KR100283010B1

KR100283010B1 - 녹용 추출물을 함유하는 조혈모세포 및 혈소판 전구세포 증식촉진용 조성물

Info

Publication number: KR100283010B1
Application number: KR19980030819A
Authority: KR
Inventors: 전길자; 김상희; 양현옥; 서지영; 한소엽
Original assignee: 전길자; 김상희; 한소엽
Priority date: 1997-11-20
Filing date: 1998-07-30
Publication date: 2001-04-02
Also published as: KR19990044781A

Abstract

본 발명은 녹용(매화록)의 특정 추출물, 특히 녹용의 클로로포름 추출물 및 그로 부터 분리·정제된 분획을 함유하는 조혈모세표 및 혈소판 전구세포(megakaryocyte) 증식촉진용 조성물 및 이러한 녹용의 클로로포름 추출물 및 그의 분획을 추출·분리·정제하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명에서는 녹용의 추출물중에서 조혈모세포 및 혈소판 전구세포 증식 촉진활성을 나타내는 활성성분으로서 하기 화학식 1로 표시되는 화합물들이 함유되어 있음을 확인하고, 이들의 합성방법 및 이들을 활성성분으로 함유하는 조혈모세포 및 혈소판 전구세포 증식촉진용 조성물, 및 또한 화학식 1의 화합물중의 신규 화합물을 제공한다.

[화학식 1]

상기식에서, R₁/R₂는 9-옥타데세노일/헥사데카노일, 헥사데카노일/9-옥타데세노일, 헥사데카노일/9,12-옥타데카디에노일, 헥사데카노일/9,12,15-옥타데카트리에노일 또는 헥사데카노일/5,8,11,14-에이코테트라에노일을 나타내며, R₃는 아세틸을 나타낸다.

Description

녹용 추출물을 함유하는 조혈모세포 및 혈소판 전구세포 증식촉진용 조성물

본 발명은 녹용(매화록)의 특정 추출물, 특히 녹용의 클로로포름 추출물 및 그로 부터 분리·정제된 분획을 함유하는 조혈모세포 및 혈소판 전구세포(megakaryocyte) 증식촉진용 조성물 및 이러한 녹용의 클로로포름 추출물 및 그의 분획을 추출·분리·정제하는 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명에서는 녹용의 추출물중에서 조혈모세포 및 혈소판 전구세포 증식 촉진활성을 나탄태는 활성성분으로서 하기 화학식 1로 표시되는 화합물들이 함유되어 있음을 확인하고, 이들의 합성방법 및 이들의 활성성분으로 함유하는 조혈세포 및 혈소판 전구세포 증식촉진용 조성물, 및 또한 화학식 1의 화합물중의 신규 화합물을 제공한다.

[화학식 1]

본래, 녹용은 사슴과(Cornu cervi)에 속하는 사슴의 각화되지 않은 유각을 채취하여 건조한 것으로 인삼과 더불어 한방에서 가장 널리 사용되고 있는 생약중의 하나이며, 우리나라에서 사용되고 있는 녹용의 기원동물로는 사슴과에 속하는 매화록(Cervus nippon Temminick var. mantchuricus Swinhoe) 및 마록(Cervus elaphus L. Cornu Ceriv Ravum) 등이 있다.

녹용은 예로부터 강장작용, 생장, 발육촉진작용, 조혈작용, 신경쇠약 치료작용, 심부전증 치료작용, 오장육부의 기능항진작용 등 다양한 효능이 있는 것으로 동의보감에 수록되어 있으며, 이외에도 자양보신, 신체활력 증강 및 심근운동개선효과, 피로회복, 신체 저항력 증진, 건뇌안신효과 등의 효과가 고대문헌에 기록되어 있다.

녹용의 신비한 약효를 규명하기 위하여 그의 성분에 관한 다양한 연구가 이루어져 왔으며, 그 결과 녹용으로 부터 유리아미노산과 미량원소, 육탄당 및 오탄당, 헥소사민, 우론산, 시알산, 산 뮤코다당류인 히알우론산과 황산콘드로이틴 A, 다양한 지방산, 프로스타글란딘류 등의 존재가 확인되었으며, 또한 당지질 및 인지질, 콜레스테롤, 히포크산틴, 콜레스트-5-엔-3β,7α-디올, 콜레스테롤 에스테르, 폴리아민 등이 분리, 보고되었다. 이 밖에도, 녹용에는 에스트론, 에스트라디올 리셉터 등이 함유되어 있는 것으로 알려져 있다.

따라서 본 발명자들은 민간약으로 뛰어난 약효를 갖는 것으로 알려져 있는 녹용에서 조혈작용에 대한 효능을 갖는 성분을 찾고자 본 연구를 하게 되었다.

현재 우리나라에서 제 1위의 사망원인인 암질환은 매년 증가추세인 것으로 알려져있다. 그러나 항암치료를 목적으로 사용되는 화학요법, 방사선 치료요법 등은 암세포 뿐 아니라 일반 정상 골수세포, 특히 면역 및 조혈기능을 조절하는 조혈세포(hematopoietic cell)까지도 동시에 손상시킴으로써 인체의 조혈기관과 면역기능을 마비시키는 것이 심각한 문제점으로 지적되어 오고 있다. 이러한 심각한 골수세포의 손상에 의한 백혈구나 혈소판의 감소로 인한 면역기능의 마비는 곧사망으로 이어지게 된다. 따라서, 조혈모세포원의 성장을 촉진시켜 저하되어 있는 면역기능 및 혈액세포들의 기능을 증진시킬 필요가 있는 질환, 특히 항암제 투여 및 방사선 조사 후에 골수기능이 저하된 상태에 있는 악성고형암, 악성혈액질환, 재생불량성빈혈, 선천성 간헐적 백혈구 감소증, 선천성 면역 및 조혈모세포 결여증, 말기 신부전증으로 인해 초래되는 빈혈, 백혈구 감소로 인한 감염, 인구 고령화로 인한 골수기능 저하증 등의 임상 각 분야에서 전반적으로 활용될 수있는 신물질의 개발이 절실히 요청되고 있는 실정이다.

면역기능 및 조혈기능의 증진과 관련하여 조혈모세포에 대한 연구가 활발히 진행되고, 이에 따라 조혈모세포에 대한 지식이 급증함에 따라 최근에 몇가지 조혈모세포 성장촉진인자가 개발되어 이들 중에서 GM-CSF(granulocyte macrophage-colony stimulating factor), G-CSF(granulocyte-colony stimula- ting factor), 에리스로포이에틴(Erythropoietin) 등은 이미 상품화에 성공하였다. GM-CSF와 G-CSF는 과립구 및 거핵구는 물론 조혈모세포의 증식과 분화를 유도하고, 골수로부터 조혈모세포들이 말초혈액으로 이동(mobilization)하는 것을 촉진시킨다.

