JPH041138A - 抗腫瘍剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、ガングリオシドＧＭａに反応するモノクロー
ナル抗体と抗腫瘍物質を含むリポソームとの結合体を有
効成分とする抗腫瘍剤に関する。

従来の技術 ガングリオシドは細胞膜の構成分子で、分子中の糖鎖が
異なる多数の分子種が知られている。例えば、ガングリ
オシドＧＭ、　、ＧＭ、　、ＧＭ、、ＧＤ、、、Ｇ　Ｄ
　１ｂ、ＧＤ、　、ＧＤ３、ＧＴ、、などが挙げられる
。ガングリオシドの種類は動物種によって異なるほか、
臓器、細胞種によっても異なることが知られているが、
ａ抱の癌化の過程においては、ガングリオシドが質的、
量的変化を起こすことが次第に明らかとなってきた二キ
十ンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、）　４５
　．２４０５（１９８５）］。

例えば、悪性黒色腫や神経芽細胞腫では、ガングリオシ
ドＧＤ、　、ＧＤ、などが癌抗原として異常発現してい
ることが報告されて−するニジャーナルオン・エクスベ
リメンタル・メディシン（Ｊ、　Ｅｙ、ｐＭｅｄ、＞　
１５５．１１３３（１９８２）　、ジャーナル・オン・
バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ
ｍ、）　２５７゜１２７５２（１９８２）　、キヤンサ
ー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、）４７　、２２
５（１９８７）、キヤンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ、）　４７　、１０９８（１９８７）、　　キヤ
ンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、）　４５　
、２６４２（１９８５）、　　プロシーディング・オン
・ザ・ナショナル・アカデミ−・オン・サイエンス・ニ
ー・ニス・ニー（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　［１，Ｓ、＾）　８０．５３９
２（１９８３）Ｅ。

さらに、ガングリオシド、ＧＤａ、ＧＤ、などのモノク
ローナル抗体を用″、）だ悪性黒色腫や神経芽細胞腫の
治療も試みろれている〔ヨーロピアン・ジャーナル・オ
ン・クリニカル・オンコロジー（Ｅｕｒ。

Ｊ、Ｃｌ１ｎ、　ｏｎｃｏｌ＞　　２４．　５６５（１
９８８）　　二　。

最近ＧＭ２　、　　Ｇ　ａ　ｌ　ＮＡ　ｃ　ＧＭ＋ｂお
よびＧ　ａ　］　ＮＡ　ｃ　Ｇ　Ｄ　＋　ａに反応性を
示すマウスモノクローナル抗体Ｄ−５４〜ｆＧが報告さ
れている〔ジャーナル・オン・バイオロジカル・ケミス
トリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ）　２６４，１２ｉ２
２＜１９８９）　：。

ガングリオシドＧＭ２は非還元末端に ＧａｌＮＡｃβ＋−（Ｎ　ｅ　ｕ　Ａ　ｃ　ａ２−ｓ）
Ｇ　ａ　］糖鎮またはＧａｌＮＡｃβ＋−（Ｎ　ｅ　Ｌ
Ｉ　Ｇ　ＣＵ　２−＋）Ｇａｌ−糖鎖の結合したガング
リオシドとして知られている。

ガングリオシドＧＭ、は悪性黒色腫、神経芽細胞腫また
は肺小細胞癌などの癌抗原として知られている。ガング
リオシドＧＭ２に特異的に反応するモノクローナル抗体
は、現在までに３つ作製されており〔キャンサー・リサ
ーチ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、）４６、４１１６（１９
８６）、プロシーディング・オン・ザ・ナショナル・ア
カデミ−・オン・サイエンス・ニー・ニス’−１−（Ｐ
ｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＩＪ、　Ｓ
、＾）７９゜７６２９　（１９８２）　、キャンサー・
リサーチ（ＣａｎｃｅｒＲｅｓ、）４８　、６１５４（
１９８８）二、抗ガングリオシド’ＧＭ、ヒトモノクロ
ーナル抗体を、悪性黒色腫の治療に用いることも試みら
れている〔ランセット（Ｌａｎｃｅｔ）＾ｐｒｉｌ　８
．７８６（１９８９）二。しかしながら、現在まだ十分
な治療効果は得られていない。ラットについては、ガン
グリオシドＧ　Ｍ　２に反応するモノクローナル抗体が
作製された報告は現在までない。

一般に、モノクローナル抗体を用いてモノクローナル抗
体が認識する抗原を発現している癌を治療するには、抗
体単独を投与する方法と、抗体と抗腫瘍物質との複合体
を投与する方法とがある。

抗腫瘍物質との複合体を投与する方法の一例としては、
癌抗原に反応するモノクローナル抗体をリン脂質ででき
たリポソームと結合させ、このリポソームに抗腫瘍物質
を含有させたケモイミュノリポソームを投与する方法〔
プロシーディング・オン・ザ・ナンヨナル・アカデミ−
・オン・サイエンス・ニー・ニス・ニー）　８０．　１
３７７（１９８３））があり、抗腫瘍効果が期待されて
いる。

しかし−一がろガングリオシドＧ　Ｍ　２に反応するモ
ノクローナル抗体をケモイミュノリポソームに応用した
報告は一二５）。

発明が解決しようとする課題 本発明の目的は、ガングリオシドＧＭ２に反応するモノ
クローナル抗体と抗腫瘍物質を含むリポソームとの結合
体を有効成分とする抗腫瘍剤を提供すること！二ある。

課題を解決するための手段 本発明者は、ガングリオシドＧＭ、やそのラクトン体を
免疫原として樹立したバイブリド−７が生産するモノク
ローナル抗体と抗腫瘍物質を含むリポソームとの結合体
を有効成分とする抗腫瘍剤：抗癌剤封入抗体修飾リポソ
ーム（ケモイミュノリポソーム）〕が癌の治療上有用で
あることを見し１出し本発明を完成させた。

