分画採取およびＧＰ
Ｃ再分画採取を行い、分子量の異なる２種の試料（Ｎｏ
、３９．４０）を得た。

の調製 調製例９によって得られた置換度（ＤＳ）０゜６３のカ
ルボキンメチル化（１−３）−β−Ｄグルカン１０２を
窒素気流下０°Ｃで２５ｍ（２の１０゜５ＭＮａＯＨに
加えてペーストとしよく撹拌しながら、それにモノクロ
ル酢酸水溶液（１０，？／１２ｍｃ）を加え、６０°Ｃ
に加温し、４時間撹拌し、冷却してから２Ｍ　　ＨＣｌ
２３０ｍ＋２を加え、次いで２００ｍ４の塩酸酸性エタ
ノール（４０ｍＱＨｃＱ。

／エタノール）中に注いで生ずる沈澱を集め、７０％エ
タノールで洗滌後、エタノール、エーテルで洗滌し、減
圧乾燥し、試料Ｎｏ、ｌ　０７の標品を得た。

調製例９に示したＤＳ＝０．６３の部分カルボキンメチ
ル化（１−３）−β−Ｄ−グルカンと同様の方法で置換
度を測定した結果このものはＤＳ＝１．２０であった。

調製例１１・部分カルボキシメチル化うミナランの調製 部分カルボキンメチル化うミナランはＬａｍ１ｎａｒｉ
ａ　ｄｉｇｉｔａｔａのラミナラン（ングマ社Ｌｏｔ　
　Ｎｏ。

７７Ｆ−３８８５）を用い、調製例９の部分カルボキシ
メチル化法と同様、Ａ、　Ｅ、　Ｃ１ａｒｋｅ　ａｎｄ
　Ｂ。

Ａ、　５ｔｏｎｅ：Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍ、　　ｌ　、　
　ｌ　７５　（１９６２）に記載の方法に準し調製し、
試料Ｎｏ、４２（ＤＳ＝０．０６）の標品を得た。

調製例２に準じて得たカードラン水不溶物３゜０２をＭ
、　Ｓａｍｅｃ、　Ｋｏｌｌｏｉｄ−Ｂｅｉｈｅｆｔｅ
　５ユ、３６９（１９４０）の方法に従い、水８０ｍ１
２に懸濁し、窒素気流下、飽和苛性ソーダ水溶液１．３
５ｍ１２を加え、完全に溶解させ、４°Ｃて、ニーにン
メチル硫酸６０ノを除々に加え、約１時間後、アセトン
中に反応液を滴下し、生ずる沈澱を集め、アセトンで充
分洗滌し、濃硫酸上減圧乾燥し、標記調製品（試料Ｎｏ
、４３、ＤＳ＝０．１６）の３．１３２を得た。

化はピリジン中でピリジン−３酸化硫黄複合体（和光紬
薬工業、Ｌｏｔ　　Ｎｏ、ＰＰＬ８８２３）を用いて次
の如く行った。

充分に乾燥したＬａｍ１ｎａｒｉａ　　ｄｉｇｉｔａｔ
ａのラミナラン（シグマ社、Ｌｏｔ　　Ｎｏ、７７Ｆ−
３８８５）０．５２を５０ｎ＋Ｉ２の脱水ピリジンに溶
解し、ピリジン−３酸化硫黄複合体１２を加え、６０°
Ｃで１時間反応させ、水１００ｍ（２を加え、冷却し、
苛性ソーダで中和し、あらかじめアルカリ水溶液で充分
洗滌してグルカンを除去した透析膜（スペクトロポア１
　、ＯＯＯカット）を用いて水に対して透析した後、濃
縮し、２倍容のアセトンを加えて糖成分を沈澱せしめ、
アセ］・／て洗滌後、濃硫酸上減圧乾燥し、０．３１の
標記調製品を得た（試料Ｎｏ、４．４、ＤＳ＝０．１４
）。