상기와 같은 조혈모세포 성장촉진인자를 발견하기 위해서, 본 발명자들은 수천년간 동양에서 보혈강장제로 사용되어 온녹용을 대상으로 하여 연구를 수행하였다. 그 결과, 본 발명자들은 녹용의 특정 추출물, 특히 녹용의 클로로포름 추출물중에 조혈모세포의 성장을 촉진시키는 물질이 존재함을 확인할 수 있었으며, 이에 대한 지속적인 연구를 통하여 녹용에서 조혈모세포 성장 촉진효능이 가장 높은 성분을 찾아내어 그 성분을 분리, 정제하고, 그 활성성분의 구조를 밝혀내어 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 녹용으로 부터 조혈모세포 성장촉진인자를 찾아내어 그 구조를 밝히고 합성하는 것을 목적으로 한다. 이러한 조혈모세포 성장촉진인자는 조혈모세포원의 성장을 촉진시켜 저하된 면역기능 및 혈액세포들의 기능 증진이 필요한 질환, 특히 항암제 및 방사선 조사후 골수기능이 저하된 상태에 있는 악성고형암, 악성혈액질환, 재생불량성빈혈, 선천성 간헐적 백혈구감소증, 선천성 면역 및 조혈 모세포 결여증, 말기 신부전증으로 인해 초래되는 빈혈, 백혈구 감소로인한 감염, 인구 고령화로 인한 골수기능 저하증 등 임상 각 분야에 전반적으로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

제1도는 실시예 1의 과정에 따르는 녹용(Cervus nippon)의 추출방법을 나타낸 도식이다.

제2도는 실시예 2 내지 5의 과정에 따르는 녹용의 클로로포름 추출물(CN-C)의 분획화방법을 나타낸 것이다.

제3도는 실시예 1 내지 5의 방법에 따라 녹용(매화록)을 추출 및 정제하는 각 단계에서 수득된 분획의 고성능 박층크로마토그램(TLC)을 나타낸 것이다.[a: CN-C-2-E-a-Mi, b: CN-C, c: CN-C-2, d: CN-C-2-E, e: CN-C-2-E-a, f: CN-C-2-E-a-Mi].

제4도는 실시예 8-2에 따라 본 발명에서 분리·확인된 녹용 추출물의 활성물질인 화학식 1의 화합물을 투여한 후의 마우스의 비장 무게를 비교하여 나타낸 그래프이다[1: 대조군, 2: 녹용의 수용성 추출물 투여, 3: GM-CSF 투여, 4: KJ-1 투여, 5: KJ-4 투여, 6: KJ-5 투여, 7: KJ-4+GM-CSF 투여, 8: KJ-5+GM-CSF 투여].

제5도는 실시예 8-2에 따라 대조군 마우스의 비장을 절단한 현미경사진(×200)이다.

제6도는 실시예 8-2에 따라 GM-CSF(100U)를 투여한 마우스의 비장을 절단한 현미경사진(×200)이다.

제7도는 실시예 8-2에 따라 화합물 KJ-1을 투여한 마우스이 비장을 절단한 현미경사진(×200)이다.

제8도는 실시예 8-2에 따라 화합물 KJ-4을 투여한 마우스의 비장을 절단한 현미경사진(×200)이다.

제9도는 실시예 8-2에 따라 화합물 K-4와 GM-CSF를 병용투여한 마우스의 비장을 절단한 현미경사진(×200)이다.

제10도는 실시예 8-2에 따라 화합물 KJ-5를 투여한 마우스의 비장을 절단한 현미경사진(×200)이다.

제11도는 실시예 8-2에 따라 화합물 KJ-5와 GM-CSF를 변용투여한 마우스이 비장을 절단한 현미경사진(×200)이다.

본 발명은 녹용의 클로로포름 추출물 또는 그로부터 분리·정제된 분획들을 유효성분으로 함유하는 조혈모세포 및 혈소판전구세포 증식촉진용 조성물을 제공하는 것을 그 첫번째 목적으로 한다.

조혈작용(hematopoiesis)은 매우 특수한 기능과 한정된 수명을 가지고 있는 수많은 성숙 혈액세포들이 생성되어 계속적으로 공급되는 일련의 발생과정이다. 조혈계는 발생능력(developmental capacities)의 체계에 따라 정렬될 수 있는 조혈전구세포(hematopoietic precursor cell)들의 매우 복잡한 조직체계로 구성되어 있다. 모든 계통의 성숙 혈액세포들의 근원지는 골수인데 이 골수조직은 여러 단계의 성숙 단계에 있는 세포들을 포함하고 있으며, 골수에서 생성된 혈액세포들은 일정 시간이 지나면 말초조직에서 파괴되고, 이러한 과정은 동물의 일생을 통하여 계속적으로 반복해서 일어나게 된다. 조혈작용은 여러 가지 계통의 세포로 증식, 분화할 수 있는 조혈모세포군(Hematopoietic Stem Cells: HSCs)에 의하여 유지되고 있다. 초기에 조혈모세포는 다능성 조혈모세포(Pluripotent Hematopoietic Stem Cells: PHSCs)라고 하는데, 아직까지도 잘 밝혀져 있지 않은 여러 과정을 거쳐서 매우 다양한 성숙 혈액세포들로 분화할 수 있는 조혈전구세포들을 만들어 내게 되고, 이 조혈전구세포들은 그 다음 단계의 더 분화된 세포들을 생산하게 된다.

HSCs는 두가지 중요한 특징을 가지고 있다. 자신과 똑같은 세포를 만들어낼 수 있는 자기복제(self-renewal) 능력과 성숙된 임파조혈세포의 모든 계통으로 분화할 수 있는 능력이다. 조혈모세포에 대한 연구는 동물에 준치사량(sublethal dose)의 방사선을 조사한 후 골수결핍으로 고통받는 동물에게 정상골수세포를 주사함으로써 이 결핍증이 회복될 수 있다는 것을 처음으로 알게 되었을 때부터 시작되었다. 이러한 전신 방사선 조사를 받은 마우스의 골수회복에 대한 최초의 정량적인 실험으로부터 방사선 조사를 받은 동물의 비장과 골수에서 골수세포와 적혈구 계통의 세포 콜로니를 형성할 수있는 능력을 갖는 조혈전구세포의 개념이 도입되었다. 자기복제능력이 있는 다능성 조혈모세포 (PHSCs)에 의한 혈구세포들의 재구성과 조혈계통에 대한 발생생물학적 측면을 이해하기 위하여 순수한 다능성 조혈모세포의 분리가 요구된다. 그러나, 이 세포들은 매우 낮은 비율로서 존재하기 때문에 분리에 어려운 점이 많았으나, 플로우 사이토메트리(flow cytometry)의 도입과 조혈모세포 표지 항원 및 분화항원(differentiation antigen)에 대한 단일클론항체의 개발로 HSCs의선별이 가능하며 그들의 성질과 특징도 점차적으로 이해하게 되었다.

본 발명에 따르는 조성물에서 유효성분으로 사용되는 녹용의 클로로포름 추출물 또는 그로부터 분리·정제된 분획들은 다음과 같은 방법에 의해 추출되는 물질이다. 본 발명에서는 또한 이러한 추출·분리방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.

본 발명에 따르면 우선, 녹용을 헥산으로 추출하고, 그 추출잔사를 다시 클로로포름으로 추출하여 수득된 추출액을 감압증류하여 녹용의 클로로포름 추출물(이하에서는 엑기스 CN-C라 한다)을 수득한다. 이러한 본 발명의 추출방법은 예를들어 제1도로 나타낼 수 있다.

상기한 바와 같은 추출방법에서 사용되는 추출용매인 헥산 및 클로로포름의 양은 각각 사용된 녹용이 잠길 정도의 양이면 충분하며, 일반적으로는 녹용 1㎏에 대하여 헥산 및 클로로포름을 각각 4∼5ℓ정도의 비로 사용한다.

