JPS63209599A - ジペプチド類の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明はα−Ｌ−アスパルチルーＬ−フェニルアラニン
低級アルキルエステルの前駆物質であるＮ−置換−α−
Ｌ−アスパルチル−し一フェニルアラニン低級アルキル
エステルのフェニルアラニン低級アルキルエステル付加
物の製造法に関するものである。α−Ｌ−アスパルチル
−し−フェニルアラニン低級アルキルエステル、特にメ
チルエステルは低カロリー甘味料として有用な化合物で
ある。

［従来の技術］ 酵素は反応基買に対し極めて特異的な触媒機能を有する
蛋白賀化合物である。しかし酵素は一般に高価であるた
め工業的にはコストの面で大きな問題となり、特定の限
られた反応に用いられるに過ぎなかった。固定化支持体
への酵素の固定化は、繰り返し使用性の他、酵素の安定
性の向上、反応の連続化という観点からも工業的な利用
価値は極めて高い。

しかし水性媒体中で行われる酵素を利用したペプチド合
成は、生成した目的ペプチドを沈殿物として反応系外へ
取り除くことにより反応を進行させることを基本として
いるため、その沈殿が固定化酵素表面上で析出、被覆さ
れ、反応の進行が妨げられるうえ、目的物の沈殿と固定
化酵素との分離に困難を来す。

これに対し、水分を含有する多孔質の固定化酵素を用い
、これを水に非混和性の有機溶媒単一相中、または水と
の二相系中に分散させることにより、目的ペプチドを沈
殿として析出させる代わりに、有機相中へ移相抽出する
方法を利用したジペプチドの合成法も提案されている。

（特公昭８０−３３８４０号、特公昭６１−５３９９号
、特開昭６１−１２２９８号） ［発明が解決しようとする問題点］ 蛋白質分解酵素によるペプチド結合切断反応の逆反応を
利用した水性媒体中でのジペプチドの合成反応では、目
的物が沈殿として生じるため、固定化酵素をこの反応に
用いる場合は水に非混和な有機溶媒で抽出し、目的物と
固定化酵素を分離する工程が加わる。そのため操作が複
雑になるうえ、有機溶媒の使用は酵素失活の原因となり
、また高価な有機溶媒を用いるため、有効な回収、再使
用を必要とし工業的にも不利である。同様に水と非混和
な有機溶媒単−相、または水との二相系でのペプチド合
成反応も上記問題を伴う。酵素反応は水性媒体中のみで
行なうのが最も好ましいが、前述の様に目的物と固定化
酵素の分離は容易ではなく、従来は水性媒体中での固定
化酵素を用いたジペプチドの合成は困難であるとされて
いた。

［問題を解決するための手段］ 本発明者らは、二つのアミノ酸誘導体としてＮ−置換ア
スパラギン酸とフェニルアラニン低級アルキルエステル
を水性媒体中で反応するに際し、フィルム状の固定化酵
素を用い、析出するＮ−置換アスパルチルフェルアラニ
ン低級アルキルエステルのフェニルアラニン低級アルキ
ルエステル付加化合物が、溶液に適当な攪拌を加えるこ
とにより微細な結晶として酵素支持体表面より剥離され
、さらに微結晶より成るスラリーの濃度を低く抑えるこ
とで固定化酵素と目的物の分離がそれらの大きさにより
可能であることを見出し、本発明の完成に至った。

［作　　用コ 本発明の方法における一方の原料であるＮ−置換アスパ
ラギン酸のＮ−置換基はペプチド合成反応において通常
使用されるアミノ基の保護基であり、例えばベンジルオ
キシカルボニル基をその好適なものとして例示すること
ができる。他方の原料であるフェニルアラニン低級アル
キルエステルの低級アルキル基は、炭素数が１〜４のア
ルキル基であり特にメチル基およびエチル基を好適なも
のとして例示できる。これら二つの原料であるアミノ酸
誘導体はＬ一体もしくはＤＬ一体を使用することができ
る。

ＤＬ一体を用いた場合、反応にはＬ一体のみが関与し、
Ｎ−置換−Ｄ−アスパラギン酸は未反応のまま溶液中に
残るが、Ｄ−フェニルアラニン低級アルキルエステルは
Ｎ−置換−α、Ｌ−アスパルチル−し一フェニルアラニ
ン低級アルキルエステルと共に付加化合物を作りて沈殿
し得る。このためＮ−置換アスパラギン酸はＬ一体であ
ることが好ましく、フェニルアラニン低級アルキルエス
テルはＤ一体を多少含んでいても差し支えない。

