JPH0365184A - 新規血栓溶解剤およびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は新規プラスミノーゲン活性化因子誘導体、該誘
導体を産生ずる細胞、該誘導体をコードするＤＮＡ配列
および該誘導体の製造法にかかわる。本発明による新規
プラスミノーゲン活性化因子誘導体は、プラスミノーゲ
ンをフィブリン溶解活性を有するプラスミンに変換する
作用を有し、種々の血栓症の治療薬として用いることが
できる。

〔従来の技術〕

ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（以下、ＴＰＡと
略記する）は、ヒト・メラノーマ細胞（Ｂｏｗｏｓ　ｍ
ｅｌａｎｏｍａ）の分泌するＴＰＡについてよく研究さ
れ、５２７のアミノ酸残基から成る糖蛋白質である［　
Ｐｅｎｎ１ｃａ、Ｄ、ら（１９Ｈ年）「ネイチャー　（
Ｎａｔｕｒｅ）Ｊ　、　　３０１巻、２１４頁］。ＴＰ
Ａは、フィブリン溶解能を有しないプラスミノーゲンを
該活性を有するプラスミンに変換する酵素で血栓溶射作
用を有している。

ＴＰＡは現在、血栓症の治療に用いられている（Ｇｒｏ
ｓｓｂａｒｄ、Ｅ、Ｂ、　（１９８７年）「ファーマシ
ューテイカル・リサーチ（Ｐｈａｒａ＋ａｃｅｕｔｌｃ
ａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）　Ｊ　。

４巻、３７５頁〕。しかし、ＴＰＡの最大の欠点はその
血中からの急速なりリアランスである。血流中に投与さ
れたＴＰＡは、主に肝臓で代謝されると推定され（Ｆｕ
ｃｈｓ、Ｉｌ、Ｅ、ら（１９８５年）「ブラッド（Ｂｆ
ｏｏｄ）　Ｊ　、　　６５巻、５３９頁〕　その血中半
減期は僅かに２分である［Ｃｏ１１ｅｎ、Ｄ、　　ら（
１９８５年）サーキュレーション（Ｃ１ｒｃｕｌａｔｉ
ｏｎ）　Ｊ　、　　７２巻。

３８４頁〕。従って、血栓症の治療には大量のＴＰＡの
投与が必要である。ＴＰＡのような蛋白の大量投与によ
る血栓症治療は、極めて高価な治療になるばかりでなく
、抗原抗体反応による副作用という懸念されるべき問題
を含んでいる。

従ッテ、Ｔ　Ｐ　Ａ　分子（７）化学的修飾（Ｗ０８４
７０１７８Ｂ）（特開昭６３−０６９３８　）　　［Ｂ
ｅｒｇｅｒ、Ｉｌ、　　ら（１９８８年）「ブラッド（
Ｂｆｏｏｄ）　Ｊ　、　　７１巻、　　ｔｅ４ｉ頁］、
酵素的修飾（特開昭６２−２８２５８２）（ＥＰＯ２５
３５８２ＡＩ）　、あるいは遺伝子工学的改変（特開昭
６１−２４３０２４．特開昭６２−１３０６９０、特開
昭６２−２７２９７６、特開昭６２−２６９６８８．特
開昭６２−２８２５８２゜特開昭６４−６３３７９）等
により血中持続性の改良された、即ち血中半減期の長い
ＴＰＡの誘導体作製の試みが行われている。

〔発明が解決しようとする課題〕

上記のように、化学修飾、酵素修飾、遺伝子工学的手法
等によって、多くの血中持続性の向上したＴＰＡ誘導体
が発明されている。しかしこれらのＴＰＡ誘導体は、血
中持続性が大幅に向上した反面、ＴＰＡの特徴的な性質
であるフィブリン溶解能の極端な低下が認められ、優れ
た治療効果を示すには至っていない。また改変によりＴ
ＰＡとしての酵素活性が著しく低下している例もある。

血中持続性が向上し、かつＴＰＡの特性をできるだけ保
持したＴＰＡ誘導体は、より少量の投与での血栓治療が
期待でき、その開発の意義は極めて大きい。

本発明は、血中半減期が長く、かつフィブリン溶Ｈ能の
強い新規ＴＰＡ誘導体を提供しようとするものである。

また本発明は、該ＴＰＡ誘導体を産生ずる動物培養細胞
の作製法および該動物培養細胞を利用した該ＴＰＡ誘導
体の製造方法を提供しようとするものである。

〔課題を解決するための手段〕

ＴＰＡはＮ末端からフィンガー領域、成長因子領域、ク
リングル１、クリングル２およびセリンプロテアーゼ活
性を有する領域の５つの領域から成る（Ｐｅｎｎｉｃａ
、Ｄ、ら（１９８３年）「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｏ）
４　、　３０１巻、２１４頁〕。

ＴＰＡの成長因子領域を欠失したＴＰＡ誘導体の作製と
性質については、いくつかの記述がある（特開昭６２−
１９８６２３．特開昭６２−２６９６８８、特開昭６４
−６３３７９）　　（Ｌａｒｓｅｎ。

Ｒ，Ｇ、ら（１９８８年）「ジャーナル、オプ、バイオ
ロジカル、ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ’旧ｏ
１ｏｇＩｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ）Ｊ　２６３巻、　
　１０２３頁〕〔Ｂｒｏｗｎｅ、Ｊ、Ｍ。

ら（１９８８年）「ジャーナル、オン。バイオロジカル
、ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ’　１３１ｏｌ
ｏｇｌｃａｌＣｈｏｅ＋１ｓｔｒｙ）Ｊ　２６３巻、　
　１５９９頁〕。

成長因子領域を欠＜　ＴＰＡ誘導体は、血中持続性が向
上したもののインビトロ血栓溶解能が著しく低下してお
り、天然型ＴＰＡの良い特性を失っている。

本発明者らは、成長因子領域を欠＜　ＴＰＡのインビト
ロフィブリン溶解能の低下は、欠失によって新たに生じ
た不自然なフィンガー領域とクリングル１領域の連結部
にあると考え、遺伝子工学的手法を用いて改良に努めた
。その結果、驚くべき事に、成長因子領域の部分欠失体
の中に従来の同領域欠失体と同等の血中持続性を保持し
つつも、インビトロ血栓溶解能が著しく改善されたもの
があることを発見した。

