JPH03505101A - 藻類におけるベータ―１，３―グルカンの製造 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 藻類におけるベータ−１，３−グルカンの製造説明 技術的分野 この発明はミトリムシ、」」ｌ　ｅ　ｎ　”　）中でベーター１．３−結合ポリ グルコースを製造する方法に関する。ベーター１３３−グルカンまたはパラミロ ンとも称する、この生体高分子は、免疫促進剤または免疫強化剤のような薬剤、 しわの処理のための生体活性（ｂｉｏａｃｔｉｖｅ）成分のような化粧品を包含 する、幾つかの異なる適用分野において、あるいは食品として有用である。

背景 ベーター１．３−グルカンは非特異免疫促進物質として知られている。具体的に 言うと、それは強力なマクロシア・−シアクチベーターであることが証明されて いる。このような活性化は、怒染性の病因および腫瘍に対する向上した抵抗性、 増強されたサイト力インの産生量、および促進された傷の治癒を包含する、或範 囲の効果を引き起こす。

ミドリムシ■肱江且）属の藻類を包含する、ベーター１．　３−グルカンを産生 ずるための幾つかの種類の微生物が知られているけれども、それは一般にサソ力 ロミケス　セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏ＋ａｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａ ｅ）　（パン屋の酵母）内で産生され、そしてこのグルカンを化学的に分解させ る複雑な方法によって細胞壁から抽出される。酵母から産生されるベーター１． ３−グルカンの最高の収率は細胞塊の僅か５％乃至７％にすぎない。

低い収率に加えて、抽出プロセスの破壊的な性質が不均質な生成物を生ずる。こ の不均質性は品質管理を困難にするとともに、酵母で産生されたベーター１．３ −グルカンを用いて遂行される免疫刺激作用の研究の再現性について問題を生じ てきた。

特開昭６３−０７１１９２号公報は、ミドリムシュ肛」胆）の細胞を培養してベ ーター１．３−グルカンを製造する方法を記載している。こめ刊行物は、培養物 中に溶けている酸素は０．１〜１．０ｐｐｍの範囲内に保たなければならず、そ して１．０ｐｐ−よりも多量に使用すると、グルカンの生成量が減ると述べてい る。これとは対照的に、本発明は実質的に１．　Ｏｐｐ＋ｉよりも多い溶存酸素 含有量を使用して、グルカンの非常に高い収率を達成する。この刊行物はベータ ー１，３−グルカンの精製方法を教示していない。

本発明は、ベーター１．３−グルカン源としてのミトリムシに関する本発明者の 研究および或条件の下ではグルカンが非常に高い収率で製造され、そしてこのグ ルカンは均質な生成物を生成する簡単な方法を経て精製することができる。

主ユ皇脱皿 本発明の一つの局面は、約４乃至１６　ｇ／Ｌの初期炭素濃度を提供するのに十 分な炭素源および約１０乃至４ｏの範囲の炭素対窒素モル比を提供するのに十分 な窒素源を初めに含み、そして約２５°Ｃ乃至約３０°Ｃの温度、約２乃至約５ のｐｌおよび約４乃至４０ｐｐｍの溶存酸素濃度に維持されている増殖培地中、 暗所においてミトリムシ」昼江匣）の細胞を培養することを特徴とするベーター １，３−グルカンの製造方法である。

これらの条件下で増殖し７ている間中、細胞は比較的純粋な形で、すなわちほぼ 結晶質の形でベーター１．３−グルカンを細胞内に蓄積する。培養の終期におい て、このベーター１．３＝グルカンは細胞塊の乾燥重量の約７０％乃至９０％を 構成する。