なお、調製例１２〜ｊ３に示した各原品のメチル基及び
硫酸基の置換度は、下記文献■、■の方法に従い測定算
出した。

■　落合、滓出、版本：有機定量分析法（微量篇）、甫
山堂（１９５６） ■　Ｗｈｉｓｔｌｅｒ、　Ｒ，Ｌ、　ｅｄ、、　Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ　ＩＩｌ、　ｐ　２２９−２３５，２７７〜
２８０　（１９６４）　、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅ
ｓｓ［市販試料］ 下記市販試料は物性を確認後、そのまま又はアルカリ可
溶化後中和し、測定に供した。

グルコース＝（和光紬薬、ＪＩＳ特級試薬）：試料ＮＯ
，１０８ ラミナリオリゴ糖：（生化学工業、ピュアー試薬）：試
料Ｎ００５〜１０ ラミナラン　Ｅ　１ｓｅｎｉａ　ａｒａｂｏｒｅａ由米
＝（牛丼化学、試薬）：試料Ｎｏ、２３ ｔｔ　　　　Ｅ　、ａｒａｂｏｒｅａ由来：（東京化成
、試薬）：試料Ｎｏ、２４ ／／　　　　Ｌａｍ１ｎａｒｉａ　ｄｉｇｉｔａｔａ由
来＝（シグマ社試薬）：試料Ｎｏ、２６ レンチナン　Ｌ　ｅｎｔｉｎｕｓ　ｅｄｏｄｅｓ（シイ
タケ）由来＝（味の素、医薬Ｌｏｔ　Ｎｏ、９　Ｚ　Ｏ
Ｉ　Ｌ　Ｓ）・試料Ｎｏ、３２ リヒエナン　ＣｅｔｒａｒＩａ　１ｓｌａｎｄｉｃａ由
来：（ングマ社、試薬）：試料Ｎｏ、３４ ｔｔ　　　　Ｕｓｎｅａ　ｂａｒｂａｔａ由来：　（シ
グマ社、試薬）：試料Ｎｏ、３５ 上記の各試料の分子量、Ｇ因子活性化阻害力価等の測定
結果を下記表−１に示す。

−　で　−　こ　ト　閃　〇　三 表中の分子量は前記ケルパーミエインヨンクロマトグラ
フイ−（以下ＧＰＣと略記することかある）により求め
た下式で定義される数平均分子量（Ｍｎ）で表し、また
、分子量分布は、下式で定義される多分散度（Ｍ　ｖ／
　Ｍ　ｎ）で表わす。

多分散度＝　Ｍ　ｗ／　Ｍ　ｎ ただし、Ｈｉはクロマトグラムを時間で等分に多分割し
ｔ；ときのｉ番目のピーク高さ（試料濃度）を、Ｍｌは
ｉ番目の分子量を表わす。

Ｇ因子活性化阻害力価は下記に示す［Ｇ因子活性化阻害
物質の活性力価測定法］にて測定しＢ当りの単位として
示した。

［Ｇ因子活性化阻害物質（以下ＣＩと略記することがあ
る）の活性力価測定法］ 反応混合液２００μＱ中には以下のものを含む。

（１）検体（注１）ＧＩ試料又は純水　　　　　５０μ
Ｑ［Ｇ因子活性化物質（ＧＡと略記、注２）］（２）カ
ブトガニライセード凝固酵素 前駆体画分（Ａ２ａｏ＝２．５Ｘ注３）　　　　　３０
ｐＱ（３）カプトカニライセードＧ因子画分（Ａ＝ａｏ
＝０．９）　　（注３）　　　　　　　　　２０ｐＱ（
４）トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）　　　　　　２
０μｍｏｌｅ（５）ＭｇＣＬ　　　　　　　　　　　　
　　　　　２０ｐ　ｍｏｌｅ（６）Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇ
ｌｙ−Ａｒｇ　　ｐＮＡ　　　　　　　　Ｏ，１３μｍ
ｏｌｅ上記反応液を３７°Ｃで３０分間インキュベート
した後、遊離するｐＮＡの量を０，０４％亜硝酸ナトリ
ウム（０，４８Ｍ　　Ｈ（ｌ溶液）、０．３％スルファ
ミン酸アンモニウム、０．０７％Ｎ−１−ナフチルエチ
レンジアミンニ塩酸塩のそれぞれ０゜５ｍｇを順次加え
、ジアゾカップリングにより色調変換し、５４５ｎｍに
おける吸光度（Ａ５４Ｓ）量として測定する。　Ｇｌ活
性は次式により算出する。