以下、本発明の詳細な説明する。本発明は、成長因子領
域の欠失したＴＰＡ誘導体のさらなる改良であり、遺伝
子工学的手法により達成されるものである。したがって
改良型ＴＰＡの作成にはＴＰＡのアミノ酸に列をコード
するＤＮＡ配列が不可欠である。そのようなりＮＡ配列
の取得は、ＴＰＡｃＤＮＡあるいは染色体ＤＮＡのクロ
ーニング、あるいはＴＰＡｃＤＮＡ　、染色体ＤＮＡや
ＴＰＡアミノ酸配列配列とにＤＮＡを化学合成すること
によって達成できるだろう。ＴＰＡｃＤＮＡは、ペニカ
等［Ｐｏｎｎ１ｃａ、Ｄ、ら（１９Ｌ１年）ネイチ＋　
−（Ｎａｔｕｒｏ）３０１巻、２１４頁コが単離してい
る。ＴＰＡのアミノ酸配列およびｃＤＮＡに対する番号
付けは、彼等が提案しているものに従った。ＴＰＡ染色
体ＤＮＡはニイ等［ＮＹ、Ｔ、　　ら（１９１１４年）
プロシーディング、オブ、ザ、アカデミ−、オン。サイ
エンス、ニーニスエイ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ　ｏｒｔ
ｈｅ　Ａｃａｄｅｍｙｏｆ’　５ｃｉｅｎｃｅ　ＵＳＡ
）　８１巻、５３５５頁］とブラウンら［Ｂｒｏｖｎ、
Ｍ、Ｊ、ら（１９ｇ５年）ジーン（Ｇｅｎｅ）　３３巻
。

２７９頁］とデーゲンら［Ｄｅｇｅｎ、Ｓ、Ｊ、Ｐ、ら
（１９８８年）ザ、ジャーナル、オン。バイオロジカル
。

ケミストリー　（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｒＢｉｏ
ｌｏｇｉｃａｌＣｈｅ＋＋＋ｌ５ｔｒｙ）２６１巻、　
６９７２頁〕がそれぞれ単離している。ＴＰＡ染色体遺
伝子のエクソンに対する番号付けは、ニイらに従うこと
にする。本発明者らは、染色体ＤＮＡ利用発現ベクター
ｐｓＶａＰＡ−１（特開昭６２−１４７８３）によって
形質転換されたＣｌｌ０−Ｋｌ細胞よりｍＲＮＡを抽出
し、ｃＤＮＡの合成およびクローニングを行なった。実
施例にあるように新たに取得したＴＰＡｃＤＮＡおよび
ｐＳＶｅＰ＾−Ｉに含まれる染色体ＤＮＡを利用してＴ
ＰＡ誘導体作成の基本となる発現ベクターｐｓＶｅｃＰ
＾−１を作成した。

従来の技術で作成され、血中持続性およびブイプリン溶
解能が評価されている成長因子領域の欠失したＴＰＡ誘
導体に関しては、ラーセンらＬａｒｓｅｎ、Ｒ，Ｇ、ら
（１９８８年）ザ６　ジャーナル、オブ。

バイオロジカル、ケミストリー（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａ
ｌ　ｏ「ＢＩｏｌｏｇＩｃａｌ　Ｃｈｅａ＋１ｓｔｒｙ
）　２６３巻、　１０２３頁〕もしくはブローネら［Ｂ
ｒｏｖｎｅ、Ｊ、Ｍ、ら（１９８８年）ジャーナル、オ
ン。バイオロジカル、ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ　
ｏｆ’　Ｂｌｏｌｏｇｌｃａｌ　Ｃｈｅｓｌｓｔｒｙ）
　２６３巻、１５９９頁］の報告がある。成長因子領域
の欠失したこれらＴＰＡ誘導体は、いずれもアミノ酸５
１番目から８７番目までを欠失したものであり、この誘
導体は本発明の対照であり、本発明にかかる成長因子領
域の欠失体あるいは部分欠失体を作成するためのちとに
なるものである。この誘導体は彼等の行なった方法で、
作成することができる。彼等は、合成ＤＮＡブライマー
を利用したループアウト法を採用しているが、それ以外
にカセット式変異導入法も有効である。即ち５１番目か
ら８７番目までのアミノ酸をコードするｃ　ＤＮＡＮＡ
配列８４（１−ｂｐ４５０を欠失したＤＮＡ配列を化学
的に合成することによっても作成することができる。上
記方法による５１番目から８７番目迄のアミノ酸を欠失
したＴＰＡ誘導体をコードするＤＮＡ配列の作成方法に
ついては、実施例２に詳細に記した。

６５番目から８９番目のアミノ酸あるいは７５番目から
８４番目のアミノ酸が欠失したＴＰＡ誘導体の作製もル
ープアウト法あるいはカセット式変異導入法いずれでも
可能である。カセット式変異導入法を採用した場合、合
成するＤＮＡ配列は、ｃＤＮＡのすべてであっても一部
であっても良い。

一部のみ合成した場合は、適当な制限エンドヌクレアー
ゼとＴ４ＤＮＡリガーゼを組み合わせれば、本来のｃＤ
ＮＡ配列の一部分を合成ＤＮＡと置き換えることが可能
である。使用する制限エンドヌクレアーゼは、数多く考
えられるが、本発明を達成するためにはＢｇｌＩＩとＮ
ａｒ　Ｉの組み合わせが好適である。より好ましくは、
合成りＮＡとｃＤＮＡ配列ｂｐ１９０付近からｂｐ３２
３付近迄を含む１３ｇ１ＩＩとＤｒａＩＩＩで切断、単
離して得た約１３０ｂｐの断片とｂｐ４５７付近からｂ
ｐ５１９付近迄を含むｌｌａｅｍとＮａｒＩで切断、単
離して得た約６０ｂｐの断片を組合せれば良い。これら
３個の断片を連結後、前述のＴＰＡ発現ベクターｐＳＶ
ｅＣＰＡ−１の欠失、変異以外は相同な部分、即ちＢｇ
ｌＩＩとＮａｒ　Ｉでの切断で生ずる約３３０ｂｐの断
片と置き換えることによって目的のＴＰＡ誘導体発現ベ
クターが作成できる。実施例３に７５番目から８４番目
までのアミノ酸を欠失したＴＰＡ誘導体の作成方法に関
して詳細に記した。

発現ベクターｐｓＶｅｃＰＡ−１は、ＴＰＡ遺伝子の上
流にＳＶ４０ウィルスの初期プロモーターがＴＰＡ遺伝
子が発現可能な形で存在しており、動物細胞に導入され
た際、ＴＰＡあるいはＴＰＡ誘導体を生産しうるように
設計されている。もちろんプロモーターとしてはＳＶ４
０以外にＴＰＡ遺伝子を発現可能なものならいかなるも
のでも利用することができる。

６５番目から８９番目までのアミノ酸を欠失したＴＰＡ
誘導体は、制限酵素１１ａｅＩ［Ｉを利用すればより容
易に作成することができる。上記ＴＰＡ誘導体発現ベク
ターの作成方法については実施例４に詳細に記した。

