JPH0387195A

JPH0387195A - ジペプチド類の製造方法

Info

Publication number: JPH0387195A
Application number: JP22177989A
Authority: JP
Inventors: Akira Hirata; 彰平田; Naoshi Honda; 尚士本田
Original assignee: Tosoh Corp
Current assignee: Tosoh Corp
Priority date: 1989-08-30
Filing date: 1989-08-30
Publication date: 1991-04-11
Anticipated expiration: 2014-05-31
Also published as: JP2897274B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、α−Ｌ−アスパルチルーＬ−フェニルアラニ
ン低級アルキルエステルの前駆物質であるＮ−置換α−
Ｌ−アスパルチルーＬ−フェニルアラニン低級アルキル
エステルのフェニルアラニン低級アルキルエステル付加
物の製造方法に関するものである。α−Ｌ−アスパルチ
ルーＬ−フェニルアラニン低級アルキルエステル、特に
メチルエステルは低カロリーＨ°味料として有用な物質
である。

（従来の技術）ペプチド類は二個以上のアミノ酸のアミノ基とカルボキ
シル乱の脱水縮合により合成される。この合成法の一つ
として、金属プロテアーゼの持つ加水分解活性の逆反応
を利用する酵素法がある。

この方法を工業的に応用する場合には、コスト低減を計
るため、反応に使用した金属プロテアーゼを濃縮膜によ
り回収し、再利用する方法が提案されている。

これに対し、金属プロテアーゼを濃縮回収するコストを
低減するため、水相および有機相の存在下、水相で合成
したペプチド類を有機相により抽出回収することで、金
属プロテアーゼを継続的に使用する方法（特公昭６０−
３３８４０、特公昭６２−１７１９）も提案されている
。

（発明が解決しようとする課題）水相および有機相の存在下、水相で製造したペプチド類
を有機相で抽出回収する方法は金属プロテアーゼを継続
的に使用することができ、製造コストを削減するために
非常に有効な方法である。

しかしながら、これらの技術を工業的に応用するために
は、反応系への基質の効率的な添加方法、合成したペプ
チド類の効率的な濃縮回収方法、金属プロテアーゼ表面
に析出する桔品の効率的な除去方法、ならびに基質と金
属プロテアーゼの効率的な混和方法を含めた、ペプチド
類の製造方法の開発が必要であった。

（課題を解決するための手段）本発明者らは、ペプチド類の縮合反応と抽出濃縮回収と
を同時に効率良く行うために、金属プロテアーゼもしく
は耐水かつ耐溶媒性の担体に固定化された粒状、紐状、
繊維状、布状あるいはハニカム状の固定化金属プロテア
ーゼの存在する反応系に、反応弘質を含む水溶液と、ペ
プチド抽出溶媒を接触させ、金属プロテアーゼの表面に
ペプチド類の結晶を析出させること無く、かつ酵素活性
を維持しつつ、脈動を重畳することで効率良く、縮合反
応と縮含物の抽出濃縮回収とを同１１ηに連続的に行う
方法を見いだし、連続製造方法を発明するに至った。

（作用）本発明による装置において、ペプチド類を効率的に合成
、抽出濃縮回収するために、反応塔内を恒温に保ち、反
応に適当なｐＨに調製した水溶液中に固定化金属プロテ
アーゼもしくは金属プロテアーゼを分散させる。さらに
、脈動を重畳することで、水相と有機相を効率的に混和
させると同時に、金属プロテアーゼ表面にペプチドの結
晶を析出させることなく、効率的に有機相に抽出濃縮回
収する。このため、この製造装置の反応塔内には溶液の
流れに対して直角に内径１〜８　ｍ　ｍ−、さらに望ま
しくは２〜４ｍｍの細孔を、開口率１０〜５０％、さら
に望ましくは２０〜３０％で適当な個数を有する多孔板
を適当な枚数存在させるのが有効である。

この製造装置を使用するときには、塔内で１〜５０ｍｍ
、さらに望ましくは１〜２０ｍｍの振幅で１０〜５００
サイクル／分、さらに望ましくは６０〜２００サイクル
／分の脈動を重畳することで、反応塔内の溶液を１］的
に即するように攪拌する。この操作で、金属プロテアー
ゼは約８００時間以上のペプチド縮合反応の後にも充分
な縮合活性を有していた。