이러한 방법에 의해 수득되는 녹용의 클로로포름 추출물인 엑기스 CN-C 는 계속해서 일련의 실리카겔 칼럼크로마토그래피및 TLC 방법에 의해 더 분획화시키고 정제한다. 즉, 녹용의 클로로포름 추출물인 엑기스 CN-C 의 후속 처리단계는 a)엑기스 CN-C를 용리액으로 클로로포름/메탄올을 사용하여 실리카겔 칼럼크로마토그래피하고, 수득되는 분획을 TLC로 처리하여 Rf치에 따라 엑기스 CN-C-1 부터 CN-C-7 까지의 7가지 엑기스를 얻는 단계: b) 상기 단계 a) 에서 수득한 엑기스중엑기스 CN-C-2를 용리액으로 헥산/에틸아세테이트(10:1)를 사용하여 실리카겔 칼럼크로마토그래피하고, 수득되는 분획을TLC로 처리하여 Rf치에 따라 엑기스 CN-C-2-A 부터 CN-C-2-F 까지의 6가지 엑기스를 얻는 단계: c) 상기 단계 b) 에서 수득한 엑기스중 엑기스 CN-C-2-E를 용리액으로 헥산/에틸아세테이트/아세트산(20:1:0.5)을 사용하여 실리카겔 칼럼크로마토그래피하고 수득되는 분획을 TLC로 처리하여 Rf치에 따라 엑기스 CN-C-2-E-a 및 CN-C-2-E-b 의 2 가지 엑기스를 얻는단계: 및 d) 상기의 단계 c) 에서 수득한 엑기스중 엑기스 CN-C-2-E-a를 메탄올에 용해시켜 메탄올-가용성 분획 CN-C-2-E-a-Ms와 메탄올-불용성 분획 CN-C-2-E-a-Mi를 얻는 단계로 구성된다(CN-C-2-E-a-Ms와 -Mi의 전개용매: 헥산/에틸아세테이트/아세트산 = 20:1:0.5). 이와 같은 녹용의 클로로포름 추출물 CN-C 의 분획화 및 정제공정은 예를들어 제2도에 간략해서 나타내었다.

상기한 바와 같은 일련의 정제과정에서 수득되는 엑기스 CN-C-2, CN-C-2-E, CN-C-2-E-a 및 최종적으로 수득되는 메탄올-불용성 분획 CN-C-2-E-a-Mi 도 각각 후술하는 실험예에 의해 입증되는 바와 같이 조혈모세포 및 혈소판 전구세포 증식 촉진활성을 가지고 있기 때문에 엑기스 CN-C 에 대신하여 본 발명의 조성물에서 유효성분으로 사용될 수 있다.

또한, 상기의 단계 c) 에서는 단계 b)에서 분리된 엑기스 CN-C-2-D를 헥산/에틸아세테이트를 용리액으로 사용하여 칼럼크로마토그래피시키고 TLC 처리하여 분리되는 2 가지 엑기스 CN-C-2-D-a 및 CN-C-2-D-b 중의 엑기스 CN-C-2-D-b 도 엑기스CN-C-2-E 와 마찬가지로 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물에서 유효성분으로 사용되는 녹용의 클로로포름 추출물 CN-C 중에 함유된 활성성분을 규명하기 위하여본 발명의 방법에 따라 최종적으로 수득된 메탄올-불용성 분획 CN-C-2-E-a-Mi 에 대하여 질량분광분석(massspectrometry)을 수행하였으며, 그 결과 이 분획에는 화학식 1 로 표시되는 아세틸디아실글리세롤류의 화합물들이 함유되어 있음을 확인할 수 있었다.

[화학식 1]

상기식에서, R₁/R₂는 9-옥타데세노일(올레오일)/헥사데카노일(팔미토일), 헥사데카노일(팔미토일)/9-옥타데세노일(올레오일), 헥사데카노일(팔미토일)/9,12-옥타데카디에노일(리놀레오일), 헥사데카노일(팔미토일)/9,12,15-옥타데카트리에노일(리놀레노일)또는 헥사데카노일(팔미토일)/5,8,11,14-에이코사테트라에노일(아라키도노일)을 나타내며, R₃는 아세틸을 나타낸다.

본 발명에 따라 녹용의 클로로포름 추출물 및 그의 분획들에 함유되어 있는 것으로 확인된 활성성분인 화학식 1 의 화합물로는 구체적으로 다음과 같은 5 가지 화합물들이 언급될 수 있다:

1) 화합물 KJ-1 (R₁/R₂=9-옥타데세노일/헥사데카노일, R3=아세틸)

1-올레오일-2-팔미토일-3-아세틸글리세롤

2) 화합물 KJ-2 (R1/R2=헥사데카노일/9-옥타데세노일, R3=아세틸)

1-팔미토일-2-올레오일-3-아세틸글리세롤

3) 화합물 KJ-3 (R₁/R₂=헥사데카노일/9,12-옥타데카디에노일, R3=아세틸)

1-팔미토일-2-리놀레일-3-아세틸글리세롤

4) 화합물 KJ-4 (R₁/R₂=헥사데카노일/9,12,15-옥타데카트리에노일, R3=아세틸)

1-팔미토일-2-리놀레닐-3-아세틸글리세롤

5) 화합물 KJ-5 (R₁/R₂=헥사데카노일/5,8,11,14-에이코사테트라에노일, R3=아세틸)

1-팔미토일-2-아라키도닐-3-아세틸글리세롤

상기한 바와 같이 본 발명에 따라 녹용 추출물로부터 활성성분으로서 분리되어 구조가 확인된 화학식 1 의 아세틸디아실글리세롤류의 화합물들이 녹용에 존재한다는 보고된 본 발명 이전에 전혀 없었다. 상기 화학식 1 의 화합물중에서 하기화학식 1a 의 화합물, 즉 화합물 KJ-1, KJ-2 및 KJ-3 은 문헌에 공지되어 있는 화합물이며[참고문헌: Journal of High Resolution Chromato- graphy, Vol 19, 497-501 (1996)], 화학식 1b 의 화합물인 화합물 KJ-4 및 KJ-5 는 본 발명 이전에는 알려지지 않았던 신규의 화합물들이다. 따라서, 본 발명에서는 화학식 1b 로 표시되는 신규화합물 KJ-4 및 KJ-5를 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.

[화학식 1a]

[화학식 1b]

상기식에서, R_1a/R_2a는 9-옥타데세노일/헥사데카노일, 헥사데카노일/9-옥타데세노일 또는 헥사데카노일/9,12-옥타데카디에노일을 나타내며,

R_1b/R_2b는 헥사데카노일/9,12,15-옥타데카트리에노일 또는 헥사데카노일/5,8,11,14-에이코사테트라에노일을 나타내며, R₃는 아세틸을 나타낸다.

제4도에 나타낸 TLC 결과에 따르면 상기한 화합물 KJ-1, KJ-2, KJ-3, KJ-4 및 KJ-5 의 5 가지 화합물들은 녹용의 클로로포름 추출물인 엑기스 CN-C에서부터 최종 정제단계에서 수득된 메탄올 불용성 분획 CN-C-2-E-a-Mi에 까지 모두 동일한 밴드를 나타내어 물질이 변성없이 유지됨을 알 수 있으며 정제단계가 진행됨에 따라 그 밴드가 더욱 명확해짐을 알 수 있다.