］Ｏｐｇ添加又は無添加 この条件下において、ＧＡによるＧ因子の活性化を１０
０％阻害するＧｒ量を１００単位とする。

（注１）検体のうち、水不溶性のものは、０．３ＭＮａ
ＯＨに溶かした後、等容の０．３Ｍ　　ＨＣＱを加えて
中和して用いる。

（注２）前記調製例５で調製したカードラン音波処理物
のＧＰＣ分画精製標品（表−２、Ｎｏ、１０６．分子量
２１６，０００）。

（注３）文献［Ｔ、　０ｂａｙａｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ、
、　Ｃ１１ｎ、　Ｃｈｉｍ。

Ａｃｔａ、１４９．５５−６５　（１９８５）］に従い
日本産カブトガニＴ、Ｌｒ１ｄｅｎＬａＬｕｓから調製
した。

上記の（ｌ→３）−β−Ｄ−グルコシド構造体を前記の
方法により不溶性担体に固定化して得られた本発明の不
溶性固定化物に、次いでＬＡＬを接触させる。両者を接
触させる場合の温度としては通常０〜４０°Ｃ１好まし
くは０〜ｌＯ℃、またはｐＨとしては６〜８の範囲が用
いられる。続いて不溶性固定化物をＬＡＬから除く。こ
のためには両者の混合物から濾過や遠心分離などによっ
て不溶性固定化物を除く、あるいは不溶性固定化物を充
填したカラムｌ：　Ｌ　Ａ　Ｌを通し、通過したＬＡＬ
を得るなとの方法を用いることができる。

ＬＡＬと接触させる該不溶性固定化物の量は、担体上に
固定化された（ｌ→３）−β−Ｄ−グルコシド構造体の
Ｇ因子活性化阻害作用の強さによって異なるので、例え
は次のようにして決定すればよい。氷冷下、一定量のＬ
ＡＬに該不溶性固定化物（エンドトキシンを含有しない
もの）を量を変えて接触させた後、遠心分離によって不
溶性固定化物を除き、これに対して通常の測定条件下に
おいてＬを充分に活性化する一定量のＧ因子活性化物質
（エンドトキシンを含有しないもの、またできる限りＧ
因子活性化阻害物質を含まないもの）を加え、通常のＬ
ＡＬ使用時と同条件で反応させる。この条件下でＬＡＬ
の活性化を１００％阻害する該不溶性固定化物の量を求
める。次に、上で求めた量の該不溶性固定化物と上記の
一定量のしＡＬとを接触させた後、更にＧ因子活性化物
質の量を変化させて加えどの濃度で加えてもＬＡＬが活
性化されないことを確認する。上記の操作によつて一定
量のＬＡＬ中のＧ因子の活性化を完全に阻害するのに必
要な該不溶性固定化物の量を求めることかできる。