反応に際しては、反応塔の上部より拙質溶波を一定の速
度で供給する。非固定化の金属プロテアゼを使用する場
合は混和溶液を反応塔の上部より添加する。合成された
ペプチドを抽出回収するための有機溶媒は址質溶戚と向
流に接触させるために、反応塔の下部より注入し、反応
塔の上部より回収する。回収された有機溶媒は反応塔の
外の容器でペプチドの結晶を析出させ、濾通、辿心沈殿
等で結晶を回収の後、抽出回収用の有機溶媒として循環
させる。なお、反応の終了した水溶液は基質を添加して
９０〜９５％を循環させる。　さらに、ペプチド類の合
成、抽出回収時には反応３４内の水溶液中に有機溶媒が
５〜３０％分散して在住することが有効であり、さらに
望ましくは１０〜２０％イ？ニア［することが有効であ
る。なお、抽出濃縮回収有機溶媒としては、酢酸エチル
、酢酸アミル、酢酸ブチル等が有効であるが、水溶液と
分離し、かつ合１戊されたペプチド類を抽出可能である
有機溶媒であれば総てが使用可能である。

旦質原料の供給速度は塔内の滞留時間１〜２０時間、さ
らに望ましくは２〜１０時間で有効である。

金属プロテアーゼとしてサーモライシンを使用し、Ｌ−
フェニルアラニンメチルエステル（以下Ｌ−ＰＭと称す
）とＮ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−アスパラギン
酸（以下Ｚ−Ｌ−ＡＳｐと称す）の縮合によりＮ−ベン
ジルオキシカルボニル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニ
ルアラニンメチルエステル（以下Ｚ−ＡＰＭと称す）を
合成する場合、反応塔はジャケットにて０〜６５℃、さ
らに望ましくは４０℃程度に保温する。ただし、この温
度は厳密に調整することは必ずしも必要ではない。

サーモライシンもしくは固定化サーモライシンは反応塔
内の水溶ｄｋ中に存７Ｅシ、この場合、水溶液のｐＨは
５．０〜８．０で右動であり、望ましくはｐＨ６，０〜
６．５で有効である。また、ＬＰＭおよびＺ−Ｌ−Ａｓ
ｐは水に冶解したのち反応塔内と同じｐＨを与えるよう
に調整され、供給される。供給される基質の濃度は、Ｌ
−ＰＭ。

Ｚ−Ｌ−Ａｓｐそれぞれ、２００−１４００ｍＭ、。

１００〜１４００ｍＭで有効であり、望ましくはそれぞ
れ、４００〜８００ｍＭ、２００−４００ｍＭで有効で
ある。

有機溶媒にて抽出されたＺ−ＡＰＭは反応塔の系外で低
温に冷却され、連続的に結晶化、回収される。結晶が除
去された有機溶媒は抽出回収溶媒として循環され、使用
される。

なお、この有機溶媒中にはＬ−ＰＭが多量に溶解する。

このため、Ｌ−ＰＭの供給のために有機溶媒を利潤する
ことも可能である。

この全体のプロセスを勘案して例として作製したのが、
図１に示す反応装置である。しかしながら、この発明に
よる反応装置は図１に限るものではない。

（発明の効果）以上の説明から明らかなように、１、水相中の生成物濃度の低下により反応平衡改善、反
応速度の１曽大か期待でき、２、晶析と組み合わせることにより生成物回収が容易に
行うことができ、３、生成物は速やかに有機溶媒中に移動することで濃縮
回収されるので、微生物による汚染の危険性が低くなる
ことが期待でき、４、脈動を重畳することにより酵素表面に析出すること
なく有機溶媒中に生成物を抽出濃縮し、有機溶媒中に結
晶として回収することができ、５、さらに以上のことに
より、酵素活性の低下を防ぎつつ微生物の汚染の少ない
生成物を速やかに製造できるようになった。

以下実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本
発明はこれらの実施例のみに駆足されるものでない。

実施例　１゜図１において、反応塔は長さ５０ｃｍ、内径０２６ｍｍのものを使用した。反応塔の内部には４．６ｃ
ｍ毎に内径４ｍｍの細孔を持つ開口率２２％の円盤を７
箇所に設置した。

１２のウォタージャケッ！・および８の熱交換器は４０
℃にて保温した。また、３のウォタージャケットおよび
１８の恒温泊は７；ｔ゛温にて冷却した。

水相としてｐＨ６，５の０，１Ｍ−モルホリノエタンス
ルホン酸−水酸化ナトリウム緩衝液（以下、ＭＥＳと称
す）を調製し、使用した。有機相としてｐＨ６，５のＭ
ＥＳで飽和した酢酸エチルを調製し、使用した。