以下、本発明について詳細に説明する。

本発明は、ガングリオシドＧＭ２やそのラクトン体また
はガングリオシドＧＭ２を発現した癌細胞で免疫したマ
ウスの胛細抱とマウス骨髄腫細胞株とを融合させてハイ
ブリドーマを作製し、非還元末端にＧ　ａ　ｌ　Ｎ　Ａ
　ｃβ＋−（Ｎ　ｅ　ｕ　Ａ　Ｃ（２２−３）Ｇａｌ−
糖鎖またはＧａ１ＮＡＣβｌ−４（ＮｅｕＧｃαｚ−ｓ
）Ｇａ＋−糖鎖を有するガングリオシドＧＭ２：こ反応
性を有するモノクローナル抗体を生産するハイブリドー
マを選択し、該バイブリド−７を培地中１＝培養するか
、マウスに投与して該マウスを復水癌化し、該培養物ま
たは腹水より採取する二と：こより得られるガングリオ
シドＧＭ、に反応するモノクローナル抗体と抗腫瘍物質
を含むリポソームとの結合体を有効成分とする抗腫瘍剤
を提供する。

本発明のモノクローナル抗体は、非還元末端にＧａｌＮ
Ａｃβ＋−（Ｎ　ｅ　ｕ　Ａ　ｃ　（２ｓ−ｓ）Ｇ　ａ
　ｌ−ａ鎖またはＧａｌＮＡｃβｌ−４（ＮｅｕＧｃｃ
ｒｚ−３）Ｇａｌ−糖鎖を有するガングリオシドＧＭ、
を抗原として認識する。

本発明のモノクローナル抗体の具体例としては、ハイブ
リドーマ細胞株ＫＭ−５３１（平成元年９月１４日付で
工業技術院微生物工業技術研究所にＦＥＲｌＪ　ＢＰ−
２５９７として寄託しである）が生産するＫＭ−５３１
またはハイブリドーマ細胞株ＫＭ−６０３（平成元年１
０月３１日付で工業技術院微生物工業技術研究所にＦＥ
ＲＭ　ＢＰ−２６３６として寄託しである）が生産する
ＫＭ−６０３が挙げられる。

本発明に用いられる抗腫瘍物質としては、腫瘍紀り包：
二作用して殺細胞活性を示すのものであればいずれでも
よいが、例えば、アドリアマイシン、マイトマイシン、
５ＦＵなどが挙げられる。

リポソームとしては、ホスファチジルコリン、ホスファ
チジルセリンなどのリン脂質、コレステロールなどの脂
質を用いて公知の方法〔キャンサー・リサーチ（Ｃａｎ
ｃｅｒ　Ｒｅｓ、）　４２　、４７３４（１９Ｂ２）：
により形成されたものであればいずれのものでも使用で
きる。

以下に本発明の抗腫瘍剤の製造法を詳細に説明する。

（１）　　動物の免疫と抗体産生細胞の調製３〜２０週
令のマウスにＮ−アセチル０Ｍ２抗原を免疫して、その
動物の牌、リンパ節、末梢血中の抗体産生細胞を調製す
る。

免疫の方法は、動物の皮下あるいは静脈内あるいは腹腔
内に、ガングリオシドＧＭ２やそのラクトン体を大＃ｊ
菌などの菌体などの担体に担持させて投与する方法、ガ
ングリオシドＧＭ２を発現した癌細胞を投与する方法ま
たはガングリオシドＧＭ２やそのラクトン体をリビッド
Ａと共に、リン脂質、コレステロールなどの脂質から成
るリポソームに保持させて投与する方法などがある。こ
れらの投与：ま、１回目の投与の後１〜２週問おきに５
〜１０回行う。各投与後３〜７日目日日底静脈叢より採
血し、その血清がガングリオシドＧＭ２と反応すること
を以下に示す酵素免疫測定法〔酵素免疫測定法（ＥＬＩ
ＳＡ）　：医学書腕利１９７６年〕などで調べる。

酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法） ９６穴のＥＩＡ用プレート〔フロー・ラボラトリーズ（
Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社製二にガング
リオシド、リン脂質およびコレステロールを含むエタノ
ール溶液を２０４／穴（ガングリオシドとして２０　ｐ
ｍｏ＋／穴）ずつ分注し、風乾後、１％ＢＳＡ（牛血清
アルブミン）を含むＰＢＳ（ＩＪン酸二ナトリウム１．
８３ｇ、　　リン酸−カリウム０．２１ｇ。

食塩７．６５　ｇ、蒸留水ＩＪ、ｐＨ７，２）溶液（Ｂ
ＳＡ−ＰＢＳ）を１００〜２００ｍ／穴分注し、４℃で
１〜２晩放置して、プレート上に残った蛋白質との結合
残基をブロック（ブロッキング）した。その後、ＢＳＡ
−ＰＢＳを捨て、レジン水あるいはＰＢＳでよく洗浄し
た後、第１抗体として、ＢＳＡ−ＰＢＳで希釈した試料
（マウス血清、ハイプリドーマ培養上清、精製モノクロ
ーナル抗体）を１００ｍ／大分注し、４℃で１晩放置す
る。

レジン水で１回、２Ｍ塩化ナトリウム溶液で６回洗浄し
た後、＄２抗体としてウサギの抗マウスイムノグロブリ
ン抗体−ペルオキシダーゼ結合物〔ダコ（Ｄ、ＡＫＯ）
社製］の１００倍希釈液、または抗ラットイムノグロブ
リン抗体−ベルオキシダーゼ結合物〔ダコ（ＤＡＫＯ）
社製二の１００倍希釈液を１００ｄ／穴分注し、室温で
２時間放獣する。

ＰＢＳでよく洗浄後、ＡＢＴＳ基質液二２．２′アジノ
ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）
ニアンモニウム５５０ｍｇを０．１Ｍクエン酸緩衝液（
ｐＨ４，２）　　ｌＪに溶かした溶液に、使用直前に過
酸化水素１ｄ／ｄを加えた溶液〕を用い、発色を０Ｄ４
１３、の吸光’！ｔＦ測定する。

細胞融合に供するにあたって、最終抗原物質投与の３〜
４日後に免疫化マウスより膵臓細胞を摘出し、騨細胞を
調製する。Ｒ＠をＭＥＭ　（日永製薬社製）中で細断し
、ピンセットでほぐし、遠心分離（１２０Ｏｒｐｍ　、
　　５分）した後、上清ヲ捨”ｒ、トリス−塩化アンモ
ニウム緩衝液（ｐＨ７，６５）で１〜？分間処理し赤血
球を除去し、ＭＥＭで３回洗浄して融合用肺細胞として
提供する。