この高い収率および生体内相対純度は、ベーター１．３〜グルカンを分解しない でその精製を容易にする。

したがって、本発明のもう１つの局面は、細胞塊が乾燥重量を基にして約７０％ 乃至約９０％のベーター１．３−グルカンを含むミドリムシフ）細胞の培養物か ら、実質的に純粋で、本質的に発熱物質を含まない（Ｐｙｒｏｇｅｎ−ｆｒｅｅ ）ベーター１゜３−グルカンを得る方法において、この方法が、無菌条件下に下 記の段階、すなわち （ａ）培養物ん上澄み液から細胞を分離し；ら）細胞を崩壊させ、そして細胞塊 から脂質および不溶性着色物質を除去する抽出剤で細胞を抽出し；（Ｃ）抽出さ れた細胞塊を抽出剤から分離し；（イ）抽出された細胞塊を希薄な酸洗浄物中で 撹拌しながら加熱して、ベーター１，３−グルカンがらｍ胞の残がいを分離し； （ｅ）酸で洗浄されたベーター１．３−グルカンを酸洗浄物から分離し；そして げ）発熱物質を含まない無菌水を用いて（ｅ）の生成物を洗浄して、前記実質的 に純粋で、本質的に発熱物質を含まないベーター１゜３−グルカンを製造する。

という段階を遂行することを特徴とする、前記方法である。

二皿皇呈員星に所 第１図、第２図の〔→〜（Ｃ）、および第３図は、後記の実施例に記載されるバ イオアッセイの結果のグラフである。

主主亙五迷行工五様人 ｐコ仁乙（１）■−Ｉ匣） ミドリムシフのいずれの種も本方法において使用できる。それらの例はユーグリ ナ　グラチリス（Ｅｕ　Ｉｅｎａ　　ｒａｃｉｌｉｓ）　、ユーグリナ　インテ ルメディア（ｂ註ｅｎａ　ｉ刀ｙゆム且）、ユーグリナヒリデ（ハ紅姐旦お謔） 、およびその他のニーグリノイド類（Ｅｕｇｌｅｎｏｉｄｓ）、例えばアスクシ ア　ロンガ（Ａｓｔａｓｉａｎ皿虹である。ユーグリナ　グラチリス（カ姐堕り 肛肛ｉ］ｉｓ）株Ｚ、　　（アメリカン　タイプ　カルチャー　コレクションを 通して入手できる）が好ましい。細胞は通常約１０’〜１ｏｂ細胞数／ａ＋ｆの 割合で培地に加えられる。

笠１玉 培養基は基本的に（１）炭素源、（２）窒素源、（３）細胞の増殖に必要な多量 栄養素、（４）細胞の増殖に必要な、または望ましい微量元素、および（５）細 胞の増殖を促進させるビタミンで構成されている。炭素源の例は、グルコース、 フラクトースおよび麦芽糖のような単純なＭ類；少糖類；コーンスターチのよう な複合炭化水素；アルカン酸並びに脂肪酸；および低級、すなわち１〜６個の炭 素原子を含むアルカノールである。培地中の炭素源の濃度は４乃至１６ｇ／Ｌ、 好ましくは８〜１２ｇ／Ｌの初期炭素含有量を提供するのに十分な濃度でなけれ ばならないや典型的な窒素源は燐酸アンモニウムおよび硫酸アンモニウムのよう なアンモニウム塩、およびアミノ酸を包含している。窒素源は１０〜４０、好ま しくは２５〜３５の範囲の炭素対窒素の初期モル比を提供するのに十分な量で培 地中に存在しなければならない。多量栄養１は燐、硫黄、Ｍｇ”（ｔなゎち、Ｍ ｇ５Ｏａ、ＭｇＣＯ３，ＭｇＣｊ！　ｚ）、Ｃａ″”（ＣａＳＯａ、ＣａＣＯ５ ン、　Ｋ”（ＫＨ２ＰＯ，ンおよびＮａ４（ＮａｔＳＯａ、Ｎａｚ−ＥＤＴＡ） のような必須元素／イオンを包含している。細胞の増殖を促進する望ましい微量 元素はＺｎ、　Ｍｎ＋　Ｍｏ、　Ｃｕ＋　Ｖ、　Ｃｏ、　Ｎｉ＋　　ＢおよびＦ ｅを包含している。これらの元素は水溶性の塩の形で培養基中に混合することが できる。培地に加えるべき好ましいビタミンはチアミンおよびＢ１□である。