以下、本発明の不溶性固定化物の調製法およびそれらを
利用してエントドキノンとのみ特異的に反応するＬ　Ａ
、　Ｌの調製法を具体例を挙げて述へる。

不溶性固定化物の調製は松本らの方法（松本勲武ら、特
開昭５９−１５４０１）に従って行った。

セルロース粉末（メツシュ、１００〜２００以上、東洋
濾紙製造）２ｇをグラスフィルター上で水でよく洗浄後
、吸引濾過した後、フラスコに入れ、水３０ｍ１２，２
Ｍ　　ＮａＯＨ水溶液１３ｍ１２およびエピクロルヒド
リン３ｍＱ、を順次加えて得られる懸濁液を４０°Ｃで
２時間振盪した後、グラスフィルター上で充分洗浄して
エポキシ活性化セルロースを得た。得られたエポキシ活
性化セルロース１容（２０ｍ１２）に８０％ヒドラジン
水化物水溶液１゜５容（３０＋ｎＱ）を加え、４０°Ｃ
で１．５時間振盪した。反応後、グラスフィルター上で
水で充分に洗浄してヒドラ−゛ノセルロースを得た。得
られたヒドラジノセルロースのうち２２　（湿重量）に
調製例４−１で得たカートランギ酸分解物（試料Ｎｏ、
！４、Ｍｎ＝５，８００）５０ｍ＆と水素化シアノホウ
素ナトリウム２６ｍ２とをＱ、２ＭＫ２ＨＰＯ，水溶液
１．５ｍ４に溶解したものを加え、室温で３日間振盪し
た。反応後、グラスフィルター上で水１ｍ１２および０
．２Ｍ酢酸ナトリウム水溶液１ｍＱで順次洗浄した。こ
のものに０．２Ｍ酢酸ナトリウム水溶液１．０ｍ１２を
加えて懸濁液とし、次いで、無水酢酸Ｑ、５ｍ４を加え
、０°Ｃで３０分間反応させた後、更に無水酢酸Ｑ、５
ｍＱを加え、室温で３０分間処理して未反応のヒドラジ
ン残基をアセチル化した。反応後、水、Ｏ，１Ｍ　　Ｎ
ａＯＨ水溶液、水、リン酸緩衝化生理食塩水（Ｐ　Ｂ　
Ｓ）で順次洗浄して、カードランギ酸分解物固定化セル
ロースを得に。

調製例１５：ラミナラン固定化セルロースの調製セルロ
ース（セルロファイン、ＧＣ−７００−ｍ、生化学工業
販売）２ｉ（湿重量）を調製例１４と同ような操作によ
ってヒドラジン誘導体としｊ二。得られｔこヒドラジノ
セルロファインのうち２２　（湿重量）にＬａｍ１ｎａ
ｒｉａ　ｄｉｇｉｔａｔａのラミナラン（シグマ社、Ｌ
ｏｔＮｏ、７７Ｆ−３８８５）５０Ｊと水素化シアノホ
ウ素ナトリウム２６ｍ２とを０゜２　Ｍ　Ｋ　ｚ　ＨＰ
　Ｏ４水溶液１．５ｍ（ｌに溶解したものを加え、室温
で３日間振盪した。反応後、調製例１４に順じて洗浄、
未反応のヒドラジン残基のアセチル化および洗浄を行い
ラミナラン固定化セルロファインを得た。

トヨバール（親水性ポリビニル合成ポリマーＨＷ５５、
Ｆｉｎｅ、東ソー販売）ｌｋ、ｉ？（湿重量）を調製例
１４に順じて操作し、エポキシ活性化トヨバールを得た
。

得られたエポキシ活性化トヨバールのウチ８００ｍｆｆ
に、アジピン酸ジヒドラジド９２２を０．ＩＭ　　Ｎａ
２ＣＯ３水溶液１．１に溶解した塩酸でｐＨを９に調整
した溶液を加え、４０°Ｃで一夜振盪した。反応後、グ
ラスフィルター上で０．２ＭＮａＣｆｆ水溶液で充分に
洗浄して、ヒドラジドトヨバールを得た。得られたヒド
ラジドトヨバール全量に、ラミナリヒオース（生化学工
業販売、Ｌｏｔ８７０１１００）３２２と水素化シアノ
ホウ素ナトリウム１０４２とを０．２Ｍ　　Ｋ２ＨＰＯ
。

水溶液６００ｍ１２に溶解したものを加え、室温で３日
間振盪した。反応後、グラスフィルター上で、水、０．
２Ｍ酢酸ナトリウム水溶液で順次洗浄した。このものに
０．２Ｍ酢酸ナトリウム水溶液４００ｍ（２、次いで無
水酢酸２００＋ｎＱを加え、０°Ｃで３０分間振盪後、
更に無水酢酸２００ｍＱを加え室温で３０分間振盪して
、未反応のヒドラジド残基をアセチル化した。反応後、
水、０．１ＭＮａＯＨ水溶液、水、リン酸緩衝化生理食
塩水で順次洗浄して、ラミナリビオース固定化トヨバー
ルを得ｊこ。