反応塔には、円盤間にニチビ（株）より堤供されたＩＱ
ＯＸ１５０ｍｍのフィルム状に固定化したサーモライシ
ン（１，２ｇの酵素量；特開昭６３−２０９５９９）を
１枚分づつ６箇所に１００　Ｘ　５　ｍ　ｍの大きさに
切断し、ｐＨ７のＭＥＳにて膨潤した後に設置した。そ
の後、ｐＨ６，５のＭＥＳにて反応塔内部を９０％満た
した＆、ｐＨ６，５のＭＥＳで飽和した酢酸エチルで反
応塔内を満たした。また、］の有機相オーバ］　１フロー　２の晶析槽、４の濾過器、および９の有機相循
環ポンプをｐＨ６，５のＭＥＳで飽和した酢酸エチルで
満たした。

１７の県質溶波リザーバーには、ｐＨ６，５のＭＥＳ中
に、Ｌ−ＰＭおよびＺ−Ｌ−Ａｓｐを溶解して、それぞ
れ３００ｍＭ、２００ｍＭにしたものを入れた。

反応に際して、反応塔内は４０℃に保ち、１４のサンプ
リング口に注射筒をつけ、モーターの駆動によりピスト
ン部を上下させることにより、反応塔内に上下差１０ｍ
ｍ、１００サイクル／分の脈動を与えた。また、有機相
の循環速度は２５ｍ１／分とし、水相への基質溶液の供
給速度は２０−７時間とした。

３８時間反応の後、Ｌ−ＰＭおよびＺ−ＬＡｓｐを溶角
ｑして、それぞれ１５０ｍＭ、　１００ｍＭにして、さ
らに５４１時間反応を続けた。

反応塔の有機相の出口と水相の出口でＺ−ＡＰＭの濃度
をＨＰＬＣカラムにより下記に示す方法でそれぞれａｌ
ｌ＋定した。

　２＜Ｚ−ＡＰＭの測定方法〉ＨＰＬＣカラム：　ＯＤＳ−８０ＴＭ　（ＯＤＳシリカ
　東ソー（株）製）カラムサイズ：内径４．６ｍｍｘ長さ１５０展開溶媒　
水ニアセトニトリル（１：　１、酢酸でｐ）（４，８に
調！ｔり流速＝１−／分検出：紫外吸収（２５４ｎｍ）結果を図２に示す。図２において、横軸は連続反応時間
（時間）を、縦軸は水相、有機相のＺＡＰＭの濃度（ｍ
　Ｍ　）を示す。

有機相のＺ−ＡＰＭの濃度は４０時間で６０ｍＭまで上
昇した。これは晶析操作を常温で行ったために、抽出さ
れたＺ−ＡＰＭか有機相中に蓄積したことによる。しか
し、有機相中のＺＡＰＭ濃度が５０ｍＭ程度とかなり高
いにもかかわらず、この時の水相中のＺ−ＡＰＭ濃度は
飽和濃度以下の４ｍＭ以下に保たれており、固定化酵素
表面にｚ−ＡｐＭ紀晶の析出および付着は見ら　３れず、効率良く安定してＬ−ＰＭとＺ−ＡｓｐよりＺ−
ＡＰＭの連続合成ができた。

実施例　２゜図１において、反応塔は長さ１００ｃｍ、内径２６ｍｍ
のものを使用した。

１２のウォタージャケットおよび８の熱交換器は４０℃
にて保温した。また、３のウオタージャケットおよび１
８の恒温搏は５℃の冷水にて冷却した。　水相としてｐ
Ｉ（６，５のＭＥＳを、有機相としてｐＨ６，５のＭＥ
Ｓで飽和した酢酸エチルを使用した。

反応塔内には、酵素濃度が４０　ｇ／ｌになるように、
サーモライシンを分散し、ｐＨ６，５のＭＥＳにて反応
塔内部を９０％満たした後、ｐＨ６，５のＭＥＳで飽和
した酢酸エチルで満たした。

また、１の有機相オーバーフロー　２の晶析槽、４の濾
過器、および９の有機相循環ポンプをｐＨ６，５のＭＥ
Ｓで飽和した酢酸エチルで満たした。

１７の、基質溶液リザーバーには、ｐＨ６，５のＭＥＳ
中に、Ｌ−ＰＭおよびＺ−Ｌ−Ａｓｐを溶　４解して、それぞれ４００ｍＭ、２００ｍＭにしたものを
入れた。

反応に際して、反応塔内は４０℃に保ち、１４のサンプ
リング口に注射筒をつけ、モーターの駆動によりピスト
ンン部を上下させることにより、反応塔内に上下差１０
ｍｍ、１００サイクル／分の脈動を与えた。また、有機
相の循環速度は２５ｄ／分とし、水相への基質溶酸の供
給速度は２０ｍ１／時間とした。