旦１灸佳 培地のｐＨは酸性に、すなわち通常２乃至６、そして好ましくは３〜４．５の範 囲に維持しなければならない、このｐＨは、適当に塩基（例えばＮａＯＨ，ＫＯ Ｈ，Ｃａ（ＯＨ）ｚ）を添加することにより、これらの範囲内に維持することが できる。温度は通常２５°Ｃ乃至３０°Ｃ２好ましくは２５”Ｃ乃至２７°Ｃの 範囲に維持される。

照明は光合成を促進するとともに、ベーター１．３−グルカンよりも蛋白質の生 産を助けるので、培養は暗所において遂行される。

培養基は、培地の通気を促進するために、増殖環の間中撹拌される。この目的の ために、かき混ぜまたはその他の手段を利用することができる。培地の酸素濃度 は周囲濃度またはそれより僅かに低い濃度（約４〜８ｐｐｍ＞乃至約４０ｐｐｍ の間で変化することができる。周囲濃度よりも高い濃度を達成するためには、通 気ガスを酸素で冨化しなければならない。

細胞は、典型的には、上記の条件下で約３〜４日間培養した後に収穫される。

ベー　−１３−グルカンの　り 細胞からグルカンを精製するのは無菌条件下で遂行しなければならない。

細胞は、まず最初に、沈降、遠心分離またはその他の慣用手段によって培養物の 上澄み液から分離される。細胞は、所望ならば、抽出の前に、水で洗浄すること ができる。ついで細胞は、超音波処理あるいは細胞壁を崩壊させる溶剤処理のい ずれかによって崩壊される。好ましくは細胞は、両者とも細胞膜を溶解し、そし て細胞塊から脂質および不溶性着色物質を抽出するメタノールおよびクロロホル ムを用いて抽出させる。抽出は好ましくは混合によって遂行され、そしてこの抽 出は、必要ならば、より効果的な抽出を達成するために繰り返してもよい、抽出 後、不溶性着色物質が除かれた細胞塊を塩酸または硫酸のような薄い鉱酸溶液で 洗浄して、結晶質グルカンから細胞膜がいの残部を剥すとともに発熱物質を除去 する。酸洗浄は撹拌下に、好ましくは約１００　”Ｃに加熱して遂行される。

酸洗浄につづいて、グルカンは発熱物質を含まない水で繰り返し洗浄して、残留 する不溶性着色物質を除去する。その結果得られた生成物は１ｍｌに付き約０． ０８未満の内毒素単位を含む少なくとも約９５〜９７％の純度を有する白色結晶 性物質である。

兜坊］ム■υ１途 結晶質のベーター１．３−グルカンは単独で処方することができるか、あるいは 重合体連鎖の寸法を小さくする物理的、化学的および酵素的方法のような方法に よって可溶化することができる。非経口投与（例えば、静脈注射、筋肉注射、腹 腔内注射等）のために、グルカンを生理的食塩水、デキストロース溶液またはこ れらに類似の溶液のような通例の非経口ビヒクル中に懸濁または溶解させる。処 方物中のグルカン濃度は通常０．０１乃至１．０重量％の範囲にある。適用の型 によって濃度の変更が必要となり得る。その他の医療上の徴候において使用する ためには、例えば傷の治癒を促進するためには、局所投与用にグルカンをクリー ム、ローション、ゲルまたはこれらに類するものの状態に処方するのが望ましく なり得る。さらにまた、このような処方物の調製に通例の薬学的に受は入れられ る担体を使用することができる。

グルカンの医学的用途は当該技術において広範囲に精査されてきた。例えば、′ グルカンの免疫薬理学（Ｉｍｍｕｎｏ　ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙｏｆ　Ｇｌｕ ｃａｎ）”、エヌ・アール・ジルジオ（Ｎ、Ｒ，Ｄｉｌｕｚｉｏ）、　　）レン ズ　イン　ファーマコロジ力ル　サイアンセズ（Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ胆世川用」 ｋ肚５ｃｉｅｎｃ犯）＋　（１９８３年８月）、第４巻、第３４４頁〜第３４７ 頁を参照されたい。このような文献には特定の処方物、および特定の徴候のため の用量を見出すことができる。

