JPH0367673B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

産業上の利用分野 本発明は発酵法による補酵素Q₁₀（以下、CoQ₁₀
と称する）の製造法に関する。 従来の技術 従来、ロドシユードモナス属に属する微生物を
用いるCoQ₁₀の製造方法としては、カロチノイド
色素生成能欠失あるいは低下変異株を使用する方
法（特公昭47−7954号、特開昭55−39730号、特
開昭55−61797号）、バクテリオクロロフイル色素
生成能向上変異株を使用する方法（特開昭56−
72694号、特開昭57−208992号）等が知られてい
る。 発明が解決しようとする問題点 すぐれたCoQ₁₀生産能を有する菌によるCoQ₁₀
の製造は常に求められている。 問題点を解決するための手段 本発明によれば、ロドシユードモナス属に属
し、CoQ₁₀生産能を有し、かつプロリンアナログ
に抵抗性を有する微生物を栄養培地に培養し、培
養物中にCoQ₁₀を生成蓄積させ、該培養物から
CoQ₁₀を採取することにより、好収率でCoQ₁₀を
生産できる。 本発明に使用する微生物はロドシユードモナス
属に属し、CoQ₁₀生産能を有し、かつプロリンア
ナログに抵抗性を有する微生物であればいずれも
用いられる。 プロリンアナログとしては、Ｌ−チアゾリジン
−４−カルボン酸、３，４−デヒドロプロリン、
Ｌ−２−アゼチジンカルボン酸、４−ヒドロキシ
−Ｌ−プロリン等があげられる。 上述の性質を有する微生物は、元来CoQ₁₀生産
能を有する微生物を親株としてこれにプロリンア
ナログに抵抗性の性質を付与することによつて得
ることができる。また、その逆の方法、すなわ
ち、プロリンアナログに抵抗性の微生物にCoQ₁₀
生産能の性質を付与することによつて得ることも
できる。 例えば、CoQ₁₀生産能を有する微生物を種々の
薬剤処理またはＸ線、γ線、Co等照射すること
によつて得られる。 このようにして得られる菌株を培養して、
CoQ₁₀生産能が親株より顕著に向上した菌株を選
択して本発明に使用する。 本発明に使用する菌株の具体例としては、ロド
シユードモナス・スフエロイデス
（Rhodopseudomonas spheroides）Ｈ−3772（以
下、Ｈ−3772と称する）及びＨ−3773（以下、Ｈ
−3773と称する）があげられる。これらのＨ−
3772及びＨ−3773は工業技術院微生物工業技術研
究所に微工研菌寄第7990号及び第7989号（寄託
日：昭和59年12月８日）として、それぞれ寄託さ
れている。 次に、上記菌株を得る操作例を説明する。 CoQ₁₀生産能を有するロドシユードモナス・ス
フエロイデスFERM−P6008（以下、FERM−
P6008と称する）の細菌を0.05Mトリス・マレイ
ン酸緩衝液（PH6.0）中に約10⁸cells／mlの濃度に
懸濁し、ここにＮ−メチル−N′−ニトロ−Ｎ−
ニトロソグアニジンを最終濃度１mg／mlになるよ
うに添加し、室温で30分間静置した後、３，４−
デヒドロプロリン（500μｇ／ml）またはＬ−チ
アゾリジン−４−カルボン酸（200μｇ／ml）を
含む下記のごとき組成を有する最少培地寒天平板
培地にそれぞれ塗抹し、生育するコロニーの中か
らＨ−3772及びＨ−3773をそれぞれ選択した。 これらの変異株は第１表から明らかなごとく、
３，４−デヒドロプロリン、Ｌ−チアゾリジン−
４−カルボン酸の各々の抵抗性を有する点で親株
であるFERM−P6008と明らかに区別できる。

【表】 −〓生育せず
上記最少培地寒天平板培地の組成 グルコース10ｇ／、NH₄Cl4ｇ／、
KH₂PO₄1ｇ／、K₂HPO₄3ｇ／、MgSO₄・
7H₂O0.4ｇ／、FeSO₄・7H₂O0.01ｇ／、
MnSO₄・4H₂O0.01ｇ／、ビチオン50μｇ／、
寒天20ｇ／、PH7.2。 本発明に使用する培地としては、使用菌株の利
用しうる炭素源、窒素源、無機物その他の栄養物
を程よく含有する培地ならば、合成培地、天然培
地のいずれも使用できる。 炭素源としては、グルコース、サツカロース、
廃糖蜜、殿粉等の炭水化物、グリセリン、ソルビ
トール等の糖アルコール類、メタノール、エタノ
ール等のアルコール類等が使用できる。 窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アン
モニウム、酢酸アンモニウム等の無機または有機
アンモニウム塩、酵母エキス、コーンスチープリ
カー等の窒素含有天然物が使用できる。 無機塩としては、リン酸二水素カリウム、リン
酸水素二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナト
リウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン等が使用でき
る。 もちろん、天然物を用いたときなどにはそれに
含まれる無機塩のみで満足させることが可能なこ
ともある。 また、本発明に使用する微生物が生育のために
特定の栄養素を必要とする場合には、その栄養素
を適当量培地に存在させなければならないが、こ
れらの物質は窒素源として例示した天然物に含ま
れて添加される場合がある。そして培養液中に各
種の物質、例えば、アミノ酸塩、核酸関連物質、
ビタミン類、有機酸類、アルコール類、ステロー
ル類、その他CoQ₁₀生合成前駆物質およびその関
連物質などを添加することによりCoQ₁₀生成量が
増加する場合がある。 培養は、振盪培養、通気撹拌培養などの好気的
条件下で行う。 培養温度は20〜40℃の範囲が適当であり、PH５
〜９程度が適当である。 培地のPH調節は炭酸カルシウム、酸あるいはア
ルカリ溶液、PH緩衝剤などによつて行う。 培養期間は通常３〜７日間でCoQ₁₀は主として
菌体中に生成蓄積する。培養物からのCoQ₁₀の単
離は常法、例えば溶媒抽出、濃縮、カラムクロマ
トグラフイー等によつて行う。 以下に、実施例を示す。 実施例 １ 種菌として、Ｈ−3772及びＨ−3773を用いた。
これら各菌株を250ml容三角フラスコ中のグルコ
ース２ｇ／dl、ペプトン１ｇ／dl、酵母エキス１
ｇ／dl、食塩0.5ｇ／dlからなる種培地（PH7.2）
30mlに接種し、30℃で24時間振盪培養した。これ
ら種培地３mlを250ml容三角フラスコ中の下記組
成の発酵培地30mlに接種し、30℃で96時間振盪培
養した。培養にあたつては、24時間目及び48時間
目にそれぞれ廃糖蜜４ｇ／dl（糖濃度換算）をフ
イードした。このとき培養物中のCoQ₁₀生成蓄積
量は、Ｈ−3772及びＨ−3773でそれぞれ138mg／
及び141mg／であつた。対照として同一条件
で培養した親株であるFERM−P6008は121mg／
であつた。 （発酵培地の組成） 廃糖蜜５ｇ／dl（糖濃度換算）、酵母エキス２
ｇ／dl、硫酸アンモニウム0.8ｇ／dl、リン酸二
水素カリウム0.05ｇ／dl、硫酸マグネシウム７水
塩0.025ｇ／dl、炭酸カルシウム２ｇ／dl、ビタ
ミンB₁0.8mg／dl、ニコチン酸0.8mg／dl（PH7.2） 実施例 ２ 種菌としてＨ−3773を用いた。 この菌株を２容三角フラスコ中の実施例１に
示した種培地300mlに接種し、30℃で24時間振盪
培養した。この種培養液300mlを５容ジヤー発
酵槽中の実施例１に示した発酵培地３に接種
し、温度30℃、通気１／min、撹拌数
350rpm／minの条件下で96時間培養した。培養
にあたつては、24時間目と48時間目にそれぞれ廃
糖蜜５ｇ／dl（糖濃度換算）をフイードした。こ
のとき培養液中にCoQ₁₀は158mg／生成蓄積し
ていた。対照として同一条件で同時に培養した親
株であるFERM−P6008は130mg／であつた。 培養終了後、Ｈ−3773の培養液２を遠心分離
し、乾燥重量として37ｇに相当する菌体を得た。
これを200mlの水に懸濁し、メタノール400ml、水
酸化ナトリウム80ｇ、ピロガロール15ｇを加え、
85℃で45分間還流後放冷し、１ずつのｎ−ヘキ
サンを加え、２回抽出した。 ｎ−ヘキサン槽を集めてこれに無水芒硝を加え
て脱水後、減圧下で濃縮した。残渣を40mlのアセ
トンに溶解して不溶物を別除去した後、再び濃
縮した。残渣を10mlのアセトンに溶解後、シリカ
ゲルカラムに流して、ベンゼンにて溶出した。
CoQ₁₀を含む画分を集めて濃縮し、残渣を５mlの
エタノールに溶解後冷却することにより、黄色の
粗結晶160mgを得た、また、同様にFERM−
P6008の培養液からは131mgを得た。 本品は、逆相薄層クロマトグラフイー、高速液
体クロマトグラフイーなどによりCoQ₁₀であるこ
とを確認した。 発明の効果 親株に較べて、CoQ₁₀生成量は、20％向上す
る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ロドシユードモナス属に属し、プロリンアナ
   ログ抵抗性を有し且つ補酵素Q₁₀を生産する能力
   を有する微生物を栄養培地に培養し、培養物中に
   補酵素Q₁₀を生成蓄積させ、該培養物から補酵素
   Q₁₀を採取することを特徴とする補酵素Q₁₀の製
   造法。 ２ プロリンアナログがＬ−チアゾリジン−４−
   カルボン酸又は３，４−デヒドロプロリンである
   特許請求の範囲第１項記載の製造法。