이들 화학식 1 의 화합물들은 공지되었거나 공지된 방법과 유사한 방법에 의해 화학적으로 합성할 수 있다. 예를들어 이들은 다음과 같은 방법에 의해 화학적으로 합성할 수 있다. 즉, 화학식 1 의 화합물은 a) 포스파티딜콜린인 1-R₁-2-R₂-3-포스포콜린 유도체를 아세트산 및 무수아세트산의 존재하에서 가아세트산분해(acetolysis)시키거나, b) 글리세롤을 R₁-OH 의 산과 반응시키고, 생성물을 다시 무수아세트산과 반응시킨 후, 생성물을 R₂-OH 의 산과 반응시킴으로써 제조할 수있다(여기에서 R₁및 R₂는 화학식 1에서 정의한 바와 같다). 이들 방법중에서 출발물질로 글리세롤을 이용하는 방법 b)가 경제적인 면에서 특히 바람직하게 이용될 수 있다.

상기한 본 발명의 방법에서 구체적인 제조공정이나 각 단계별 반응조건은 실시예에서 설명하겠으나 간단한 원리를 예를 들어 설명하면 다음과 같다. 화합물 KJ-1 인 1-9-옥타데세노일-2-헥사데카노일-3-아세틸글리세롤은 방법 a) 에 따라 시약으로 시판되고 있는 β-팔미토일-γ-올레오일포스파티딜콜린(Sigma사 시약)을 아세트산/무수아세트산(3:2, v/v)에 넣고 150℃에서 반응시키고, 여러 가지 용매를 사용하여 생성된 1-9-옥타데세노일-2-헥사데카노일-3-아세틸글리세롤을 칼럼크로마토그래피에 의해 분리함으로써 제조할 수 있다. 또 다른 방법으로 경제적인 합성법인 방법 b) 에 따르면, 우선 글리세롤과 올레산을 디사이클로헥실카보디이미드와 디메틸아미노피리딘의 존재하에서 반응시키고, 생성된 모노올레오일 글리세롤을 칼럼으로 분리하여 무수아세트산과 디메틸아미노피리딘을 가하여 반응시킨 후, 생성된 모노아세틸 모노올레오일글리세롤을 칼럼으로 분리하고 팔미트산을 가하여 디사이클로헥실카보디이미드와 디메틸아미노피리딘의 존재하에서 반응시키고, 생성된 KJ-1을 칼럼으로 분리하는 방법에 의해서도 화합물 KJ-1을 제조할 수 있다.

화합물 KJ-2 인 1-헥사데카노일-2-9-옥타데세노일-3-아세틸글리세롤의 합성방법은 화합물 KJ-1을 제조하는 상기의 경제적방법과 동일한 방식으로 수행할 수 있는데, 즉 방법 b) 에 따라 글리세롤과 팔미트산을 디사이클로헥실카보디이미드와 디메틸아미노피리딘의 존재하에서 반응시키고, 생성된 모노팔미토일글리세롤을 칼럼으로 분리하여 무수아세트산과 디메틸아미노피리딘을 가하여 반응시킨 후, 생성된 모노아세틸 모노팔미토일 글리세롤을 칼럼으로 분리하여 올레산을 가하고 디사이클로헥실카보디이미드와 디메틸아미노피리딘의 존재하에서 반응시키고, 생성된 KJ-2를 칼럼으로 분리하는 방법에 의해 화합물 KJ-2를 제조할 수 있다.

화합물 KJ-3 인 1-헥사데카노일-2-9,12-옥타데카디엔오일-3-아세틸글리세롤의 제조를 위해서는 방법 a) 에서 출발물질로사용되는 포스파티딜콜린을 천연물로부터 분리하여 이용할 수도 있다. 즉, 화합물 KJ-3 은 계란에서 추출한 포스파티딜콜린을 아세트산/무수아세트산(3:2, v/v)에 넣고 150℃에서 반응시켜 생성된 KJ-3를 칼럼으로 분리함으로써 수득할 수 있다. 또한, 방법 b) 에 따르는 경제적인 방법으로 글리세롤과 팔미트산을 디사이클로헥실카보디이미드와 디메틸아미노피리딘의 존재하에서 반응시키고, 생성된 모노팔미토일 글리세롤을 칼럼으로 분리하여 무수아세트산과 디메틸아미노피리딘을 가하여 반응시키고, 생성된 모노아세틸 모노팔미토일 글리세롤을 칼럼으로 분리하여 리놀레산을 넣고 디사이클로헥실카보디이미드와 디메틸아미노피리딘의 존재하에서 반응시키고 생성물을 칼럼으로 분리시킴으로써 화합물 KJ-3를 제조할수도 있다.

상기한 각각의 방법과 유사한 방법에 의해 화합물 KJ-4 인 1-헥사데카노일-2-9,12,15-옥타데카트리엔오일-3-아세틸글리세롤 및 화합물 KJ-5 인 1-헥사데카노일-2- 5,8,11,14-에이코사테트라엔오일-3-아세틸글리세롤도 동일하게 합성할 수 있다.

상기한 바와 같이 녹용 추출물에서 조혈모세포 및 혈소판 전구세포 증식촉진활성을 나타내는 활성성분을 경제적으로 화학적 합성방법에 의해 제조할 수도 있기 때문에 값이 비싸고 입수가 어려운 녹용을 원료로 이용하는 대신에 합성방법에 의해 제조된 이들 5가지 물질중의 어느 하나 또는 이들 중의 두가지 이상의 혼합물을 이용함으로써 녹용 추출물과 동등한 놀랄만한 효과를 얻을 수 있다.

따라서, 본 발명에서는 상기 화학식 1 의 화합물 하나 또는 그 이상을 유효성분으로서 함유하는 조혈모세포 및 혈소판 전구세포 증식 촉진용 조성물을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.

본 발명에 따르는 녹용의 클로로포름 추출물 또는 그의 분획 또는 화학식 1 의 화합물을 유효성분으로서 함유하는 조혈모세포 및 혈소판 전구세포 증식 촉진용 조성물은 임상적인 목적으로 투여할 경우에는 목적하는 바에 따라 주사용 제제 및경구용 제제로 투여 할 수 있다. 주사용 제제, 예를 들면 멸균주사용 수성 또는 유성 현탁액은 공지된 기술에 따라 적합한 분산제, 습윤제 또는 현탁제를 사용하여 제조할 수 있다. 사용될 수 있는 약제학적으로 허용되는 용매에는 물, 링거액 및 등장성 NaCl 용액이 있으며, 멸균 고정오일은 통상적으로 용매 또는 현탁매질로서 사용한다. 모노-, 디글리세라이드를 포함하여 어떠한 무자극성 고정오일도 이러한 목적으로 사용될 수 있으며, 또한 올레산과 같은 지방산도 주사용 제제에 사용한다.

경구투여용 고체투여 형태는 캅셀제, 정제, 환제, 산제 및 입제 등의 형태일 수 있으며, 특히 캅셀제와 정제가 유용하다.정제 및 환제는 장피제로 제조하는 것이 바람직하다. 고체투여 형태는 본 발명에 따른 고분자 다당류 분획을 수크로즈,락토즈, 전분 등과 같은 하나 이상의 불활성 희석제 및 마그네슘스테아레이트와 같은 윤활제, 붕해제, 결합제 등과 같은 담체와 혼합시킴으로써 제조할 수 있다.

본 발명에 따르는 조성물의 특정환자에 대한 투여용량 수준은 유효성분으로 사용되는 추출물, 분획 또는 화합물의 종류,조성물이 투여될 개개 환자의 체중, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률, 약제혼합 및 그 밖에 본 발명의 조성물을 사용하고자 하는 환자의 조건에 따라 전문가에 의해 다양하게 변화될 수 있을 것이다.