発現ベクターの動物培養細胞への導入とＴＰＡ誘導体生
産細胞の作成 動物細胞へのＤＮＡの導入法として、トランスフェクシ
ョン効率に差はあるが、リン酸カルシウム法［ｗｕｇｌ
ｅｒ、Ｍ、ら（１９７７年）セル（Ｃｅｌｌ）、　　１
１巻、２３３頁］、マイクロインジェクション法［＾ｎ
ｄｅｒｓｏｎ、Ｗ、Ｐ、　ら（１９８９年）プロシーデ
ィング。

オブ、ザ、ナショナル、アカデミ−、オン。サイエンス
、ニーニスニー（同上）　７７＠、５３９９頁］、リボ
ゾーム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法或いは細胞融合法
（５ｃｈｏｆ’ｆｎｅｒ、Ｗ、ら（１９８０年）プロシ
ーディング、オプ、ザ、ナショナル、アカデミーオン。

サイエンス、ニーニスニー（同上）　、　　７７巻、　
２１６３頁〕電気導入法〔達家雅明ら、（１９８７年）
細胞工学、６巻、４９４頁）などが利用できる。

ＴＰＡ誘導体発現ベクターを細胞に導入後、適当な選択
マーカー遺伝子によって獲得した形質により形質転換株
を得ることができる。動物細胞での選択マーカー遺伝子
としては、Ｅｃｏｇｐｔ　（Ｍｕｌｌ１ｇａａｎ＋Ｒ，
Ｃ，ら（１９８０年）サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　
、　２０９巻。

１４２２頁）　　　ｎｅｏ　　［５ｏｕｔｈｅｒｎ、Ｐ
、Ｊ、　　ら（１９８２年）ジャーナル、オン。モレキ
ュラー、アンド、アプライド、ジエネティツクス（Ｊｏ
ｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒａｎｄ　Ａｐｐ
ｌｉｅｄ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）　１巻、３２７頁］　、
　ｄｈｒｒ（ＷＩｇｌｅｒ、Ｍ、　ら（１９８０年）プ
ロシーディング、オブ、ザ、ナショナル、アカデミ−。

オン。サイエンス、ニーニスニー（同上）、７７巻、３
２７頁〕等の遺伝子が用いられる。ＴＰＡ誘導体発現ベ
クターは、これら選択マーカー遺伝子を同一プラスミド
内に含んでいてもあるいは別のプラスミドであっても形
質転換株の取得は可能である。得られた形質転換株がＴ
ＰＡ誘導体を生産するか否かは、それぞれの形質転換細
胞の培養液に含まれるプラスミノーゲン活性化活性を測
定することによって決定できる。

ＴＰＡ誘導体の精製 ＴＰＡ誘導体生産株の培養は、宿主となる動物細胞株に
応じた培養法により行なうことができる。

培養上清からのＴＰＡ誘導体の回収精製は、ＣＰＧ１キ
レ−ティング　セファロース、Ｃｏｎ−Ａセファロース
、イオン交換体、オクチルセファロース、セファデック
スゲルでのクロマトグラフィ、抗体力ルムクロマトグラ
フィーや電気泳動等を用いて行なうことができる。プラ
スミノーゲン活性化活性は、プラスミノーゲン含有フィ
ブリン平板を用いる方法［Ｍａｃｋｌｅ、Ｍ、　　ら（
１９８１年）ブリティッシュ、ジャーナル、オブ、ヘマ
トロジー（Ｉｔｒｌｔｌｓｈ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｒｌ
ｌｃｖａｔｏｒｏｇｙ）　４７巻、７７頁〕やプラスミ
ンの合成基質８２２５１の分解を測定する方法［＾ＩＩ
ｅｎ、Ｒ，＾、とＰｅｔ］ｐｅｒ、Ｄ、ｓ、（１９８１
年）トロンボシス、アンド、ヘモスタシス（Ｔｈｒｏｏ
＋ｂｏｓｌｓａｎｄ　ＨａｅｌＩｏｓｔａｓｉｓ）４５
巻、４３頁］　ＣＬＴ法（Ｇａｆ’ｆ’ｎｅｙ、Ｐ、Ｔ
、とＣｕｒｔｉｓ、Ａ、Ｄ、　　（１９８５年）トロン
ボシス、アンド、ヘモスタシス（同上）５３巻。

１３４頁］　ＥＬＩＳＡ法［ｌ１ｏｌｖｏｅｓｔ、Ｔ、
ら（１９８５年）トロンボシス　アンド　へモスタシス
（同上）５５巻、６８４頁］によって測定できる。

血栓溶解能の評価 本発明が提示するＴＰＡ誘導体は、血栓の溶解にかかわ
る種々の性質すなわち比活性、フィブリン親和性、活性
のフィブリン依存性、プロテアーゼ抵抗性、血中持続性
、プラスミノーゲン活性化活性、インビトロ血栓溶解能
あるいは阻害剤感受性等のいずれかにおいて改善された
性質を持つ。

フィブリン親和性は、フィプリンタロフトへの取込みを
指標とする方法に従って測定することができる（Ｃｏｌ
ｌｅｎ、Ｄ、ら（１９８８年）ブラッド（口Ｉ　ｏｏｄ
　）７１巻、２１６頁〕。インビトロ血栓溶解能は、１
２５Ｉ−フィブリンからの放射能のＲＭを指標する方法
に従って測定することができるＩ：Ｌａｒｓｅｎ。

Ｇ、Ｒ，ら（１９８８年）ザ、ジャーナル、オン。バイ
オロジカル、ケミストリー（同上）２６３巻、　１０２
３ｎ〕。活性のフィブリン依存性あるいはプラスミノー
ゲン活性化活性は、プラスミンの合成基質５２２５１を
利用するコレンら（Ｃｏｌｌｅｎ、Ｄら（１９８２年）
ザ、ジャーナル、オン。バイオロジカル、ケミストリー
（同上）２５７巻、　２９１２頁〕の方法にて測定する
ことができる。血中持続性に関してはべ−べら［ｒ３ｅ
ｏｂｅ、Ｄ、Ｐ、ら（１９８８年）トロンポンス　リサ
ーチ（同上）４３巻、６６３頁］あるいはマットソンら
［Ｍａｔｔｓｏｎ、Ｃｈ、ら（１９８３年）トロンボシ
ス　リサーチ（同上）３０巻、９１頁〕が報告しており
、それらに記載の方法で血中半減明が８−１定できる。