１星■ 以下の実施例は、ベーター１．３−グルカンを製造するためのユーグリナ　グラ チリス（ｈ■ｅｎａ■ａｃｉｌｉｓ）の培養、ミトリムシ（ｈ紅並■細胞からの ベーター１．３−グルカンの精製、およびそのベーター１．３−グルカンの生物 学的活性を説明するものである。これらの実施例は説明するために提供されてお り、決して本発明を限定することを意図するものでない。

ニー゛１　　グーチ１ス（Ｅ用匡阻１匹旦ＸＳ）息培墨ユークリナ　グラチリス （影■ニジ％ユｎ）株Ｚを使用した。この株はアメリカン　タイプ　カルチャー 　コレクションからＮ１１Ｅ１２７１６として入手できる。この株の１００ｍｆ 接種材料を、２５〜２７°Ｃ，ｐＨ３，５〜４．０において、暗所で混合しなが ら（１２０〜２００ｒｐｍ）７２時間増殖させた培養物から調製した。

次の組成を有する増殖培地を使用した。

炭−一分　　　　　　　　　　　　盪−−Ｊ３ｄｐ−グルコース　　　　　　　 　　　　　　　　１０〜４０（ＮＨ，）　ｚｓＯｎ　　　　　　　　　　　　　 　　　　　　１．９Ｋ）１２ＰＯ，０，２５ ＭｇＣ０，０，６０ ＣａＣＯｚ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．１２ＮａｔＥＤＴ Ａ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｏ，０５ＦｅＳＯａＣＮＨａ＞ｚ ｓＯａ　・６ＨｘＯＯ，０５Ｍｎ５Ｏｎ　・Ｈｚｏ　　　　　　　　　　　　　 　　　　　０．０１８ＺｎＳＯａ　・７ＨｚＯＯ，０２５ （ＮＨａ）ＪＯｔＯｚｇ　・４Ｈ２００，００４ＣｕＳＯａ　　　　　　　　　 　　　　　　　　　　　　Ｏ，００１２ＮＨ，ＶＯ３０，０００５ ＣｏＳＯａ・７Ｈｚ０　　　　　　　　　　　　　　　　　０．０００５１３８ ０３　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．０００６ＮｉＳ（１ｍ・６ Ｈ，ＯＯ，０００５ ビタミンＢｌ（ＭＣＩ！、）　チアミンＨＣｆ０．００２５ビタミンＢ１□ＣＮ ジアノコバラミン　　　　　　　０．０００００５撹拌機および通気装置が取り 付けられているフラスコ中で、１１の培地に１００ａ＋ｆｆｉの接種材料を加え た。培養物を２５〜２７°Ｃにおいて７２〜９６時間暗所に維持した。ｐＨを３ ．０〜４．５に維持し、そして必要に応じてｐＨをＮａＯＨで調整した。約１７ ５ｒｐａ＋　　（１２０〜２００ｒｐｍの範囲）で撹拌を維持した。

培養物にＩ　Ｌ／ｗｉｎ　　（０，５〜２．３　Ｌ／＋ｉｎの範囲）の平均流速 で空気および／または純粋な酸素を通して、８乃至ｔ　Ｏｐｐ＋ｍの溶存酸素濃 度を提供した。　。

ミトリムシ（７は、無菌制御と、ガスおよび栄養素の能率的な物質移動を与える 別の種類の発酵槽の中で増殖させることもできる。これらの装置はケモスタント 、撹拌型タンク反応器（ｓｔｉｒｒｅｄ　ｔａｎｋ　ｒｅａｃｔｏｒ）、エアリ フト反応器および還流装面を包含するが、これらに限定されない。