본 발명은 이하의 실시예에 의해 더욱 상세히 설명되나 본 발명이 이들에 의해 어떤 식으로든 제한되는 것은 아니다.

[실시예 1]

녹용(매화록) 1.75㎏을 잘게 부숴 비이커에 넣고 녹용이 잠길 정도로 (대략 7ℓ) 헥산을 가하고, 2 시간 동안 80℃에서 가열하여 2 회 추출하고 여과하였다(이 여과액을 추출액 1이라고 함). 추출액 1을 감압하에 증류시키고 건조시켜 엑기스 CN-H 24.6g을 수득하였다.

추출액 1을 분리하고 남은 잔사에 클로로포름을 잠길 정도(대략 7ℓ)로 가하고, 2 시간 동안 70℃에서 가열하여 2 회 추출하고 여과하였다(이 여과액을 추출액 2라고 함). 추출액 2를 감압하에서 증류시켜 녹용의 클로로포름 추출물인 엑기스 CN-C 14g을 수득하였다.

다시 추출액 2를 분리하고 남은 잔사에 70℃ 의 에탄올(대략 6ℓ)을 가하고 하루 동안 90℃에서 가열하여 3 회 추출하고 여과하였다(이 여과액을 추출액 3이라고 함). 추출액 3을 감압하에 증류시켜 엑기스 CN-E 91g을 수득하였다.

상기에서 수득된 엑기스 CN-H, CN-C 및 CN-E 각각에 대하여 후술하는 실시예 8에 기재된 바와 같이 조혈작용을 검색한 결과 얻어지는 조혈모세포 증식활성을 지표로 하여 조혈효과가 있는 것으로 판단되는 엑기스 CN-C를 이하의 정제과정에 사용하였다.

[실시예 2]

분말 실리카겔 350g에 클로로포름/메탄올(500:1) 혼합용액 650㎖를 가하여 팽윤시킨 후, 열린 칼럼[베드체적(bed volume)= 600∼650㎖]에 충진시켰다. 상기 실시예 1에서 수득한 엑기스 CN-C 14g을 최소량(엑기스를 녹일 수 있는 최소량)의 클로로포름/메탄올(500:1)에 용해시켜 실리카겔이 충진된 칼럼에 적용시켰다. 칼럼에 용리액으로서 클로로포름/메탄올(500:1)을 마르지 않게 넣어주면서 50㎖ 씩의 용출분획을 받은 다음(이때, 공체적 (void volume)은 200㎖임), 이것을TLC(전개용매: 클로로포름/메탄올 = 300:1)로 전개하여 요오드로 발색시킨 후 Rf치에 따라 분리하였다. 이렇게 하여 모두 7개의 주요 분획을 분리하였다. 분리된 각각의 분획을 감압증류하여 건조시켜 엑기스 CN-C-1 내지 CN-C-7를 수득하였다. 이들 7가지의 엑기스에 대하여 후술하는 실시예 8에 기재된 바와 같이 조혈작용을 검색한 결과 조혈효과가 있는 것으로 판단되는 엑기스 CN-C-2를 분리하여 이하의 정제과정에 사용하였다.

[실시예 3]

실시예 2에서 정제된 분획중 조혈작용 효능이 큰 것으로 확인된 분획 CN-C-2 380㎎을 취하였다. 분말 실리카겔 20g에 헥산/에틸아세테이트(50:1) 혼합용액 50㎖를 가하여 팽윤시켜 칼럼(베드 체적=100㎖)에 충진시켰다. 엑기스 CN-C-2 380㎎을 용리액인 헥산/에틸아세테이트(50:1) 최소량에 용해시켜 실리카겔 칼럼에 적용시켰다. 실시예 2에서와 동일한 방법에 따라 용리액을 넣어주면서 15㎖씩 용출분획을 받아 TLC(전개용매: 헥산/에틸아세테이트 = 50:1)로 전개하고, 요오드로 발색시킨 후 Rf에 따라 6개의 부분으로 분리하였다. 분리된 각각의 부분을 감압증류시키고 건조시켜 각각 CN-C-2-A내지 CN-C-2-F로 지정된 엑기스를 수득하였다. 이들 6가지의 엑기스에 대하여 후술하는 실시예 8에 기재된 바와 같이 조혈작용을 검색한 결과 조혈효과가 있는 것으로 판단되는 엑기스 CN-C-2-E를 분리하여 이하의 정제과정에 사용하였다.

[실시예 4]

실시예 3에서 정제한 분획중 조혈작용 효능이 높은 것으로 확인된 분획 CN-C-2-E 70㎎을 취하였다. 분말 실리카겔 3.5g에 헥산/에틸아세테이트/아세트산(20:1:0.5) 혼합용액 10㎖를 가하여 팽윤시켜 칼럼(베드체적=24㎖)에 충진시켰다. 엑기스 CN-C-2-E 70㎎을 용리액인 헥산/에틸아세테이트/아세트산(20:1:0.5) 최소량에 용해시켜 실리카겔 칼럼에 적용시켰다. 실시예 3에서와 동일한 방법으로 용리액을 넣어 주면서 10㎖씩 용출분획을 받아 TLC(전개용매: 헥산/에틸아세테이트/아세트산 = 20:1:0.5)로 전개하고, 요오드로 발색시킨 후 Rf에 따라 두 부분으로 나누어 각각 엑기스 CN-C-2-E-a 및 CN-C-2-E-b로 표시하였다. 이 두가지의 엑기스에 대하여 후술하는 실시예 8에 기재된 바와 같이 조혈작용을 검색한 결과 조혈효과가 있는 것으로 판단되는 엑기스 CN-C-2-E-a를 분리하여 이하의 정제과정에 사용하였다.

[실시예 5]

실시예 4에서 분리된 부분 중에서 첫 번째 부분인 엑기스 CN-C-2-E-a 62㎎을 취하였다. 이 엑기스 CN-C-2-E-a에 메탄올5㎖을 가하여 혼합시켜 메탄올-가용성 부분(엑기스 CN-C-2-E-a-Ms)과 메탄올-불용성 부분(엑기스 CN-C-2-E- a-Mi)으로 분리하였다. 엑기스 CN-C-2-E-a-Ms는 20㎎을 수득하였고, 엑기스 CN-C-2-E-a-Mi는 40㎎을 수득하였다.

실시예 1∼5에서 수득된 각각의 활성분획들에 대한 TLC 결과를 제4도에 나타내었다. 제4도에서 보는 바와 같이 엑기스 CN-C에 있는 밴드가 정제되어 가는 과정에서도 동일하게 나타남을 알 수 있다. 따라서 활성을 나타내는 부분이 정제과정에서 변성되어 나타나거나 없어진 것이 아님을 알 수 있다. 처음에는 다른 부분 때문에 가려졌던 밴드가 정제되어감에 따라 진하게 발색되었다.

[실시예 6]

[조혈작용 활성물질의 구조 분석]

실시예 5로부터 최종 정제된 두 물질중에서 메탄올-불용성 부분인 엑기스 CN-C-2-E-a-Mi를 VG70-VSEQ 질량분석기(mass spectrometer)로 분석하였다. 질량분석에 따라 확인된 것으로 녹용 추출물중에 존재하는 활성화합물을 요약하면 다음 표 1에 기재된 바와 같다.