調製例１４て得たカートランギ酸分解物固定化上ＬＯ−
ス（Ｍ体１０．４　ｍＱ）をエンドトキシンを除くため
、グラスフィルター上で０．ＩＭ　　ＮａＯＨＩＱおよ
び蒸留水ＩＱで順次洗浄後、蒸留水を加えて２．６ｍ（
！の野濁液とし、これを用いてプレケル−Ｍ王剤（ケル
化法リムルステスト製品、凍結乾燥品、ＬＯＬＡＢＯｌ
、感度０．１２５ＥＵ／ｍＱ、生化学工業販売）１バイ
アルを溶解した後、毎分３．０００回転、１０分間遠心
分離し、上溝（ＬＡＬ−１）を得た。この上清およびプ
レゲルＭ王剤を２．２ｍｆｆの蒸留水で溶解したもの（
ＬＡＬ−２）のエンドトキシン（Ｅ、　ｃｏｌｉ　　０
１１１：Ｂ４由来）および部分カルボキンメチル化（１
−３）−β−Ｄ−グルカン（以下、（１−３）β−Ｄ−
グルカンと記す調製例９で得た試料Ｎｏ。

４１）に対する反応性をプレゲル−Ｍの標準操作法（０
、１ｍＱ検体にＱ　、　ｌ　ｍＱのＬＡＬを加え、３７
０Ｃで６０分間静置、加温する。）に従ってゲル化の有
無で調べた結果を表−２に示す。表中、＋、−はゲル化
の有無を表わす。

表−２ 表から明らかなようにＬＡＬ−１はエンドトキシンとの
み反応する目的のＬＡＬである。

調製例１５で得たラミナラン固定化セルロファイン湿体
積０．４ｍＱをグラスフィルター上で、０゜ＩＭ　　Ｎ
ａＯＨｌθおよび蒸留水１１２で順次洗浄後、蒸留水を
加えて４ｍＱとし、このうち０．２ｍＱに蒸留水１．８
ｍ＋２を加えた懸濁液をポリビニリデン７０ライドｆｌ
ｕ（０−２２μｍ、マイレクスＧＶフィルターユニット
、日本ミリボア工業製、、　ＬｏｔＣＥＩＩ）で濾過し
、ラミナラン固定化セルロファインかイ寸着したフィル
ターを？尋だ。一方、カットカニ（Ｔａｃｈｙｐｌｅｕ
ｓ　ｔｒｉｄｅｎｔａｒｕｓ）の血リンパを採取し遠心
分離（毎分３．０００回転、５分間）で血球（約２０２
）を得、これに０．０２　Ｍ　　ＴｒｉｓＨＣＱ緩衝液
（ｐＨ８，０）を加え、ワーリング・ブレンターでホモ
ゲナイスした後、遠心分離（毎分ｇ、ｏｏｏ回転、３０
分間、４℃）により上溝と沈澱物とに分画した。この抽
出操作をもう一度繰り返し、上清合計約１５０ｍｆｆを
Ｌ　Ａ　Ｉ−とじて得た。このＬＡＬのうち１ｍＱを上
記のラミナラン固定化セルロファイン付着フィルターで
濾過し、濾液を得、このうち０．０４ｍＱｌｌ：Ｍ２Ｃ
１２２１，５１’ｉおよび合成基質（Ｎ　−シｅｒｔ−
ブトキシカルボニルＬｅｕ−Ｇｌｙ　　Ａｒｇ　　Ｐ−
ニトロアニリド）４．０μ２を加えて凍結乾燥した。こ
の凍結乾燥品に０゜２Ｍ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣθ緩衝液（
ｐＨ８，０）０．１ｍＱおよび検体（実施例１で使用し
たエンドトキシンあるいは（１−３）−β−Ｄ−グルカ
ンの種々濃度の水溶液）Ｏ，１ｍ１２を加えて３７°Ｃ
で３０分間加温した後０．６Ｍ酢酸０．４ｒｎＱを加え
て反応停止し、４０５ｎｍにおける吸光度を測定した結
果および未処理ＬＡＬを用いて同様に測定した結果を第
４図に示す。図中■印は未処理ＬＡＬを使用した場合の
吸光度を、△印はラミナラン固定化セルロファインで処
理したＬＡＬを使用した場合の吸光度を示す。図から明
らかなように、ラミナラン固定化セルロファインで処理
したＬＡＬは（１−３）−β−Ｄ−グルカンとは反応せ
ず、エンド１〜キンンとのみ反応し、これ全使用するこ
とによってエンドトキシンの特異的測定か可能である。