（２）骨髄腫細胞の調製 骨髄腫細胞としては、マウスから得られた株化細胞を使
用する。たとえば、８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡ
ＬＢ／ｃ由来）骨髄腫細胞株Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８−Ｕｌ　
　（Ｐ３−０１）　　Ｃｊｙレント・トピックス・イン
・ミクロバイオロジイ・アンド・イムノロシイ−１（Ｃ
ｕｒｒｅｎｔ　Ｔｏｐｉｃｓ　＋ｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ
ｏｇｙ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ−１）　Ｅ　　
Ｃヨーロピアン寺ジャーナル−オン拳イムノロシイ（Ｅ
ｕｒｏｐｅａｎＪ、　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）　６　、
５１１−５１９（１９７６）　：ｌ　、ＳＰ２１０−Ａ
ｇ１４　　（ＳＰ−２）　　Ｃネイチャー（Ｎａｔｕｒ
ｅ）２７６　　、２６９−２７０　（１９７８）Ｅ　、
Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８６５３（６５３）　　Ｃジャーナ
ル・オン・イムノロシイ（ＪＩｍｍｕｎｏｌｏｇＹ）　
１２３　　、１５４８−１５５０（１９７９）］、］Ｐ
３Ｘ６３−＾ｇ８Ｘ６３）　Ｃネイチ−？−（Ｎａｔｕ
ｒｅ）　２５６　、４９５−４９７（１９７５）　Ｅな
どが用いられる。これるの細胞株は、８−アザグアニン
培地［ＲＰＭ１１６４０培地：二グルタミン（１，５＋
ｎＭ）　、２メルカプトエタノール（５Ｘ　１０−’Ｍ
）、ジェンタマイシ：／　（１０ｐｇ／　ｍｌ’）およ
び牛胎児血清（Ｆ’Ｃ３）（Ｃ３Ｌ社製、１０％）を加
えた正常培地に、さらに８−７ザグアニン（１５■／＋
１１１りを加えた培地〕で継代するが、細胞融合の３〜
４日前に正常培地に継代し、融合当日２ｘ１０７以上の
細胞数を確保する。

（３）細胞融合 （］）で免疫した抗体産生細胞と（２）で得られた骨髄
腫細胞をＭＥＭ培地またはＰＢＳでよく洗浄し、細胞数
が、抗体産生細胞ご骨髄腫細胞＝５〜１０：１になるよ
う混合し、遠心分離（１，２０Ｏｒｐｍ、　５分）した
後、上清を捨て、沈澱した細胞群をよくほぐした後、攪
拌しながら、３７℃で、ポリエチレングライコール−１
，０００（ＰＥＧ−１，０００）２ｇ。

ＭＥＭ２ｍおよびジメチルスルホキシド０．７−〇混！
０．２〜１Ｉ１１２／１０３抗体産生細胞を加え、１〜
２分間毎にＭＥＭ１〜２−を数回加えた後、ＭＥＭを加
えて全量が５０ｍ１になるようにする。遠心分離（９０
０ｒｐｍ、　５分）後、上清を捨て、ゆるやかに細胞を
はぐしｔ二後、正常培地（ＦＣＳ　１０％を含むＲＰＭ
Ｉ　１６４（ｌ培地）　１００ゴを加え、メスピペット
による吸込み、吹出しでゆるやかに細胞を懸濁する。

この懸濁液を９６穴培養用プレートに１００ｄ／穴ずつ
分注し、５％ＣＯ２インキユベーター中、３７℃で２４
時間培養する。培養プレートに１ｏ０４／穴のＨＡＴ培
地〔正常培地にヒポキサンチン（１０−’Ｍ）、チミジ
ン（１，５Ｘ　１０−５Ｍ１ｌおよびアミノプテリン（
４Ｘ１０−’Ｍ）を加えた培地］を加え、さらに２４時
間培養する。以後２日間、２４時間毎に、培養上清１０
０ｍを捨て、新たに同量のＨＡＴ培地を加え、５％ＣＯ
２インキュベーター中、３７℃で１０−１４日間培養す
る。

コロニー状に生育してきた融合細胞の認められる穴につ
いて、上清１００ρを捨て、ＨＴ培地（ＨＡＴ培地かみ
アミノプテリンを除いた培地）を同量加え、以後２日間
、２４時間毎にＨＴ培地への変換を行う。

ＨＴ培地で３〜４日間培養後、培養上清の一部をとり上
記の酵素免疫測定法又は、免疫組織学的判定法（ＡＢＣ
法）（＃素抗体法、学際企画刊、１００頁、１９８５年
）により、ガングリオシドＧＭ。

に対する抗体価を測定する。このとき、同様の方法でガ
ングリオシドＧＭ３などの他のガングリオシドとの反応
性も測定し、ガングリオシドＧＭ。

に特異的に反応するものを選択する。ガングリオシドＧ
Ｍ、に強く反応し、ガングリオシドＧＭ３などの他のガ
ングリオシドに反応しない穴について、限界希釈法によ
りクローニングを２回繰り返し、安定してガングリオシ
ドＧＭ、に強い抗体価の認められたものを抗ガングリオ
シドＧＭ、モノクローナル抗体産生バイブリド−７株と
して選択する。

（４）モノクローナル抗体の調製 プリスタン処理Ｃ２，６，１０，１４−テトラメチルペ
ンタデカン（Ｐｒｉｓｔａｎｅ）　０．５　ｔｒｙを腹
腔内投与し、２週間飼育する〕した８〜１０週令のヌー
ド雌マウスに、（３）で得られた抗ガングリオシドＧＭ
２モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞５Ｘ１０
’細飽／匹を腹腔内注射する。１０〜２１日でハイブリ
ドーマは腹水癌化する。このマウスから腹水を採取し、
遠心分離（３，００Ｏｒｐｍ、５分）して固形分を除去
後、５０％硫酸アンモニウムにて塩析し、ＰＢＳに塩化
す）ＩＪウム０．５Ｍを加えた液で透析し、セルロファ
インＧＳＬ２０００　　（生化学工業社製）（ベツドボ
リューム７５０ｒＩｉＩ）のカラムに流速１５ｒＩｉ！
／時で通塔し、ＩｇＭ画分を集め、精製モノクローナル
抗体とする。