反応塔の有機相の出口と水相の出口でＺＡＰＭの濃度を
ＨＰＬＣカラムにより実施例１に示す方法でそれぞれ測
定した。

結果を図３に示す。図３において、横軸は連続反応時間
（時間）を、縦軸は水相、有機相の２＝ＡＰＭの濃度（
ｍ　Ｍ　）を示す。

有機相のＺ−ＡＰＭの濃度は３０時間で３０ｍＭまで上
昇した。これは晶析工程で種晶を使用しなかったために
、抽出されたＺ−ＡＰＭが有機相に蓄積したことによる
。しかし、安定的にＺＡＰＭが粘晶化し、濾過により回
収された３０時］　５間以降では有機相のＺ−ＡＰＭ濃度は２０ｍＭ程度にな
った。このことで連続的に水相よりＺＡＰＭを抽出する
ことができるようになった。この時、水相のｌ−ＡＰＭ
濃度は飽和濃度以下の３ｍＭ程度に保たれており、サー
モライシンの触媒作用で、Ｌ−ＰＭとＺ−ＡｓｐよりＺ
−ＡＰＭの連続合成がてきた。

この時の反応収率はＺ−Ｌ−Ａｓｐを址準にして７０％
になった。

【図面の簡単な説明】

図１は本発明の方法で使用できる反応装置の一例を示す
図であり、図２および図３は本発明の実施例において得
られた水相および有機相中の２−ＡＰＭの経貼変化を示
す図である。１：有機＋Ｈオーバーフロー　２：晶析相、３：ウォー
タージャケット、４：濾過器、５：有機相リザーバー　
６＝吸引ポンプ、７：濾波回収、８：熱交換器、　６９：有機相循環ポンプ、］０・恒温水入口、１１・恒温
水出口、］２．ウォータージャケット、１３：反応塔、１４：サンプリング口、１５：水相オー
バーフロー　１６：反応残液相、１７：基質溶酸（原料
）リザーバ

Claims

【特許請求の範囲】

（１）アミノ基に保護基を有するＤ体を含んでもよいＬ
−アミノ酸とカルボキシル基をエステル化したＤ体を含
んでもよいＬ−アミノ酸とを縮合させる反応において、
金属プロテアーゼもしくは、固定化した金属プロテアー
ゼが充填された反応塔の中で、２種のアミノ酸を含む基
質水溶液と有機溶媒を接触させ、縮合反応と縮合物の抽
出を同時に行うことを特徴とする製造方法。
（２）アミノ基に保護基を有するＤ体を含んでもよいＬ
−アミノ酸がＬ−アスパラギン酸であり、カルボキシル
基をエステル化したＤ体を含んでもよいＬ−アミノ酸が
Ｌ−フェニルアラニンである特許請求の範囲第１項の製
造方法。
（３）アミノ基の保護基がベンジルオキシカルボニル基
である特許請求の範囲第１項の製造方法。
（４）アミノ基に保護基を有するアミノ酸がＺ−Ｌ−ア
スパラギン酸、カルボキシル基がエステル化されたアミ
ノ酸がＬ−フェニルアラニンメチルエステル、縮合物が
Ｚ−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエ
ステルである特許請求の範囲第１項の製造方法。
（５）有機溶媒が酢酸エステルである特許請求の範囲第
１項の製造方法。
（６）含水触媒に水を補給することを特徴とする特許請
求の範囲第１項の製造方法。
（７）基質水溶液と有機溶媒を向流に接触させ塔内流動
に脈動を重畳することを特徴とする特許請求の範囲第１
項の製造方法。
（８）基質水溶液と有機溶媒を並流に接触させ塔内流動
に脈動を重畳することを特徴とする特許請求の範囲第１
項の製造方法。
（９）固定化酵素触媒として繊維含有樹脂を担体として
用いることを特徴とする特許請求の範囲第１項の製造方
法。
（１０）反応塔内に粒状、繊維状、紐状、布状に成型し
た固定化酵素を配置することを特徴とする特許請求の範
囲第１項の製造方法。
（１１）多孔板を塔軸に垂直に多数配置し、その間に粒
状、繊維状、紐状、布状に成型した固定化酵素を配置す
ることを特徴とする特許請求の範囲第１項の製造方法。
（１２）固定化酵素触媒をハニカム状に成型したことを
特徴とする特許請求の範囲第１項の製造方法。