이들 각각의 분리된 화합물 KJ-1, KJ-2, KJ-3, KJ-4 및 KJ-5 는 이하의 실시예 7 에 제시된 물리화학적 데이터와 일치하는 결과를 나타내어 그 구조를 확인할 수 있었다.

[실시예 7]

[7-1. 1-올레오일-2-팔미토일-3-아세틸글리세롤(KJ-1) 합성]

[7-1-1. 글리세롤로 부터의 합성]

글리세롤(1.0 eq)을 테트라하이드로푸란(20.0 eq)에 용해시키고 디사이클로헥실카보디이미드(0.7 eq)와 디메틸아미노피리딘(0.1 eq)을 가하고 온도를 0℃로 저하시켰다. 여기에 올레산(0.5 eq)을 가하여 4시간 동안 반응시켰다. 생성된 모노올레오일글리세롤을 칼럼크로마토그래피(n-헥산:에틸아세테이트=18:1)에 의해 분리하여 메틸렌클로라이드(20.0 eq)에 용해시키고 아세트산 무수물(1 eq)을 가하여 온도를 -78℃로 저하시켰다. 여기에 디메틸아미노피리딘(0.2 eq)를 가하고 1시간 동안 반응시킨 후, 생성된 모노아세틸 모노올레오일 글리세롤을 칼럼크로마토그래피(n-헥산:에틸아세테이트=18:1)에의해 분리하였다(수율: 23%). 분리된 모노아세틸 모노올레오일 글리세롤(0.2 eq)을 메틸렌클로라이드(2.0 eq)에 다시 용해시키고, 디사이클로헥실카보디이미드(1.2 eq)와 디메틸아미노피리딘(0.2 eq)을 가한 후, 온도를 0℃로 저하시켰다.여기에 팔미트산(0.23 eq)을 가하고 2 시간 동안 반응시킨 후, 생성된 목적화합물 KJ-1을 칼럼크로마토그래피(n-헥산:에틸아세테이트=18:1)에 의해 분리하였다(수율: 3.42 %).

[7-1-2. 포스파티딜콜린으로 부터의 합성(가아세트산분해)]

포스파티딜콜린(1-올레오일-2-팔미토일-3-포스포콜린) 500㎎을 아세트산/무수아세트산(3:2) 50㎖에 용해시키고 아르곤 가스중에서 8시간 동안 150℃의 오일 베스(oil bath)하에서 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 반응용액을 클로로포름/메탄올/물(8:4:3) 30㎖씩으로 3 회 추출하고, 물로 세척한 후 1시간 동안 무수황산나트륨으로 건조시켜 목적화합물 KJ-1 300㎎(수율: 71.3%)을 수득하였다. 합성된 화합물의 구조를 IR,¹H-NMR 및¹³C-NMR 에 의해 확인하였다.

IR (CH2Cl2) 3018.13 sp²CH 피크, 1744.5 (강) cm^-1카보닐 피크

¹H NMR (CDCl₃) : δ 5.32 (m, 2H) 비닐 양성자, 5.24 (m, 1H) 글리세롤-t-탄소 양성자, 4.25 (dt, 2H), 4.12 (dd, 2H) 글리세롤-말단 탄소 양성자, 2.29 (m, 4H) 카보닐 탄소 양성자, 2.05 (s, 3H) 아세틸 그룹 양성자, 1.98 (br, 4H) 알릴 양성자, 1.60 (br, 4H) 카보닐-β-탄소 양성자, 1.23 (m, 44H) 탄화수소 양성자, 0.86 (t, 6H) 지방산 말단 탄소 양성자(t: 삼중선, m : 다중선, dt : 삼중선중의 이중선, dd : 이중선의 이중선, br : 브로드 피크).

¹³C NMR (CDCl₃) : δ 172.9, 172.5, 170.1 카보닐 피크, 129.8, 129.4 비닐 탄소, 68.6, 62.1, 61.8 글리세롤 탄소

[7-2. 1-팔미토일-2-올레오일-3-아세틸글리세롤(KJ-2)의 합성]

[7-2-1. 글레세롤로 부터의 합성]

상기 7-1-1 에 기술된 화합물 KJ-1 의 합성방법과 동일한 방법에 따라 해당하는 지방산(팔미트산, 올레산)을 사용하여 목적화합물 KJ-2를 합성하였다(수율: 3.45%).

[7-2-2. 포스파티딜콜린으로 부터의 합성]

상기 7-1-2 에 기술된 화합물 KJ-1 의 합성방법과 동일한 방법에 따라 해당하는 포스파티딜콜린(1-팔미토일-2-올레오일-3-포스포콜린)을 사용하여 가아세트산분해반응을 수행하여 목적화합물 KJ-2를 합성하였다(수율: 70.2%).

IR (CH₂Cl₂) 3018.13 sp²CH 피크, 1744.5 (강) cm^-1카보닐 피크

¹H NMR (CDCl₃) : δ 5.32 (m, 2H) 비닐 양성자, 5.24 (m, 1H) 글리세롤-t-탄소 양성자, 4.25 (dt, 2H), 4.12 (dd, 2H) 글리세롤-말단 탄소 양성자, 2.29 (m, 4H) 카보닐-측쇄 탄소 양성자, 2.05 (s, 3H) 아세틸 그룹 양성자, 1.98 (br, 4H) 알릴 양성자, 1.60 (br, 4H) 카보닐-β-탄소 양성자, 1.23 (m, 44H) 탄화수소 양성자, 0.86 (t, 6H) 지방산 말단 탄소 양성자

[7-3. 1-팔미토일-2-리놀레일-3-아세틸글리세롤(KJ-3)의 합성]

[7-3-1. 글리세롤로 부터의 합성]

상기 7-1-1 에 기술된 화합물 KJ-1 의 합성방법과 동일한 방법에 따라 해당하는 지방산(팔미트산, 리놀레산)을 사용하여 목적화합물 KJ-3을 합성하였다(수율 : 3.21%).

[7-3-2. 포스파티딜콜린으로 부터의 합성]

상기 7-1-2 에 기술된 화합물 KJ-1 의 합성방법과 동일한 방법에 따라 해당하는 포스파티딜콜린(1-팔미토일-2-리놀레일-3-포스포콜린)을 사용하여 가아세트산분해반응을 수행하여 목적화합물 KJ-3를 합성하였다(수율 : 74.5%).

[7-3-3. 계란으로 부터의 합성]

계란 노른자 9개(약 123.31g)에 에테르 400ℓ를 넣고 교반하여 약 1시간 동안 방치하였다. 위의 녹은 부분만 따라 내어 수욕중에서 용매를 증발시킨 후 300㎖ 정도의 아세톤을 가하고 교반하면 순수하지 않은 포스파티딜콜린이 침전물(2.46g)로 가라앉는다. 이 침전물을 용리액인 클로로포름/메탄올/물(65:25: 4) 20㎖에 용해시켰다. 분말 실리카겔 150g을 클로로포름/메탄올/물 (65:25: 4) 400㎖ 에 가하여 팽윤시킨 후 열린 칼럼에 채웠다. 순수하지 않은 포스파티딜콜린 침전물을 실리카겔 칼럼에 적용시키고 50㎖씩 분획을 수거하였다. TLC로 표준물질 포스파티딜콜린과 비교하여 순수한 포스파티딜콜린 부분만(300㎎)을 수거하여, 포스파티딜콜린으로 부터 화합물 KJ-1을 제조하는 7-1-2 의 방법과 동일한 방법에 따라 가아세트산분해반응을 수행하여 목적화합물 KJ-3 180㎎을 합성하였다.