本発明に使用される固定化酵素はフィルム状のものであ
り、析出する結晶との分離が可能である程度以上の大き
さを持つ必要がある。少なくとも２×２１以上の大きさ
が必要であり、それ以上の大きさがあれば特に制限はな
いが、大き過ぎるとフィルムの破損を招く恐れがある。

本発明の方法ではこれらのフィルムに酵素が固定化され
たものを使用するが、通常の固定化法により得られたも
のを使用できる０例えば物理的吸着法、イオン結合法、
共有結合法、包括法、架橋法等の方法により固定化され
たものが挙げられる。しかし固定化法はこれらに限定さ
れるものでなく、固定化後の形態がフィルム状となる方
法であれば良い０本発明で最も好ましいものとしてポバ
ール樹脂より成る光架橋固定化酵素フィルムが例示され
る。

上記の如くして調製される固定化酵素に用いられる酵素
は、活性中心に金属イオンを有する金属プロテイナーゼ
であり、例えばサーモライシン、サーモアーゼが挙げら
れる。

本発明において使用される溶媒は、最も好ましくは水で
ある。その除水には水と混和する有機溶媒を添加しても
良い。

本発明において用いられるＮ−置換アスパラギン酸とフ
ェニルアラニン低級アルキルエステルの使用量は限定的
でない、目的付加生成物沈殿は化学量論上では１：２の
モル比であるが、実際には　１００：１ないしｔ　：　
ｉｏｏ　、好ましく５：１ないし１：５、最も好ましく
は２：１ないし１：４のモル比で用いられる。

本発明の方法は、Ｎ−置換アスパラギン酸とフェニルア
ラニン低級アルキルエステルの両原料基質を溶解した水
性溶媒中に、固定化酵素フィルムを分散させ、攪拌する
ことにより行なわれる。この反応は蛋白買分解酵素が酵
素活性を示すｐＨ条件、温度条件のもとで反応させるも
のである０通常はｐＨが５．５〜８．０〜６０℃が用い
られ、より好ましくはｐＨ６〜７．５．３０〜４０℃で
良好な結果を与える０反応溶液中の食塩等の塩類の存在
は、反応中に析出が起らない濃度で含有されても問題な
いが、これら塩濃度の増加と共にフィルムの膨潤性が低
下し、反応が抑制されるため、低濃度の存在下行うこと
が好ましい。

反応中の攪拌は固定化酵素フィルムとそのフィルムに付
着した生成物を剥奪するに充分であればよい。攪拌か弱
過ぎると生成物のフィルムへの付着量が増加するために
反応速度が低下し、強過ぎるとフィルムの破砕が起こり
好ましくない、攪拌は遅くともフィルムが浮揚する程度
が必要である。超音波照射による反応液の分散効果は液
を均一にできる面では優れているが、固定化酵素フィル
ムより結晶を剥奪するという面では好ましい結果は与え
ない。

本発明の方法を用いて反応を連続的に行なうには、生成
物のスラリー濃度を低く抑える必要がある。スラリー濃
度が高過ぎると固定化酵素を含む溶液からスラリーのみ
を抜き出すのが困難となるだけでなく、フィルム表面へ
の生成物の付着が起こり反応速度の低下をもたらす、高
くてもスラリー濃度は３０ｇ／１００ｍｆｉ以下で行う
ことが好ましい。

本発明の反応は反応容器よりフィルムが流出しない状態
でスラリー溶液のみを抜き出せる装置、例えば適当なメ
ツシュを備え付けた装置を用いることで、フィルム状固
定化酵素とその表面より剥離された目的物結晶をその大
きさにより分離できることにより、容易に反応の連続化
が可能である。

本発明の方法により得られるＮ−置換−α−Ｌ−アスパ
ルチル−し一フェニルアラニン低級アルキルエステルの
フェニルアラニン低級アルキルエステル付加化合物は、
酸処理した後Ｎ−置換−α−Ｌ−アスパルチル−し−フ
ェニルアラニン低級アルキルエステルからフェニルアラ
ニン低級アルキルエステル酸付加物を分離除去し、Ｎ−
置換基を適当な方法により取り除（ことで、低カロリー
甘味剤であるα−Ｌ−アスパルチルーＬ−フェニルアラ
ニン低級アルキルエステルに導くことができる。