精−−１ すべての精製手順を無菌条件下で遂行した。

３０００〜４００Ｏｒｐｍにおいて培養物を５〜１０分間遠心分離することによ って、細胞を収穫した。ついで、発熱物質を含まない水で細胞塊を洗浄し、そし て再び遠心分離にかけた。

場合により、細胞に超音波処理を施して、それの細胞壁を崩壊させることができ る。その後、撹拌機を備えたフラスコ中に、水洗した固形物を入れ、そして等容 量（容量×３まで）のメタノールを加えた。混合物を撹拌しなから６５°Ｃにお いて５〜１０分間還流させてから、冷却させた。ついで２倍容量のクロロホルム を加えてから、混合物を室温でさらに２０〜３０分間撹拌した。ついで細胞塊を 真空濾過し、そして２〜３倍の付加的容量のクロロホルムで洗浄した。濾過され た細胞塊をフラスコに移し、そして等容量のメタノールおよび２倍容量のクロロ ホルムを加えた。この混合物を室温で３０〜６０分間撹拌してから、上記のよう に真空濾過した。

つぎに、濾過された塊を十分な容量のＩＮ塩酸中に取り上げて、比較的薄い懸濁 液を提供させた。この混合物を溶剤の匂いが感じられなくなるまで沸騰させた後 、さらに２時間還流させた。その後固形物を遠心分離し、そして水で繰り返し洗 浄して、白色結晶質固体の状態で実質的に純粋なベーター１．３−グルカンを提 供した。この物質は使用するまで４°Ｃで貯蔵した。

工藤益牲 ミトリムシ（ｈれ並針から調製したベーター１．３−グルカンの生体活性の特性 を示すために、様々な試験を実施した。これらの検定を以下に述べる。

肛！■太Ｕ　　それぞれ１８乃至２０ｇの体重を有する４６週乃至４８週齢のブ ラックマウス（Ｃ５７ＢＬ／６）を４つのグループに分けた。１０匹の対照マウ スに生理的食塩水を静脈注射する一方、残りの被験マウスでは、その生理的食塩 水に様々な用量の微粒状ベーター１．３−グルカン（０，５，０，２５および０ ．１２５■／日）を与えた。用量を１日、２日および３日目に投与した。１日目 にはマウスのグルカンに対する怒受性を証明するために少なくとも１時間おいて 等しい用量のベーター１．３−グルカンを２回与え；２日目および３日目には用 量全部を唯１回の注射で与えた。６日目にマウスを犠牲にして１、細網内皮系（ ＲＥＳ）器官、すなわち肺臓、肝臓および肺を取り出した。各器官の重量を個々 に測定し、そして平均重量および標準偏差計算値を下記の表に示す。これらのデ ータを使用して、第１図に示される用量反応曲線が生成する。この曲線で示され るように、グルカンで処理された動物は対照動物と比較して、それらのＲＥＳ器 官の重量が著しく増大していることが立証された。この重量増加は処理動物の免 疫系の重要な鼓舞を示している。

ｍ　　マウスの感受性に関するベーター１，３−グルカンのリステリア　モノサ イトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ　＋ａｏｎｏｃ　ｔｏ　υ旦Ｏ−に対する効果を 測定するために、細菌攻撃の検定を実施した。

発熱物質を含まない食塩水０．５ｍｆｆ１中に３種の濃度でベーター１．３−グ ルカンを懸濁させたものを、１日、２日および３日目に静脈注射により投与し、 ついで６日目に６．０Ｘ１０’のリステリア　モノサイトゲネス（Ｌ　　ｍｏｎ ｏｃ　ｔｏ　ｅｎｅｓで腹膜組織内を通してマウスを攻撃させた。異なる濃度の 病原体を用いて、この検定を何度も繰り返した。下記の表に示した結果は、その 代表的なものである。これらの結果は、動物１体に付きベーター１，３−グルカ ン０．５■を３回服用させると、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）　Ｗ機体の攻 撃にさらされた生存動物の数が著しく増大したことを示している。ベーター１． ３−グルカンに類似の寸法を有するセルロース系微粒状物質であるアビセル（Ａ ｖｉｃｅｌ。