抗体のサブクラスの決定は、マウスモノクローナル抗体
タイピングキット（ザイメット社製）およびラットモノ
クローナル抗体タイピング抗体（ノルデイックイムノロ
ジー社製）を用−）で行う。

蛋白量の定量は、フォーリン法および２８０　ｎｍでの
吸光度［１，０（００，、。）ζイムノグロブリン１■
／ｍｌ〕より算出する。

（５）抗腫瘍剤封入抗体修飾リポソーム：ケモイミニノ
リポソーム（Ｃｈｅｍｏ　１ｍｍｕｎｏ　Ｌｉｐｏｓｏ
ｍｅ）　、以下ＣＩＬと略記する〕の作製 バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　８
　、３４４（１９６９）記載の方法によりリン脂質、コ
レステロールなどの脂質のクロロホルム／メタノール（
２／１）混合溶液１０−を減圧にて溶媒留去し、これに
５ｍｌのに゛−緩衝液を加え、４５℃に加温して攪拌し
、超音波処理して形成させたリポソームの膜上に、抗体
あるいは抗体のサブユニットを組み込む〔ジャーナル・
オン・エクスペリメンタル・メディシンＵｏｕｒｎａｌ
　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ
）　５０　。

３５（１９８６＞〕。リポソームに抗腫瘍物質を封入す
るには、リポソームをＮａ”−緩衝液で平衡化したセフ
ァロースＣＬ６Ｂカラム（ファルマシア社製）１００ｍ
ｌに通塔し、リポソームの内外にイオンの勾配を作製し
、これにパリノマイシン（ＶＬＭ）などのイオノフオア
を用いて、アドリアマイシン（ＡＤＭ）などの抗腫瘍物
質を封入する方法〔バイオケミ力・エト・バイオフィジ
ヵ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙ
ｓｉｃａ　Ａｃｔａ）　　２９４　、８１６（１９８５
））あるいは抗腫瘍物質を含む水溶液中でリポソームを
作製することにより抗腫瘍物質を封入する方法などが用
いられる。

本発明に用いる抗ガングリオシドＧＭ２モノクローナル
抗体は、それ自体で補体依存的細胞障害活性（ＣＤＣ活
性）を有し、抗腫瘍剤として有用であるが、該モノクロ
ーナル抗体を用いて作製したＣＩＬは、ガングリオシド
ＧＭｘを発現している腫瘍細胞に抗腫瘍剤を運ぶことに
より正常細胞を傷つけることなく腫瘍細胞に対して殺細
胞活性、増殖抑制活性などの抗腫瘍効果を示し、より有
用な抗腫瘍剤として期待される。

以下本発明の実施例を示す。

実施例１゜ （１）　　抗原の調製 Ｎ−アセチルＧＭ、（ヤトロン社製）５ｎｍｏｌｅを１
ｍｌのクロロホルム：メタノール：２規定塩酸（６０：
３０：４．５）混合液中に溶解し、室温で１８時間放置
したつこれを５ＥＰ−ＰＡＫカラム（ウォーターズ　ア
ソシエイト社製）に通塔し、ガングリオシドＧ　Ｍ　２
とＧＭｚのラクトン体との混合物を得た。溶媒を留去後
、残渣を９００ｍ２の蒸留水に溶解し、１％酢酸で処理
した大腸菌（ε、Ｃｏ１１　Ｋ−１２）０．９ｍｇを混
合し、３７℃で３０分間放置した。

これを凍結乾燥後３．６　ｒＩｉｌのＰＢＳに懸濁し、
抗原溶液を得た。

（２）抗体産生細胞の調製 （１）で調製した抗原溶液２００ｍ１をマウスおよびラ
ットの腹腔に１週に１回、計７回投与し免疫した。

最終投与後の３日日にマウスおよびラットよりそれぞれ
牌細胞を調製して、細胞融合に供した。

（３）マウス骨髄腫ｍ胞の調製 ８−アザグアニン耐性マウス骨髄腫細胞株Ｐ３−０１を
正常培地で培養し、細胞融合時に２Ｘ１０’以上の細胞
を得、細胞融合に親株として供した。

（４）ハイブリドーマの作製 （２）と（３）で得られた牌細胞と骨髄腫細胞とを１０
：１の割合で用い、前述した方法で融合させ、ＨＡＴ培
地で３７℃、１４日間口０２５％下で培養した。融合細
胞を選択し、ＨＴ培地に変えてさらに培養した後、ガン
グリオシドＧ　Ｍ　’ａに対する抗体価の測定をして、
活性な穴を選び、さらに正常培地に変え、２回クローニ
ングを繰り返して、酵素免疫測定法又は、免疫組織学的
判定法（ＡＢＣ法）により、ガングリオシドＧＭ２に特
異的に反応するハイブリドーマを選択した。すなわち、
ガングリオシドＧＭ、（犬の赤血球よりノーレス（Ｎｏ
ｒｅｓ）等の方法〔ジャーナル・イミュノロジー（Ｊ、
　Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｈ３９、３１７１（１９８７）］に
従って精製したもの）およびガングリオシドＧＭ２　（
ヤトロン社製）それぞれ２ｎｇを５ｎｇのフォスファチ
ジルコリン（シグマ社製）と２．５　ｎｇのコレステロ
ール（シグマ社製）とを含む２−のエタノール溶液に溶
解した。このうち２０ρを９６穴マイクロタイタープレ
ート（フローラボラトリーズ社製）の各式にそれぞれ分
注し、風乾後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液でブロッキング
を行った。ハイブリドーマの培養上清をガングリオシド
ＧＭ、を吸着させたプレートとガングリオシドＧＭ、を
吸着させたプレートｉこ各５０ｍずつ分注し、１８時間
、４℃で反応させた。

以下公知の方法〔キャンサー・リサーチ（［ａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ、）　４６．４４３８（１９８６）］に従い反応
を行い、ガングリオシドＧＭ、に反応せず、ガングリオ
シドＧＭ２に特異的に反応するマウスモノクローナル抗
体を産生ずるハイプリドーマ株およびラットモノクロー
ナル抗体を産生ずるハイプリドーマ株を選択した。