〔発明の効果〕

血中持続性以外に、生体内における血栓溶解能に影響す
る因子は、フィブリン親和性、フィブリンによる活性化
、プラスミノーゲン活性化活性、プロテアーゼ抵抗性、
阻害剤感受性など様々である。本発明が提供する新規Ｔ
ＰＡ誘導体は、天然型ＴＰＡに比べてはるかに改善され
た血中持続性を持ち、且つ既に知られている成長因子領
域の欠失誘導体よりも天然型ＴＰＡに近いインビトロ血
栓溶解能を保持している点で、心筋梗塞等の血栓症の治
療に用いることができ、現花試みられている治療方法を
改善することができる。

〔実施例〕

以下に実施例を示すが、本発明に係わる諸実験は、内閣
総理大臣の定める「組換えＤＮＡ実験指針」に従って行
なった。また実施例中のファージ、プラスミド、ＤＮＡ
１種々の酵素、大腸菌等を扱う詳しい諸操作は以下にあ
げる雑誌、底置を参考とした。

ｉ、蛋白質　核酸　酵素、２６巻、４号（１９８１年）
臨時増刊　遺伝子操作（共立出版） ２、遺伝子操作実験法、高木座敷　編著（１９８０年）
講談社 ３、遺伝子操作マニュアル、高木座敷　編著（１９８２
年）講談社 ４、　　　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　　Ｃｌｏｎｌｎｇ　　
ａ　　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　　ｍａｎｕａｌ、Ｔ。

ＭａｎｌａｔｉＳら編（１９８２年）　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐ
ｒｉｎｇ　ｌ１ａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ ５、　　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｉｎ　Ｅｎｚｙ＋ｗｏｌｏｇ
ｙ、６５巻、Ｌ、Ｇｒｏｓｓｍａｍら編（１９８０年）
　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ６、　１（ｅｔｈｏｄ
ｓ　［ｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、６５巻、Ｒ，Ｗｕ編
（１９７９年）　ＡｃａｄｅＩＩｌｉｃ　Ｐｒｅｓｓ実
施例１ ＴＰＡ発現ベクターｐｓＶｅｃＰ＾−１の作成ＴＰＡ発
現ベクターｐｓＶｅｃＰＡ−１は以下に記述するステッ
プを経て作成した。

ａ、ＴＰＡのｃＤＮＡクローンｐ　ＣＨ７９は以下の様
にして作成］、た。

まず、染色体ＤＮＡ利用ＴＰＡ発現ベクターｐｓＶｅＪ
３Ａ−１（特開昭６２−１４７８３）を導入したＣＨＯ
−Ｋ　１細胞から、既知のグアニジン−ホットフェノー
ル法に準じ、トータルＲＮＡを抽出した。次に、オリゴ
ｄＴセルロースクロマトグラフィーにより、ポリＡ　　
ｍＲＮＡを調製し、ショ糖濃度勾配遠心法によって分子
量分画してＴＰＡのｍＲＮＡを含む両分を得た。市販の
ｃＤＮＡ合戊キブト（アマジャム社製）にこの両分を供
してｃＤＮＡを合成し、市販のλｇｔｌＯ利用ｃＤＮＡ
クローニングキット（アマジャム社製）を用いて、ＣＤ
ＮＡライブラリーを作成した。このライブラリーに対し
て、ｐｓＶｅＰＡ−１を制限酵素Ｘｂａ　Ｉで切断、単
離した第１０．１１及び１２エクソンを含む約２．５　
Ｋｂの断片をプローブとして用い、通常の方法でブラー
クハイプリダイゼイションを行なって陽性ファージを選
択した。得られた陽性ファージＤＮＡを調製し、制限酵
素１１１ｎｄｌｌｌ　（宝酒造株製）で消化後アガロー
スゲル電気泳動を行なって、クローニングに用いたと同
じＸｂａ１２．５Ｋｂ断片をプローブとしてサザンハイ
プリダイゼイション法により解析した。その結果、ＣＨ
７９と名づけたクローンには、ｌｌ１ｎｄＩＩ［で約２
．２　Ｋｂに切断されるプローブ陽性の断片が含まれて
いることが分かった。

：（７）Ｉｌｌｎｄｍ約２．２　Ｋｂ断片をアガロース
ゲル電気泳動法にて単離後、同じく旧ｎｄｍで消化した
ｐＵＣｌつ〔宝酒造■製〕とＴ４ＤＮＡリガーゼを用い
て連結後、Ｅ、ｃｏｌｌ　Ｄｌｌｌに導入してｐＣＨ７
９を作成した。このｃＤＮＡクローンｐＣＨ７９のｃＤ
ＮＡ部分の塩基配列をＭ１３法を利用した市販のキット
〔宝酒造■製〕にて決定した。５′末端に存在する発現
ベクター由来のＩ１１ｎｄｍ認識部位より約１５０ｂｌ
）下流にＢｇｌＩＩの認識部位が存在し、塩基配列はそ
の下流約１５００ｂｐの終始コドンＴＧＡまでｂｐ５８
５のＣがＴ及びｂｐ１７２５のＡがＣであった以外は、
ペニカら（Ｐｅｎｎ　ｔｅａ　、　Ｄら（１９８３年）
ネイチ＋　−（Ｎａｔｕｒｅ）　３０１巻、２１４頁〕
が報告した塩基配列と一致しており、さらに、ＴＧＡコ
ドンから約４１０塩基下流には発現ベクターに由来する
Ｉｌｌｎｄｍ部位が存在していた。

ｂ、ＴＰＡ発現ベクターｐＳＶｅＣＰ＾−１の作成ｐｓ
ＶｅｃＰＡ−ｌは、第１図に示した手順により作成した
。ｐｓＶｅｓａｌｌ　（特開昭６２−１４７８３）を制
限酵素Ｎｅｏ　Ｉで切断後、大腸菌内での複製起点およ
びアンピシリン耐性を付与する約４．７　Ｋｂ断片を単
離し、さらにＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて環状化後Ｅ、
ｃｏｌｉ　ＤＩＡＬに導入してｐｓＶｅｓａｌ　ｌｌ−
１１１ｎｄを作成した。従って、このベクターはｔｌｉ
ｎｄＩＩ［認識部位をはさんでＳＶ４０の複製起点を含
む初期プロモーター領域とＳＶ４０のポリアデニル化シ
グナルを含む配列がそれぞれ存在している。次に、ｐｓ
Ｖｅｓａｌ　ｌｌ−ｌ１１ｎｄをｌｌｌｎｄｍにて切断
後、ｐｓＶｅＰＡ−１を１ＩｉｎｄｎＩ及びｌ３ｇ１Ｉ
［で切断、単離して得たＴＰＡ染色体ＤＮＡの全第２エ
クソンと第３エク゛Ｊンの一部を含む約１．９　Ｋｂと
、ｐＣＨ７９を１ＩＩｎｄｌｌＩ及びＢｇｌＩＩで切断
したＴＰＡｃＤＮＡを含む約２Ｋｂ断片とをＴ４ＤＮＡ
　リガーゼにて連結後、Ｅ、ｃｏｌｉ　［１１に導入し
てｐＳＶｅＣＰＡ−１を作成した。このＴＰＡ発現ベク
ターｐＳＶｏＣＰＡ−１は、第２エクソンから第３エク
ソンのＢｇｌｎ認識部位までが染色体ＤＮＡ由来であり
、それ以降がｃＤＮＡより威り、天然型のＴＰＡを発現
する遺伝子をコードしている。