登録商標）（ＦＭＣ社）は、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）の攻撃からマウス を保護しないで、ベーター１．３−グルカンがその微粒状の性質とは係わりなく 、生体応答を引き出すことを示している。

第２表 リステリアモノサイトゲネス（ＬＴＳＴＥＲＩＡ　ＭＯＮＯＣＹＴＯＧＥＮＥＳ ）の攻撃に対するＣ５７ＢＬ／６マウスの怒受性に関するベーター１，３−グル カン処理の効果 ベーター１．３−グルカン　生存動物の数／の用量　　　　　　　　　　動物全 部の数　　有　意　性０．５０　■　　　　　　　　　　　　　　　７／１０　 　　　　　　　　　ｐ＜　　　、００５０．２５１１ｇ　　　　　　　　　３／ １０　　　　　　　ｎ、ｓ。

０．５０　ｍｇ　Ａｖｉｃｅｌ　　　　　Ｏ／１０　　　　　　　ｎ、ｓ。

食塩水　　　Ｏ／１０ 亙住バ狂　天然の微粒状ベーター１．３−グルカンの溶液を、５０．５００．ま たは５０００■／ｋｇのいずれかの単一用量あるいは８日間連続して１５，１５ ０、または１５００■／ｋｇの用量で腹膜＆！１織内を通してマウスに投与した 。すべてのマウスが生存し、そして病気の状態の重大な徴候を示さないで、投与 量は゛無毒であることを示した。１０日目に、ベーター】、３−グルカンの効果 を測定するために、検死を遂行した。若干内蔵の癒着が発見されたが、これは、 恐らくこの抵抗する微粒状物質の掻端に高い投与量によるものと思われる。ヘー ター１．３−グルカンが重大な毒性を示さないということは、それの潜在的に高 い治癒インデックス（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　１ｎｄｅｘ）を示唆している。

１襲玖呈伎足 ＢＩ３黒色腫によって攻撃されたマウスの生存期間に関するベーター１．３−グ ルカンの効果を、短期（下記第３表）または長期（下記第４表）処理計画を使用 して評価した。そこに報告されているように、０．５■のベーター　１．３−グ ルカンによって処理された動物においては首尾一貫して生存期間が著しく増大し た。微粒状ベーター１，３−グルカンのより低い用量によって、より気まぐれな 応答が見られた。ベーター１．３−グルカンの処理を７日目まで遅らせた別の実 験においては、重要な治療効果は観察されなかった。

第３表 ＢＩ３黒色腫細胞が接種されたＣ５７ＢＬ／６マウスの生き残りに関するベータ ー１．３−グルカン処理の効果処　　　理１ （ベーター１．３　　　平均生存　　　増　加−グルカンの用量）　　期間（日 ）　　百分率　　　有意性塩　　　水　　　　　　　２４．２±　４．９６−− 　　　　　　−−０，１２５■　　　　　３３．５±１０．．２１　　３８　　 　　ｐ　＜　、０２０．２５０■　　　　　　３４．３±１０．５５　　　４２ 　　　　ｐ　＜　、０１０．５００　　■　　　　　　　　　　３８．４±　７ ．８５　　　　　５９　　　　　　　ｐ　　＜　　、００１ａ１グループに付き １０匹のマウスに、０日目にその後ろの横腹にｌＸｌ０’のＢＩ３黒色腫細胞を 皮下注射した。各グループは発熱物質を含まない塩水の形で静脈注射を施すこと により、１日、４日、７日、１０日および１３日目に、その各グＪレープのそれ ぞれのベーター１．３−グルモ 受けた。