ここで、該マウスモノクローナル抗体をマウスモノクロ
ーナル抗体ＫＭ−５３１とする。また、該ラットモノク
ローナル抗体をラットモノクローナル抗体ＫＭ−６０３
とする。

（５）モノクローナル抗体の精製 ブリスタン処理したＳｊｌ令ヌード雌マウスに（４）で
得られたハイプリドーマ株ＫＭ−５３１およびＫＭ−６
０３を５Ｘ１０’細胞／匹それぞれ腹腔的注射した。１
０〜２１日後に、ハイブリドーマは腹水癌化した。腹水
のたまったマウスから、腹水を採取（１〜８−７匹）し
、遠心分離（３，００Ｏｒｐｍ、５分）して固形分を除
去した。５０％硫酸アンモニウムにて塩析し、塩化ナト
リウム０．５Ｍを添加したＰＢＳで透析後、セルロファ
インＧＳＬ２（１００（生化学工業社製）　（ベットボ
リューム７５０ｍ１）のカラムに流速１５−７時で通塔
しＩｇＭ画分を集め、精製モノクローナル抗体とした。

（６）サブクラスの決定 マウスモノクローナル抗体タイピングキット（ザイメッ
ト社製）を用いて、ＥＬＩＳＡ法によりマウスモノクロ
ーナル抗体ＫＭ−５３１のサブクラスをＩｇＭと決定し
た。また、ラットモノクローナル抗体タイピング抗体（
ノルデイックイムノロジー社製）を用いて、前記と同様
の方法によりラットモノクローナル抗体ＫＭ−６０３の
サブクラスをＩｇＭと決定した。

（７）　　ＫＭ−５３１およびＫＭ−６０３の特異性の
検討 ＫＭ−５３１およびＫＭ−６０３の特異性の検討に用い
る標準としてのガングリオシドＱａｌＮＡｃＧＭ＋ｂ、
ＧＤ、、、ＧＤ、ｂ、ＧＴ、、はシグマ社製（ガングリ
オシド　タイプ■）、ガングリオシドＧＤ３、Ｎ−アセ
チルＧＭ２はヤトロン社製のものをそれぞれ用いた。ガ
ングリオシドＧＭ、、ＧＭ、　、Ｎ−グリコリルＧＭ２
　、ＧＤ２は、それぞれ犬赤血球、ウシ脳、マウス肝、
培養細胞株ＩＭＲ３２（ＡＴＣＣＣＣＬｌ　２７）より
公知の方法〔ジャーナル・オン・バイオロジカル・ケミ
ス　ト　リ　−　（Ｊｏｕｒｎａｌ’ｏｆ　　Ｂｉｏｌ
ｏｇｉｃａｌ　　口ｈｅｍｉｓｔｒｙ）２６３．１０９
１５．２０７９（１９８Ｂ）］に準じて作製した。

ＫＭ−５３１、ＫＭ−６０３の特異性は、以下のＴＬＣ
（薄層クロマトグラフィー）免疫染色および酵素免疫測
定法で調べた。

（ａ）ＴＬＣ免疫染色 ＴＬＣ免疫染色は、公知の方法〔ジャーナル・オン・バ
イオロジカル・ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、）　２５’、、　１４３６５（１９Ｂ２）　
〕に準じて行った。すなわち、ガングリオシドＧＭ、　
、ＧＭ、　、ＧＭＧＤ、　、ＧＤ、、、Ｇ　ａ　ｌ　Ｎ
Ａ　ｃ　ＧＭ＋ｂおよびＧＴ、。

をＨＴＰＬＣプレート　（ワットマン社製）にスポット
し、クロロホルム：メタノール：　０．２５％塩塩化カ
ルシウム水液液５０：４０二１０）の展開溶媒で展開し
、０．５％ポリイソブチルメタクリレイト　（アルドリ
ッチ社製）エタノール溶液に浸潤、乾燥後、１％ＢＳＡ
−ＰＢＳ溶液で１時間ブロッキングした。次−）で第１
抗体としてＫＭ−５３１（１０■／ｍｌ）の１％ＢＳＡ
−ＰＢＳ溶液で１８時間室温で反応させ、ＰＢＳ溶液で
洗浄後、第２抗体としてビオチン化抗マウスイミニノグ
ロプリン抗体（ダコ社製）を加えて１時間反応させた。

さらにＰＢＳ溶液で洗浄後、アとジン・ペルオキシダー
ゼ（ダコ社製）を１時間反応させ、ＨＲＰカラーデベロ
プメント試薬（バイオラット社製）を用いて発色させた
。

結果を第１図（ｂ）に示す。ＫＭ−５３１はＮ−アセチ
ルＧＭ２とＧａｌＮＡｃＧ？ｖ！＋ｂにのみ反応した。

なお、ＴＬＣレッジノール（メルク社製）染色法による
各種ガングリオシドの染色効果を第１図（ａ）に示す。

また、ＫＭ−６０３につ−）ても上記と同様に１％ＢＳ
Ａ−ＰＢＳ溶液で反応させ、ＰＢＳ溶液で洗浄後、第２
抗体としてペルオキシダーゼ結合の抗うットイミュノグ
ロプリン抗体（ダコ社製）を加えて１時間反応させ、同
試薬を用いて発色させ、ＫＭ−６０３の特異性を検討し
た。

結果を第２図ら）に示す。ＫＭ−６０３はＮ−アセチル
ＧＭ２とＧ　ａ　Ｉ　ＮＡ　ｃ　ＧＭ＋ｂにのみ反応し
た。

なお、ＴＬＣレッジノール（メルク社製）染色法による
各種ガングリオシドの染色効果を第２図（ａ）に示す。

ら）酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法） ガングリオシドＧＭ３　、Ｎ−アセチルＧＭ２、Ｎ−グ
リコリルＧＭ２　、ＧＭ＋　、ＧＤ−、ＧＤ１□、ＧＤ
、　、ＧＤ、、およびＧＴ、、をそれぞれ抗原として９
６大の　ＥＩＡ用プレートこフロー・ラボラトリーズ（
Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社製：の各式に
吸着させ、前述のＥＬＩ　ＳＡ法で各種ガングリオシド
とＫＭ−５３１との反応性を調べた。

