JPH0561915B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

〔産業上の利用分野〕 本発明は、メタノール資化性を有する微生物を
用いるビタミンB₁₂の生産方法に関するものであ
る。詳しくは、アセトバクテリウム（Aceto−
bacterium）属に属するメタノール資化性細菌を
メタノールを主炭素源とする培地に培養し、菌体
内及び菌体外に蓄積されたビタミンB₁₂を採取す
るビタミンB₁₂の発酵生産に関するものである。 〔従来の技術〕 ビタミンB₁₂は、核酸代謝、蛋白質代謝、脂質
代謝および炭水化物の代謝において必須の因子で
あることがよく知られており、ビタミンB₁₂欠乏
症、造血機能障害、肝機能障害、神経疾患の治療
薬としての医薬品や飼料添加物として広く実用に
共され、利用が増大している。 一方、ビタミンB₁₂生産供給については、その
構造の複雑さのために化学合成法が極めて困難
で、工業的には現在および将来にわたつて発酵
法、または生化学的方法による生産が主流を占め
るものと考えられる。 微生物によるビタミンB₁₂の生産に関しては、
従来糖質を炭素源としたプロピオニバクテリウム
（Propionibacrterium）属、バチルス（Bacillus）
属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）
属、アースロバクター（Arthrobacter）属、ロ
ドシユードモナス（Rhodopseudomonas）属、
シユードモナス（Pseudomonas）属、ストレプ
トマイセス（Streptomyces）属、ロドスピリナ
ム（Rhodospirillum）属、アクチノマイセス
（Actinomyces）属、セレノモナス
（Selenomonas）属、ノカルジア（Nocardia）
属、及びクロストリデユウム（Clostridium）属
等に属する、放線菌や細菌による発酵生産が最も
よく知られている。ビタミンB₁₂の発酵生産にお
いて糖質は、もつとも広く利用されてきた炭素源
であるが、天然物を原料としているため価格や供
給量などが不安定であるという欠点を持つてい
る。これに対して、入手容易でかつ安価で安定し
た供給量が期待できるメタノールを炭素源として
利用することは、工業生産上極めて有利である。
これらの観点から、メタノールを主要炭素源とし
て利用できるメタノール資化性菌によるビタミン
B₁₂発酵が精力的に研究されてきており、プロタ
ミノバクター（Protominobacter）属、メタノモ
ナス（Methanomonas）属、メタノバチルス
（Methanobacillus）属、シユードモナス
（Pseudomonas）属、及びブチリバクテリウム
（Butyribacterium）属に属する、メタノール資
化性細菌によるビタミンB₁₂の発酵生産の報告が
ある。 〔発明が解決しようとする問題点〕 しかしながら、これらの方法の大半は、通気培
養等の好気的培養法によるものであり、メタノー
ルが培養時に揮散する量が多く培養操作上不都合
であるという欠点を持つている。本発明者らは、
メタノール資化性を有する嫌気性細菌を嫌気的に
培養することによりビタミンB₁₂を生産する一連
の研究を行つてきた結果、アセトバクテリウム
ウツデイ（Acetobacterium woodii）がこの目
的に適することを見出し、これに基づいて本発明
を完成させるに至つた。 〔問題点を解決するための手段〕 すなわち本発明は、アセトバクテリウム属に属
するメタノールを資化する微生物をメタノールが
主炭素源として含まれる培地で嫌気的に培養し、
培養物よりビタミンB₁₂を採取することを特徴と
する微生物によるビタミンB₁₂の製造法に関する
ものである。本発明において使用する微生物とし
ては、アセトバクテリウム属に属するメタノール
資化性のビタミンB₁₂生産菌であれば全て用いる
ことができる。具体例としては、アセトバクテリ
ウム ウツデイDSM1030やアセトバクテリウム
ウツデイDSM2396をあげることができる。 本発明においては、主炭素源としてメタノール
を含みさらに通常用いられる窒素源、塩類、微量