ｂ塩水対照標準と比較した、各グループに関する平均生存期間のスチューデント のｔテストによって統計上の有意性を測定した。

第４表 ＢＩ３黒色腫細胞が接種されたＣ５７ＢＬ／６マウスの生き残りに関するベータ ー１．３−グルカン処理の効果平均生存　　　増　加 処　　理１　　　　期間（日）　　百分率　　　有意性塩　　　水　　　　　２ ９．７±５．１５　　　　−−　　　　　−−０．２５■ベーター　　　３０． ０±９．７６　　　　　１　　　　　　ｎ、ｓｌ、３−グルカン ０．５０■ヘーター　　　３５．０±４．７４　　　　１８　　　　　ｐ　＜　 、０５′″１グループに付き１０匹のマウスに、０日目にその後ろの横腹にｌＸ ｌ０ＳのＢＩ３黒色腫細胞を皮下注射した。各グループは発熱物質を含まない塩 水の形で静脈注射を施すことにより、１日、４日、７日、１０日、１３日、１６ 日、１９日、２２日、２５日および２８日目に、その各グループー１．３−グル カン処理または塩水処理を受けた。

１塩水対照標準と比較した、各グループに関する平均生存期間のスチューデント のむテストによって統計上の有意性を測定した。

ベー　−１　３−グルカンに・　る坑」すλ服注２プレーおよびポスト−ベータ ー１，３−グルカン−処理ラビントから血清を集め、そしてベーター１．３−グ ルカンに対する抗体が生成するかどうかを測定するために検定した，ベーター１ ．３ーグルカンの２種の調合物をエライザ（ＥＬ）ＳＡ）によって試験すると、 前記のように調製され、かつ精製されたベーター１．３−グルカンは抗原応答を 引き出さないという結果が示される。

−てジ．５仏２ＪＵ乱性　様々な濃度のベーター１．３−グルカンと混合させた キーホール　リンペット　ヘモシアニン（ＫＨＬ）でマウスを免疫化することに よって、体液性免疫応答の発生および相乗作用を助長するベーター１．３−グル カンの能力を評価した。対照標準は塩水および完全フロイント　アジュバント（ ＣＦＡ）から構成されていた．免疫化してから７．２１および３５日目に、これ らの動物から血清を集めた。２１日目に塩水中のＫＬＨで動物に追加の抗原刺激 を与え、そして４２日目に再び血清試料を採取した。７日目に、エライザにより 測定される、ＫＬＨに対する抗体の産生が、塩水中のＫＬＨで処理された動物と 比較して、ＣＦＡまたは１００μｇのベーター１。

３−グルカンで処理された動物では約５倍増強されたという結果が示される（第 ２ａ図参照）、２１日目には、１００１Ｉｇのベーター１．３−グルカンで処理 されたマウスはＫＬＨのみで処理されたマウスよりも１０倍大きい抗体産生量を 示した（第２ｂ図参照）。２１日目に残りのマウスに１μｇのＫＬＨで追加の抗 原刺激を与えた後、その１４日後に血清を採取して試験した。ＫＬＨに対する抗 体の量はグループ全体で非常に多がったが、ベーター１．３−グルカンで処理さ れたマウスは、ＫＬＨのみで免疫化されたマウスよりも著しく高い（約１０倍） 抗体滴定量を示した（第２ｃ図参照）。

且旦三二１皮Ｈ激孟ユ　骨髄のコロニー形成刺激活性（Ｃ３Ａ）の解放を引き起 こすベーター１．３−グルカンの能力を試験する予備実験を遂行した。様々な濃 度のベーター１，３−グルカンをＣ５７ＢＬ／６マウスに静脈内注射で投与し、 そして注射後様々な時点で３匹のマウスのグループから血清試料を採取し、つづ いてＣ５Ａについて検定した。この検定においては、軟寒天中で各血清試料の様 々な希釈液の存在下に正常なマウスの骨髄細胞を培養した。それから７日後にこ れらの培養物中に生じる細胞コロニーの数を各血清希釈液につい゛ζ測定し、そ してその結果を、各血清ＩＩｌβによって刺激された骨髄コロニーの数で表した 。第３図に見られるように、微粒状ベーター１，３−グルカン２．５ｍｇまたは ５■の投与によって、著しい量の血清ベーター１．３−グルカンの解放が引き起 こされた。動物中におけるＣ３Ａの周知の強力な促進物質である、細菌性のリポ 多糖類（ＬＰＳ）は、この研究では陽性対照（ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏ ｌ）として含まれ、そしてまた血清Ｃ３Ａを誘導する能力も示した。