コントロールとしてＥＩＡ用プレートにホスファチジル
コリンおよびコレステロールを含むエタノール溶液を２
０ｔｄｌ／穴分注し、以下上記と同様の方法により行い
吸光度を測定した。

結果を第１表に示した。ＫＭ−５３１はＮ−アセチルＧ
Ｍ、にのみ反応し、それ以外のガングリオシドとは反応
しなかった。

第　　　１　　　表 上記と同様の方法でＫＭ−６０３と各種ガングリオシド
との反応性を調べた。

また、コントロールも、上記と同様の方法により行５）
、吸光度を測定した。

結果を第２表に示す。ＫＭ−６０３はＮ−アセチルＧ　
Ｍ　＝およびＮ−グリコリルＧＭ２に強く反応した。ガ
ングリオシドＧＤ０とＧ　Ｄ　２とにも若干反応したが
、それ以外のガングリオシドとは反応しなかった。

第　　　　２　　　　表 実施例２ 補体依存的細胞障害活性（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ　Ｄｅ
ｐｅｎｄｅｎｔ［ｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　：　ＣＤ　
Ｃ）（ａ）　　標的細胞の調整 １０％ＦＣ５添加ＲＰ　Ｍ　Ｉ　１６４０培地に浮遊さ
せた標的細胞ＧＭ、陽性細胞ＩＭＲ３２，ＴＹＨ。

Ｊ１ｒｋａｔｊ５よびＧＭ、陰性細胞ＫＡＴＯＩをそれ
ぞれ１ｘ１０７個／−に調整し、Ｎ　ａ　２”ＣｒＯ４
を１００　ｐｃ　ｉ／　Ｉ　ＸＩＯ’個になるように加
え、３７℃で１時間反応後、培地で３回洗浄した。

次いで４℃、３０分間培地中に放置し、自然解離させ、
遠心分離（１２０Ｏｒｐｍ、　５分）後、培地を加えて
４Ｘ１０’個／ｍｆ＋、：ｌ整した。

ら）補体の吸収 ウサギ補体の凍結乾燥品（セダーレーンラボラ）　ＩＪ
−社製）を水に溶かし、標的細胞２Ｘ１０’個を加え、
４℃、３０分間反応させた。これを遠心分離（１２０Ｏ
ｒｐｍ、　５分比、再び標的細胞２Ｘ１０’個を加え、
上記と同様にして反応させた後、フィルターに通して細
胞を除き、補体溶液とした。

（ｃ）ＣＤＣ活性の測定 ９６穴Ｕ字底プレートにＫＭ−５３１またはＫＭ−６０
３を各濃度０．０５　ｕｇ／　ｄ〜５０　ｕｇ／−の範
囲で加え、各々に標的細胞２Ｘ１０５個を添加した。室
温で１時間反応させ、遠心分離（１２０ｏｒｐｍ、　５
分）後、上清を除去し、補体５０ｕ１を添加し、３７℃
、１時間反応させた。遠心分離（１２０Ｏｒｐｍ、　５
分）後、上清のＳ　ＩＣｒ量をγ−カウンターにて測定
した。対照として補体の代わりに培地を添加し、上記と
同様に行い、対照の”Ｃｒ量を測定した。全遊離”Ｃｒ
量は、補体の代わりに５規定水酸化ナトリウムを添加し
、上記と同様に行い、上清の”ｃ　ｒ量を測定すること
により行った。

ＣＤＣ活性は、下式により求めた。

結果を第３図に示す。Ｋ　Ｍ　−５３１およびＫＭ６０
３はＧＭ、陽性細胞である１ＭＲ３２，ＴＹＨおよびＪ
ｕｒｋａｔに対して強い細胞障害活性を示し］ たが、ＧＭ、陰性細胞であるＫＡＴＯＩＩＩに対しては
細胞障害活性を示さなかった。

実施例３ ＫＭ−５３１およびＫＭ−６０３を用いたケモイミュノ
リポソーム（ＣＩＬ）の作製 ＣＩＬは公知の手法〔実験医学６．８９（１９８８）］
に準じ、以下の方法に従って作製した。

（ｉ＞抗体の還元 ＫＭ−５３１およびＫＭ−６０３１０＠ｇを０、２　Ｍ
　）リス塩酸溶液（ｐＨ８，６）へ透析し、遠心分離（
１０，００Ｏｒρｍ、５分）して沈澱物を除いた。抗体
溶液を２８℃に保ちながら、Ｌ−システィン（牛丼化学
社製）を最終濃度が５０ｍＭとなるように加え、約１０
分間反応させ、抗体の還元を行った。反応液をに゛−緩
衝液〔１５０ｍＭグルタミン酸カリウム（シグマ社製）
、２０ｍＭ　　ＨＥＰＥＳ　（ナカライテスク社製）　
、ｐＨ６，８〕で平衡化したＰＤＩＯカラム（ファルマ
シア社製）９−に通塔し、ＩｇＭサブユニットを含む両
分（ＩｇＭ）を集めた。

（ｉｉ＞ｍ−マレイミドベンゾイル−ジノくルミトイル
ホスファチジルエタノールアミン（ＭＢＰＥ）の作製 メソッズ・イン・エンザイモロジー［（Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）　１２１　、７６（１９
８６）に記載の方法によりＭＢＰＥを作製した。

すなわち、５０μｍｏｌｅのｍ−マレイミドベンゾイル
サクシニミドエステル（ＭＢＳ：牛丼化学社製）と４０
μｍｏｌｅのジパルミトイルホスファチジルエタノール
アミン（ＤＰＰＥ：シグマ社製）とを５ｉのクロロホル
ム：メタノール（９：１）混合液に懸濁し、攪拌下２５
℃で９０分間反応させた。得られた反応物をクロロホル
ムで抽出し、ユニシル（ナカライテスク社製、乾燥重量
４ｇ）に通塔し、クロロホルム：メタノール（１００：
Ｏ〜９５：５の濃度勾配）で溶出し、ＭＢＰＥを得た。