実施例２ ＤＧＦＳ発現ベクターの作成 天然型のＴＰＡの５１番目から８７番目までのアミノ酸
を欠失したＴＰＡ誘導体をＤＧＦＳと名づけ、その発現
ベクターｐｓＶｅＤＩＩ−１を第２図に示した手順によ
り作成した。ｐｓＶｅｃＰ＾−１を［３ｇ１ＩＩ及びＮ
ａｒ　Ｉで消化し約０．３３にｂの断片を得、さらにこ
れをＤｒａＩ［Ｉ及びＩＩ　ａ　ｅ　ｍで消化して得ら
れるＢｇｌＩＩ−ＤｒａＩ［Ｉ約１３０ｂｐ、　　Ｉｌ
ａｅｍ　−ＮａｒＩ約６０ｂｐ断片を単離した。

ＤＮＡ合成機（３８１Ａ　　ＤＮＡシンセサイザ、アプ
ライド　バイオシステムズ）にて、以下の配列を合成し
た。

５’　　　　　　ＧＴＧＣＣＴＧＴＣＡＡＡＡＧＴＡＣ
ＣＡＧＧＧ　　　３’３’　　　　ＡＧＴＣＡＣＧＧＡ
ＣＡＧＴＴＴＴＣＡＴＧＧＴＣＣＣ５’それぞれの１本
鎖ＤＮＡを合成、常法に従ってアニールし、２本鎖ＤＮ
Ａとした後、これとｐｓＶｃＣＰＡ−１のＢｇｌＩＩ−
Ｎａｒｌ約８．ｌＫｂ断片とＢｇｌＩＩ−ＤｒａＩＩＩ
　１３０　ｂｐ断片と　ＩＩａｅＩＩＩ　−Ｎａｒ　Ｉ
　６０　ｂｐ断片とをＴ４ＤＮＡリガーゼで連結後、Ｅ
、ｃｏｌｌ　Ｄｌｌｌに導入してＤＧＦＳ発現ベクター
ｐｓＶｅＤＩＩ−１を作成した。

実施例３ ＤＧＦＩ［Ｉ発現ベクターの作成 天然型のＴＰＡの７５番目から８４番目までのアミノ酸
を欠失したＴＰＡ誘導体をＤＧＦｍと名づけ、その発現
ベクターｐｓＶｅＰＡＤ３を第３図に示した手順により
作成した。ｐｓＶｅｃＰ＾−１をＢｇｌＩＩ及びＮａｒ
　Ｉで消化し約０．３３Ｋｂの断片を得、さらにこれを
ＤｒａＩＩ［及び１ＩａｅＩ［Ｉで消化して得られてい
るＢｇｌ　Ｕ　−ＤｒａＩＩＩ約１３０ｂｐ、　　Ｉｌ
ａｅｍ　−Ｎａｒｌ約６０ｂｐ断片を単離した。

ＤＮＡ合成機（３８１Ａ　　ＤＮＡシンセサイザ、アプ
ライド　バイオシステムズ）を用いて以下のＤＮＡを合
成した。

Ｅｌ−１５°ＧＴＧＣＣＴＧＴＣＡＡＡＡＧＴＴＧＣＡ
ＧＣＧＡＧＣＣＡ　　３’Ｅｉ−２５’　ＣＣＴＴＧＧ
ＣＴＣＧＣＴＧＣＡＡＣＴＴＴＴＧＡＣＡＧＧＣＡＣＴ
ＧＡ３′ Ｅ２−１　５’＾ＧＧＴＧＴＴＴＣＡＡＣＧＧＧＧＧＣ
ＡＣＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧ　３’Ｅ２−２　５’　ＧＧ
ＣＣＴＧＣＴＧＧＣＡＧＧＴＧＣＣＣＣＣＧＴＴＧＡＡ
ＡＣＡ　３’Ｅ５−１　５’　ＧＣＣＣＴＧＴＡＣＴＴ
ＣＴＣＡＧＡＴＴＴＣＧＴＧＴＧＣＣＡＧＧＡＡＡＴＡ
ＧＡＴＡＣＣＡＧＧＧ　３’ Ｅ５−２　５’　ＣＣＣＴＧＧＴＡＴＣＴＡＴＴＴＣＣ
ＴＧＧＣＡＣＡＣＧ＾＾＾ＴＣＴＧＡＧＡＡＧＴＡＣＡ
Ｇ　８　’ それぞれの１本鎖ＤＮＡを合成後、Ｅｌ−１とＥｌ−２
，Ｅ２−１とＥ２−２．Ｅ５−１とＥ５−２の組み合わ
せで常法に従ってアニールし、２本ｌｊ’ｌ　Ｄ　Ｎ　
Ａとした。これら３種の２本鎖ＤＮＡとｐｓＶｅｃＰ＾
−１の［３ｇ１ＩＩ−Ｎａｒｌ約８．ＩＫｂ断片とＢｇ
ｌＩＩ−ＤｒａＩＩＩ　１３０　ｂｐ断片と　Ｉｌａｅ
ｍ　−Ｎａｒ　Ｉ　６０ｂｐ断片とをＴ４ＤＮＡリガー
ゼで連結してＤＧＦｍ発現ベクターｐ！１ｌＶｅＰＡＤ
３を作成した。

実施例４ ＤＧＦ１発現ベクターの作成 天然型ＴＰＡの６５番目のアミノ酸から８９番目のアミ
ノ酸までを欠失したＴＰＡ誘導体をＤＧＦｌと命名しそ
の発現ベクターｐｓＶｅＰＡＤ５を第４図に示した手順
で作成した。