成分などを加えた培地が利用される。窒素源とし
ては、アンモニア塩類、硝酸塩類、尿素等の無機
窒素やペプトン、NZ−アミン、麦芽エキス、肉
エキス、酵母エキス、コーンステイープリカー、
カゼインン分解物、フイツシユミールあるいはそ
の消化物などの窒素性有機物などを用いることが
できる。 さらに無機塩類としては、例えばコバルト塩
類、リン酸塩類、マグネシウム塩類、マンガン塩
類、亜鉛塩類、カルシウム塩類、モリブデン塩
類、鉄塩類、ナトリウム塩類などをあげることが
できる。また、必要に応じ酵母エキス等の微量有
機成分やビタミン成分等を添加することができ
る。さらに培地に５，６−ジメチルベンズイミダ
ゾールやイミダゾールの如きビタミンB₁₂前駆体
も添加できる。培地組成は、必要に応じ適宜変え
ることができる。本発明で使用する培地の１例を
第１表に示した。 培養は、窒素、二酸化炭素からなる気相中で嫌
気的条件で、静置培養、振盪培養などを行う。な
お気相の成分組成は実質的に酸素のない状態で任
意に選択できる。培養温度は20〜40℃、好ましく
は28〜32℃、PHは、5.5〜8.5程度の条件が用いら
れる。培養日数は、３〜10日程度が良く、他の培
養条件により任意に決めることができる。 本発明における培養物からのビタミンB₁₂の採
取は、従来法と同様に行うことができる。ビタミ
ンB₁₂は、主に菌体内に蓄積されるため、まず遠
心分離などにより培養物中の菌体を捕集する。シ
アノ型ビタミンB₁₂として培養物から分離すると
きには、菌体にシアンイオンを加えて硫酸等の酸
でPH５に調整したのち煮沸することにより抽出で
きる。補酵素型ビタミンB₁₂、ヒドロキシ型ビタ
ミンB₁₂、メチル型ビタミンB₁₂として培養物か
ら分離するときは、常法に従つてメタノール、エ
タノール、アセロン、ピリジン等の溶剤を用い、
暗所で菌体から抽出する事ができる。抽出された
ビタミンB₁₂の精製は、フエノール抽出、活性炭
吸着、カラムクロマトグラフイーなどを適宜に組
み合わせて行うことができる。 〔発明の効果〕 本発明により人手が容易で、かつ安価で安定供
給が期待できるメタノールを使用して嫌気的にメ
タノールの揮散量もなくビタミンB₁₂を得ること
ができる。 〔実施例〕 以下に実施例によつて本発明を説明する。 実施例 １ 第１表に示した１％メタノール含有培地をPH
7.8に調節し20mlを100ml三角フラスコに入れ窒素
67％、二酸化炭素33％の雰囲気下で嫌気状態とし
た後、120℃20分間加熱滅菌した。これに予め30
℃で３日間静置培養したアセトバクテリウム ウ
ツデイDSM1030の菌懸濁液を約0.3ml植菌し、30
℃で７日間静置培養した。培養液中のビタミン
B₁₂蓄積量を常法に従いラクトバチルス ライヒ
マニイ（Lactobacillus lichmannii）ATCC7830
を用いるバイオアツセイにより求めたところ1.2
mg／であつた。 実施例 ２ 第１表に示した培地にビタミンB₁₂前駆体とし
れ５，６−ジメジルベンズイミダゾールを１あ
たり10mg添加した培地を用いる以外は、実施例１
と同様に実施した結果、７日間の培養で培養液中
に蓄積されるビタミンB₁₂の量は、1.5mg／であ
つた。 実施例 ３ 使用する菌株をアセトバクテリウム ウツデイ
DSM2396とする以外は、実施例１と同様に実施
した結果、７日間の培養で培養液中に蓄積される
ビタミンB₁₂の量は、1.4mg／であつた。 実施例 ４ 第１表に示した培地にビタミンB₁₂前駆体とし
て５，６−ジメジルベンズイミダゾールを１あ
たり10mg添加した培地を用いる以外は、実施例３
と同様にアセトバクテリウム ウツデイ
DSM2396を用いて実施した結果、７日間の培養
で培養液中に蓄積されるビタミンB₁₂の量は、2.4
mg／であつた。

【表】

【表】

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ アセトバクテリウム属に属し、メタノールを
   資化する微生物をメタノールが主要炭素源として
   含まれる培地で嫌気的に培養し、培養物よりビタ
   ミンB₁₂を採取することを特徴とする、微生物に
   よるビタミンB₁₂の製造方法。