（ｉｉｉ）　ＡＤＭ封入ＣＩＬの作製 ２５μｍｏｌｅのジパルミトイルフオスファチジルコリ
ン、１７．５μｍｏｌｅのコレステロール、２．５μｍ
ｏｌｅのＭＢＰＥの混合物をクロロホルム１０−に溶解
し、４５℃に加温して、溶媒除去し、均一な脂質薄膜を
形成させた。さらに真空ポンプで約１時間吸引して完全
に溶媒を除き、５献のに゛−緩衝液を加え、４５℃で攪
拌し、さらに超音波処理した。

得られた粗Ｓ　Ｕ　Ｌ　（Ｓｍａｌｌ　ｌＪｎｉｌａｍ
ｅｌｌａｒ　Ｌｉｐｏｓｏｍｅ）を遠心分離（１０，０
ＯＯＸ　ｇ、　　１０分）し、得られた上清と（１）で
得たＩ　ｇ　Ｍ　ｓを含むＫ“−緩衝溶液とを混合し、
３７℃で１時間反応させた後、Ｌ−システィン５■を加
え未反応のマレイミド基を不活化させた。反応液をＮａ
’−緩衝液（１５０ｍＭ塩化ナトリウム、２０ｍＭ　Ｈ
ＥＰＥＳ、ｐＨ７，５）で平衡化したセファロースＣＬ
ＳＢカラム（ファルマシア社製）１００−に通塔し、リ
ポソームと反応しなかった蛋白質（抗体）を分離すると
同時に、リポソームの外液のに゛をＮ　、　０と置換し
、Ｋ″″（内液）／Ｎａ（外液）のイオン勾配に調整し
た。

得られたリポソームをさらに遠心分離（１０，０ＯＯＸ
ｇ、１０分）・し、脂質の定量をＰテストワコ−（和光
純薬社製）を用いて行った。このリポソームにパリノマ
イシン（ＶＬＭ；シグマ社製）とアドリアマイシン（Ａ
ＤＭ；シグマ社製）を脂質１　、ｕ＋ｎｏｌｅに対して
それぞれ０．５．．４０ｕｇの割合になるように加え、
３７℃、４時間反応させた。反応後、セファロースＣＬ
６Ｂカラム３０ｍに通塔し、Ｎａ”−緩衝液を用いて溶
出し、Ａ　Ｄ　Ｍ封入ＣＩＬ２０−を得た。

実施例４゜ ＣＩＬの細胞結合試験 １００ｄのＫＭ−５３１を用いて作製したＡＤＭ封入Ｃ
Ｉ　Ｌ　（ＫＭ−５３１−ＣＩ　Ｌ、　ＡＤＭ５■含有
）と、１００ρの２０％ＦＣ５（牛胎児血清）添加ＲＰ
Ｍ１１６４０培地（日永製薬社製）に浮遊させたＧＭａ
陽性細胞ＴＹＨおよびＧＭ。

陰性細胞ＫＡＴＯＩ［［（ＩＢＬ社製）のｌＸｌ０’個
の細胞とを混合した。

３７℃、３０分間反応後、１％ＦＣ３添加ＰＢＳで３回
洗浄し、ＩＩＩＬｌｌｌのＰＢＳ溶液を加え、細胞懸濁
液を調製した。これに０．５％トリトン×１００（ナカ
ライテスク社製）　ｌｄを加え、ＡＤＭの定量を蛍光光
度計〔日立Ｆ−３０００（日立製作所）、励起波長４８
０　ｎｍ、蛍光波長５８０ｎｍ　］で測定した。

その結果を第４図に示す。ＡＤＭ封入ＫＭ５３１−ＣＩ
ＬはＧ　Ｍ　２陽性細胞であるＴＹＨに有意に多く結合
したが、Ｇ　Ｍ　２陰性細胞であるＫＡＴＯＩＩ［に対
する結合性は弱かった。

次にＫＭ−６０３を用いて作製したＡＤＭ封入ＣＩＬ　
（ＫＭ−６０３−ＣＩＬ）１００威のＧＭ。

陽性細胞ＩＭＲ３２、ＴＹＨおよび０Ｍ２陰性細胞ＫＡ
ＴＯＩ［に対する結合試験を上記と同様に行った。

その結果を第５図に示す。ＡＤＭ封入ＫＭ−６０３−Ｃ
ＩＬはＫＭ−５３１の場合と同様；：ＧＭ２陽性細飽Ｉ
ＭＲ３２およびＴＹＨとに有意に多く結合したが、ＧＭ
、陰性細胞Ｋ　Ａ　Ｔ　Ｏｍに対する結合性は弱かった
。

実施例５゜ ＣＩＬの細胞増殖抑制効果 １０％ＦＣ３添加ＲＰ　Ｍ　ｒ　１６４０培地ｓ：懸濁
サセた標的細胞ＧＭ２陽性細胞ＩＭＲ３２およびＧ　Ｍ
　’ａ陰性細胞ＫＡＴＯＩＩ［それぞれ２Ｘ１０’個／
ｄを２００ρずつＵ室底９６穴プレート（ファルコン社
製）に分注し、遠心分離（１２０Ｏｒｐｍ、　５分）し
、上清を除去後、０．０５〜５０　ｇ／ｄの濃度に調整
したアドリアマイシンを含有するＫＭ−６０３−ＣＩＬ
のＮａ′−緩衝溶液またはＫＭ−６０３のＮａ−緩衝溶
液（各々１０％ＦＣ５添加）を２００頭加え、よく攪拌
して４℃、３０分間反応させた後、ＰＢＳで３回洗浄し
余分なＣＩＬまたは抗体を除去した。さらに１０％ＦＣ
５添加ＲＰＭＩ　　１６４０培地２００戚中に懸濁させ
た後、その２５４ずつを平底９６穴プレート（コーニン
グ社製；１ｄｏｓｅ当たり３穴）に各々分注し、１０％
ＦＣ５添加ＲＰＭ１１６４０培地を加え全量を２００４
とした。３７℃、２０時間培養後、３Ｈ−チミジン０．
５μＣｉ（２０ｍ）を各式に加え、さらに４時間培養し
、セルハーベスタ−（キャンプリッジ　テクノロジー社
製）を用いて細胞をグラスフィルター上に回収し、その
フィルターの放射活性を測定して細胞増殖の指標とした
。