［発明の効果］ 以上の説明より明らかなように、 ■　固定化酵素としてフィルム状のものを用いることで
、僅かな攪拌を加えるだけで固定化酵素からジペプチド
付加化合物を容易に剥離することができ、 ■　剥離後の目的物のスラリーの濃度を低く保つことで
、固定化酵素と目的物沈殿をそれらの大きさにより分離
することができ、 ■　さらに以上のことより、従来困難とされていた固定
化酵素を用いた水性溶媒中でのジペプチド類の連続合成
反応が可能となった。

以下実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本
発明はこれらの実施例のみに限定されるものでない。

［実施例］ ０．１Ｍ−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）−水
酸化ナトリウムＭ衝溶液に、Ｎ−ベンジルオキシカルボ
ニル−し−アスパラギン酸２８．７ｇ（ｏ、ｘｏｎ＋ｏ
Ｕ）とＬ−フェニルアラニンメチルエステル塩酸塩４３
．１ｇ（０，２０ＩＩＩｏ旦）を溶解し、［）Ｈ−６，
６に調整して全量１０００社の基質溶液を調製した。

次に上記基質溶液１２Ｉｌ＋ｕと３０重量％のザーモア
ーゼを含み２Ｘ２ｍｍに切断ｌノだ光架橋固定化酵素フ
ィルム　にチビ社製、膜厚３５μｍ）２５００枚を全量
３０社の反応容器に加え、３５℃で５００ｒｐｍの攪拌
下、反応を行った。

反応中連続的に０〜３℃に冷却された槽より上記基質溶
液を２　ｍｆｉ／ｈの流速で添加した。また反応により
生じたＮ−ベンジルオキシカルボニル−α−し一アスパ
ルチルーし一フェニルアラニンメチルエステルのし一フ
ェニルアラニンメチルエステル付加化合物沈殿は、目開
きＩ　Ｘ　１　ｉｎの金属メツシュを通１ノで反応容器
底部より流出し、スラリー溶液として１８０ｍＮ／ｈの
流速で抜き取られた。このスラリー溶液は濾過して沈殿
を除いた後、濾液を再び反応容器に循環した。基質溶液
の供給により増加した分の溶液は反応容器底部より、目
的沈殿物を含むことなく、供給時の５０％量のＮ−ベン
ジルオキシカルボニル−し−アスパラギン酸を含む溶液
として抜き取られた。

この反応の定常時における溶液の平均滞留時間は１０時
間、スラリー濃度は１０〜１５重量％であった。

結果を図−１に示す。

【図面の簡単な説明】

図−１は本発明法における経時的ジペプチド生成量を示
すグラフであり、横軸は反応時間（時間）、縦軸は生成
したＮ−ベンジルオキシカルボニル−α−Ｌ−アスパル
チル−し一フェニルアラニンメチルエステルのし一フェ
ニルアラニンメチルエステル付加物の濃度（ｍｍｏｕ／
ｌ）を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　Ｎ−置換アスパラギン酸とフェニルアラニン低級ア
   ルキルエステルを固定化酵素の存在下、水性媒体中で反
   応を行なうに当り、フィルム状の固定化酵素を用い、か
   つ反応中に析出するスラリー濃度を３０ｇ／１００ｍｌ
   以下で反応を行なうことを特徴とするＮ−置換α−Ｌ−
   アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン低級アルキルエス
   テルのフェニルアラニン低級アルキルエステル付加物の
   製造方法 ２　Ｎ−置換アスパラギン酸の置換基がベンジルオキシ
   カルボニル基である特許請求の範囲第１項記載の方法 ３　Ｎ−置換アスパラギン酸がＬ−体および／またはＤ
   Ｌ−体である特許請求の範囲第１項ないし第２項記載の
   方法 ４　フェニルアラニン低級アルキルエステルの低級アル
   キル基がメチル基である特許請求の範囲第１項記載の方
   法 ５　フェニルアラニン低級アルキルエステルがＬ−体お
   よび／またはＤＬ−体である特許請求の範囲第１項ない
   し第４項記載の方法 ６　フィルム状の固定化酵素が光架橋固定化酵素である
   特許請求の範囲第１項記載の方法 ７　フィルム状固定化酵素の酵素が金属プロテイナーゼ
   である特許請求の範囲第１項記載の方法