天然型ＴＰＡ発現ベクターｐＳＶｅｃＰＡ−１をｌ３ｇ
１ＩＩ及びＮａｒ　Ｉで消化し約０．８３Ｋｂ及び約８
．ｌＫｂの断片をそれぞれ調製した。約０．３３　Ｋｂ
の断片を制限酵素１１ａｅｌＩ［で消化後、両末端がＩ
ｌａｅｍで切断された約７５ｂｐの断片を除去し、これ
と上記約８．ｌＫｂの断片とをＴ４ＤＮ＾リガーゼで環
状化後、３．ｃｏｌｌＤｌｌｌに導入して、ｐｓＶｅＰ
ＡＤ５を作成した。

実施例５ ＤＧＦＳとＤＧＦＩＩＩのトランジェント発現及びその
ザイモグラフィー分析 ＴＰＡ発現ベクターｐＳＶｅＰＡＤ３およびｐｓＶｅＤ
ＩＩ−１をそれぞれ使用し、Ｃｌｌ０−Ｋｌ　（ＡＴＣ
Ｃ，ＣＣＬ−８１）を宿主として、チェノら［Ｃｈｅｎ
、Ｃ，ａｎｄ　Ｏｋａｙａｍａ、Ｉｌ、ら（１９８７年
）モレキュラー　アンド　セルラー　バイオロジー（Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ旧ｏｌｏ
ｇｙ）７巻、２７４５頁］の方法に準じて形質転換を行
なった。即ち、プラスミド［Ｔ　Ｐ　Ａ発現ベクター：
ｐｓＶ２ｎｅｏ−ｄｈｆｒ−３００：ｌ　（重量比）］
−リン酸カルシウム共沈殿物を予め５％牛脂血清（Ｆ　
ＣＳ）を含むＭＤ培地（ＭＣＤＢ３０２：ダルベッコ変
法ＭＥＭ冒１：１、シグマ）で生育させた細胞（５Ｘ１
０５細胞／　１０　ｍｌ培地／直径１０■培養皿）に加
え、１５時間後に培地を洗浄して更新した。さらに４８
時間後、培地を５μｇ／ｍｌ、インシュリン、１　ｍｇ
　／　ｍｌ牛血清アルブミン、７ｍＭ　　ε−アミノカ
プロン酸、５０μＭフォイバン（小野薬品工業）を含む
ＭＤ無血清培地に変え、さらに４８時間培養を続けた。

次の培養液中に含まれるＴＰＡ誘導体をトッドらの方法
Ｉ　Ｄｏｄｄら（１９８８年）スロンボシスアンドへモ
スタシス（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　ａｎｄ　Ｉｌａｅｍ
ｏｓＬａｓｔｓ）、５５巻、９４頁］に従って、フィブ
リンザイモグラフィーによる分析に供した。ＤＧＦＳあ
るいはＤＧＦｍは、ＣＨＯ細胞の生産するりコンビナン
ドＴＰＡ　（特開昭６２−１４７８３）よりもアミノ酸
欠失を反映する分子量の低下が確認できた。（第５図） 実施例６ マーカーベクターｐｓＶ２ｎｅｏ−ｄｈｆ　ｒの作成ｐ
ｓＶ２ｎｅｏ−ｄｈｆｒは以下の手順で作成した。

ｐｓＶ２ｄｈｆｒ　（アメリカン　タイプカルチャー　
コレクション　ｒＤＮＡ　Ｖｅｃｔｏｒｓ　３７１４Ｂ
）を制限酵素Ｐｖｕ■で切断し、そこにＢａｍＨＩリン
カ−ｄ　（ｐＣＧＧＡＴＣＣＧ）［宝酒造■製］をＴ４
ＤＮＡリガーゼで連結後、Ｅ、ｃｏｌｌ　Ｄｌｌｌｌ：
導入し”’ＣｐＳＶ２Ｂｄｈｆ’ｒを作成した。

１）ＳＶ２Ｂｄｈｆ’ｒをＢａｗｌ（Ｔで消化して得ら
れる　ｄｈ「ｒ遺伝子を含む約２Ｋｂの断片をアガロー
ス電気泳動法により調製し、ｐｓＶ２ｎｅｏ　　（アメ
リカン　タイプカルチャーコレクション　ｒＤＮＡ　Ｖ
ｅｃｔｏｒｓ　　　３７１４９　）をＢａｍ１ｌｌで切
断したＤＮＡとをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて環状化後
、Ｅ、ｃｏｌｌ　Ｄｌｌｌに導入し、ｎｅｏとｄｈｆ’
ｒ遺伝子が同発現方向に押入されたＩ）ＳＶ２ｎｅｏ−
ｄｈ「ｒを作成した。

実施例７ ＴＰＡ発現ベクターの動物培養細胞への導入とＴＰＡの
生産 ＴＰＡ発現ベクターｐＳＶｅＰＡＤ５、或いはｐＳＶｅ
ＤＩＩ−１をそれぞれ使用し、Ｃｌｌ０−Ｋｌ　（ＡＴ
ＣＣ，ＣＣＬ−６１）を宿主として、チェノらの方法（
同上）に準じて形質転換を行なった。即ち、プラスミド
［Ｔ　Ｐ　Ａ発現ベクター：　ｐｓＶ２ｎｅｏ−ｄｈｆ
’ｒ−Ｂｏｏ：ｌ　（重量比）］−リン酸カルシウム共
沈殿物を予め５％牛脂児血清（ＦＣＳ）を含むＭＤ培地
（ＭＣＤＢ８０２：ダルベツコ変法ＭＥＭ−１：　１、
シグマ）で生育させた細胞（５ｘ１．０”細胞／　１０
　ｍｌ培地／直径１０ｃｍ培養皿）に加え、１５時間後
に培地を洗浄して更新した。さらに４８時間後、培地を
５％ＦＣＳ、１１００μｇ／ｍ１０４１８硫酸塩（ギブ
コ）　、７　ｍ　Ｍ　ε−アミノカプロン酸、５０μＭ
フォイパン（小野薬品工業）を含むＭＤ培地に変え、さ
らに約２週間培養を続けＧ４１８耐性株を分離した。Ｇ
４１８耐性株を１２穴マルチデイツシユ（リンブロー社
製）の底面全体に成育させ、上記培地で２４時間培養し
、培地中に含まれるＤＧＦ　１あるいはＤＧＰＳの含量
を実施例９にあるような蛋白定量された標品を標準とし
てその活性をプラスミノーゲン含有ブイプリン平板を用
いて測定した。［Ｈａｃｋｌｅ、　Ｍら（１９８１年）
ブリティッシュ　ジャーナル　オブヘマトロジー（Ｂｒ
ｉｔｉｓｈ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｌ’　Ｉｌｅｍａｔｏ
ｌｏｇｙ）、４７巻、７７頁］。