コントロールの放射活性は、ＣＴＬまたはにＭ−６０３
の代わりに培地を加える以外は上記と同様に行うことに
より測定した。

また、ＫＭ−６０１−ＣＩＬＯ代わりに抗肺腺癌モノク
ローナル抗体ＫＭ−９３を抗体とし、アドリアマイシン
を封入したＣ［、であるＫＭ−９３ＣＩＬを用いる以外
は上記と同様に行って放射活性を測定した。

細胞増殖抑制率は下式により求めた。

結果を第６図に示す。ＫＭ−６０３−ＣＩＬはＧＭ２陽
性細晧ＩＭＲ３２に対してより選択的に強い細胞増殖抑
制効果を示したのに対し、ＧＭｆｆ陰性細胞ＫＡＴＯＩ
ＩＩに対しては、抑制効果を示さなかった。またＫＭ−
６０３単独（２００ｇ／−添加：２０■／ｘｉ！ＡＤＭ
を含むリポソームに結合した抗体量に相当する）および
ＫＭ−９３−ＣＩＬにおいては、細胞増殖抑制効果は認
められなかった。

発明の効果 本発明によれば、癌の治療に有用なガングリオシドＧ　
Ｍ　２に反応するモノクローナル抗体と抗腫瘍物質を含
むリポソームとの結合体を有効成分とする抗腫瘍剤が提
供される。

【図面の簡単な説明】

第１図および第２図の（ａ）は、ＴＬＣレッジノールに
よる各種ガングリオシドの染色の効果を示す。 第１図および第２図の（ｂ）は、それぞれＫＭ−５３１
、ＫＭ−６０３によるＴＬＣ免疫染色の結果を示す。 第３図の（ａ）、　（ｂ）は、それぞれＫＭ−５３１，
ＫＭ−６０３のＧＭ２１１ｉ性細胞ＩＭＲ３２，ＴＹＨ
。 Ｊｕｒｋａｔおよび０Ｍ２陰性細胞Ｋ　Ａ　Ｔ　ＯＩＩ
Ｉ　ｉ：ｍ対する補体依存的細胞障害活性を示す。 ・：ま、ＧＭ、陽性細胞ＩＭＲ３２ ０は、ＧＭ、陽性細胞ＴＹＨ △は、Ｇ　Ｍ　２陽性細胞Ｊｕｒｋａｔ口は、ＧＭ、陰
性細胞ＫＡＴＯＩ［Ｉ　　　をそれぞれ示す。 第４図は、ＡＤＭ量を指標としたＡＤＭ封入ＫＭ−５３
１−ＣＩＬのＧＭ２陽性細胞ＴＹＨおよびＧ　Ｍ　ａ陰
性細胞ＫＡＴＯＩ［［に対する結合量を示す。 第５図は、ＡＤＭ量を指標としたＡＤＭ封入ＫＭ６０３
−ＣＩＬのＧＭ２陽性細胞ＩＭＲ３２゜ＴＹＨおよび０
Ｍ２陰性細胞ＫＡＴＯ［［に対する結合量を示す。 第６図の（ａ）、　（ｂ）は、それぞれ３Ｈ−チミジン
の取り込みを指標としたＡＤＭ封入ＣＩＬの０Ｍ２陰性
細胞ＫＡＴＯＩＩ［およびＧ　Ｍ　２陽性細胞ＩＭＲ３
２に対する細胞増殖抑制効果を示す。 ○は、ＫＭ−６０３−ＣＩＬ △は、ＫＭ−９３−ＣＩＬ 口は、ＫＭ−６０３をそれぞれ示す。 第 図 第４ 図 第２図 ＡＤＭ（ｎｇ　／　Ｉ　ｘ　ｔｏ’　１ｔ１２１第５ 図 ＡＤＭ（ｎｇ／１ｘｌｏ６世叩） （ｂ） 第３ 図 ＫＭ−５３１のｊｉ！ｎ（ｐｑ／ｍわ （ａ） ＫＭ−６０３の３９７４８　（Ｐ９””（ｂ） 手 続 補 正 書（自発） 第６ 図

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）少なくとも一種のガングリオシドＧＭ＿２に反応
   するモノクローナル抗体と抗腫瘍物質を含むリポソーム
   との結合体を有効成分とする抗腫瘍剤。
2. （２）該ＧＭ＿２が非還元末端にＧａｌＮＡｃβ＿１＿
   −＿４（ＮｅｕＡｃα＿２＿−＿３）Ｇａｌ−糖鎖を有
   するものである請求項１記載の抗腫瘍剤。
3. （３）該ＧＭ＿２が非還元末端にＧａｌＮＡｃβ＿１＿
   −＿４（ＮｅｕＧｃα＿２＿−＿３）Ｇａｌ−糖鎖を有
   するものである請求項１記載の抗腫瘍剤。
4. （４）該モノクローナル抗体がＩｇＭクラスに属するラ
   ットモノクローナル抗体ＫＭ−６０３である請求項１記
   載の抗腫瘍剤。
5. （５）該モノクローナル抗体がＩｇＭクラスに属するマ
   ウスモノクローナル抗体ＫＭ−５３１である請求項１記
   載の抗腫瘍剤。
6. （６）抗腫瘍物質がアドリアマイシンである請求項１記
   載の抗腫瘍剤。
7. （７）ＩｇＭクラスに属し、少なくとも一種のガングリ
   オシドＧＭ＿２に反応するラットモノクローナル抗体Ｋ
   Ｍ−６０３。
8. （８）ＩｇＭクラスに属し、少なくとも一種のガングリ
   オシドＧＭ＿２に反応するマウスモノクローナル抗体Ｋ
   Ｍ−５３１。
9. （９）ラットモノクローナル抗体ＫＭ−６０３を生産す
   る能力を有するハイブリドーマＫＭ−６０３（ＦＥＲＭ
   ＢＰ−２６３６）。
10. （１０）マウスモノクローナル抗体ＫＭ−５３１を生産
    する能力を有するハイブリドーマＫＭ−５３１（ＦＥＲ
    ＭＢＰ−２５９７）。