これらの結果はまた、ベーター１．３−グルカンが用量依存方法（ａ　ｄｏｓｅ −ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｍａｎｎｅｒ）でＣ３Ａの解放を刺激したことも示唆し ている。これらのデータは微粒状酵母グルカンを使用する他のものの血清Ｃ３Ａ 研究と一致しており、そしてそれらはミトリムシ（ｈ■並針によって産生された ベーター１，３−グルカンが放射線療法または化学療法によって激しく減少した 骨髄の回復を促進する上で効果的であり得ることを示唆している。

国際調査報告 国際調査報告 ＵＳ　９００１６４４ ５Ａ　　３５９２３

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．約４乃至約１６ｇ／Ｌの炭素を提供するのに十分な炭素源および約１０乃至 約４０の範囲の炭素対窒素モル比を提供するのに十分な窒素源を含み、そして約 ２５℃乃至約３０℃の温度、約２乃至約６のｐＨおよび約４乃至４０ｐｐｍの溶 存酸素濃度に維持されている増殖培地中、細胞塊が乾燥重量を基にして約７０％ 乃至約９０％のベータ−１，３−グルカンを含むまで、暗所においてミドリムシ （Ｅｕｇｌｅｎａ）の細胞を培養することを特徴とするベータ−１，３−グルカ ンの製造方法。
2. ２．細胞がユーグリナグラチリス（Ｅｕｇｌｅｎａｇｒａｃｉｌｉｓ）である、 請求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．炭素源がグルコースであり、そして窒素源が水溶性アンモニウム塩である、 請求の範囲第１項または第２項記載の方法。
4. ４．炭素源が８乃至１２ｇ／Ｌの炭素を提供し、そして窒素源が２５乃至３５の 範囲の炭素対窒素モル比を提供する、請求の範囲第１項、第２項または第３項記 載の方法。
5. ５．ｐＨを約３．５と４．５との間に維持する、請求の範囲第１項、第２項、第 ３項または第４項記載の方法。
6. ６．細胞塊が乾燥重量を基にして約７０％乃至９０％のべータ−１，３−グルカ ンを含むミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ）細胞の培養物から、実質的に純粋で、本 質的に発熱物質を含まないベータ−１，３−グルカンを得る方法において、この 方法が、無菌条件下に下記の段階、すなわち （ａ）培養物の上澄み液から細胞を分離し；（ｂ）細胞を崩壊させ、そして細胞 塊から脂質および不溶性着色物質を除去する抽出剤で細胞を抽出し；（ｃ）抽出 された細胞塊を抽出剤から分離し；（ｄ）抽出された細胞塊を酸洗浄物中で撹拌 しながら加熱して、べーた−１，３−グルカンから細胞の残がいを分離し；（ｅ ）酸で洗浄されたベータ−１，３−グルカンを酸洗浄物から分離し；そして （ｆ）無菌水を用いて（ｅ）の生成物を洗浄して、前記実質的に純粋で、本質的 に発熱物質を含まないベータ−１，３−グルカンを製造する、 という段階を遂行することを特徴とする、前記方法。
7. ７．抽出剤がメタノールおよびクロロホルムからなる、請求の範囲第６項記載の 方法。
8. ８．希薄な酸洗浄物が塩酸洗浄物である、請求の範囲第６項または第７項記載の 方法。
9. ９．請求の範囲第６項、第７項または第８項の方法によって製造された、実質的 に純粋で本質的に発熱物質を含まないべータ−１，３−グルカン。
10. １０．ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ）の細胞から誘導された、実質的に純粋で本 質的に発熱物質を含まないベータ−１，３−グルカン。