IR (CH₂Cl₂) 3064.45 sp²CH 피크, 1740.64 (강) cm-1 카보닐 피크

¹H NMR (CDCl₃) : δ 5.32 (m, 4H) 비닐 양성자, 5.24 (m, 1H) 글리세롤-t-탄소 양성자, 4.25 (dt, 2H), 4.12 (dd, 2H) 글리세롤-말단 탄소 양성자, 2.72 (m, 2H) 올레핀-탄소 양성자, 2.29 (m, 4H) 카보닐-측쇄 탄소 양성자, 2.05 (s, 3H) 아세틸-그룹 양성자, 1.98 (br, 4H) 알릴 양성자, 1.60 (br, 4H) 카보닐-β-탄소 양성자, 1.23 (m, 38H) 탄화수소 양성자,0.86 (t, 6H, J=6.5Hz, 6.8Hz) 지방산-말단 탄소 양성자

¹³C NMR (CDCl₃) : δ 172.9, 172.5, 170.1 카보닐 피크, 129.8, 129.4 비닐 탄소, 68.6, 62.1, 61.8 글리세롤-탄소

[7-4. 1-팔미토일-2-리놀레노일-3-아세틸글리세롤(KJ-4)의 합성]

[7-4-1. 글리세롤로 부터의합성]

상기 7-1-1 에 기술된 화합물 KJ-1 의 합성방법과 동일한 방법에 따라 해당하는 지방산(팔미트산, 리놀렌산)를 사용하여 목적화합물 KJ-4를 합성하였다(수율 : 3.17%).

IR (CH₂Cl₂) 3018.13 (약) sp²CH 피크, 1740.64 (강) cm-1 카보닐 피크

¹H NMR (CDCl₃) : δ 5.30 (m, 6H) 비닐 양성자, 5.24 (m, 1H) 글리세롤-t-탄소 양성자, 4.25 (dt, 2H), 4.12 (dd, 2H) 글리세롤-말단 탄소 양성자, 2.72 (t, 4H) 올레핀-탄소 양성자, 2.29 (m, 4H) 카보닐-측쇄 탄소 양성자, 2.05 (s, 3H) 아세틸-그룹 양성자, 1.98 (br, 4H) 알릴 양성자, 1.60 (br, 4H) 카보닐-β-탄소 양성자, 1.23 (m, 32H) 탄화수소 양성자,0.90 (t, 3H, J=7.5Hz), 0.86 (t, 6H, J=6.5Hz) 지방산-말단 탄소 양성자

¹³C NMR (CDCl₃) : δ 173.2, 172.8, 170.4 카보닐 피크, 131.8, 130.1, 128.3, 128.1, 127.7, 127.0 비닐 탄소, 68.7,62.3, 62.0 글리세롤 탄소

[7-5. 1-팔미토일-2-아라키도노일-3-아세틸글리세롤(KJ-5)의 합성]

[7-5-1. 글리세롤로 부터의 합성]

상기 7-1-1 에 기술된 화합물 KJ-1 의 합성방법과 동일한 방법에 따라 해당하는 지방산(팔미트산, 아라키돈산)을 사용하여 목적화합물 KJ-5를 합성하였다(수율 : 3.31%).

[7-5-2. 포스파티딜콜린으로 부터의 합성]

상기 7-1-2 에 기술된 화합물 KJ-1 의 합성방법과 동일한 방법에 따라 해당하는 포스파티딜콜린(1-팔미토일-2-아라키도일-3-포스포콜린)을 사용하여 가아세트산분해반응을 수행하여 목적화합물 KJ-5를 합성하였다(수율 : 69.2%).

IR (CH₂Cl₂) 3064.45 (약) sp²CH 피크, 1740.64 (강) cm-1 카보닐 피크

¹H NMR (CDCl₃) : δ 5.32 (m, 8H) 비닐 양성자, 5.24 (m, 1H) 글리세롤-t-탄소 양성자, 4.25 (dt, 2H), 4.12 (dd, 2H) 글리세롤-말단 탄소 양성자, 2.75 (t, 6H) 올레핀-탄소 양성자, 2.30 (4 중선, 4H) 카보닐-측쇄 탄소 양성자, 2.15∼1.99알릴 양성자, 2.05 (s, 3H) 아세틸-그룹 양성자, 1.65 (m, 2H), 1.55 (br, 2H) 카보닐-β-탄소 양성자, 1.23 (m, 30H)탄화수소 양성자, 0.86 (m, 6H) 지방산-말단 탄소 양성자

¹³C NMR (CDCl₃) : δ 173.2, 172.8, 170.4 카보닐 피크, 130.4, 128.9, 128.7, 128.5, 128.3, 128.0, 127.8, 127.5 비닐탄소, 68.9, 62.3, 62.0 글리세롤 탄소

[실시예 8]

[녹용의 조혈작용 효능 검색 방법]

상기 실시예 1 내지 5 에서 수득된 녹용 추출물 및 그의 정제된 엑기스, 및 합성된 화학식 1 의 화합물들의 조혈작용 효능을 검색하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.

[8-1. 콜로니 형성 효능 시험 (Colony-Forming Unit in Culture)]

[8-1-1. 마우스의 골수세포 분리]

SPF(Specific Pathogene Free: 특정 병원체가 없는) 조건하에서 사육한 생후 6∼10주일된 C57Bl/6계의 수컷 마우스를 사용하여 마우스 다리의 정골과 대퇴골로부터 RPMI 1640 영양배지(Gibco #430-1800)로 세척하여 골수를 분리하였다. 분리한 골수를 여과하여 단세포 부유액으로 만들고, 다시 RPMI 1640 영양배지로 3회 반복 세척한 후 세포수를 측정하였다.비중이 1.063과 1.075 사이에 있는 간세포(幹細胞: stem cell) 풍부 분획을 얻어서 RPMI로 2회 세척하였다.

[8-1-2. 시료의 제조]

모든 녹용 시료는 디메틸설폭사이드(DMSO)에 100㎎/㎖의 농도가 되도록 용해시켜 이것을 저장용액(stock solution)으로 사용하여 조혈작용 효능 검색에 이용하였다.

[8-1-3. CFU-C(colony-forming unit in culture) 분석]

1.1% 메틸셀룰로스판에 상기 8-1-1의 방법으로 분리된 골수세포 1.2×10⁴세포/웰(cell/well)과 상기 8-1-2에서 제조된 각각의 시료를 함께 접종한 후, 37℃ 의 CO₂-인큐베이터에서 배양하고, 1주일 후에 콜로니의 수를 측정하였다. 시료로는 실시예 1 내지 5에서 분리된 녹용 추출물 CN-C, CN-C-2, CN-C-2-E, CN-C-2-E-a 및 CN-C-2-E-a-Mi를 각각 사용하였다.측정된 결과는 표 2 에 기재하였다. 측정된 결과로부터 다음 식에 의해 콜로니 형성효능(Colony Forming Efficiency:CFE)을 구하였다.

CFE=(시료에 있는 콜로니의 전체수)/(대조군에 있는 콜로니의 전체 수)

상기 표 2에 기재된 결과로부터, 본 발명에 따르는 녹용의 클로로포름 추출물 CN-C 및 그로부터 정제된 각각의 엑기스는 모두 우수한 콜로니 형성 효능을 나타내며, 따라서 조혈작용 효능을 가지고 있음을 알 수 있다.