実施例８ 形質転換株のメソトレキセート（Ｍｔｘ）による選択及
び培養 実施例７で得たｐｓＶｅＰＡＤ５あるいはｐｓＶｅＤＩ
Ｉ−１の形質転換株をそれぞれ直径１０ｃｍの培養皿に
１０３から１０５個の細胞を植え５０ｎＭから２００　
ｎＭのＭｉｘを含むＭＤ培地で約１カ月培養を続け、Ｍ
ｉｘに対して耐性を示す株を分離した。これらの耐性株
が２４時間あたり生産するＤＧＦＩあるいはＤＧＦＳの
量を実施例７に示したようにフィブリン平板法により測
定した。表−１には実施例７および８で得られたＤＧＦ
　ＩあるいはＤＧＦＳの生産法名及びその力価を示した
。Ｍｔｘで選択した細胞からは親株よりも高いＴＰＡ生
産性を示す株が得られた。また、これらの細胞はＭＤ無
血清培地（ＭＤ培地、７ｌｌ１Ｍ　　ε−アミノカプロ
ン酸、５０μＭフォイバン　１■／ｍｌ牛血清アルブミ
ン５μｇ／ｍｌインシュリン）においてもＴＰＡを生産
した。

法名 ＰＡＤ５−１７ ＰＡＤ５−２０ ＰＡＤ５−２１ １０ＰＡＤ５−１７−１ ｘｏｐＡｏ５−ｒ７−ｚ １０ＰＡＤ５−１７−４ １０ＰＡＤ５−２１−１ ５ＤＨ１−２−５ ５０１（１−２−８ ５ＤＩ１１−２−４ ５ＤＨ１−１８−３ ５ＤＩ１１−１８−７ １０ＤＩ１１−１８−８ １０ＤＨＩ−２−５ １０ＤＩ１１−２−１１ １０ＤＩ１１−２−１２ １００１１１−１８−１ １０ＤＩ＋１−１８−２ 生産ＴＰＡ ＤＧＦ　Ｉ ＤＧＦ　Ｉ ＤＧＦＩ ＤＧＦ　Ｉ ＤＧＦ　Ｉ ＤＧＦ　Ｉ ＤＧＦ　Ｉ ＤＧＦＳ ＤＧＦＳ ＤＧＦＳ ＤＧＦＳ ＤＧＦＳ ＤＧＦＳ ＤＧＦＳ ＤＧＦＳ ＤＧＦＳ ＤＧＦＳ ＤＧＦＳ 表−１ ベクター名 ｐＳＶｅＰＡＤ５ ｐＳＶｅＰＡＤ５ ｐＳＶｅＰＡＤ５ ｐＳＶｅＰＡＤ５ ｐＳＶｅＰＡＤ５ ｐＳＶｅＰＡＤ５ ｐＳＶｅＰＡＤ５ ｐｓＶｅＤＨｌ ｐｓＶｅＤＨｌ ｐｓＶｅＤＨｌ ｐｓＶｅＤＨｌ ｐｓＶｅＤＨｌ ｐｓＶｅＤＨｌ ｐｓＶｅＤＨｌ ｐｓＶｅＤＨｌ ｐｓＶｅＤＨｌ ｐＳＶｅＤＨｌ ｐｓＶｅＤＨｌ ＴＰＡ力価 ［μｇ／ｍｌ］ ０．７９ ０．２５ ０．８４ ４．３ １．９ １．７ ３．３ ０．７６ ０．６２ ０．６６ １．５５ １．０ １．２ １．３ ２．６ ２．０ １．０５ ４．５ Ｍｔｘ濃度 ［ｎＭ］ ００ ００ ００ ００ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ００ ００ ００ ００ ００ 実施例９ ＴＰＡ誘導体ＤＧＦＳおよびＤＧＦ　Ｉの回収、精製 以下にＴＰＡ誘導体およびＤＧＦＩの回収、精製の工程
を示す。工程途中のＴＰＡ抗原の検出には、市販のＥＬ
ＩＳＡキット（ＩＭＵＢＩＮＤ　ＴＰ＾ＥＬＩＳＡ　Ｋ
ＩＴ、アメリカンダイアグノステイカ社製）を用いた。

１０ＰＡＤ５−１７−１あるいはｌ０ＤＩ１１−１８−
２を実施例８で示したＭＤ無血清培地にて培養し得たＤ
ＧＦＳあるいはＤＧＦＩを含む培養液を、ＩＭＮａｃｌ
、５０μＭフォイパンを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ１７，５）にて平衝化したＣＰＧ−１０（エレクトロ
ヌクレオニクス社製）カラムにチャージし、平衡化に用
いたと同じ緩衝液にて洗浄した。ＣＰＧ−１０カラムを
通過した培養液および洗浄液中にＤＧＦＳあるいはＤＧ
ＦＩは、はとんど検出されなかった。ＣＰＧ−１０カラ
ムよりＤＧＦＳあるいはＤＧＦ　ＩをＩＭ　　Ｎａｃｌ
、　０．５　Ｍ　　ＫＳＣＮ。

１Ｍε−アミノカプロン酸および５０μＭフォイパンを
含む２０μＭリン酸緩衝液（ｐｌ［７，５）にて溶出し
た。溶出液をそのままＩ　Ｍ　　Ｎａｃｌ、　０．０１
％Ｔｗｏｅｎ　８０および５０μＭフォイバンを含む２
０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）にて平衡化したＣｏ
ｎＡ−３ｏｐｈａｒｏｓｅ　　（ファルマシア社製）カ
ラムにチャージした。平衝化に用いたと同じ緩衝液にて
洗浄後、２Ｍ　　ＫＳＣＮ、０．４　Ｍ　　α−メチル
マンノシド。

０．０ｉ％Ｔνｅｅｎ８０および５０μＭフォイバンを
含む２０μＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）にて溶出した
。

Ｅｌ、ＩＳＡを利用してＣｏｎＡ　５ｅｐｈａｒｏｓｅ
の通過培養ｌ＆、洗浄および溶出液中に含まれるＴＰＡ
抗原を検出したところ、ＤＧＦＩあるいはＤＧＦＳはほ
とんどＣｏｎＡ　５ｅｐｈａｒｏｓｅに吸着し、溶出回
収されていることが分かった。