調製例１６で得たラミナリビオース固定化トヨパール湿
体積６００ｍＣをグラスフィルター上で、０．１Ｍ　　
ＮａＯＨ１，５００１２および蒸留水ｌ。

５００Ｑで順次洗浄後、これに実施例２と同様な操作で
得た未処理ＬＡＬ１ｎｏ２を蒸留水で５００倍希釈した
ものを加え、４°Ｃで３０分間振盪後、遠心分離（毎分
３，０００回転、１０分間）により得た上清を凍結乾燥
し、これに蒸留水を加え、１ｍＱとした。このうちＱ　
、　］　ｍＱに、実施例■と同様にエントトキンンある
しＡは（１→３）−β−ＤグルツＪンの種々濃度の水溶
液０川ｍｕを加え、３７°Ｃで６０分間反応させた結果
、（１−３）−β−Ｄ−グルカン（０，１−１０，００
０Ｊ？／ｍＲ）ではゲル化せず、一方エンドトキンン（
ｌｏｉ／ｍＱ以上）ではゲル化した。

【図面の簡単な説明】

第１図は、カブトガニ・アメボサイｌ−−ライセードに
関する凝固系の反応機構を示す図である。 第２図は、市販カードランの分子篩クロマトによる分画
パターン（抽出曲線）を示す図であり、○印はＧ因子活
性化阻害力価（左側、縦軸）を示す、Δ印は糖含量を示
す。 第３図は、第２図で得られたＮｏ、４４〜４６画分を再
クロマトした分画パターンを示す図であり、○印はＧ因
子活性化阻害力価（左側、縦軸）を示し、Δ印は糖含量
を示す。 第４−１図は、未処理とＬＡＬおよび本発明により処理
したＬ　Ａ　Ｌと各種濃度のエナ［・［・キノンとを反
応させたときの吸光度を示す図であり、○印は未処理Ｌ
　、Ａ　Ｌを示し、△印は実施例２により処理したＬ　
Ａ　Ｌを示す。 第４−２図は、未処理のＬＡＬおまひ本発明により処理
したＬ　Ａ　Ｌと各種濃度の（１−３）−βＤ−グルカ
ンとを反応させたときの吸光度を示す図であり、○印は
未処理ＬＡＬを示し、△印は実施例２により処理したＬ
ＡＬを示す。 画今番号 （０，５ｍｌ　ｌｈ／ｆｆ） 第４−１図 工〉トドキシン （ｐｇ／ｍｌ） 第３図 面分番号 （０，５ｍｌ／画分） 第４−２図 （１＋３）−β−Ｄ−グルカン （ｌｏｇ　（ｇ／ｍｌ）） 手続補正音（睦） 平成３年２月　７日 特許庁長官　植　松　　　敏　　殿 １　事件の表示 平成２年特許願第２５５２０１号 ２、発明の名称 カブトガニ・アメボサイト・ライセ トの調製法 ３、補正をする者 事件との関係 名称　生化学工業株式会社 ４、代理人

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）式［ I ］ ▲数式、化学式、表等があります▼・・・・・［ I ］ （式中、ｎは２〜３７０の数を表す） で示される（１→３）−β−Ｄ−グルコシド構造体を不
   溶性担体に固定化して得られる不溶性固定化物に、カブ
   トガニ・アメボサイト・ライセートを接触させることを
   特徴とする、エンドトキシンに特異的に反応するカブト
   ガニ・アメボサイト・ライセートの調製法。