[8-2. 생체내 CFUs(Colony-Forming Unit in Spleen) 분석시험]

본 발명에 따라 분리된 녹용 추출물중의 활성성분으로 확인된 상기의 화합물(KJ-1, KJ-4 및 KJ-5)이 조혈모세포 증식촉진활성을 가지고 있는지를 확인하기 위하여 후술하는 바와 같이 동물을 이용한 생체내 검색법으로서 준치사량의 방사선을 조사한후 저하된 골수기능의 회복도를 측정하는 방법(CFUs)을 수행하였다.

6∼8 주령의 C57Bl/6 마우스를 137-Cs 방사선조사기(irradiator)(CIS #IBL437)를 사용하여 8.0Gy 의 조사량으로 전신에 방사선을 조사한 후 틸과 맥큘로흐(Till ＆ McCulloch)의 방법에 준하여 꼬리정맥을 통해 1.5×10⁵개의 동종골수세포를주입함으로써 골수이식을 실시하였다. 마우스는 대조군과 합성물질 투여군으로 나누었다. 골수이식 후 1일, 2일, 3일에 각각의 시료들을 투여하고, 14일째에 비장을 적출하여 비장의 무게를 측정하고(표 3, 제4도), 콜로니 형성을 관찰하기위해 비장 조직을 포르말린으로 고정한 후 절단하여 H/E (Hematoxylin/Eosin) 염색을 실시한 다음 조직학적 구조변화를 검경하였다(제5도 내지 제11도).

그 결과, 대조군 및 녹용 수용성 추출물을 투여한 마우스의 비장보다 합성물질을 투여한 마우스 비장이 크기가 더 크고 결절이 많이 생겼으며, 합성물질의 투여량이 증가할 수록 비장의 크기가 더욱 커지고 결절이 더욱 많이 생긴다는 것을 알수 있었다. 따라서 이러한 결과로부터 화합물 KJ-1 내지 KJ-5의 물질들은 조혈모세포 및 혈소판 증식 촉진활성을 갖고 있음을 확인할 수 있었다.

[8-3. 단핵세포(monocyte) 티미딘 흡수시험]

사람의 전혈(whole blood) 100㎖ 로 부터 단핵세포 5×106 세포/㎖ 를 취하여 RPMI-1640+2% FBS 에 현탁시키고 37℃ 의5% CO2-인큐베이타에서 배양하였다. 이 세포를 웰 플레이트에 2-3×10⁶세포/4㎖/웰의 농도로 넣은 후 GM-CSF와 KJ-3를각각 넣고, 37℃ 의 인큐베이타에서 7일간 배양하였다. 이 웰에³H-티미딘 1μCi를 가한 후 24시간 동안 배양하고 트립신분해시키고 베타카운터기로 측정하였다. 그 결과는 표 4 에 기재하였다.

[8-4. T4/T8 티미딘 흡수시험]

사람의 전혈로부터 단핵세포를 분리하고, 단핵세포로 부터 T 세포를 분리하였다. 이 T 세포를 MACS 키트 칼럼을 이용하여 T4와 T8을 분리하였다. 분리한 세포를 IMDM+10% FBS 로 현탁시켜 웰 플레이트에 2×10⁶세포/4㎖/웰의 농도로 넣은후 IL-2 20㎍/㎖ 와 KJ-3 0.01㎎/㎖/웰을 가하고 인큐베이타에서 7일간 배양하였다. 이 웰에³H-티미딘 1μCi를 가한후 24시간 동안 배양하고 트립신 분해시킨 후, 베타카운터기로 측정하였다. 그 결과는 표 5 에 기재된 바와 같다.

상술한 바와 같이, 본 발명에 따라 분리 및 정제된 녹용의 추출물, 특히 녹용의 클로로포름 추출물과 그로부터 분획화하여 정제된 엑기스는 우수한 조혈모세포 및 혈소판 전구세포 증식 촉진활성을 나타냄을 알 수 있다. 본 발명에 따라 또한 녹용 추출물 중에서 조혈모세포 및 혈소판 증식촉진활성을 나타내는 활성물질이 분리 및 확인되어 이들을 합성방법에 의해 제조하여 이용할 수도 있게 되었다. 본 발명에 의해 밝혀진 새로운 물질은 조혈모세포 및 혈소판 증식 촉진작용을 함으로써 면역기능 및 혈액 세포들의 기능 증진이 필요한 질환, 특히 항암제 및 방사선 조사후 골수기능이 저하된 상태에있는 질환 등 임상 각 분야에 걸쳐서 전반적으로 치료제로서 사용될 수 있을 것이다.

Claims

유효성분으로서 녹용을 헥산으로 추출하고, 추출잔사를 다시 클로로포름으로 추출하여 수득된 녹용의 클로로포름 추출물(엑기스 CN-C) 또는 그로부터 실리카겔 칼럼크로마토그래피 및 TLC에 의해 더 분리·정제된 분획을 함유하는 조혈모세포 및 혈소판 전구세포 증식촉진용 조성물.
제1항에 있어서, 유효성분으로서 엑기스 CN-C를 클로로포름/메탄올을 용리액으로 사용하여 칼럼크로마토그래피를 수행하고 TLC 하여 수득된 분획 CN-C-2 를 함유하는 조성물.
제2항에 있어서, 유효성분으로서 엑기스 CN-C-2를 다시 헥산/에틸아세테이트를 용리액으로 사용하여 칼럼크로마토그래피를 수행하고 TLC 하여 수득된 분획 CN-C-2-E를 함유하는 조성물.
제3항에 있어서, 유효성분으로서 엑기스 CN-C-2-E를 헥산/에틸아세테이트/아세트산을 용리액으로 사용하여 칼럼크로마토그래피를 수행하고 TLC 하여 수득된 분획 CN-C-2-E-a를 함유하는 조성물.
제4항에 있어서, 유효성분으로서 엑기스 CN-C-2-E-a를 메탄올에 용해시켜 분리한 메탄올-불용성 분획 CH-C-2-E-a-Mi를 함유하는 조성물.
녹용을 헥산으로 추출하고, 추출잔사를 다시 클로로포름으로 추출하여 녹용의 클로로포름 추출물을 수득하거나, 수득된 녹용의 클로로포름 추출물을 칼럼크로마토그래피 및 TLC에 의해 더욱 분리·정제함을 특징으로 하여 제1항 내지 제5항중의 어느 하나에 기술된 녹용의 클로로포름 추출물 및 그로부터 분리·정제된 분획을 제조하는 방법.
유효성분으로 화학식 1의 화합물을 함유하는 조혈모세포 및 혈소판 전구세포 증식촉진용 조성물 :

[화학식 1]

상기식에서, R₁/R₂는 9-옥타데세노일/헥사데카노일, 헥사데카노일/9-옥타데세노일, 헥사데카노일/9,12-옥타데카디에노일, 헥사데카노일/9,12,15-옥타데카트리에노일 또는 헥사데카노일/5,8,11,14-에이코사테트라에노일을 나타내며, R₃는 아세틸을 나타낸다.
하기 화학식 1b의 화합물 :

[화학식 1b]

상기식에서, R_1b/R_2b는 헥사데카노일/9,12,15-옥타데카트리에노일 또는 헥사데카노일/5,8,11,14-에이코사테트라에노일을 나타내며, R₃는 아세틸을 나타낸다.