溶出液を０．１５Ｍ、　Ｎａｃｌ　Ｏ，０１％Ｔｗｅｅ
ｎ　８０および５０μＭフォイパンを含む２０ＩＩＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７，５）に対して透析後、同緩衝液に
て平衝化した抗体カラム（ＰＡＭ−２−８ｅｐｈａｒｏ
ｓｅ　、アメリカンダイアグノステイカ社製）にチャー
ジした。０．３ＭＫ　Ｓ　ＣＮ、　０．１５Ｍ　ＮａＣ
ｌ、　０．０１％Ｔｗｅｅｎ　８０を含む２０ｍＭリン
酸緩衝液（ｐＨ７，５）にて洗浄後、３ＭＫ　Ｓ　ＣＮ
、　Ｏ，１５Ｍ　ＮａＣｌ、　０．０１％Ｔｖｅｅｎ　
８０を含むリン酸緩衝液にて溶出した。′溶出液中に含
まれるＤＧＦ　ＩあるいはＤＧＦＳを５ＤＳ−ポリアク
リルアミド電気泳動にかけて精製度を分析した。その電
気泳動図６に示した。ＤＧＦ　ＩあるいはＤＧＦＳと思
われる単一のバンドが検出された。同溶出岐中に含まれ
る蛋白量をウシ血清アルブミンを標準としてローリ−法
にて測定した。その結果ＤＧＦＩは１０ＰＡＤ５−１７
−１の培養液約２Ｌより　２．３■がＤＧＦＳはｌ０Ｄ
１１１−１８−２の培養液約２Ｌより　４．ｌｆｆ１ｇ
が、回収、精製されていることが分かった。

実施例１０ インビトロ血栓溶解能測定 ＤＧＦＩおよびＤＧＦＳのインビトロ血栓溶解能（２５ を　　！−フィブリンからの放射能の遊離を測定するラ
ーセンら（同上）の方法に従って測定した。

４．５５μｇ　／　ｍ　１ヒト　リジンタイププラスミ
ノーゲン、Ｏ，１Ｍ　　ＮａＣｌ、　Ｏ，ＯＯＬ％Ｔｗ
ｏｅｎ　８０を含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，２
）に５ｍｇ／ｍｌとなるようにヒトフィブリノーゲンを
溶解後、ヒトトロンビンを１．０ＮＩＩＩ　ｕｎｉｔ　
／　ｍ　１となるよっつに添加し、適当な容器内で３７
℃で１時間放置して凝固させた。作成したブイプリンク
ロット当量の酸素液を重層し、３７℃で４時間反応させ
た。反応後各容器内の可溶性画分を抜取り「−カウンタ
７にて試料中に含まれる放射能を測定した。その結果を
第７図に示す。ＤＧＦＩはＤＧＦＳよりも強力なインビ
トロ血栓溶解能をもっていることが分かった。

実施例１１ ＤＧＦＳ、ＤＧＦＩの血中半減期測定 精製したＤＧＦＩおよびＤＧＦＳの３ｏｏμｇをウサギ
に耳介静脈よりそれぞれ単回投与し、その血中半減期を
測定した結果、ＤＧＦＩ、ＤＧＦＳいずれの誘導体も同
程度の血中持続性を示し、その半減期は、第８図に示す
ように、１５分とａｌｌｌ定された。

【図面の簡単な説明】

第１図はベクターｐＳＶｅＣＰＡ−１の作成法を示す嘆
成因、第２図はベクターｐｓＶｅＤＩｌ−１の作製法を
示す模式図、第３図はベクターｐｓＶｅＰＡＤ−３の作
製法をす模式図、第４図はベクターｐｓＶｅＰＡＤ５の
作製法を示す模式図、第５図はＤＧＦＳ及びＤＧＦＩＩ
Ｉのフィブリンザイモグラフィー、第６図はＤＧＦ！お
よびＤＧＦＳのＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動
像、第７図はインビトロ血栓溶解能のδｔ１定結果を示
す模式図、第８図は、ウサギに投与したＤＧＦ　Ｉおよ
びＤＧＦＳの血中減衰曲線を示す。 第１．２．３および４図中、ＳＶｅ、ｐｏｌｙＡ、ＯＲ
１，。 Ｅｃｏｇｐｔ、ＴＰＡｃＤＮＡ、Ａｍｐ、　、　Ａ　Ｔ
　Ｇ及びＴＧＡは、それぞれＳＶ４０のＤＮＡ複製起点
を含む初期プロモーター領域、ＳＶ４０のポリ（Ａ）付
加シグナルを含む領域、プラスミドの複製起点、ＥｃＯ
ｇｐｔ遺伝子、ＴＰＡのｃＤＮＡ遺伝子、ＴＰＡの染色
体遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ＴＰＡ遺伝子の翻
訳開始コドン、ＴＰＡ遺伝子の翻訳終止コドンを示す。 第５および６図中ＣＨＯｒＴＰＡは、ＣＨＯ細胞で生産
したりコンビナンドＴＰＡを示す。 第１．２．３および４図中、円上の黒塗りの部分及び数
字は、ＴＰＡ染色体遺伝子のエクソンおよびエクソン番
号を表わす。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）天然型ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子のア
   ミノ酸配列において、６５番目から８９番目まであるい
   は７５番目から８４番目までのアミノ酸を欠失したフィ
   ブリン溶解活性を有する組織プラスミノーゲン活性化因
   子誘導体。 （２）形質転換された動物培養細胞で産生され、グリコ
   シル化された請求項１記載の組織プラスミノーゲン活性
   化誘導体。 （３）動物培養細胞がＣＨＯ−Ｋ１である請求項２記載
   の組織プラスミノーゲン活性化因子誘導体。 （４）天然型の組織プラスミノーゲン活性化因子と同等
   なフィブリン溶解活性を有し、かつ血中持続性が改善さ
   れた請求項１ないし３のいずれかに記載の組織プラスミ
   ノーゲン活性化因子誘導体。 （５）請求項１記載の組織プラスミノーゲン活性化因子
   誘導体をコードするＤＮＡ配列。（６）ＤＮＡ配列がｃ
   ＤＮＡである請求項５記載のＤＮＡ配列。 （７）ＤＮＡ配列が染色体ＤＮＡである請求項５記載の
   ＤＮＡ配列。 （８）ＤＮＡ配列がｃＤＮＡと染色体ＤＮＡのハイブリ
   ッドＤＮＡである請求項５記載のＤＮＡ配列。 （９）請求項５ないし８のいずれかに記載のＤＮＡ配列
   を含む発現ベクターで形質転換された動物培養細胞。 （１０）細胞がＣＨＯ−Ｋ１である請求項９記載の動物
   培養細胞。 （１１）請求項１記載の組織プラスミノーゲン活性化因
   子誘導体をコードするＤＮＡ配列を有する発現ベクター
   で形質転換された動物培養細胞を培養してプラスミノー
   ゲン活性化因子誘導体を生成せしめ、これを採取するこ
   とを特徴とするプラスミノーゲン活性化因子誘導体の製
   造方法。 （１２）動物培養細胞としてＣＨＯ−Ｋ１を使用する請
   求項１１記載の製造方法。